Summary
I detta arbete beskriver vi en akut, kronisk och multigenerational bioassay för att studera effekterna av enkel- och kombinerade stressfaktorer på den turkosa killifish Nothobranchius furzeri. Detta protokoll syftar till att studera livshistoria egenskaper (dödlighet, tillväxt, fruktsamhet, vikt) och kritiska termisk maximalt.
Abstract
De äggläggande tandkarpar Nothobranchius furzeri är en framväxande modellorganism inom ekotoxikologi och dess tillämplighet i akuta och kroniska ekotoxikologiska försök har påvisats. Sammantaget är känsligheten hos arterna som giftiga föreningar i intervallet med, eller högre än, för andra modell arter.
Detta arbete beskriver protokoll för akut, kronisk och multigenerational bioassays av enkel- och kombinerade stressfaktor effekter på N. furzeri. På grund av dess korta mognad tid och livscykel tillåter denna ryggradsdjur modell studiet av slutpunkter som mognad tid och fruktsamhet inom fyra månader. Transgenerationell hela livscykeln exponering prövningar kan utföras i så lite som 8 månader. Eftersom denna art producerar ägg som är torktåliga och förbli lönsamt år, hotellets kulturen av arten behövs inte men individer kan rekryteras när det behövs. Protokollen är avsedda att mäta livshistoria drag (dödlighet, tillväxt, fruktsamhet, vikt) och kritiska termisk maximalt.
Introduction
Känslighet profiler för en rad arter till strategiskt utvalda gifter har varit beskrivs1 för bestämmelserna om EU: S REACH (registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier). Akut eller kortsiktiga toxicitetstester användes främst för detta ändamål som de ger en snabb indikation på en artens känslighet. Men i deras naturliga miljö, organismer utsätts under mycket längre tidsperioder och hela livscykel eller även flera generationer kan vara drabbade2. Dessutom utsätts vanligtvis organismer i förorenade miljöer för mer än en stressfaktor i en tid, som kan interagera med varandra, eventuellt resulterar i synergistiska effekter3. Säkra koncentrationer beräknade utifrån akut, enda stressfaktor toxicitetstester kan därför underskatta de faktiska riskerna som införts av gifter i naturliga miljöer. Det är därför tillrådligt att även studera de kroniska och multigenerational effekterna av subletala koncentrationer av gifter i ett miljömässigt relevanta sammanhang som förespråkas av Europeiska kommissionen4,5 och den amerikanska MILJÖVÅRDSMYNDIGHETEN (United States Environmental Protection Agency)6,7. Speciellt i ryggradsdjur forskning är kostnaderna för arbetskraft, pengar och tid hög när du utför kroniska och multigenerational exponeringsstudier på grund av den relativt långa livslängden hos ryggradsdjur jämfört ryggradslösa modellorganismer. Därför är det lämpligt att välja den lämpligaste fisk modell organismen, beroende på forskningsfrågan. Dessutom bör ett brett utbud av ryggradsdjur vara tillgänglig för att testa allmängiltigheten i svaren mellan arter kunna anpassa regler baserat på de mest känsliga arterna. För nu finns det ett behov av att utveckla nya, effektiva protokoll med ryggradsdjur modell arter kännetecknas av kort livscykel att sänka kostnaderna för att utföra kroniska och multigenerational exponeringar på ryggradsdjur7,8.
Den turkosa killifish Nothobranchius furzeri är en intressant fisk modell att använda i sådana långsiktiga exponering experiment på grund av dess korta mognad tid och livscykel (generationstid mindre än 4 veckor9). Detta innebär att ekologiskt relevanta endpoints som mognad tid och fruktsamhet kan studeras inom en kort tid jämfört med andra fisk modeller7. Dessutom producerar dessa fiskar torktåliga, vilande ägg som förblir lönsamt i flera år om den förvaras under normala förhållanden, vilket eliminerar behovet av en kontinuerlig kultur9. Ekotoxikologiska studier innebär detta också att replikera fisk kan alla kläckas i exakt samma ögonblick, vilket resulterar i tid synchrony för alla djur, även bland partier av ägg som produceras vid olika tidpunkter. Vi rekommenderar att använda laboratoriet GRZ stam för att utföra exponering experiment. Denna stam utför väl under laboratorieförhållanden, är homozygot (förutom könskromosomer) och genomet är väl karakteriserade10,11.
I ekotoxikologiska studier är det viktigt att markera lämpliga testkoncentrationer. Flera kompletterande metoder kan användas för detta ändamål. Den nominella koncentrationen utbud kan baseras på känsligheten hos en närstående arter, såsom Nothobranchius guentheri12. Alternativt, spänna kan baseras på standard fisk modeller, såsom zebrafisk (Danio rerio)2 som har en jämförbar känslighet för de flesta gifter (Philippe et al. känslighet (i review)). I kombination, med båda alternativen, bör en rangefinding experiment utföras för att markera det nominella koncentrationen. För akut testning, bör forskare sträva efter koncentration behandlingar med 100% dödlighet, mellanliggande och 0% mortalitet efter 24 h exponering för den för människor. För kronisk testning, är det tillrådligt att köra den rangefinding experiment i två veckor för att kontrollera om Pseudocoremia dödlighet i tillståndet med de högsta testkoncentrationerna inte överstiger 10% under denna referensperiod.
Protokollet kan fungera som en baslinje att utföra akut och kronisk exponering för vattenburna föroreningar på N. furzeri, att undersöka potentiella effekter av stressfaktorer både på individuell och cellulär nivå. Det kan också användas för att utföra flera stressfaktor forskning för att rymma en högre ekologisk relevans, blanda olika giftiga föreningar eller studerar interaktiva effekter mellan föroreningar och andra naturliga stressfaktorer (e.g. predation) eller antropogena stressfaktorer (t.ex. uppvärmning på grund av klimatförändringen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den etiska kommittén av KU Leuven.
1. kläckägg och allmänt underhåll av N. furzeri
- Förbereda fisk medium (pH 7) vid en temperatur på 14 ° C och Lägg till renat typ II vatten, med tillsats standardiserade salter, i en ledningsförmåga på 600 µS/cm (24 ° C).
- Välj ägg från raden GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratorium som har lagrats under standardiserade förhållanden13. Välj ägg i DIII scenen (dvs redo att kläckas), igenkännliga av närvaron av gyllene ögon9 och försiktigt överföra dem med en mjuk pincett till en plast 2 L tank (inte mer än ca 30 ägg per tank).
Obs: För att få ett tillräckligt antal friska testorganismer, kläcka dubbelt så många ägg som antalet nödvändiga fisk larver. - Lägg till 1 cm fisk mediets vid 12 ° C och låt vattentemperaturen gradvis konvergerar till rumstemperatur (24 ° C)9. Fisk kommer kläcks inom de första 12 h.
- Efter 24 h, mata ungarna en koncentrerad dos av nyligen kläckta Artemianauplii (för mer i detalj på frekvens och mängd mat, se protokollet avel av Polačik et al. 20169) och ökar vattendjupet till 5 cm av lägga till fisk medium.
- Efter 36 h, mata ungarna en annan koncentrerad dos av nymalen kläckt Artemia följande och Lägg till fisk medium för att öka vattendjupet till 10 cm.
- Inkubera fisk behållare (t.ex. i en inkubator, klimat rummet eller uppvärmda vattenbad) villkor som konstant temperatur under en 14 h:10 h ljus: mörk regim.
- Innan start av försöket, komplexa fisk behållare (utan fisk) med exponering förening genom att fylla dem med den högsta koncentrationen av exponering medium och lämnar det över natten för att begränsa överföringen av gifter till behållaren i den faktiska experimentera.
- 48 h efter kläckningen, Välj friska buoyant larver att starta exponering experimentet. Ignorera så kallade mage-reglagen som inte kunde fylla sin simblåsa och därmed har en nedsatt bärighet (kontinuerligt sjunka till botten).
2. kortsiktig exponering protokoll
Obs: Forskare bör sikta på minst 20 replikat (20 fisk i separata burkar) per behandling. Förutom en full kontroll behandling, internkontrollbör ett lösningsmedel ingå om stamlösning av föreningen bereds med ett lösningsmedel. Kontrollen lösningsmedel bör innehålla mängden lösningsmedel för koncentrationen av lösningsmedel i högsta exponeringen.
- Förbereda de experimentella behållarna (0,5 L glasburkar) genom att märka dem och fylla dem med lämplig exponering medium (olika toxiska koncentrationer). Lägg till föreningen för att få den rätta koncentrationen.
- Överföra larver (48 h efter kläckning) individuellt till behållare (1 fisk per behållare för dosövervakning).
Obs: Fiskar utsätts individuellt för att minimera potentiella störande effekter av social interaktion som konkurrens för mat och aggression. Fisk är dock tillåtet att visuellt interagera i enlighet med etiska normer för laboratoriebruk djur. - Följa upp denna akut exponering för en varaktighet på upp till 2 veckor. Under den tiden mata fiskarna ad libitum med Artemia följande två gånger per dag, 7 dagar i veckan.
- Uppdatera medium varannan dag att bibehålla vattenkvaliteten och att minimera potentiella effekter av sammansatta nedbrytning. Övervaka viktiga vatten variabler (upplöst syrgas nivåer ska överstiga 80%, ledningsförmåga bör ligga mellan 600 och 700 µS/cm, pH mellan 7,8 och 8,2 och hårdhet (som CaCO3) mellan 350 och 450 mg/L, som ligger inom spänna av uppfödning optimala för N. furzeri 9). Ta vattenprover före och efter uppfriskande mediet för att fastställa faktiska sammansatta koncentrationer.
- Slutpunkter
- Kontrollera fisk för dödlighet, stress (t.ex. avvikande beteende: simmar uppochned) eller sjukdom dagligen (morgon, kväll). Konsultera offentliggörandet av Shedd o.a. (1999) 12 för detaljer på observation av dödlighet, stress eller sjukdom.
- Beräkna LC50 värden baserat på dödlighet med dos-responskurvor (Ritz och Streibig, 2005) vid olika tidpunkter. Använd funktionen drm i demokratiska republiken Kongo paketet i R v3.2.3 (R Core Team, utveckling, 2016) eller liknande statistiska metoder.
3. kronisk exponering protokoll
Obs: Sikta på minst 25 fisk/skick i början av experimentet, att minimera chanserna för en skev kön-förhållande och för att tillgodose potentiella bakgrund dödlighet på grund av naturliga orsaker (dvs. åldersrelaterade dödlighet).
- Kläckning (se avsnitt 1)
- Fas I (2 dagar efter kläckningen-16 dagar efter kläckning)
- Följ protokoll som beskrivs i 2.1-2.4
- Som under den andra fasen av experimentet, kommer att mediet försämra hela veckan (ingen förfriskning, se nedan). Förvara den erforderliga mängden av medium för en vecka i stora inert behållare för att tillåta liknande nedbrytning av föreningen.
- Fas II (16 dagar efter kläckningen-slut)
- Förbered 2 L experimentella glasburkar av komplexbildande dem med föreningen. Fyll burkarna med rätt exponering medium och lägga till en luftslang för att lufta burken. Hus fisk individuellt i dessa burkar för återstoden av experimentet. Tillåta visuell interaktion att rymma etiska normer.
- Uppdatera medlet en gång per vecka. Överföra fisken med ett netto till en ny burk som innehåller samma exponering medium. Ta vattenprover varje dag under hela veckan för att övervaka nedbrytningen av sammansatta i varje koncentration behandling. Beräkna en nedbrytning kurva för varje behandling om flera stressfaktorer är testade (t.ex. toxicitet av en förening i olika temperatur regimer). Mäta abiotiska parametrar (pH, temperatur, % upplöst syre, konduktivitet) tre gånger per vecka.
- Från 2 dagar efter kläckning (dph) till 23 dph, mata fiskarna två gånger per dag, 7 dagar i veckan ad libitum Artemia följande. Från 24 dph - 37 dph, komplettera ad libitumArtemia kosten med hackad Chironomus larver. Från 38 dph på, mata fiskarna två gånger per dag, 7 dagar i veckan ad libitum fryst Chironomus larver.
- Slutpunkter
- Dagligen kontrollera fisk för dödlighet, stress eller sjukdom12.
- Att avgöra tillväxt, mäta Förkroppsliga storleksanpassar på veckobasis (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) genom att överföra fisk till en petriskål fylld med medium från sin reservoar. Ta 4-5 storlek kalibrerad bilder av fisk från ovan (på en fast höjd) och analysera dem digitalt med en rumslig mätprogram (e.g. ImageJ).
Obs: För vuxna fiskar, Använd en högre petriskål för att minimera hantering stress genom att hålla all fisk under vattennivån under hela mäta processen. - För manlig mognad, okulärbesiktiga fisk dagligen för färgning från 15 dph och framåt. Kontrollera att fenorna för första tecknen på bröllops färgning (sekundära sexuella egenskaper). Använd den första dagen som detta syns som en proxy för manlig mognad tid.
- Par icke-könsbestämmas fisk med män i behandlingsgruppen samma eller icke-experimentella hanar tre gånger per vecka från 30 dph och framåt för att bestämma kvinnliga mognad tid (den dag det första ägget deponeras). Till detta Använd protokollet lekbeståndets beskrivs i 3.4.5.
- För fruktsamhet, par mogna honor med mogna män 3 gånger / vecka från 30 dph och framåt, inom deras behandlingar med ett passage system.
- Förbereda en lekande tank (1 L) för varje par, med exponering medium från akvariet manliga kompletteras med lek substrat (fina sand < 500 µm).
- Överför både hanen och honan till lekbeståndets tanken och låta dem leka i två timmar. Minimera mänsklig aktivitet eller störning runt lekbeståndets behållarna under denna process.
- Därefter, försiktigt överföra fisk tillbaka till deras ursprungliga bostäder behållare, utan onödiga blandning av bevattna, som skulle virvla upp ägg i lekbeståndets substratet.
- Filtrera äggen ut genom att hälla lekbeståndets substratet över en 500 µm mesh. Räkna äggen och överföra dem (med mjuk pincett) till fuktig torv i petriskålar9,14.
- Ta bort döda ägg dagligen. Efter en vecka, tätning Petri skålen med tätande film och lagra den i en temperatur kontrollerade inkubator vid 28 ° C och en 14:10 cykel h ljus: mörk för omedelbar utveckling till DIII fas (dvs redo att kläckas efter ca tre veckor). För långsiktig lagring, förvara äggen vid 17 ° C i konstant mörker som ägg in i vilande fas och förbli lönsamt i flera år. När rekrytera fisk från dessa vilande ägg för experiment, överföra vilande äggen till 28 ° C förhållanden med 14:10 h cykel ljus: mörk i cirka tre veckor för att tillåta utveckling till fasen DIII.
- Mäta kritiska termisk maximum (CTmax) (ett mått för prestanda15) av vuxen fisk.
- Använd ett vattenbad som värms med en konstant hastighet på 0,33 ° C/min och där vattnet cirkuleras kontinuerligt. Lägga till flera 1 L akvarier för varje individuella fiskar.
Obs: Tanke utrymmesbegränsningar i vattenbad, är det nödvändigt att arbeta i flera serier. Potentiella skillnader i villkor bland serien bör beaktas när utföra statistisk analys av inklusive 'serien' en slumpmässiga faktor. - Starta rättegång genom att lägga fisken till akvariet när vattnet i akvariet har nått den experimentella uppfödning temperaturen av fisken (allmänt 28 ° C). Övervakning av temperatur i de 1 L akvarier av CTmax badet varje 5-min med en digital termometer (0,1 ° C skala).
- Avslutas rättegången när fisken misslyckas med att upprätthålla en dorso-ventralt upprätt position eller startar ryckningar tungt16,17. Mät temperaturen i 1 L akvarium, som är den kritiska maximal temperaturen. Överföra fisken tillbaka till dess experimentella bostäder för återhämtning.
- Använd ett vattenbad som värms med en konstant hastighet på 0,33 ° C/min och där vattnet cirkuleras kontinuerligt. Lägga till flera 1 L akvarier för varje individuella fiskar.
- Mät vikt (0,1 mg noggrannhet) fisken den sista dagen av experimentet genom att klappa den torr och överföra det på en vägning båt. Obs: All fisk bör mätas fyra timmar efter den sista utfodring för att standardisera mat vikt i tarmkanalen.
- Avliva fisken med hjälp av 0,1% Tricaine.
4. transgenerationell exponering protokoll
Obs: För att mäta transgenerationell effekterna av föroreningar på N. furzeri, följ protokollet kronisk exponering som beskrivs ovan för den första generationen.
- Två gånger i veckan, kontrollera utvecklingen av producerade ägg (dvs. andra generationen) lagras vid 28 ° C 14:10 h ljus: mörk cykel villkor genom att inspektera petri rätter för embryon i DIII fas (se Polačik m.fl. 20169). När mer än 50 replikat för varje föräldrarnas behandling är fullt utvecklade, kläck dem efter protokollet i 1.1.
- Utsätta friska, flytande fisk till exakt samma set-up och behandling som föräldrarnas fisken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av N. furzeri akut exponering för olika koncentrationer av koppar, beräknad enligt 2.5.2, Visa cleardose-responssamband (figur 1). Det finns en ökning av dödligheten med ökande toxiska koncentration. LC50 värden minska över tiden, vilket innebär att mer tid med minskande koncentrationer, passerar innan 50% i replikat die. För detaljerade resultat på akut och kronisk exponering av N. furzeri till koppar, samt jämförelse av artens känslighet jämfört med andra arter, hänvisar vi till Philippe et al. 20177.
I den kroniska exponeringen rättegång är kroppsstorlek och fruktsamhet känsliga slutpunkter. Det kan finnas omfattande variationer i tillväxten av fisken, beroende på temperatur18. Vuxen storlekar mellan 30 och 50 anses mm normalt i denna uppsättning. Set-up tillåta att hitta skillnader mellan behandlingar (figur 2A). I en kronisk exponering-analys med hjälp av vattenburna koppar, det fanns en signifikant effekt av koppar exponering under vecka tre (χ²5,34 = 40,7, P < 0.001), med N. furzeri utsätts för 19.38 µg/L Cu är mindre än alla andra fiskar (alla P < 0,001) (figur 2B). För fruktsamhet, bör kontrollvärden varierar mellan cirka 50 ägg per vecka per hona på toppen av ägget produktion7. I ett annat experiment, med hjälp av vattenburna klorpyrifos och en 2 ° C temperaturstegring, fann vi en signifikant interaktion mellan temperatur uppgång och klorpyrifos exponering på fruktsamhet (χ22 202 = 25,3, P < 0,001). Vid 28 ° C, fisk utsätts för 4 µg/L producerade mindre ägg jämfört med fisk utsätts för 2 µg/L och kontroll fisk (båda P < 0,001) (figur 2B). Vid 30 ° C, kontroll fisk produceras fler ägg jämfört med alla klorpyrifos utsatt fisk (båda P < 0,007). Både den huvudsakliga effekten av exponering för klorpyrifos (χ22 202 = 96,8, P < 0,001) och den huvudsakliga effekten av temperatur (χ21 202 = 10.18, P < 0,001) signifikant minskad fruktsamhet. Mätningen är ganska tidskrävande på grund av hantering av fisken och plätering av ägg på torv9, men det är ofta den mest känsliga slutpunkten.
Mognad tid påverkas ofta av föroreningar i hanar. Manlig mognad tid påverkades betydligt av kronisk exponering för vattenburna klorpyrifos (χ22,41 = 11,79, P = 0,003), med män som utsätts för 4 µg/L CPF (C2) har en 18% långsammare mognad jämfört med kontroll män (figur 3A ). Detta svar bör dock, tolkas med försiktighet eftersom mognad tid görs indirekt genom att bestämma uppkomsten av bröllops färgning som en proxy. Även män anses mogna några dagar efter utseendemässigt av färgning9, kan det finnas några fel på den exakta tidpunkten för mognad använder sig av måttet.
Nära de termiska maximala uppvisar fisk oberäkneligt simning, ökad opercular rörelse och förlust av förmåga att förbli i en dorso-ventralt upprätt position 16,17. CTmax värden skiljer sig mellan N. furzeri stammar. Naturliga populationer har CTmax värden mellan 39 ° C och 42 ° C när uppfödda i temperaturer mellan 24 och 28 ° C (figur 3B). Inavlade GRZ stam, men når redan dess termiska maximum på runt 37-38 ° C, även när uppfödda vid 28 ° C. Proceduren är inte dödliga för fisken, sällsynta fall av dödlighet förekommer. Sådan fisk är bäst undantagna från den CTmax analysen, eftersom de troligen utgör fisk som är relativt dåliga allmäntillstånd.
Tidigare resultat mestadels visade att CTmax kan påverkas av det förorenande ämnet, i detta fall, 3,4-DCA (χ22,71= 17,65, P < 0,001) med fisk utsätts för 0,1 mg/L 3,4-DCA med ett 0.32 ° C lägre termisk högst jämfört med kontroll fisk (P < 0,001). Dessutom CTmax påverkades av den stegrande temperaturen (χ21,71= 322,0, P < 0,001) och fisk som har fötts upp vid 28 ° C hade en 1,3 ° C högre CTmax jämfört med fisk som har fötts upp vid 24 ° C.
Figur 1: dos-responskurva för koppar exponering. Dos-respons kurvor visar kumulativ mortalitet av Nothobranchius furzeri i koppar exponering koncentration (µg/L Cu och i förhållande till exponeringstid)-funktion. Prickarna visar LC50 värden. Denna siffra har ändrats från Philippe et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekter på storlek och fruktsamhet som slutpunkter. (A) storlek (i cm) av Nothobranchius furzeri utsätts för olika koncentrationer av koppar vid vecka 3, 7, 11 och 15. Asterisken anger att C5 fisk är mindre efter tre veckor på signifikansnivån p < 0,05. Värden presenteras som menar ± SEM. prov storlekar är n = 6; 6. 7. 7. 7. 7 i vecka 3, n = 6; 6. 7. 7. 4 i vecka 7, n = 5; 4. 5. 5. 3 i vecka 11 och n = 5; 3. 3. 5. 2 i vecka 15. B) fruktsamhet genom tiden av fisk utsätts för olika koncentrationer av klorpyrifos, korsade med två temperatur behandlingar, mätt som antalet ägg per vecka. För att förbättra läsbarhet och tolkningsbarhet av figuren, visas felstaplar inte på grafer. Antalet kvinnor i varje behandling i början och slutet av den period för äggläggning anges med bokstaven 'n'. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekter på mognad tid och CTmax. (A) genomsnittlig ålder (i dagar) där de första tecknen på färgning fanns hos hanar av Nothobranchius furzeri utsätts för olika klorpyrifos koncentrationer (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) och 4 µg/L CPF (C2)) och två temperaturer (28 ° C och 30 ° C). B) genomsnittliga kritiska termisk maximalt (CTmax) fisk utsätts för olika koncentrationer av 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0), 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) och 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) och två temperaturer (24 ° C och 28 ° C). Nominella koncentrationer presenteras som medelvärde ± SE. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver en ny bioassay använder Nothobranchius furzeri, en framväxande modellorganism, för att studera enskilda och kombinerade långsiktiga effekter av gifter och andra stressfaktorer. De presenterade protokoll har tillämpats för att mäta känsligheten av arter till en matris av gifter (koppar, kadmium, 3,4-dikloranilin och klorpyrifos). På grund av dess snabba livscykel, denna ryggradsdjur modell tillåter bedömning av subletala och transgenerationell effekter inom fyra månader. En annan stor fördel med att använda denna fiskarter som modell för toxicitet screening är det faktum att den producerar torktåliga ägg. Detta gör det möjligt för forskare att lagra ägg eller få dem från en leverantör och eliminerar behovet av en kostsam och tidskrävande Hotellets kultur. Embryon kan dessutom lagras i flera år tills ungarna är behövs12.
Efter att ha studerat känsligheten hos N. furzeri till ett antal referens gifter, kan vi lägga att känsligheten hos arten är i intervallet med, eller högre än, andra modell arter beroende på den testa föreningen. Mäta effekter på fruktsamhet, i synnerhet kan öka jämförbarheten av känsligheten på de studera arterna, eftersom det är en rutinmässigt mätt slutpunkt i andra modell arter. Slutligen, i vilken utsträckning som flera stressfaktorer utöva negativa effekter, när administreras individuellt eller i kombination, är beroende av utvärderade slutpunkten och exponeringskoncentrationen.
Det finns fortfarande vissa begränsningar när du arbetar med N. furzeri. En av de viktigaste begränsningarna är standardiseringen av mat. Partier av Artemia cystor eller mygglarver kan variera i kvalitet och som sådan, kan påverka resultatet av studien. Det är därför lämpligt att beställa en stor sats av mat att använda under hela längd av experimentet.
Vi anser att detta protokoll är allmänt tillämplig för ekotoxikologiska screening. Subst. furzeri utvecklas snabbt till ett standardtest arter i ekotoxikologi. Tillgången till denna standard protokoll kan underblåsa dess etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till gruppen sfären av UAntwerpen och Institutionen för växtskydd av fås för analys av vattenprover. Stöd under detta projekt tillhandahölls av Excellence Center ' Eco och socio-evolutionära dynamik (PF/10/007) KU Leuven forskningsfonden. AFG (11Q0516N) och ESJT (CVE-SB151323) finansierades som doktorand och TP (12F0716N) som post-doc fellow CVE Flandern (Fonds yrkesverksamma Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
