Summary
Bu çalışmada, akut, kronik ve multigenerational bir bioassay turkuaz killifish Nothobranchius furzeritek ve kombine stresler etkilerini çalışmaya açıklar. Bu iletişim kuralı hayat-Tarih özellikleri (ölüm, büyüme, verimlilik, ağırlık) ve kritik termal maksimum çalışma için tasarlanmıştır.
Abstract
Killifish Nothobranchius furzeri ecotoxicology alanında gelişmekte olan bir model organizma ve akut ve kronik ecotoxicity test onun uygulanabilirliği göstermiştir. Genel olarak, toksik bileşikler için türlerin hassasiyet aralığı ile ya da daha yüksek, diğer modeli türlerin mevcuttur.
Bu eser akut, kronik ve multigenerational BİYOANALİZLER i. furzeritek ve kombine tetikleyici efektleri için iletişim kurallarını açıklar. Kısa olgunlaşma zamanı ve yaşam döngüsü nedeniyle bu omurgalı model dört ay içinde bitiş noktaları olgunlaşma zamanı ve verimlilik gibi çalışma sağlar. Transgenerational tam ömrü pozlama denemeler kadar az 8 ay içinde gerçekleştirilebilir. Bu tür kuraklığa dayanıklı yumurta üretir ve yıl boyunca geçerli kalır, türlerin yerinde kültür gerekli değildir ama bireyler gerektiğinde işe. Protokoller ölçü hayat-Tarih özellikleri (ölüm, büyüme, verimlilik, ağırlık) ve kritik termal maksimum için tasarlanmıştır.
Introduction
Duyarlılık profilleri için stratejik olarak seçilen toxicants türlerin bir dizinin (kayıt, değerlendirme, yetkilendirme ve kimyasallar kısıtlama) Avrupa ulaşmak mevzuat için açıklanan1 olmuştur. Onlar bir türün hassasiyeti hızlı bir göstergesidir gibi akut veya kısa vadeli toksisite testleri çoğunlukla bu amaç için kullanılmıştır. Ancak, kendi doğal ortamlarında organizmalar üzerinde çok daha uzun süre maruz kalır ve tam ömürleri ya da hatta birkaç nesil etkilenen2olabilir. Ayrıca, kirli ortamlarda organizmalar genellikle muhtemelen sinerjik etkileri3' te sonuçlanan birbirleriyle etkileşime girebilir, bir anda, birden çok tetikleyici için sunulur. Bu nedenle, güvenli konsantrasyonları hesaplanan dayalı akut, tek tetikleyici toksisite testleri, doğal ortamlarında toxicants tarafından dayatılan gerçek riskleri hafife. Bu, bu nedenle, aynı zamanda Avrupa Komisyonu4,5 ve USEPA (Amerika tarafından savunduğu gibi sublethal toxicants bir çevre ilgili bağlamda konsantrasyonları kronik ve multigenerational etkileri çalışmaya tavsiye edilir Birleşik Çevre Koruma Ajansı)6,7. Özellikle omurgalı araştırmada, kronik ve multigenerational pozlama çalışmaları nedeniyle nispeten uzun ömrü için omurgasız canlılar karşılaştırıldığında omurgalıların gerçekleştirirken emek, para ve zaman açısından maliyetleri yüksektir. Bu nedenle, araştırma soru bağlı olarak en uygun balık model organizma seçmek için tavsiye edilir. Ayrıca, omurgalı türleri geniş bir dizi türlerin en hassas türler üzerinde dayalı düzenlemeler adapte edebilmek için karşıdan karşıya yanıt genelliği test etmek için kullanılabilir olması gerekir. Şimdi, yeni, kronik ve multigenerational Etkilenmeler omurgalılar7,8performans maliyetleri düşürmek için kısa yaşam döngüleri ile karakterize omurgalı modeli türleri ile etkili iletişim kuralları geliştirmek için gerek yoktur.
Turkuaz killifish Nothobranchius furzeri onun kısa olgunlaşma zamanı ve yaşam döngüsü (oluşturma süresi 4 hafta9' dan daha az) nedeniyle böyle uzun süreli pozlama deneylerde kullanmak için ilginç bir balık modelidir. Bu olgunlaşma zamanı ve verimlilik gibi ekolojik ilgili bitiş noktaları diğer balık modelleri7' ye göre bir kısa zaman dilimi içinde okudu olabilir anlamına gelir. Ayrıca, bu balık için birkaç yıl böylece sürekli kültür9ihtiyacını ortadan kaldırarak, standart koşullarda saklandığında uygun kalır kuraklığa dayanıklı, uyuyan yumurta üretmek. Ecotoxicological çalışmalarda, bu da balık tüm tam olarak aynı anda, farklı zamanlarda üretilen yumurta toplu işlemleri arasında bile tüm hayvanlar için zaman senkronizasyonu sonuçlanan yumurtadan bu çoğaltılır anlamına gelir. Pozlama deneyler gerçekleştirmek için laboratuvar GRZ zorlanma kullanarak tavsiye. Bu yük de laboratuvar koşullarında gerçekleştirir, (seks kromozom hariç) homozigoz ve genom de karakterize10,11.
Ecotoxicological çalışmalarda test konsantrasyonları uygun aralığı seçmek önemlidir. Bu amaçla çeşitli tamamlayıcı yöntemler kullanılabilir. Nominal konsantrasyon aralığı Nothobranchius guentheri12gibi ilişkili bir tür duyarlılığını temel alabilir. Alternatif olarak, aralığın en toxicants (Philippe vd karşılaştırılabilir bir duyarlılık var Zebra balığı (Danio rerio)2 gibi standart balık modelleri duyarlılığını temel alabilir (İnceleme)). Bu seçeneklerin her ikisi ile birlikte deney bir mesafe nominal konsantrasyon aralığı seçmek için yapılmalıdır. Akut test etmek için araştırmacılar konsantrasyon tedaviler için % 100 ölüm, ara mortalite ve % 0 mortalite ile maruz kalmanın toxicant 24 saat sonra amacı olmalıdır. Kronik test etmek için deneme durumda en yüksek test konsantrasyonları ile larva ölüm oranı % 10 Bu başvuru dönemde aşmadığı Eğer doğrulamak iki hafta için mesafe ölçme cihazı çalıştırmak için tavsiye edilir.
Protokol stresler bireysel ve hücresel düzeyde olası etkilerini inceleyerek, su kaynaklı kirleticiler akut ve kronik maruz i. furzeriüzerinde gerçekleştirmek için bir temel olarak hizmet verebilir. Daha yüksek bir ekolojik uygunluğu, farklı toksik bileşikler karıştırma ya kirliliği ve diğer doğal stresler (örneğin predasyona) arasında etkileşimli efektleri eğitim barındırmak için birden çok tetikleyici araştırma gerçekleştirmek için de kullanılabilir veya antropojenik stresler (örneğin Isınma İklim değişikliği nedeniyle).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada KULeuven Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. tarama ve i. furzeri genel bakım
- Hazırlamak balık orta (pH 7) 14 ° c sıcaklıkta ve 600 µS/cm (24 ° C) iletkenlik için eklenen standart tuzları ile arıtılmış tip II su ekleyin.
- Yumurta standart koşullar13altında saklanan GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratuvar satırı seçin. Yumurta (Yani çatlamaya hazır), DIII aşamasında seçin tanınabilir varlığı ile altın gözler9 ve yavaşça onları bir plastik 2 lt tank (tank başına yaklaşık 30'dan fazla yumurta) cımbız yumuşak bir çift ile aktarın.
Not: yeterli sayıda sağlıklı test organizmalar için gerekli balık larva sayısı olarak iki katı kadar yumurtalar çatlar. - Balık orta 1 cm 12 ° C'de eklemek ve yavaş yavaş oda sıcaklığında (24 ° C)9' a yakınsama su sıcaklığı. Balık ilk 12 saat içinde yumurtadan.
- (Bakınız gıda, miktarı ve sıklığı konusunda daha fazla ayrıntı için Polačik vd. 20169üreme Protokolü) 24 saat sonra taze taranmış Artemianauplii konsantre doz yavru yem ve su 5 cm için arttırmak Balık orta ekleme.
- 36 h sonra yavru taze taranmış Artemia nauplii bir konsantre doz yem ve su derinliği 10 cm artırmak için balık orta ekleyin.
- 14 h:10 h altında balık konteynerler (örneğin bir kuluçka makinesi, iklim oda veya ısıtmalı su banyosu) sabit sıcaklık koşullarında kuluçkaya ışık: karanlık rejimi.
- Toxicants aktarmak gerçek kapsayıcısında sınırlamak için karmaşık balık kapları (balık) olmadan onları maruz kalma orta yüksek konsantrasyon ile doldurma ve gideriş o bileşik pozlama ile deney başlamadan önce gece deneme.
- 48 h damızlık sonra sağlıklı neşeli larva pozlama deneme başlatmak için seçin. Onların yüzme kesesi doldurun ve sonuç olarak Engelli bir kaldırma kuvveti vardır koyamadık sözde göbek kaydırıcıları atmak (sürekli altına lavabo).
2. kısa süreli maruz kalma Protokolü
Not: Araştırmacılar en az 20 çoğaltır (20 balık ayrı kavanoz) tedavi başına hedeflemelisiniz. Bahçedeki hisse senedi çözüm bir çözücü kullanarak hazırlanan tam denetim tedavisi yanı sıra, solvent denetim dahil edilmelidir. Solvent denetim çözücü en yüksek pozlama konsantrasyon çözelti konsantrasyonu eşit miktarda içermelidir.
- Onları etiketleme ve onlara uygun pozlama orta (farklı yaydıkları konsantrasyonları) ile girerek deneysel konteynerler (0,5 L Cam Kavanoz) hazırlayın. Doğru konsantrasyon elde etmek için bileşik ekleyin.
- Larva (48 saat sonrası çıkım) ayrı ayrı kaplara (bireysel izleme için konteyner başına 1 balık) aktarın.
Not: Balıklar tek tek gıda ve saldırganlık için rekabet gibi sosyal etkileşim olası karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için maruz kalır. Ancak, Balık görsel olarak laboratuvar hayvan kullanmak için etik standartlara uygun olarak etkileşimine izin verilir. - Bu akut maruz kalma kadar 2 hafta süresince izleyin. Bu süre içinde balıklara yem ad libitum Artemia nauplii günde iki kez, haftada 7 gün ile.
- Orta her geçen gün su kalitesini korumak için ve potansiyel bileşik bozulması etkilerini en aza indirmek için yenileyin. İzlemek anahtar su değişkenleri (çözünmüş oksijen seviyesi % 80'i aşan, iletkenlik aralığı 600 ve 700 µS/cm, pH 7.8 8.2 ve sertlik (olarak CaCO3) arasında arasında 350 ve uygun yetiştirme koşulları aralığı içinde yatıyor 450 mg/L arasında i. furzeri 9). Su örnekleri önce ve gerçek bileşik konsantrasyonu belirlemek için orta ferahlatıcı sonra al.
- Bitiş noktaları
- Balık ölüm, stres için kontrol edin (örneğin anormal davranış: baş aşağı yüzme) ya da hastalık her gün (sabah, akşam). Shedd vd yayınlanması danışın (1999) 12 gözlem mortalite, stres veya hastalık hakkında ayrıntılı bilgi için.
- LC hesaplamak50 değerlerine dayalı farklı zaman noktalarda doz-yanıt eğrileri (Ritz ve Streibig, 2005) kullanılarak mortalite. ' R v3.2.3 (R geliştirme çekirdek takımı, 2016) drc pakette drm işlevini kullanın ya da benzer istatistiksel yaklaşımlar.
3. kronik pozlama Protokolü
Not: Amacı en az 25 balık/durum deneme, çarpık seks oranı olma olasılığını en aza indirmek için ve potansiyel arka plan ölüm doğal nedenler nedeniyle karşılamak için başlangıcı olarak (i.e. yaşa bağlı mortalite).
- (Bkz: 1) çıkım
- Aşama ı (2 gün-sonrası 16 gün sonrası kuluçka çıkım)
- 2.1-2.4 açıklandığı gibi iletişim kuralı izleyin
- İkinci aşamasında deneme olarak, orta (hiçbir ferahlık, aşağıya bakınız) hafta boyunca düşer. Orta gerekli miktarda bir hafta boyunca bahçedeki benzer düşmesine izin vermek için büyük etkisiz kaplarda saklayın.
- Aşama II (16 gün sonrası çıkım-bitiş)
- 2 L hazırlamak deneysel cam kavanozlar kompleks tarafından onları ile bileşik. Kavanoz doğru pozlama orta ile doldurun ve kavanoz havalandırmak için bir hava tüp ekleyin. Bu kavanozlar deneme geri kalanı için ayrı ayrı ev balık. Etik standartları karşılamak görsel etkileşim sağlar.
- Haftada bir kez orta yenileyin. Bir ağ ile balık aynı poz orta içeren yeni bir kavanoza aktarın. Su örnekleri her konsantrasyon tedavisinde bileşik bozulması izlemek için bir hafta boyunca her gün al. Bir bozulma eğrisi birden fazla stres varsa her tedavi için (örneğin bir bileşim içinde farklı sıcaklık rejimleri toksisite) test hesaplamak. Abiyotik parametreleri (pH, sıcaklık, % çözünmüş oksijen, iletkenlik) haftada üç kez ölçmek.
- 2 sonrası kuluçkalık (dph) kadar gün 23 dph, günde iki kez, 7 gün hafta ad libitum Artemia nauplii başına balık yemi. 24 dph - 37 dph, kıyılmış Chironomus larvaları ile reklam libitumArtemia diyet tamamlıyor. 38 dph üzerinde günde iki kez, 7 gün başına hafta ad libitum Chironomus larva dondurulmuş balık yemi.
- Bitiş noktaları
- Günlük onay balık ölümleri, stres veya hastalık12.
- Büyüme belirlemek için balık orta onların rezervuar ile dolu bir petri aktararak haftalık olarak (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) vücut büyüklüğü ölçmek. 4-5 kalibre boyutu fotoğraf yukarıdan balık (sabit bir yükseklikte) çekmek ve bunları dijital olarak (örneğin ImageJ) kayma bir ölçüm programı kullanarak analiz.
Not: tüm balık ölçme işlemi tüm boyunca su altında tutarak işleme stresi en aza indirmek için daha yüksek bir petri yetişkin balık için kullanın. - Erkek olgunlaşma için balık günlük 15 dph itibaren gelen renklendirme için kontrol edin. Yüzgeçleri için evlilik renklendirme (ikincil cinsel özellikleri) ilk belirtileri kontrol edin. İlk gün, bu erkek olgunlaşma bir proxy olarak görünür zamanı kullanın.
- Sigara sexed balık erkek aynı tedavi grubunun veya deneysel olmayan erkekler haftada üç kez ile 30 dph itibaren kadın olgunlaşma süresi (gün ilk yumurta yatırılır) belirlemek için bir çift gördüm. Bunun için 3.4.5 içinde açıklanan yumurtlama protokolü kullanın.
- Verimlilik için çift Olgun kadın olgun erkek 3 kez / 30 dph haftadan itibaren içinde kendi tedavileri kullanarak bir geçiş düzeni.
- Pozlama orta substrat yumurtlama ile desteklenmiş erkek akvaryum kullanarak her çift için yumurtlama tankı (1 L) hazırlamak (ince kum < 500 µm).
- Hem erkek hem de kadın yumurtlama tanka transferi ve iki saat boyunca yumurtlamak izin. İnsan faaliyetleri veya yumurtlama konteyner çevresinde rahatsızlık bu işlem sırasında en aza indirmek.
- Daha sonra hafifçe balık geri onların özgün konut kaplarına gereksiz yumurtlama substrat yumurta kadar whirl su karıştırma olmadan aktarın.
- Yumurtaları yumurtlama substrat 500 µm kafes dökerek filtre. Yumurtaları saymak ve aktarmak (yumuşak cımbız kullanarak) için nemli torf yosun, Petri yemekler9,-14.
- Ölü yumurta her gün kaldırın. Sonra bir hafta, Petri film mühürleme ile çanak ve bir sıcaklığında saklayın mühür kontrollü kuluçka 28 ° c ve bir 14:10 s açık: koyu DIII faz (Yani yaklaşık üç hafta sonra çatlamaya hazır) hemen Geliştirme döngüsü. Uzun süreli depolama için üzerine yumurta uyuyan aşama girmek ve birden fazla yıl boyunca uygun kalmak sürekli karanlık yumurta 17 ° C'de depolayın. Balık deneyler için uyuyan bu yumurtadan işe, uyuyan yumurta 28 ° C koşullarına 1410: s açık: koyu döngüsü DIII faz kalkınma için izin vermek yaklaşık üç hafta boyunca ile aktarın.
- Yetişkin balık kritik termal maksimum (CTmax) (performans15için bir ölçü) ölçmek.
- Isıtılan bir su banyosu 0,33 ° C/dk sabit bir oranda kullanmak ve içinde sürekli su sirküle olduğunu. Tek tek her balık için birkaç 1 L aquaria ekleyin.
Not: alanıyla ilgili kısıtlamalarla su banyosu içinde göz önüne alındığında, birkaç dizisi çalışmak gereklidir. Şartlar serisi arasında potansiyel farklılıklar istatistiksel analiz 'serisi' rastgele bir faktör olarak dahil ederek gerçekleştirirken dikkate alınmalıdır. - Deneme su içinde belgili tanımlık akvaryum balık (genellikle 28 ° C) deneysel yetiştirme sıcaklığı ulaşmıştır akvaryuma balık ekleyerek başlayın. CTmax Bath 1 L aquaria sıcaklığında dijital termometre (0.1 ° C ölçek) kullanarak her 5 dk izlemek.
- Balık dorso-ventrally dik konumunu korumak başarısız olur veya ağır16,17seğirmesi başlatıldığında davayı sona. Kritik maksimum sıcaklık 1 L akvaryum ısısını ölçmek. Balık geri kurtarma için deneysel onun konut aktarın.
- Isıtılan bir su banyosu 0,33 ° C/dk sabit bir oranda kullanmak ve içinde sürekli su sirküle olduğunu. Tek tek her balık için birkaç 1 L aquaria ekleyin.
- Balık ağırlığı (0.1 mg doğruluk) kuru okşamaya ve tartı bir teknede aktarma deneme son gününde ölçmek. Not: Tüm balık gıda ağırlık bağırsak standartlaştırmak için son besleme sonra dört saat ölçülmelidir.
- % 0.1 kullanarak balık ötenazi Tricaine.
4. Transgenerational pozlama Protokolü
Not: İ. furzerikirleticilerin transgenerational etkileri ölçmek için ilk nesil için yukarıda özetlenen kronik pozlama Protokolü uygulayın.
- Haftada bir iki kez, 28 ° C'de depolanan üretilen yumurta (i.e. belgili tanımlık ikinci üretme) gelişimi kontrol 1410: s açık: koyu döngüsü koşulları embriyolar için petri kaplar DIII aşamasında teftiş tarafından (bkz: Polačik vd. 20169). Otelde her ebeveyn tedavi 50'den fazla çoğaltır tam olarak gelişmiş, onları 1.1 protokolüne hatch.
- Tam olarak aynı kurulum ve tedavi olarak ebeveyn balık için sağlıklı, neşeli balık maruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İ. furzeri akut maruz kalma bakır, farklı konsantrasyonları sonuçlarını hesaplanan 2.5.2 olduğu gibi cleardose-yanıt ilişkileri (şekil 1) göstermek. Yaydıkları konsantrasyonu artan ölüm bir artış vardır. LC50 değerleri zaman içinde konsantrasyonları azaltılarak, daha fazla zaman çoğaltır die % 50'si önce geçer anlamı azaltmak. Bakır, yanı sıra diğer türlere göre türün hassasiyeti karşılaştırılması için i. furzeri akut ve kronik pozlama üzerinde ayrıntılı sonuçlar için Philippe vd 20177' ye bakın.
Kronik pozlama deneme, vücut büyüklüğü ve verimlilik hassas bitiş noktaları vardır. Balık, bağlı olarak sıcaklık18büyüme kapsamlı değişim olabilir. 30 ile 50 arası yetişkin boyutları mm bu kurulum normal kabul edilir. Set-up izin tedaviler (şekil 2A) arasındaki farkları bulma. Su kaynaklı bakır kullanarak bir kronik pozlama assay olarak, üç hafta boyunca bakır maruz kalma önemli bir etkisi vardı (χ²5,34 40.7, P = < 0.001), 19.38 µg/L diğer tüm balık (tüm P daha küçük Cu maruz i. furzeri ile < 0.001) (şekil 2B). Verimlilik için denetim değerleri yaklaşık 50 yumurta başına haftalık zirvesinde dişi yumurta üretim7arasında dalgalanma. Başka bir deneyde, su bazlı chlorpyrifos ve 2 ° C sıcaklık artışı kullanarak sıcaklık yükselişi ve chlorpyrifos pozlama üzerinde verimlilik arasında önemli bir etkileşim bulduk (χ22,202 25,3, P = < 0.001). 28 ° C'de 2 µg/L ve denetim balık maruz balık kıyasla daha az yumurta 4 µg/L maruz balık üretilen (her iki P < 0.001) (şekil 2B). 30 ° C'de denetim balık tüm maruz chlorpyrifos balık için karşılaştırıldığında daha fazla yumurta üretilen (her iki P < 0,007). Her iki ana etkisini chlorpyrifos maruz (χ22,202 96,8, P = < 0.001) ve sıcaklık temel etkisi (χ21,202 10.18, P = < 0.001) azaltılacağını verimlilik. Ölçüm balık işleme ve turba9yumurta kaplama nedeniyle oldukça zaman alıcıdır ama genellikle en hassas bitiş noktası.
Olgunlaşma zamanı kirleticiler erkeklerde en sık etkilenir. Erkek olgunlaşma zamanı önemli ölçüde etkilenen su bazlı chlorpyrifos kronik maruz (χ22,41 11.79, P = 0,003 =), 4 µg/L denetim erkekler (şekil 3A karşılaştırıldığında % 18 daha yavaş olgunlaşma sahip CPF (C2) maruz erkek ). Bu yanıt gerekir, ancak, olgunlaşma zamanı dolaylı olarak bir proxy olarak evlilik renklendirme başlangıcı belirlenerek attı beri dikkatle yorumlanmalıdır. Her ne kadar erkek bir kaç gün sonra renklendirme9görünümünü olgun kabul edilir, bu ölçü birimi kullanılarak olgunlaşma tam zamanlaması üzerinde bazı hatası olabilir.
Termal en balık dengesiz Yüzme, artan opercular hareketi ve bir dorso-ventrally dik pozisyonda 16,17' kalır yeteneği kaybı sergi. CTmax değerler i. furzeri suşları arasında farklılık gösterir. Doğal nüfus CTmax değerleri arasında 39 ° C ve 42 ° C sıcaklıklarda 24 ve 28 ° C (3B rakam) arasında yetiştirilen zaman var. Doğuştan GRZ gerginliği, ancak, zaten yaklaşık 37-38 ° c, termal maksimum bile 28 ° C'de yetiştirilen ne zaman ulaşır Bu yordam için balık öldürücü değildir, ancak nadiren de olsa ölüm görülebilmektedir. Onlar büyük olasılıkla nispeten yoksul genel durumda balık temsil gibi böyle balık en iyi CTmax analizinden bırakılır.
Önceki sonuçları çoğunlukla CTmax kirletici tarafından bu durumda etkilenebilir gösterdi, 3,4-DCA (χ22,7117,65, P = < 0.001) 0.1 mg/L 3,4-DCA 0,32 ° C daha düşük termal maksimum kontrol balık için karşılaştırıldığında sahip maruz balık ile (P < 0.001). Ayrıca, CTmax yetiştirme sıcaklığı ile etkilendi (χ21,71322.0, P = < 0.001) ve 28 ° C'de yetiştirilen edildi balık vardı bir 1.3 ° daha yüksek CTmax karşılaştırıldığında balık 24 ° C'de yetiştirilen edildi C
Şekil 1: bakır maruz kalma doz-yanıt eğrisi. Doz-yanıt gösteren toplu ölüm Nothobranchius furzeri bakır pozlama konsantrasyon (µg/L Cu ve çekim hızı ile ilgili olarak) işlevinde eğrileri. Noktalar LC50 değerleri gösterir. Bu rakam Philippe vd 20172den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: boyut ve bitiş noktaları olarak verimlilik üzerine etkileri. A) boyutu (cm) Nothobranchius furzeri 3, 7, 11 ve 15 hafta bakır farklı konsantrasyonları maruz. Yıldız işareti gösterir C5 balık p önem düzeyinde üç hafta sonra daha küçük < 0,05. Değerleri ± SEM örnek boyutları demek gibi sunulmaktadır n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 içinde hafta 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 içinde hafta 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 hafta 11 ve n = 5; 3; 3; 5; 2 haftada 15. B) verimlilik balık iki sıcaklık tedaviler ile geçti chlorpyrifos, farklı konsantrasyonlarda maruz zaman içinde ölçülen yumurta haftada sayısı olarak. Okunabilirlik ve interpretability figürün artırmak için grafikler üzerinde hata çubukları gösterilmez. Her tedavi başlangıç ve bitiş süresi döşeme yumurta kadın sayısı harfi kullanarak belirtilir 'n'. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: olgunlaşma zamanı ve CTmax etkileri. A) demek hangi rengi ilk belirtileri ortaya çıktı farklı chlorpyrifos konsantrasyonları (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) ve 4 µg/L CPF (C2)) ve iki sıcaklık (28 ° C ile 30 ° C) maruz Nothobranchius furzeri erkek yaşı (gün olarak). B) ortalama kritik termal maksimum (CTmax) 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0), 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) ve 0.1 mg/L 3,4-DCA (C2)) ve iki sıcaklık (24 ° C ve 28 ° C) farklı konsantrasyonları maruz balık. Nominal konsantrasyonları ortalama değer ± SE. sunulmaktadır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu eser bireysel çalışmaya Nothobranchius furzeri, ortaya çıkan bir model organizma kullanarak yeni bir bioassay açıklar ve uzun vadeli etkileri toxicants ve diğer stresler kombine. Sunulan iletişim kuralları toxicants (bakır, kadmiyum, 3,4-dichloroaniline ve chlorpyrifos) bir diziye tür duyarlılığı ölçmek için başarıyla uygulandı. Hızlı ömrünün, nedeniyle bu omurgalı modeli sublethal değerlendirilmesi için izin verir ve transgenerational dört ay içinde etkiler. Bu balık türleri toksisite tarama için bir model olarak kullanmanın bir diğer büyük avantajı kuraklığa dayanıklı yumurta üretir gerçektir. Bu yumurta Mağaza veya onları bir tedarikçiden araştırmacılar etkinleştirir ve pahalı ve zaman alıcı yerinde kültür gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, embriyo yavru gerekli12kadar birkaç yıl boyunca saklanır.
İ. furzeri başvuru toxicants sayıda duyarlılığını okuduktan sonra biz türlerin hassasiyet aralığıyla mevcuttur veya daha, bu diğer yüksek bağlı olarak test edilmiş Bileşik tür model ekleyebilirsiniz. Diğer model türler rutin olarak ölçülen bir son nokta olarak verimlilik, etkisini ölçme okudu türün hassasiyetini karşılaştırılabilir özellikle, artırabilirsiniz. Son olarak, uzantı için ayrı ayrı yönetilen veya kombine, hesaplanan bitiş noktası ve pozlama konsantrasyon bağımlı olduğunda yan etkileri, birden çok stres uygulamayın.
İ. furzeriile çalışırken hala bazı sınırlamalar vardır. En önemli sınırlamalar biri gıda standardizasyon. Toplu Artemia kisti veya bloodworms kalitesinde farklı olabilir ve bu nedenle, çalışmanın sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle Gıda deneme tüm uzunluğu kullanmak için büyük bir toplu sipariş için tavsiye edilir.
Bu iletişim kuralı ecotoxicological tarama için yaygın olarak uygulanabilir olduğunu düşünüyoruz. İ. furzeri ecotoxicology bir standart test türler içine hızla geliştirmektedir. Bu standart protokol kullanılabilirliğini kuruluşundan yakıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Küre grup UAntwerpen ve Ugent, bitki koruma bölümü su örnekleri analiz için minnettarız. Bu proje sırasında destek mükemmellik merkezi tarafından sağlanan ' çevre ve sosyo-evrimsel KU Leuven araştırma fonu dinamikleri (PF/10/007). AFG (11Q0516N) ve ESJT (iki-SB151323) olarak doktora finanse ve TP (12F0716N) iki Flanders (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek) tarafından post-Doktora Bursu olarak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
