Summary
Neste trabalho, descrevemos um bioensaio agudo, crônico e várias gerações para estudar os efeitos dos estressores único e combinadas sobre o turquesa killies Nothobranchius furzeri. Este protocolo é projetado para estudar traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.
Abstract
O Nothobranchius furzeri killies é um organismo modelo emergente no campo da ecotoxicologia e demonstrou-se sua aplicabilidade em ensaios de ecotoxicidade aguda e crônica. Em geral, a sensibilidade da espécie de compostos tóxicos está no intervalo com, ou superior, de outras espécies de modelo.
Este trabalho descreve os protocolos para os bioensaios agudos, crônicos e várias gerações dos efeitos combinados e único estressor na furzeri s.. Devido ao seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida, este modelo de vertebrados permite o estudo de pontos de extremidade como tempo de maturação e fecundidade no prazo de quatro meses. Ensaios de exposição de ciclo de vida completo transgeracional podem ser executados em menos de 8 meses. Desde que esta espécie produz ovos que são resistentes à seca e permanecem viável durante anos, a cultura no local das espécies não é necessária, mas os indivíduos podem ser recrutados quando necessário. Os protocolos destinam-se a medida traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.
Introduction
Perfis de sensibilidade de uma matriz de espécies tóxicas para estrategicamente selecionadas foram descritos1 para a legislação europeia chegar (registo, avaliação, autorização e restrição de produtos químicos). Testes de toxicidade aguda ou a curto prazo foram usados principalmente para esta finalidade como eles dão uma indicação rápida de sensibilidade da espécie. No entanto, em seu ambiente natural, os organismos são expostos por períodos muito mais longos e ciclos de vida completo ou até mesmo várias gerações podem ser afetada2. Além disso, organismos em ambientes poluídos normalmente estão expostos a mais de um fator de estresse em um momento, que pode interagir uns com os outros, possivelmente resultando em efeitos sinérgicos3. Portanto, testes de toxicidade concentrações seguro calculado com base na aguda, o único fator de estresse podem subestimar os riscos reais impostos por substâncias tóxicas em ambientes naturais. É, portanto, aconselhável também estudar os efeitos crônicos e várias gerações de concentrações subletais de substâncias tóxicas em um contexto ambientalmente relevante, como defendido pela Comissão Europeia4,5 e da EPA (Unidos Agência de proteção ambiental dos Estados)6,7. Especialmente na investigação de vertebrados, os custos em termos de tempo, dinheiro e mão de obra são elevados ao realizar estudos de exposição crônica e multigeracionais devido a expectativa de vida relativamente longa de vertebrados em comparação com organismos invertebrados modelo. Portanto, é aconselhável escolher o mais apropriado organismo modelo de peixe, dependendo a pergunta de pesquisa. Além disso, uma grande variedade de espécies de vertebrados deve estar disponível para testar a generalidade das respostas em toda espécie de ser capaz de se adaptar a regulamentação baseada nas espécies mais sensíveis. Por enquanto, há uma necessidade de desenvolver novos protocolos eficientes com espécies de vertebrados modelo caracterizados por ciclos de vida curtos para diminuir os custos da realização de exposições crônicas e várias gerações em vertebrados7,8.
O turquesa killies Nothobranchius furzeri é um modelo interessante de peixe para uso em tais experimentos de exposição a longo prazo por causa de seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida (tempo de geração de menos de 4 semanas9). Isto significa que os pontos de extremidade ecologicamente relevantes como tempo de maturação e de fecundidade podem ser estudados dentro de um curto espaço de tempo em comparação com outros modelos de peixe7. Além disso, estes peixes produzem ovos resistentes à seca, dormentes que permanecem viáveis por vários anos, quando armazenada em condições normais, eliminando assim a necessidade de uma cultura contínua9. Em estudos ecotoxicológicos, isto também implica que replicar peixe pode tudo ser incubado no mesmo momento, resultando em sincronia de tempo para todos os animais, mesmo entre lotes de ovos produzidos em momentos diferentes. Recomendamos utilizar o laboratório cepa GRZ para realizar experimentos de exposição. Esta cepa executa bem em condições de laboratório, é homozigota (exceto cromossomos sexuais) e o genoma é bem caracterizada10,11.
Em estudos ecotoxicológicos, é importante selecionar o apropriado intervalo de concentrações. Vários métodos complementares podem ser usados para este fim. O intervalo de concentração nominal pode basear-se a sensibilidade de uma espécies relacionadas, tais como Nothobranchius guentheri12. Alternativamente, a escala pode basear a sensibilidade de modelos padrão de peixes, como o peixe-zebra (Danio rerio)2 , que têm uma sensibilidade comparável à maioria das substâncias tóxicas (Philippe et al (em revisão)). Em combinação, com essas duas opções, uma gama de encontrar o experimento deve ser conduzida para selecionar o intervalo de concentração nominal. Para o teste agudo, pesquisadores devem procurar para tratamentos de concentração com 100% de mortalidade, mortalidade intermediária e 0% de mortalidade após 24 h de exposição para a toxicidade. Para o teste crônica, é aconselhável executar a gama de encontrar o experimento por duas semanas para verificar se a mortalidade larval na condição com as maiores concentrações de teste não exceda 10% durante este período de referência.
O protocolo pode servir como uma base para realizar a exposição aguda e crônica aos poluentes de origem hídrica em s. furzeri, examinando os efeitos potenciais de estressores tanto a nível individual e celular. Também pode ser usada para executar a pesquisa multi estressor para acomodar uma maior relevância ecológica, mistura de diferentes compostos tóxicos ou estudar efeitos interativos entre poluição e outros factores de stress naturais (por exemplo, predação) ou antropogênicas estressores (por exemplo, o aquecimento devido às alterações climáticas).
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética da Kortenberg.
1. incubação e manutenção geral de furzeri s.
- Preparar peixe médio (pH 7), a uma temperatura de 14 ° C e adicionar água purificada do tipo II, com adicionado sais padronizadas, com uma condutividade de 600 µS/cm (24 ° C).
- Selecione a linha de laboratório GRZ (Gona-Rhe-Zhou) que foram armazenados sob condições padronizadas13ovos. Selecione os ovos na fase DIII (ou seja, prontos para eclodir), reconhecíveis pela presença de olhos de ouro9 e suavemente transferi-los com um macio par de pinças para um tanque de 2L de plástico (não mais do que aproximadamente 30 ovos por tanque).
Nota: Para ter um número suficiente de organismos teste saudável, chocar ovos duas vezes tantas como o número de larvas de peixes necessários. - Adicionar 1 cm do meio de peixe a 12 ° C e deixe a temperatura da água gradualmente convergem para a temperatura ambiente (24 ° C)9. Peixe eclodirão dentro as primeiras 12 horas.
- Após 24h, alimentar os filhotes uma dose concentrada de recém nascidos Artemianauplii (para mais detalhes sobre a frequência e a quantidade de comida, consulte protocolo de criação de Polačik et al . 20169) e aumentar a profundidade de água de 5 cm por adicionando o meio do peixe.
- Após 36 h, alimentar os filhotes mais uma dose concentrada de recém nascidos de náuplios de Artemia e adicionar meio peixe para aumentar a profundidade de água de 10 cm.
- Incubar os recipientes de peixes sob condições de temperatura constante (por exemplo, em uma incubadora, a sala de clima ou o banho de água aquecida) sob um 14 h:10 h regime de luz: escuro.
- Antes do início do experimento, recipientes de peixe complexo (sem peixes) com a exposição composto por preenchê-los com a maior concentração de meio de exposição e deixá-lo durante a noite a fim de limitar a transferência de substâncias tóxicas para o recipiente no real experimento.
- 48 h após a eclosão, selecione larvas flutuantes saudáveis para começar o experimento exposição. Descartar a chamada barriga-controles deslizantes que não foram capazes de encher a sua bexiga natatória e, consequentemente, ter uma flutuabilidade prejudicada (continuamente afundar até o fundo).
2. a curto prazo protocolo de exposição
Nota: Pesquisadores devem apontar para pelo menos 20 repetições (20 peixes em frascos separados) por tratamento. Além de um tratamento completo controle, um controle solvente deve ser incluído se a solução estoque do composto é preparada usando um solvente. O controle do solvente deve conter a quantidade de solvente, igualando a concentração de solvente na maior concentração de exposição.
- Prepare os recipientes experimentais (frascos de vidro de 0,5 L) rotulá-los e preenchê-los com o meio de exposição adequado (diferentes concentrações tóxicas). Adicione o composto para obter a concentração correta.
- Transferi as larvas (para pós-incubação 48 h) individualmente para os recipientes (1 peixe por contêiner para monitorização individual).
Nota: Peixes são expostos individualmente para minimizar potenciais efeitos de confundimento de interação social como a competição por comida e agressão. No entanto, peixes podem interagir visualmente de acordo com padrões éticos para o uso de animais de laboratório. - Acompanhar esta exposição aguda para uma duração de até 2 semanas. Durante esse tempo, alimentar os peixes ad libitum com náuplios de Artemia , duas vezes por dia, 7 dias por semana.
- Atualize o meio todos os dias para manter a qualidade da água e para minimizar os efeitos potenciais de degradação de compostos. Monitorar as variáveis chave de água (níveis de oxigênio dissolvido devem exceder 80%, condutividade deve variar entre 600 e 700 µS/cm, pH entre 7,8 e 8,2 dureza (como CaCO3) entre 350 e 450 mg/L, que se encontra dentro do intervalo de condições ideais de criação para furzeri s. 9). Colher amostras de água antes e depois de atualizar o meio para determinar as concentrações de compostos reais.
- Pontos de extremidade
- Verifique o peixe para a mortalidade, stress (por exemplo, o comportamento aberrante: nadar de cabeça para baixo) ou doença diariamente (manhã, tarde). Consulte a publicação de Shedd et al (1999) 12 para obter detalhes sobre a observação da mortalidade, stress ou doença.
- Calcular LC50 valores baseados na mortalidade usando curvas dose-resposta (Ritz e Streibig, 2005) em pontos de tempo diferentes. Use a função de drm no pacote RDC em v3.2.3 R (R desenvolvimento Core Team, 2016) ou abordagens estatísticas semelhantes.
3. protocolo de exposição crônica
Nota: Visam um mínimo de 25 peixes/condição no início do experimento, para minimizar as chances de uma sexo-relação enviesada e para acomodar a mortalidade de fundo potencial devido a causas naturais (i. e. mortalidade relacionada à idade).
- Incubação (ver seção 1)
- Fase I (2 dias pós-incubação-16 dias pós-incubação)
- Seguir o protocolo, conforme descrito no ponto 2.1-2.4
- Como durante a segunda fase do experimento, o Médio irá degradar ao longo da semana (nenhum refresco, veja abaixo). Armazene a quantidade necessária de média para uma semana em grandes recipientes inertes para permitir semelhante degradação do composto.
- Fase II (16 dias pós-incubação-final)
- Preparar 2L experimental frascos de vidro por complexantes-los com o composto. Encha os frascos com o meio de exposição correta e adicionar um tubo de ar para ventilar o frasco. Casa peixe individualmente esses vidrinhos para o restante do experimento. Permita a interação visual acomodar padrões éticos.
- Atualize o meio uma vez por semana. Transfira o peixe com uma rede para um novo frasco contendo o mesmo meio de exposição. Colher amostras de água todos os dias durante uma semana para monitorar a degradação do composto em cada tratamento de concentração. Calcule uma curva de degradação para cada tratamento se múltiplos estressores são testados (por exemplo, toxicidade de um composto em regimes de temperatura diferente). Medir parâmetros abióticos (pH, temperatura, oxigênio % dissolvido, condutividade) três vezes por semana.
- Desde 2 dias pós-incubação (dph) até 23 dph, alimente os peixes duas vezes por dia, 7 dias por náuplios de Artemia ad libitum semana. De 24 dph - 37 dph, complemente a dieta de anúncio libitumArtemia com larvas de Chironomus picadas. De 38 dph em, alimente os peixes duas vezes por dia, 7 dias por semana ad libitum congelado Chironomus larvas.
- Pontos de extremidade
- Diariamente Verifique o peixe para mortalidade, stress ou doença12.
- Para determinar o crescimento, medir o tamanho do corpo em uma base semanal (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) através da transferência de peixe para um prato de petri preenchido com média de seu reservatório. Tirar fotos de tamanho calibrado de 4-5 do peixe de cima (em uma altura fixa) e analisá-los digitalmente usando um programa de medição espacial (por exemplo, ImageJ).
Nota: Para os peixes adultos, use um prato de petri maior para minimizar o estresse da manipulação, mantendo todos os peixes submergidos durante todo o processo de medição. - Para maturação masculina, inspecione visualmente o peixe diariamente para a coloração de dph 15 em diante. Verifique se as aletas para os primeiros sinais de coloração nupcial (característica sexual secundária). Usar o primeiro dia em que é visível como um proxy para o tempo de maturação masculino.
- Um par de peixe não-sexados com machos do grupo de tratamento mesmo ou machos não-experimentais, três vezes por semana de 30 dph em diante a fim de determinar o tempo de maturação de fêmeas (o dia que o primeiro ovo é depositado). Para tal, utilize o desova protocolo descrito no 3.4.5.
- Para a fecundidade, casal maduro fêmeas com machos maduros 3 vezes / semana de dph 30 em diante, dentro de seus tratamentos utilizando um esquema de cruzamento.
- Preparar um tanque de desova (1 L) para cada par, usando o meio de exposição do aquário masculino suplementado com substrato de desova (areia fina < 500 µm).
- Transferir o macho e a fêmea para o tanque de desova e permitir que eles desovam durante duas horas. Minimize a actividade humana ou perturbação ao redor dos recipientes desova durante este processo.
- Depois, gentilmente transferi peixes volta para seus recipientes originais de habitação, sem mistura desnecessária de água, que seria giro os ovos no substrato desova.
- Filtre os ovos por derramando o substrato de desova sobre uma 500 µm malha. Conte com o ovo e transferi-los (usando uma pinça macia) de musgo de turfa úmido em placas de Petri9,14.
- Remova ovos mortos diariamente. Depois de uma semana, o selo o Petri prato com filme de selagem e armazená-lo em uma temperatura controlada incubadora a 28 ° C e um 14:10 h luz: escuro ciclo de desenvolvimento imediato à fase DIII (ou seja, prontos para eclodir após cerca de três semanas). Para armazenamento a longo prazo, armazene os ovos a 17 ° C na escuridão constante, sobre os quais ovos entram a fase dormente e permanecem viáveis por vários anos. Quando peixes provenientes desses ovos dormentes para experimentos de recrutamento, transferi os ovos dormentes para condições de 28 ° C com 14:10 h luz: escuro ciclo por aproximadamente três semanas permitir o desenvolvimento da fase de DIII.
- Medir o máximo térmico crítico (CTmax) (uma medida de desempenho15) de peixes adultos.
- Usar um banho de água aquecida a uma taxa constante de 0,33 ° C/min e em que a água é circulada continuamente. Adicione vários aquários de 1 L para cada peixe individual.
Nota: Dadas as restrições de espaço no banho de água, é necessário trabalhar em várias séries. Diferenças de potencial em condições entre séries devem ter em conta quando a realização de análises estatísticas, incluindo a 'série', como um fator aleatório. - Inicie o julgamento, adicionando os peixes no aquário quando a água do aquário tiver atingido a temperatura de criação experimental do peixe (geralmente de 28 ° C). Monitore a temperatura nas aquários de 1L do banho CTmax cada 5min com um termómetro digital (escala de 0.1 ° C).
- Termine o julgamento, quando o peixe não consegue manter uma posição dorso-ventralmente vertical ou começa a contorcer-se fortemente16,17. Medir a temperatura do aquário de 1 L, que é a temperatura crítica máxima. O peixe de volta para seu alojamento experimental para recuperação de transferência.
- Usar um banho de água aquecida a uma taxa constante de 0,33 ° C/min e em que a água é circulada continuamente. Adicione vários aquários de 1 L para cada peixe individual.
- Medir o peso (precisão de 0,1 mg) do peixe no último dia do experimento acariciando-seco e transferindo-o em um barco de pesagem. Nota: Todos os peixes devem ser mensurados a quatro horas após a última alimentação para padronizar o peso do alimento no trato intestinal.
- Eutanásia o peixe usando 0.1% tricaina.
4. protocolo de exposição transgeracional
Nota: Para medir transgeracional efeitos dos poluentes sobre s. furzeri, segui o protocolo de exposição crônica descrito acima para a primeira geração.
- Duas vezes por semana, verificar o desenvolvimento dos ovos produzidos (ou seja, a segunda geração) armazenado a 28 ° C 14:10 condições de ciclo de luz: escuro h inspecionando os pratos de petri para embriões na fase de DIII (ver Polačik et al 2016.9). Quando mais de 50 repetições de cada tratamento parental estão totalmente desenvolvidas, chocar seguindo o protocolo em 1.1.
- Expor um peixe saudável, flutuante para exatamente a mesma configuração e tratamento como o peixe parental.
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Representative Results
Os resultados da exposição aguda do furzeri s. para diferentes concentrações de cobre, calculado como em 2.5.2, mostrar relações cleardose-resposta (Figura 1). Há um aumento da mortalidade, com o aumento da concentração tóxica. Valores de LC50 diminuem ao longo do tempo, significando que, com a diminuição de concentrações, mais o tempo passa antes 50% do Replica morrer. Para resultados detalhados sobre a exposição aguda e crônica dos s. furzeri ao cobre, bem como a comparação da sensibilidade da espécie em comparação com outras espécies, nos referimos a Philippe et al . 20177.
A exposição crônica experimental, fecundidade e tamanho do corpo são sensíveis, pontos de extremidade. Pode haver variação extensiva no crescimento dos peixes, dependendo da temperatura de18. Tamanhos adultos entre 30 e 50 milímetros são considerados normais neste set-up. A configuração permitir encontrar diferenças entre os tratamentos (Figura 2A). Em um ensaio de exposição crônica usando cobre fluvial, houve um efeito significativo de exposição cobre durante três semanas (χ ²5,34 = 40,7, P < 0,001), com s. furzeri expostos a 19.38 µ g/L Cu sendo menor do que todos os outros peixes (todos os P < 0,001) (Figura 2B). Para a fecundidade, valores de controle devem variar entre cerca de 50 ovos por semana por fêmea no pico de produção de ovos7. Em outro experimento, usando Clorpirifós fluvial e um aumento de temperatura de 2 ° C, verificou-se uma interação significativa entre a exposição de ascensão e Clorpirifós temperatura na fecundidade (χ22.202 = 25,3, P < 0,001). A 28 ° C, peixes expostos a 4 µ g/L produziram menos ovos comparados com peixes expostos a 2 µ g/L e a controle de peixes (ambos P < 0,001) (Figura 2B). A 30 ° C, controle de peixe produzido mais ovos em comparação com todos os peixes de Clorpirifós expostos (ambos P < 0,007). O principal efeito da exposição ao clorpirifos (χ22.202 = 96,8, P < 0,001) e o principal efeito da temperatura (χ21.202 = 10.18, P < 0,001) reduziu significativamente a fecundidade. A medição é bastante demorada devido a manipulação do peixe e o chapeamento dos ovos na turfa9, mas muitas vezes é o ponto de extremidade mais sensível.
Tempo de maturação mais frequentemente é afetado por poluentes nos machos. Tempo de maturação masculino foi significativamente afectado pela exposição crônica ao clorpirifos fluvial (χ22,41 = 11.79, P = 0,003), com machos expostos a 4 µ g/L CPF (C2) tendo uma maturação mais lenta de 18% em relação ao controle de machos (Figura 3A ). Esta resposta deve, no entanto, ser interpretados com precaução, uma vez que o tempo de maturação é marcado, indiretamente, determinando o aparecimento da coloração nupcial como um proxy. Embora os machos sejam considerados para amadurecer-se alguns dias após o aparecimento da coloração9, pode haver algum erro sobre o calendário exacto de maturação usando esta medida.
Perto o máximo térmico, peixes exibem natação errática, maior movimento odontódios e perda da capacidade de permanecer em uma posição ereta dorso-ventralmente 16,17. CTmax valores diferem entre as cepas de s. furzeri . Populações naturais têm CTmax valores entre 39 ° C e 42 ° C, quando criados em temperaturas entre 24 e 28 ° C (Figura 3B). A estirpe GRZ pura, no entanto, já atinge seu máximo térmico em torno de 37-38 ° C, mesmo quando criados a 28 ° C. Considerando que este procedimento não é letal para os peixes, raros casos de mortalidade ocorrem. Tais peixes são excluídos melhor a análise CTmax, como eles provavelmente representam peixes que estejam em condições de total relativamente pobre.
Resultados anteriores principalmente mostrou que CTmax pode ser afetado do poluente em questão, neste caso, 3,4-DCA (χ22,71= 17,65, P < 0,001) com peixes expostos a 0,1 mg/L 3,4-DCA 0,32 ° C inferior máxima térmica comparado a controle de peixes (P < 0,001). Além disso, CTmax foi afetado pela temperatura criação (χ21,71= 322.0, P < 0,001) e peixes que foram criados a 28 ° C tinham um 1,3 ° C CTmax mais elevado comparado a pescar que foram criados a 24 ° C.
Figura 1: curva Dose-resposta para exposição cobre. Das curvas dose-resposta apresentando mortalidade cumulativo do Nothobranchius furzeri em função da concentração de cobre da exposição (em µ g/L de Cu e em relação ao tempo de exposição). Pontos indicam valores de LC50 . Esta figura foi modificada de Philippe et al . 20172. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: efeitos sobre o tamanho e fecundidade como pontos de extremidade. A) tamanho (em cm) do Nothobranchius furzeri expostos a diferentes concentrações de cobre na semana 3, 7, 11 e 15. Asterisco indica que o peixe C5 é menores após três semanas a nível de significância de P < 0,05. Valores são apresentados como média ± SEM. Sample tamanhos são n = 6; 6. o; 7; 7; 7; 7 semanas em 3, n = 6; 6. o; 7; 7; 4 semana em 7, n = 5; 4; 5. o; 5. o; 3 na semana de 11 e n = 5; 3; 3; 5. o; 2 na semana 15. B) fecundidade através do tempo de peixes expostos a diferentes concentrações de Clorpirifós, cruzada com dois tratamentos de temperatura, medida pelo número de ovos por semana. Para melhorar a legibilidade e interpretabilidade da figura, barras de erro não são mostradas nos gráficos. O número de fêmeas em cada tratamento no início e no final do período de postura de ovos é indicado usar a letra ' n '. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeitos sobre o tempo de maturação e CTmax. A) média de idade (em dias) na qual os primeiros sinais de coloração apareceram em machos de Nothobranchius furzeri expostos a concentrações diferentes de Clorpirifós (0 µ g/L (C0), 2 µ g/L (C1) e CPF (C2) de 4 µ g/L) e duas temperaturas (28 ° C e 30 ° C). B) médio máximo térmico crítico (CTmax) de peixes expostos a diferentes concentrações de 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0) 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) e 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) e duas temperaturas (24 ° C e 28 ° C). Concentrações nominais são apresentadas como média ± SE. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve um bioensaio novo usando Nothobranchius furzeri, um organismo modelo emergente, para estudar o indivíduo e combinados a longo prazo efeitos de substâncias tóxicas e outros estressores. Os protocolos apresentados foram aplicados com êxito para medir a sensibilidade da espécie para uma matriz de substâncias tóxicas (cobre, cádmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifós). Devido ao seu ciclo de vida rápido, este modelo de vertebrados permite a avaliação da subletais e transgeracional efeitos no prazo de quatro meses. Outra grande vantagem de usar esta espécie de peixe como um modelo para a seleção de toxicidade é o fato de que produz ovos resistentes à seca. Isto permite que os pesquisadores armazenar ovos ou obtê-las de um fornecedor e elimina a necessidade de uma cultura no local cara e demorada. Além disso, os embriões podem ser armazenados durante vários anos até que os filhotes são necessários12.
Depois de estudar a sensibilidade do s. furzeri para um número de substâncias tóxicas de referência, podemos acrescentar que a sensibilidade da espécie está no intervalo com, ou modelo maior, de outras espécies, dependendo do composto testado. Medir os efeitos sobre a fecundidade, em particular, pode aumentar a comparabilidade da sensibilidade sobre as espécies estudadas, como é um ponto de extremidade rotineiramente medido em outras espécies de modelo. Finalmente, na medida em que múltiplos estressores exercem efeitos adversos, quando administrado individualmente ou combinados, depende o ponto de extremidade avaliado e a concentração de exposição.
Existem ainda algumas limitações quando se trabalha com s. furzeri. Uma das limitações mais importantes é a padronização dos alimentos. Lotes de cistos de Artemia ou bloodworms podem diferir em qualidade e podem, como tal, os resultados do estudo de impacto. Portanto, é aconselhável pedir uma grande quantidade de alimentos para usar durante todo o comprimento do experimento.
Acreditamos que este protocolo é amplamente aplicável para rastreio ecotoxicológicos. S. furzeri está desenvolvendo rapidamente em uma espécie de teste padrão em ecotoxicologia. A disponibilidade do presente protocolo padrão pode abastecer seu estabelecimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Estamos gratos ao grupo esfera do UAntwerpen e o departamento de proteção de cultivos da UGT para análise de amostras de água. Suporte durante esse projeto foi fornecido pelo centro de excelência ' Eco e dinâmica sócio-evolutiva (PF/10/007) do fundo de investigação KU Leuven. AFG (11Q0516N) e ESJT (FWO-SB151323) foram financiados como doutorado e TP (12F0716N) como companheiro de pós-doutorado pela FWO Flandres (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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