Summary
이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.
Abstract
송사리 Nothobranchius furzeri ecotoxicology의 분야에서 신흥 모델 유기 체 이며, 급성 및 만성 ecotoxicity 테스트에 그것의 적용은 입증 되었습니다. 전반적으로, 독성 화합물을 종족의 감도, 또는 이상, 다른 모델의 범위입니다.
이 작품 명. furzeri에 대 한 단일 및 결합 된 스트레스 효과의 급성, 만성, 및 대가족제 생물 검정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 짧은 성숙 시간 및 주기,이 척추 모델 4 개월 이내 끝점 성숙 시간과 통치 등의 연구를 수 있습니다. Transgenerational 전체 수명 주기 노출 시험 빠르면 8 개월만에 수행할 수 있습니다. 이 종 가뭄 방지 계란을 생산 하 고 있기 때문에 가능한 오랫동안 유지, 종족의 현장 문화 필요 하지 않습니다 하지만 개인 필요할 때 채용 될 수 있습니다. 프로토콜은 측정 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 설계 되었습니다.
Introduction
전략적으로 선택한 유독 종족의 감도 프로필 유럽 도달 법안 (등록, 평가, 승인, 및 화학 물질의 제한)에 대 한 설명된1 되었습니다. 급성 또는 단기 독성 테스트 그들은 종족의 감도의 빠른 알려주지이 목적을 위해 주로 사용 했다. 그러나, 그들의 자연 환경에서 유기 체는 더 이상 기간 동안 노출 하 고 전체 수명 주기 또는 심지어 여러 세대 수 있습니다 영향을 받는2키를 누릅니다. 또한, 오염 된 환경에 있는 유기 체는 일반적으로 노출 이상의 스트레스를 한 번에, 서로 상호 작용 수 있는 시너지 효과3발생할. 따라서, 안전한 농도 계산된에 따라 급성, 단일 스트레스 독성 테스트 이용과 자연 환경에 의해 부과 된 실제 위험을 과소 평가 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 또한 유럽 위원회4,5 와 USEPA (미국에 의해 주 창으로 환경 관련 컨텍스트에서 이용과의 sublethal 농도의 만성 및 대가족제 효과 공부 하는 것이 좋습니다. 미국 환경 보호국)6,7. 특히 척추 연구, 노동, 돈, 그리고 시간 비용에 높은 척추 동물 무척 추 동물 모형 유기 체에 비해 상대적으로 긴 수명으로 인해 만성 및 대가족제 노출 연구를 수행할 때. 따라서, 그것은 가장 적절 한 물고기 모델 유기 체, 연구 질문에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 또한, 광범위 한 척 추가 있는 종 규정 가장 민감한 종에 따라 적응 수 종에 걸쳐 응답의 보편성을 테스트 하기 위해 사용할 수 있어야. 지금, 새로운, 척추 모델 종 척추 동물7,8에 만성와 대가족제 노출 수행의 비용을 줄이고 짧은 주기가 특징으로 효율적인 프로토콜을 개발 하는 필요가 있다.
청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 는 짧은 성숙 시간과 라이프 사이클 (생성 시간 4 주9미만) 때문에 같은 장기 노출 실험에 사용 하는 재미 있는 물고기 모델입니다. 즉, 성숙 시간과 통치 등 생태 관련 끝점 다른 물고기 모델7에 비해 짧은 시간 프레임 내에서 공부 될 수 있다. 또한,이 물고기 유지 함으로써 지속적인 문화9에 대 한 필요성을 제거 하는 표준 조건 하에서 저장 될 때 몇 년 동안 가능한 가뭄 방지, 휴면 계란 생산. Ecotoxicological 연구에서이 또한 물고기 수 모두 해치 할 정확한 동일한 순간에 서로 다른 시간에 생산 하는 계란의 배치 중 에서도 모든 동물에 대 한 시간 synchrony에 결과 복제를 의미 합니다. GRZ 스트레인 실험실을 사용 하 여 노출 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이 긴장 실험실 조건 하에서 잘 수행, homozygous (성 염색체)를 제외 하 고는 게놈은 잘 성격 나타낸된10,11.
Ecotoxicological 연구에서 그것은 시험 농도의 적절 한 범위를 선택 하는 것이 중요입니다. 여러 가지 보완적인 방법을이 끝을 사용할 수 있습니다. 공칭 농도 범위 Nothobranchius guentheri12등 관련된 동물의 감도 기반으로 수 있습니다. 또는, 범위는 표준 어 모델, 대부분 유독 (필립 외 에 비해 감도가 zebrafish (Danio rerio)2 의 감도에 근거 할 수 있다 (에서 검토)). 함께, 이러한 옵션을 모두 찾는 실험 범위 명목상 농도 범위를 선택 하 실시 한다. 급성 테스트에 대 한 연구는 toxicant에 노출의 24 시간 후 100% 사망률, 중간 사망률 0% 사망률과 집중 치료에 대 한 목표로 한다. 테스트용 만성, 그것은 찾는 경우 높은 테스트 농도 조건에서 애벌레 사망률이 기준 기간 동안 10%를 초과 하지 않는 확인 하려면 2 주 동안 실험 범위를 실행 하는 것이 좋습니다.
프로토콜은 스트레스 두 개인 및 세포 수준에서의 잠재적인 효과 조사 waterborne 오염 물질에 급성 및 만성 노출 명. furzeri에 수행 하는 기준으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 높은 생태 관련성, 다른 유독한 화합물을 혼합 또는 오염 및 다른 자연 스트레스 (예: 포식) 간의 대화형 효과 공부에 맞게 멀티 스트레스 연구를 수행 하 사용 될 수 있습니다 또는 anthropogenic 스트레스 (예: 기후 변화로 인해 지구 온난화).
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 KULeuven의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 화 명 furzeri 의 일반 유지 보수
- 준비 물고기 14 ° C의 온도에서 매체 (pH 7)와 600 µS/c m (24 ° C)의 전도도에 추가 표준화 된 소금, 정제 타입 II 물을 추가.
- 표준화 된 조건13에서 저장 된 GRZ (Gona-토크쇼-Zhou) 연구소 라인에서 계란을 선택 합니다. (즉 해치 준비), DIII 단계에서 계란을 선택 인식할 수 있는 황금 눈9 의 그리고 부드럽게 존재에 의해 그들 핀셋의 부드러운 쌍을 전송 플라스틱 2 리터 탱크 (탱크 당 더 이상 약 30 알).
참고: 하기 위해서는 건강 한 시험 생물의 충분 한 수, 필요한 물고기 애벌레의 수로 두 번 많은 계란 해치. - 12 ° C에서 물고기 매체의 1 cm를 추가 하 고 물 온도 실내 온도 (24 ° C)9점차 수렴 하 게. 물고기는 처음 12 h 이내 해치 것입니다.
- 24 시간 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemianauplii 집중된 투여 (대 한 음식의 양과 주파수에 자세히 Polačik 외. 20169번 식 프로토콜을 참조)에 의해 5 cm에 물 깊이 증가 물고기 매체 추가.
- 36 h 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemia nauplii 의 다른 집중된 투여 하 고 물고기 매체 물 깊이 10 cm를 증가 추가 합니다.
- 14 h:10 h에서 일정 한 온도 조건 (예: 보육, 기후 실 또는 온수 물 목욕) 물고기 컨테이너를 품 어 빛: 다크 정권.
- 실험을 시작 하기 전에 복잡 한 물고기 컨테이너 (물고기) 노출 노출 매체의 높은 농도 함께 그들을 작성 하는 것 그것을 떠날 하 여 복합 하룻밤 실제 컨테이너에 유독의 전송을 제한 하려면 실험입니다.
- 해칭, 후 48 h 노출 실험을 시작 하는 건강 한 부 력 애벌레를 선택 합니다. 무시 하 고 결과적으로 장애인된 부 력 그들의 수영 방광을 채우기 할 수 없었던 소위 배 슬라이더 (지속적으로 바닥에 싱크).
2. 단기 노출 프로토콜
참고: 연구원 치료 당 적어도 20 복제 (별도 항아리에 20 물고기)에 대 한 목표로 한다. 용 매를 사용 하 여 화합물의 재고 솔루션을 준비 하는 경우 모든 권한 치료 뿐만 아니라 용 매 제어는 포함 되어야 합니다. 솔벤트 컨트롤 최고 노출 농도에서 용 매 농도 인 용 매의 양을 포함 해야 합니다.
- 그들 하 고 적절 한 노출 매체 (다른 toxicant 농도)와 그들을 작성 하는 것에 의해 실험 용기 (0.5 L 유리 항아리)를 준비 합니다. 정확한 농도 얻기 위해 화합물을 추가 합니다.
- 컨테이너 (개별 모니터링에 대 한 컨테이너 당 1 물고기)에 애벌레 (48 h 후 부 화)를 개별적으로 전송 합니다.
참고: 물고기 음식과 침략에 대 한 경쟁 등 사회적 상호 작용의 잠재적인 혼란 효과 최소화 하기 위해 개별적으로 노출 됩니다. 그러나, 물고기 실험 동물 사용에 대 한 윤리 기준에 따라에서 시각적으로 상호 작용할 수 있습니다. - 최대 2 주 동안이 급성 노출 후속. 그 시간 동안, 물고기 먹이 광고 libitum Artemia nauplii 두 번 하루, 7 일/주를.
- 새로 고침 매체 매일 수 질을 유지 하 고 복합 저하의 잠재적인 영향을 최소화 합니다. 주요 물 변수 모니터링 (용 존된 산소 수준 80%를 초과 한다, 전도도 해야 600 그리고 700 µS/c m, pH 7.8와 8.2, 고 경도 (CaCO3)로 사이 350와 450 mg/L, 최적의 양육 조건의 범위 내 명. furzeri 9)에 대 한. 전과 후 실제 화합물 농도 결정 하는 매체 물 샘플을 가져가 라.
- 끝점
- 물고기 사망, 스트레스에 대 한 확인 (예: 탈 선 행동: 거꾸로 수영) 또는 질병 매일 (아침, 저녁). Shedd 외 의 게시를 참조 하십시오 (1999) 사망률, 스트레스 또는 질병의 관찰에 대 한 내용은 12 .
- LC 계산 복용량 응답 곡선 (리츠와 Streibig, 2005)를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 사망률에 따라50 값. Drm 함수를 사용 하 여 R v3.2.3 (연구 개발 핵심 팀, 2016) drc 패키지에서 또는 유사한 통계 접근.
3. 만성 노출 프로토콜
참고: 상태 생선/25 비뚤어진된 섹스 률의 가능성을 최소화 하 고 자연적인 원인으로 인 한 잠재적인 배경 사망률에 맞게 실험의 발병의 최소 목표 (즉. 연령 관련 사망률).
- (참조 1) 부 화
- 차 전 (2 일 후-16 일 후 부 화 부 화)
- 2.1-2.4에 설명 된 대로 프로토콜을 따라
- 실험의 두 번째 단계 동안 매체 주 (없음 다, 아래 참조)에 걸쳐 떨어집니다. 화합물의 비슷한 저하를 허용 하기 위하여 큰 불활성 용기에 1 주일에 대 한 매체의 필요한 양을 저장 합니다.
- 단계 II (16 일 후 부 화-끝)
- 2 L 준비 실험 유리 항아리 complexing에 의해 그들 화합물으로. 정확한 노출 매체와 항아리와 항아리 공기에 쐬는 공기 튜브를 추가. 실험의 나머지 부분에 대 한 이러한 항아리에 개별적으로 집 물고기. 윤리 기준에 맞게 시각적 상호 작용을 허용 합니다.
- 주 당 한 번 매체를 새로 고칩니다. 동일한 노출 매체를 포함 하는 새 항아리에 그물과 물고기를 전송. 각 농도 처리에서 화합물의 저하를 모니터링 하는 데 1 주일 동안 매일 물 샘플을 가져가 라. 각 치료 경우 여러 스트레스에 대 한 저하 곡선 테스트 (예: 다른 온도 정권에서 화합물의 독성)를 계산 합니다. 주 당 세 번 abiotic 매개 변수 (pH, 온도, 용 존 % 산소, 전도도)를 측정 합니다.
- 2 일 후 부 화 (dph) 23 dph까지, 하루에 두 번, 주 ad libitum Artemia nauplii 당 7 일 물고기를 먹이. 24 dph-37 dph에서에서 다진된 Chironomus 애벌레와 광고 libitumArtemia 다이어트를 보완. 에 38 dph에서 두 번 하루, 7 일 주일 광고 libitum Chironomus 애벌레 냉동 물고기를 먹이.
- 끝점
- 매일 물고기 사망, 스트레스 또는 질병12에 대 한 확인 합니다.
- 결정 성장, 페 트리 접시에 생선을 전송 하 여 (9 dph-16 dph-21 dph-...) 주간 기준 본문 크기를 측정 하는 그들의 저수지에서 매체 가득 합니다. (고정된 높이)에서 4-5 위에서 물고기의 보정 크기 사진을가 고 디지털 공간 측정 프로그램 (예: ImageJ)를 사용 하 여 그들을 분석.
참고: 성인 물고기에 대 한 전체 프로세스를 측정 하는 동안 잠긴 모든 물고기를 유지 하 여 처리 스트레스를 최소화 하기 위해 높은 페 트리 접시를 사용 합니다. - 남성 성숙에 대 한 시각적으로 매일 15 dph 이후부터 채색에 대 한 물고기를 검사 합니다. 결혼식 채색 (2 차 성적 특성)의 첫 번째 징후에 대 한 지 느 러 미를 확인 하십시오. 이 표시 됩니다 프록시 남성 성숙으로 첫 날을 사용 합니다.
- 커플 비 sexed 물고기 같은 치료 그룹의 남성 또는 주당 3 회 실험 비 남성 30 dph에서 이후 여성 성숙 시간 (첫 번째 계란 입금 일)을 결정 하기 위하여. 이 위해, 3.4.5에 설명 된 산란 프로토콜을 사용 합니다.
- 통치에 대 한 몇 가지 성숙한 성숙한 남성과 여성 3 회 / 30 dph 주 이후, 그들의 처리에서 사용 하 여 횡단 계획.
- 산란 탱크 (1 L) 기판 산란 보충 남성 수족관에서 노출 매체를 사용 하 여 각 커플에 대 한 준비 (미세 모래 < 500 µ m).
- 산란 탱크에 남성과 여성 모두 전송 및 2 시간 동안 산란 하도록 허용. 인간의 활동 또는이 프로세스 동안 산란 컨테이너 주위 방해를 최소화 합니다.
- 그 후, 부드럽게 물고기 다시 전송 그들의 원래 주택 컨테이너 산란 기판에 달걀을 소용돌이 물의 불필요 한 혼합 없이.
- 500 µ m 메쉬 위에 산란 기질을 붓는 의해 계란을 필터링. 계란을 계산 하 고 그들을 전송 (사용 하 여 부드러운 핀셋) 접시9,14에서 축축한 물 이끼를.
- 매일 죽은 계란을 제거 합니다. 후 주, 물개는 페 트리 필름 밀봉 된 접시와 온도에 저장 제어 28 ° C에서 인큐베이터와 14시 10분 h 빛: 다크 DIII 단계 (즉, 약 3 주 후 해치 준비)을 즉시 개발 주기. 장기 보관을 위해 따라 계란 휴면 단계를 입력 하 고 가능한 여러 년 남아 지속적인 암흑에서 17 ° C에 계란을 저장. 14:10 h 28 ° C 조건 실험, 휴면이 계란에서 모집 물고기 전송 휴면 계란 빛: 다크 DIII 단계로 개발 수 있도록 약 3 주에 대 한 주기.
- 성인 물고기의 중요 한 열 최대 (CTmax) (15성능 측정)를 측정 합니다.
- 0.33 ° C/min의 일정 한 속도로 열 물 목욕을 사용 하 고 물을 지속적으로 순환 됩니다. 각 개별 물고기에 대 한 몇 가지 1 L aquaria을 추가 합니다.
참고: 물 목욕에서 공간 제약을 감안할 때, 그것은 여러 시리즈에서 일 필요가 있다. 시리즈 중 조건에서 잠재적인 차이 계정에 임의의 요소로 ' 시리즈'를 포함 하 여 통계 분석을 수행할 때 취해야 한다. - 수족관에 물에는 물고기 (일반적으로 28 ° C)의 실험적인 양육 온도 도달 했습니다 때 수족관에 물고기를 추가 하 여 재판을 시작 합니다. 디지털 온도계 (0.1 ° C 스케일)를 사용 하 여 모든 5 분 1 L aquaria CTmax 목욕의 온도 모니터링 합니다.
- 물고기 dorso ventrally 수직 위치를 유지 하거나 무 겁 게16,17꿈 틀 시작 때 재판을 종료. 중요 한 최대 온도 1 L 수족관에서 온도 측정 합니다. 물고기는 그것의 실험 주택 복구에 대 한 다시 전송.
- 0.33 ° C/min의 일정 한 속도로 열 물 목욕을 사용 하 고 물을 지속적으로 순환 됩니다. 각 개별 물고기에 대 한 몇 가지 1 L aquaria을 추가 합니다.
- 건조 모리 아 티와 무게 보트에 전송 하 여 실험의 마지막 날에는 생선의 무게 (0.1 mg 정확도)를 측정 합니다. 참고: 모든 생선 창 자에서 음식 무게 표준화에 마지막 수 유 후 4 시간 측정 한다.
- 0.1%를 사용 하 여 물고기를 안락사 Tricaine.
4. Transgenerational 노출 프로토콜
주: 명. furzeri에 오염 물질의 transgenerational 효과 측정 하는 1 세대에 대 한 위에서 설명한 만성 노출 프로토콜을 따릅니다.
- 매주 두 번, 28 ° C에 저장 된 생산된 계란 (즉 2 세대)의 개발 확인 14시 10분 DIII 단계에서 배아의 배양 접시를 검사 하 여 h 빛: 다크 주기 조건 (Polačik 외. 참조 20169)입니다. 각 부모의 치료의 50 개 이상의 복제 완전히 개발 되는 때, 1.1에서 프로토콜을 따르고 그들을 해치.
- 건강 한, 잘 뜨는 물고기 정확 하 게 동일한 설치 및 부모의 물고기 치료를 노출.
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Representative Results
명. furzeri 의 구리의 다른 농도 급성 노출의 결과 2.5.2에서 계산, cleardose-응답 관계 (그림 1). Toxicant 농도 증가와 사망률에서 증가 있다. LC50 값 시간이 지남에 감소는 농도 감소와 함께 더 많은 시간 복제 다의 50% 통과 의미. 에 대 한 자세한 결과 다른 종에 비해 종 감도의 비교 뿐만 아니라 구리 하 명 furzeri 의 급성 및 만성 노출 우리 필립 외. 20177를 참조 하십시오.
만성 노출 시험에서 신체 크기와 통치는 민감한 끝점. 온도18에 따라 물고기의 성장에 광범위 한 변화 될 수 있습니다. 30에서 50 사이 성인 크기 m m는 정상으로 간주이 설정에서. 설정 치료 (그림 2A) 간의 차이 찾는 것을 허용 한다. 만성 노출 분석 결과 waterborne 구리를 사용 하 여, 있었다 구리 노출의 중요 한 효과 3 주 동안 (χ²5,34 40.7, P = < 0.001), 북 아 일 furzeri 19.38 µ g/L 다른 모든 물고기 (모든 P 보다 작은 되는 Cu에 노출 된 < 0.001) (그림 2B). 통치에 대 한 제어 값 계란 생산7의 절정에 여성 당 주 당 약 50 계란 사이 변동 한다. 또 다른 실험에서 우리 통치에 온도 상승과 chlorpyrifos 노출 사이의 중요 한 상호 작용을 발견 waterborne chlorpyrifos와 2 ° C 온도 상승를 사용 하 여 (χ22,202 25.3, P = < 0.001). 28 ° C에서 4 µ g/L에 노출 물고기 물고기 2 µ g/L 및 제어 물고기에 노출에 비해 적은 계란 생산 (두 P < 0.001) (그림 2B). 30 ° C에서 제어 물고기 모든 노출 chlorpyrifos 물고기에 비해 더 많은 달걀을 생산 (두 P < 0.007). Chlorpyrifos에 노출의 두 주요 효과 (χ22,202 96.8, P = < 0.001) 및 온도의 주요 효과 (χ21,202 10.18, P = < 0.001) 통치를 크게 감소. 측정은 물고기의 처리 및 토 탄9, 달걀의 도금 때문에 꽤 시간이 소요 하지만 그것은 종종 가장 민감한 끝점.
성숙 시간은 남성에서 오염 물질의 영향을 가장 많이. 남성 성숙 시간 waterborne chlorpyrifos에 만성 노출에 의해 영향을 크게 받았다 (χ22,41 11.79, P = 0.003 =), 남성 4 µ g/L CPF (C2) 제어 남성 (그림 3A에 비해 18% 느린 성숙 하는 데에 노출 ). 그러나이 응답 한다,, 성숙 시간 프록시 결혼식 채색의 발병을 확인 하 여 직접 득점은 이후 주의와 해석. 남성은 채색9의 외관 후에 몇 일을 성숙으로 간주 됩니다, 하지만 있을 수 있습니다 몇 가지 오류 성숙이이 측정을 사용 하 여 정확한 타이밍에.
열 최대 근처 물고기 전시 엉뚱한 수영, 증가 opercular 운동과 dorso ventrally 수직 위치 16,17에 능력의 손실. CTmax 값 명. furzeri 긴장 사이 다. 자연 인구 39 ° C와 42 ° C 24와 28 ° C (그림 3B) 사이의 온도에서 reared 때 사이 CTmax 값을 가집니다. 그러나 타고 난된 GRZ 스트레인,, 이미 도달 약 37-38 ° C에 열 최대 28 ° c.에 양육 하는 경우에 이 절차는 물고기에 게 치명적인, 사망률의 드문 경우에 발생지 않습니다. 그들은 가장 가능성이 상대적으로 빈약한 전반적인 상태에 있는 물고기를 대표 같은 물고기 잘 CTmax 분석에서 제외 됩니다.
이전 결과 대부분 보여주었다는 CTmax 영향을 받을 수는 오염 물질에 의해이 경우에, 3, 4-DCA (χ22,7117.65, P = < 0.001) 생선 제어 생선에 비해 0.32 ° C 낮은 열 최대 데 0.1 mg/L 3, 4-DCA에 노출 (P < 0.001). 또한, CTmax 양육 온도 의해 영향을 받았다 (χ21,71322.0, P = < 0.001)와 28 ° C에서 reared 했다 물고기는 1.3 ℃ 높은 CTmax 물고기에 비해 24 ° c.에 reared 했다 그를 했다
그림 1: 구리 노출에 대 한 복용량 응답 곡선. 복용량 응답 곡선 (µ g/L Cu와 노출 시간에 관하여) 구리 노출 농도의 함수에 Nothobranchius furzeri 의 표시 누적 사망률. 점 LC50 값을 나타냅니다. 이 그림은 필립 외. 20172에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 크기와 끝점으로 통치에 효과. A) 3, 7, 11 및 15의 크기 (cm) Nothobranchius furzeri 주에 구리의 다른 농도에 노출. 별표 나타냅니다 C5 물고기는 P의 의미 수준에서 3 주 후 작은 < 0.05. 값 의미 ± SEM. 샘플 크기 표시 됩니다는 n = 6; 6; 7; 7; 7; 7에 주 3, n = 6; 6; 7; 7; 4에 주 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 주 11와 n = 5; 3; 3; 5; 15 주에서 2입니다. B) 물고기 chlorpyrifos, 2 개의 온도 처리와 함께의 다른 농도에 노출의 시간을 통해 통치 주 당 계란의 수로 측정. 가독성과 판독 그림의 향상, 오차 막대 그래프에 표시 되지 않습니다. 시작 및 끝 기간 누워 계란에서 각 치료에 여성 수는 편지를 사용 하 여 표시 됩니다 ' n '. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 성숙 시간 및 CTmax에 대 한 효과. A) (일에서) 시대를 채색의 첫 번째 징후는 다른 chlorpyrifos 농도 (0 µ g/L (C0), 2 µ g/L (C1)과 4 µ g/L CPF (C2)) 및 두 개의 온도 (28 ° C 그리고 30 ° C)에 노출 되는 Nothobranchius furzeri 의 남성에 등장을 의미. B) 뜻 중요 한 열 (CTmax)의 최대 3, 4-DCA (0 mg/L 3, 4-DCA (C0), 0.05 mg/L 3, 4-DCA (C1), 그리고 0.1 mg/L 3, 4-DCA (C2)) 및 두 개의 온도 (24 ° C와 28 ° C)의 다른 농도에 노출 하는 물고기. 공칭 농도 평균값이 ± SE.로 표시 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 작품 Nothobranchius furzeri, 신흥 모델 유기 체, 개인 연구를 사용 하 여 새로운 생물을 설명 하 고 유독 다른 스트레스의 장기적인 효과 결합. 제시 프로토콜 성공적으로 유독 (구리, 카드뮴, 3, 4-dichloroaniline, 및 chlorpyrifos)의 배열에 종의 감도 측정에 적용 했다. 그것의 빠른 수명 주기 때문이 척추 모델 sublethal의 평가 대 한 허용 하 고 transgenerational 4 개월 이내 효과. 이 어류를 사용 하 여 독성 심사를 모델의 또 다른 주요 장점은 가뭄 방지 계란 생산 하는 사실 이다. 이 연구팀은 달걀을 저장 하거나 공급 업체에서 그들을 얻을 수 있습니다 하 고 비용과 시간이 소요 현장 문화에 대 한 필요성을 제거 합니다. 또한, 배아 파묻혀 필요한12때까지 몇 년 동안 저장할 수 있습니다.
공부 후 참조 이용과의 수 명. furzeri 의 감도, 우리 종족의 감도, 범위에 또는 다른 그 보다 더 높은 종, 시험된 화합물에 따라 모델을 추가할 수 있습니다. 통치에 대 한 효과 측정 특히 증가할 수 있다 공부 종에 감도의 comparability 다른 모델 종에 정기적으로 측정 된 끝점은. 마지막으로, 범위는 여러 스트레스 발휘 불리 한 효과 개별적으로 관리 하거나 결합, 평가 된 끝점 및 노출 농도에 따라 다릅니다.
명. furzeri작업할 때 아직도 몇 가지 제한이 있습니다. 가장 중요 한 제한 중 식품의 표준화 이다. Artemia cysts 또는 bloodworms 일괄 처리과 같은 연구의 결과 영향을 미칠 수, 있습니다. 품질에 다 수 있습니다. 그것은 그러므로 실험의 전체 길이 중 사용할 음식의 큰 일괄 처리를 주문 하는 것이 좋습니다.
우리는이 프로토콜은 ecotoxicological 심사에 널리 적용 됩니다 믿습니다. 명. furzeri 는 ecotoxicology에 표준 테스트 종으로 급속 하 게 개발 된다. 이 표준 프로토콜의 가용성 설립을 연료 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 물 샘플의 분석에 대 한 감사는 UAntwerpen와는 시간적의 작물 보호 학과의 구체 그룹에. 이 프로젝트 중 지원 우수 센터에 의해 제공 된 ' 환경 및 사회 진화 역학 (PF/10/007) 구 루벤 연구 기금. AFG (11Q0516N) 및 ESJT (FWO-SB151323)로 박사 투자 했다 고 FWO 플랑드르 (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek)에서 박사 후 연구원으로 TP (12F0716N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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