Summary
يعرض البروتوكول هذا الاعتداء حبة رواية في المختبر أن أكثر نماذج مناسب عملية في فيفو تنتشر الأوعية بإدراج بيريسيتيس. ويتيح هذا التعديل المقايسة حبة الخص أكثر إخلاص الغيروية التفاعلات الخلوية بين خلايا بطانية والخلايا الجدارية التي حاسمة بالنسبة للأوعية.
Abstract
الأوعية نمو الأوعية الجديدة من المفرج الموجودة من قبل وهو عنصرا هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتنمية والتئام الجروح، ونمو الورم وورم خبيث، وأمراض العين والقلب والأوعية الدموية. نماذج فعالة في المختبر أن الخص بيولوجيا تولد الأوعية ضرورية لدراسة هذه العملية على نحو ملائم وتحديد آليات التنظيم التي يمكن أن تكون مستهدفة في نهاية المطاف لاستراتيجيات علاجية جديدة. والرزن الأوعية حبة قد ثبت سابقا أن الخص مراحل متعددة تنتشر غشائي في المختبر. ومع ذلك، حد من هذا التحليل الافتقار إلى من بطانية – تعمل الخلية الجدارية التفاعلات، التي مفتاح لتنظيم خلايا غشائي الجزيئية والمظهرية في فيفو. البروتوكول هنا يقدم منهجية لدمج الخلايا الجدارية في مقايسة الأوعية حبة ويوضح ارتباط ضيق غشائي الخلايا وبيريسيتيس أثناء تبرعم في المختبر. تفاصيل البروتوكول أيضا منهجية لإسكات فعالة من الجينات المستهدفة باستخدام siRNA في خلايا بطانية للدراسات الميكانيكية. وإجمالا، يوفر هذا البروتوكول في المختبر تحليل أن من الأنسب نماذج أنواع الخلايا المختلفة المشاركة في تنتشر الأوعية، ويوفر منبرا أكثر فسيولوجيا ذات صلة لتقييم العلاج واكتشاف رواية آليات التنظيم تولد الأوعية.
Introduction
الأوعية حيوية embryogenesis المناسبة والتئام الجروح، وكما أنها تلعب أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض بما في ذلك التقدم1 والشريان التاجي مرض السرطان. 2 , 3 وجود فهم أفضل لكيفية حدوث عملية تولد الأوعية خلال التطور الطبيعي، وكيف يتم إعادة تنشيطها في سياقات باثولوجي، أمر بالغ الأهمية لتطوير الرواية، والعلاجات الفعالة. نماذج المؤمنين في المختبر أن الخص المراحل الهامة وأنواع الخلايا المعنية في الأوعية في فيفو ضرورية للسماح للباحثين أفضل وصف الآليات الجزيئية التي يقود الأوعية وجعل الاكتشافات رواية في لائحة بطانية.
ناكاتسو وهيوز الأمثل مقايسة حبة تبرعم التي قد أظهروا يخضع للعديد من مراحل معروفة تنتشر الأوعية. 4 , 5 غرض الطريقة المعروضة هنا البناء على التحليل الأمثل ناكاتسو وهيوز من خلال دمج بيريكتييس في التحليل، حتى يمكن إدراج أدوار باراكريني وجوكستراكريني من الخلايا الجدارية في الخلية البطانية تنتشر في دراسات الرواية تولد الأوعية. بيريسيتيس هي الخلايا الجدارية التي تتحدد بدورها كالخلايا التي تحافظ على إغلاق الاتصال المادي مع خلايا غشائي بسبب المضمنة في غشاء الطابق السفلي والأوعية الدموية. 6 بيريسيتيس وخلايا بطانية مزاولة المعقدة عبر الحديث عن طريق إشارات المسارات بما في ذلك الشق الإشارات، إنج-Tie2، PDGFRβ، TGFRβ، وغيرها الكثير. 7 , 8 الماوس نماذج ناقصة في هذه المسارات مما يشير إلى إثبات التغطية بيريسيتي الفقيرة النامية المفرج في امبريوجينيسيس، مما أدى إلى إعادة عرض الأوعية الدموية الفقيرة والمفرج المختلة وظيفيا. 7 بالإضافة إلى ذلك، دور بيريسيتيس في الأوعية باثولوجي مهم ولكن في كثير من الأحيان تحت تقدير. على سبيل المثال، ميزة فريدة من نوعها للورم المفرج أن السفن التي غير ناضجة أكثر، راشح، ومختلة بسبب التغطية بيريسيتي الفقيرة. 9 أنه قد اقترح أن وجود أو عدم وجود بيريسيتيس هائلة تؤثر النمط الظاهري لورم الأوعية الدموية وهو وسيط هام للردود على الأوعية والعلاجات انتيتومور. 9 وهكذا، بما في ذلك دور بيريسيتيس في فحوصات في المختبر مفتاح لالتقاط أكثر تماما الآليات الهامة لتنظيم بطانية.
على الرغم من أن هناك العديد من الاختبارات في المختبر و السابقين فيفو المستخدمة حاليا لدراسة الأوعية، هناك أوجه قصور للنظر في كل منها. بعضها، مثل انتشار بطانية وفحوصات الهجرة بطانية، يتم تبسيط مفرط والتركيز على دالة بطانية واحدة في بيئة معزولة في زراعة الأنسجة من البلاستيك. 10 فحوصات أخرى تحدث في إعداد 3 الأبعاد (3D) أكثر، مثل المقايسة تشكيل أنبوب ماتريجيل،10 ولكن هذه الاختبارات لا يزال المفرطة والتركيز أكثر على قدرة خلايا بطانية ترحيل ونموذج حيثياته الأوعية الدموية الهياكل، خلافا لتنتشر من المفرج الموجودة من قبل. وعلاوة على ذلك، أي من هذه الاختبارات تتضمن أنواع الخلايا الجدارية. هناك السابقين فيفو نماذج مثل المقايسة الشريان الاورطي الحلبة التي تدمج بيريسيتيس الموجودة في الجهاز المضيف، ولكن التلاعب بالجينات لهذه النماذج تحديا أكبر بكثير نظراً لضرورة توليد نماذج الماوس الضربة القاضية أو المحورة وراثيا مسارات للفائدة. حبة نبتت المقايسة مثاليا نظراً لأنها نماذج تنتشر بطانية والانتشار والهجرة وحتى تشكيل ملامسة والتجويف في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. 4 المقايسة إخلاص تسمح بتقييم آليا إلى العديد من المراحل المختلفة لتنتشر، في حين لا يزال يسمح لمباشرة التعديل الوراثي لخلايا بطانية أو بيريسيتيس في أجواء أكثر الخاضعة للرقابة. الجلطات فيبرينوجين يحتوي على الخرز تبرعم يمكن بسهولة الثابتة، الملون، وتصويرها في مراحل مختلفة من نبتت؛ يمكن أيضا أن توضع هذه براعم في غرفة تصوير الحي القيام بالتصوير في الوقت الحقيقي لتنتشر. المنهجية المقدمة هنا مثالية لدراسة الآليات الأساسية لتولد الأوعية عن طريق في عمق فينوتيبينج وتحليل دقيق للمسارات تفعيلها خلال الأوعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اليوم الأول:
1-عابر تعداء الخلايا غشائي
- إذا رغبت في ذلك، من تعداء عابرة للبشرية الحبل الوريد غشائي الخلايا (هوفيك) استخدام النوكليوتيد الجينات التنظيمية (مثل مايكرو-الكشف أو الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)) والكاشف ليبوفيكتاميني المناسبة وفقا لأداء إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد حققت نجاحا كبيرا أداء عكس ترانسفيكشنز مع تسلسل siRNA مخصصة وكاشف تعداء تجارية (انظر الجدول المواد). المؤلفين لم تختبر الأخرى بروتوكولات تعداء والكاشفات مع هذا التحليل. خطوات تعداء عكس استخدام الكواشف المذكورة فيما يلي: - إعادة تشكيل سيرناس المجففة بالتبريد أو ميكرورناس بتركيز 20 ميكرومتر في المياه الحرة نوكلياسي.
- جعل الحلول تعداء في النسبة التالية: 1 مل من أي مصل وسائل الإعلام الحرة مع 9 ميليلتر siRNA أو ميكرورنا.
- تحرض الحل والسماح لها باحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 18 ميليلتر من تعداء كاشف للحل وتحرض.
- يسمح الحل لاحتضان كل 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مدة 20-40 دقيقة، التحريض الحل لفترة الحضانة.
- بينما هو حضانة الحل تعداء، فصل هوفيك استخدام حل مفرزة خلية (مثلاً، أككوتاسي). لقارورة T175، يغسل قارورة مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم إضافة 5 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضان قارورة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إضافة 5 مل من وسائل الإعلام كاملة إلى قارورة T175، وإزالة تعليق خلية من قارورة والطرد المركزي 1200 لفة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ وريسوسبيند بيليه الخلية في كثافة 1 × 106 خلايا كل مل في EGM2.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد حققت نجاحا كبيرا باستخدام "الخلية غشائي النمو المتوسطة" (EGM2) الذي يحتوي على طقم عيار عامل النمو القياسية، فضلا عن إضافي 10 ٪ FBS. - وبمجرد الانتهاء من حل تعداء تفرخ، لوحة 1 مل من محلول في صفيحة 10 سم، وإضافة 1 مل تعليق هوفيك في الأعلى.
- إضافة مل 7 إضافية وسائط كاملة لكي مل 9 وحدة التخزين النهائي في اللوحة 10 سم.
- جعل اثنين على الأقل 10 سم لوحات قيمتها الخلايا لكل شرط تعداء التأكد من أن هناك ما يكفي من خلايا متاحة للخطوات اللاحقة في المقايسة.
ملاحظة: هذه الشروط يؤدي تركيز عمل نهائي للجينات اليغنوكليوتيد التنظيمية من 20 نانومتر. الكتاب وجدت هذه الشروط أن يسفر ضربة قاضية 60-80% من التعبير الجيني لأهدافها للفائدة. باحثين آخرين قد تحتاج إلى تحسين ظروف تعداء وفقا لاحتياجاتها التجريبية. - تبادل وسائل الإعلام إضافة وظيفة ح 4-6 مجمعات siRNA مع وسائل الإعلام كاملة جديدة.
ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام ممر هوفيك 1-2.
2 يوم
2-طلاء من حبات ميكروكارير مع خلايا بطانية
- إعادة تشكيل الخرز ميكروكارير (مثلاً، 3 سيتوديكس) بتركيز 60,000 الخرز/مل في برنامج تلفزيوني والاوتوكلاف.
ملاحظة: حبات ميكروكارير تأتي بتركيز حوالي 3 × 106 حبات كل غرام. إعادة تشكيل الخرز بنسبة 20 ملغ حبات الواحد مل من برنامج تلفزيوني للحصول على كثافة حبة من حبات تقريبا 60,000/mL. - أنابيب قاسمة 1 مل وسائط كاملة في العدد المطلوب من القاع المستديرة Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
- "الماصة؛" 20 ميليلتر من تعليق حبة ميكروكارير في كل أنبوبة (تأخذ الرعاية لضمان أن الحل حبة هو حراكه جيدا قبل بيبيتينج).
ملاحظة: المحتمل سيكون هناك تقلب كبير في تركيز العمل النهائي الخرز موجودة في تعليق حبة ميكروكارير معينة. الخرز يمكن أن تنضم بسهولة إلى الجانبين من الحاويات البلاستيكية والزجاج الذي يمكن أن يغير إلى حد كبير حبة تركيز في الحل. سوف تحتاج حجم أنسب حل حبة إضافة إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل دفعة من تعليق حبة ميكروكارير يحددها المحقق تجريبيا. الأرقام المعروضة هنا تهدف إلى خدمة أكثر كنقطة انطلاق. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون الأمثل الشروط حتى تكون هناك 10-20 حبات مضمنة داخل الجل فيبرينوجين كل بئر في 24 لوحة جيدا في نهاية المقايسة. راجع مزيد من المناقشة في جزء المناقشة أدناه فيما يتعلق بالاستغلال الأمثل للأرقام الخرز للمقايسة. - فصل transfected تعداء بوست ح 24 هوفيك استخدام الحل مفرزة الخلية كما يلي:
- تغسل كل لوحة 10 سم الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، ثم أضف 2 مل الحل مفرزة الخلية واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل في وسائل الإعلام كاملة.
- أضف 1 مل تعليق خلية (أي 1 × 106 هوفيك) لكل أنبوبة نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تحتوي على حبات.
- بلطف تحرض أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية كل 20 دقيقة لمدة 4 ح في 37 درجة مئوية (إذا كان الشروع في الخطوة 3، 4) أو 2.5 إلى 3 ح (إذا كان الشروع في الخطوة 3، 2).
ملاحظة: هذه مدة وتواتر حدوث قلاقل قد تجريبيا حددت الباحثين السابقة الذين الأمثل حبة الأساسية تنتشر المقايسة. 4 لم يتم اختبارها ترددات أخرى من الانفعالات والمدد الزمنية للخطوة طلاء حبة من المؤلفين.
3-متسلسلة طلاء بيريسيتيس على حبات المغلفة هوفيك ميكروكارير
- يبدأ فصل الخلايا 10T1/2 (بيريسيتيس) باستخدام الحل مفرزة الخلية (التربسين) على النحو التالي:
- أغسل قارورة T175 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، ثم أضف 5 مل التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند 10T1/2 بتركيز 2 × 105 خلايا/0.5 مل في وسائل الإعلام كاملة.
ملاحظة: خلايا تم شراؤها من جمع الثقافة نوع الأمريكية (ATCC).
ملاحظة: الخلايا 10T1/2 الثقافة في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) تستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين والستربتوميسين.
- بعد 2.5 إلى 3 ح للتحريض على حبة + الحل هوفيك، انتظر 5 دقائق للسماح الخرز وهوفيك التعويم الحر لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- إزالة 0.5 مل من وسائل الإعلام كاملة من كل أنبوبة ماصة P1000 استخدام وإضافة 2 × 105 10T1/2 في وسائل الإعلام كاملة بحجم 0.5 مل لكل أنبوبة نظام مراقبة الأصول الميدانية. تحرض حل الخلية وحبه وثم الاستمرار في احتضان عند 37 درجة مئوية. ما زالت تحرض كل 20 دقيقة حتى الخرز وقد تم تحريكها لإجمالي ح 4.
ملاحظة: نسبة هوفيك 5: 1 بيريسيتي على الخرز أمر ضروري للحفاظ على التغطية المناسبة بيريسيتي للسفن.
ملاحظة: الخطوات البديلة التالية يمكن اتباعها بدلاً من ذلك في هذه النقطة في البروتوكول: - تحرض الخرز وهوفيك فقط من أجل ح 4.
- بمجرد اكتمال ح 4 طلاء هوفيك من الخرز ميكروكارير، تحرض الأنابيب مرة أخيرة، انتظر 30-60 ثانية، ثم على الفور إزالة 1.5 1.75 مل من محلول من أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: هذا ينبغي السماح الوقت الكافي لمعظم الخرز تسوية بينما سيتم إزالتها هوفيك التعويم الحر كثيرة في وسائل الإعلام.- إضافة 2 × 105 10T1/2 في وسائل الإعلام كاملة وإحضار وحدة التخزين نظام مراقبة الأصول الميدانية أنبوب يصل إلى 2 مل.
- بلطف تحرض أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية كل 20 دقيقة لمدة ساعة إضافية.
- بمجرد اكتمال التحريض، بلطف تحرض الأنابيب مرة واحدة أخيرة وفورا إزالة الحل الكامل (2 مل)، وإضافته إلى لوحة 6-سم. إضافة 3 مل إضافية وسائط كاملة لكل لوحة ووضع اللوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3 يوم
4-إعداد حلول جل فيبرينوجين
- إعداد الحلول العامل aprotinin بتركيز 1 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني وثرومبين في 50 وحدة/مل.
ملاحظة: يمكن إجراؤها بمخزون كبير من كل من هذه الحلول وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة سنة على الأقل. - جعل حلاً جديدة من الفيبرينوجين بتركيز 2 ملغ/مل. جعل الحل ما يكفي أن يكون 2.5 مل من محلول الواحدة وتحريكها نظام مراقبة الأصول الميدانية الأنبوبة.
- الحارة الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للسماح لكل من الفيبرينوجين الخوض في الحل.
- إضافة ميليلتر 37.5 من حل أبروتينين كل 1 مل من محلول الفيبرينوجين.
- عقيمة تصفية الحل وتوضع جانبا في درجة حرارة الغرفة.
5-إعداد الخرز لزرع هلام
- فحص الأطباق التي تحتوي على الخرز المغلفة ميكروكارير تحت المجهر باستخدام هدف X 20 لضمان أن جميع حبات قد تم المغلفة بما فيه الكفاية بخلايا بطانية.
- قوة "الماصة؛" الحل مطلي من الخلايا لفصل لهم من لوحة 6-سم ووضع الحل في أنبوب. أغسل اللوحة 2 X مرات إضافية مع وسائل الإعلام كاملة ونقل إلى الأنبوب لجمع جميع حبات المتبقية التي قد تنضم إلى اللوحة.
- تجنب إدخال فقاعات الهواء واستخدم ماصة p1000 لتقليل إجهاد القص على الخرز المغلفة بالخلية البطانية.
- إذا كان تقييم كفاءة siRNA ضربة قاضية في خلايا بطانية المسبق، في الخطوة 2، من المؤكد أن يكون لوحة خرز المطلي هوفيك فقط. ثم خلال هذه الخطوة (5.2)، فصل الخرز وجمع بقايا هوفيك تعلق على لوحة لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل قبكر.
- انتظر 3 دقائق للسماح الخرز في الحل بتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- إزالة جزء كبير من المادة طافية قدر الإمكان دون الإخلال ببيليه حبة استخدام تلميح ماصة p1000 (لا تستخدم المضخة فراغ).
- أضف 1 مل من وسائل الإعلام كاملة لكل أنبوبة والخرز ريسوسبيند.
- انتظر 30-60 ثانية للسماح بالخرز لتسوية للأسفل. قم بإزالة جزء كبير من المادة طافية كإمكانية استخدام ماصة P1000 دون إزعاج بيليه حبة. لا تستخدم المضخة فراغ كما هو زيادة كبيرة في احتمال إزالة بيليه حبة بطريق الخطأ.
- كرر الخطوات من 5.5 و 5.6 إضافية مرتين. والهدف هو إزالة قدر من هوفيك التعويم الحر الذي قد تم فصل من لوحة 6-سم قدر الإمكان، بينما لا إزالة عدد كبير جداً من الخرز هوفيك المغلفة، التي ينبغي أن يستقر في الأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية بسرعة أكبر من خلايا التعويم الحر.
- إضافة 1 مل من وسائل الإعلام كامل إلى الخرز.
6-تضمين المغلفة الخرز في جل فيبرينوجين
- قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون إزعاج بيليه حبة في كل أنبوبة نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام ماصة P1000.
- ريسوسبيند الخرز في 2.5 مل من محلول الفيبرينوجين.
- "الماصة؛" ميليلتر 13 الحل ثرومبين إلى كل المطلوب كذلك من صفيحة زجاجية 24-جيدا. الطلاء في صفيحة زجاجية أمر ضروري لتمكين التصوير الأمثل لبراعم.
ملاحظة: لا تترك ثرومبين يجلس في بئر لأكثر من 5-10 دقيقة قبل الخطوة التالية. - إضافة 0.5 مل من محلول حبة/الفيبرينوجين لكل بئر.
- من المؤكد أن ريسوسبيند الحل حبة جيدا قبل بيبيتينج الحل في كل مرة.
- أخذ الحيطة والحذر عناية "الماصة؛" مباشرة إلى ثرومبين موجودة بالفعل في البئر. ببطء "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 2-3 مرات لمزيج دقيق الحل، مع أخذ الحذر عدم إدخال أي فقاعات الهواء.
- تأكد من تغيير تلميح ماصة بين الآبار.
- أخذ الحيطة والحذر عدم التحرك أو اضطراب لوحة عند أي نقطة خلال الأولية فيبرينوجين تخثر الدم، كما أن أي تحرك قد يؤدي إلى تعطيل تكوين هلام.
- اترك لوحة يجلس في غطاء محرك السيارة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل اللوحة بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية ح 1.5-2 إضافية للسماح للجل ترسيخ تماما
7-طلاء الليفية على رأس جل فيبرينوجين
- خلال آخر 30 دقيقة من ترسيخ هلام، فصل عادي الليفية الرئة البشرية (نهلف) على النحو التالي:
- أغسل قارورة T175 الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، ثم أضف 5 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند نهلف بتركيز 20,000 خلايا/مل في وسائل الإعلام كاملة.
ملاحظة: يمكن استزراع الخلايا نهلف مع دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS و 1% "البنسلين والستربتوميسين".
- بلايت 1 مل تعليق خلية نهلف على الجل من كل بئر ووضع مرة أخرى في الحاضنة.
- تغيير الوسائط كاملة كل يوم لمدة المقايسة.
8-مراقبة تنتشر على مدى 2-7 أيام بعد زرع حبة في جل فيبرينوجين. طول الفترة الزمنية المطلوبة لتنتشر سيتوقف على عدد هوفيك المرور والكثير.
9-تثبيت تنتشر الإنزيم
- بمجرد حدث تنتشر كافية ليتمكن من تحديد فرق المظهرية بين مجموعات علاجية، غسل جميع الآبار مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 0.5 مل من محلول مفرزة خلية لكل بئر ووضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة اللوحة من الحاضنة والاستفادة من الجانبين من اللوحة.
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة إزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا نهلف المتزايد على رأس جل فيبرينوجين قدر الإمكان لتسهيل اختراق جسم جل فضلا عن تصوير جل. وقت الحضانة المجموع مع الخلية المفرزة الحل قد تحتاج إلى تعديل لتحسين إزالة نهلف. وحذر الباحثين هي لعدم احتضان الهلام لفترات طويلة من الوقت الحل مفرزة الخلية قد تخترق الجل وتبدأ تعطيل هياكل غشائي داخل. - بمجرد تمت إزالة كمية كافية من الخلايا نهلف، إخماد الحل مفرزة الخلية مع 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- نضح بفصل نهلف والوسائط باستخدام الشافطة فراغ، وغسل الآبار مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 300 ميليلتر من محلول بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إزالة الحل بارافورمالدهيد 2% وتغسل كل 3 مرات أيضا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يرجى التخلص من 2% بارافورمالدهيد الحل المناسب وفقا للمبادئ التوجيهية "الصحة البيئية" والسلامة (EHS).- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل خير وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة وصمة عار أو صورة براعم.
10-تلطيخ لتنتشر في التحليل
- إضافة 300 ميليلتر من 0.5% 100 تريتون العاشر في برنامج تلفزيوني لكل جيد واحتضان لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام الشافطة فراغ، إزالة X100 تريتون ويغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- إضافة 500 ميليلتر من عرقلة الحل لكل جيل واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حل حظر تتكون من المكونات التالية: 1% ألبومين المصل البقري (BSA) 5% FBS، 0.1% توين-20 و antiserum 1% (استخدام نفس الأنواع التي تستمد منها الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بك) في برنامج تلفزيوني. - إزالة الحل حظر من كل بئر وإضافة 300 ميليلتر المصبوغة الحل الذي يحتوي على جسم الأولية لكل بئر.
ملاحظة: الحل المصبوغة هو نفسه كحل حظر، ولكن دون أنتيسيروم هذا. الكتاب نجاحا تفرخ مع الأجسام المضادة الأولية في تخفيف من 1: 200 إلى 1: 400. - احتضان الأجسام الأولية في تلطيخ الحل عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية.
- نضح حل جسم الأولية ويغسل 3 مرات في تبس مع توين 0.5% عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. بعد الغسيل الثالث، استبدال مع المخزن المؤقت للمياه العذبة والصرف الصحي مرة أخرى وتخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- احتضان مع جسم الثانوي الفلورسنت المخفف 1: 1000 في تلطيخ الحل ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل المصبوغة وتغسل 5 مرات لكل 20 دقيقة مع TBS المحتوية على 0.5% توين في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
- تمييع النووية وصمة عار في برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد حققت نجاحا كبيرا مع 1:10000 هويشت المخفف في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: ليست هناك حاجة إزالة الحل المصبوغة النووية قبل التصوير. - الصورة في غضون أيام قليلة من الانتهاء من تلطيخ لالتقاط الإشارات الأمثل الفلورسنت.
11-تنتشر في التحليل الكمي
- بعد قد تم تصويرها براعم، استيراد ملفات الصور في إيماجيج واستخدام أداة العد لحساب العدد براعم، أو أداة لقياس أطوال تنبت خط.
ملاحظة: يتم تعريف براعم كنتوءات غشائي بطول أكبر من أو يساوي قطر حبة تنتشر من خلالها. 11 يمكن قياس طول تنبت كالمسافة من النقطة التي تبدأ برعم جاحظ الخروج من حبة غيض برعم. تنبت متوسط طول كل حبة ومتوسط عدد براعم كل حبة مقاييس مفيدة لتقييم التأثيرات المظهرية لإسكات الجينات في تنتشر الأوعية. يمكن أيضا استخدام متوسط عدد الخرز التي تحتوي على برعم واحد على الأقل من كل مجموعة المعاملة كمقياس لتقييم مدى متانة تنتشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح هذا البروتوكول لضيق ارتباط الخلية اثنان أنواع في المختبر، ووجود بيريسيتيس يكمل حدوث تبرعم (الشكل 1 أ، ب). كما يتيح البروتوكول الفعال إسكات (مثلاً عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي) الجينات من الفائدة في خلية نوع من الاهتمام مثل (فيجفا على وجه التحديد في خلايا بطانية) أو PDGFRβ في بيريسيتيس7،12 أثناء الفحص، الذي يمكن أن تترجم إلى تثبيط النمط الظاهري تبرعم في المقايسة. الباحثين استخدام هذا البروتوكول يتم تشجيعهم على القيام معيار غشائي خلية فقط تبرعم مقايسة بالتوازي مع الإنزيم تبرعم المغلفة بيريسيتي للتحقيق أكثر دقة بالمساهمات الفريدة من بيريسيتيس في وظائف الأوعية الدموية وتعمل قيد الدراسة.
الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول أهمية التمسك بقصد الحصول على حبات المغلفة بما فيه الكفاية (الشكل 2 أ، ب) التي سوف تكون قادرة على الخضوع لتنتشر قوية في جل فيبرينوجين. الكتاب وجدت أن وجود فائض من بيريسيتيس (مثل بيريسيتيس المغلفة بنسبة 10T1 1/2 إلى 1 هوفيك) النتيجة في فرط بيريسيتي من عجز كامل جيدا واللاحقة تبين هياكل الأوعية الدموية متميزة داخل البئر.
رقم 1. بيريسيتيس إقران محكم مع سفن غشائي في حبة نبتت المقايسة. (أ) الفحص تبرعم القياسية مع هوفيك الخرز المطلي فقط. الصور مجهرية [كنفوكل] (ب) من بيريسيتي تنتشر في التحليل تبين أن بيريسيتيس الالتفاف حول السفن غشائي في مقايسة تبرعم، بل لا تعوق تنتشر بها. الأزرق هو هويشت (وصمة عار النووية)؛ الأحمر CD31 (غشائي وصمة عار)، والأخضر ديسمين (بيريسيتي وصمة عار). كل قياس قضبان، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. وقد الخرز المطلي كرة غولف الخام، مثل المظهر. الخرز عارية ميكروكارير (A) على سطح أملس تماما، في حين المغلفة بشكل مناسب الخرز جاهزة لزرع هلام فيبرينوجين (ب) لها مظهر مثل كرة غولف الخام،. مقياس بار، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لوصف مراحل معقدة والتفاعلات الخلوية الغيروية تنتشر الأوعية عن طريق تمكين الباحث توظيف النهج الوراثية والتصوير إجراء تحقيقات شاملة آليا. عند القيام التحليل، من الضروري أن كفاءة طلاء غشائي من الخرز تجري خلال حبة الخطوات الانفعالات. سوف يتم طلاء بطانية الفقراء واضحا، إذا لم يظهر الخرز سطح خشن مثل كرة غولف في صباح اليوم التالي قبل زرع هلام وبدلاً من ذلك تظهر متجانسة تماما. العناية لضمان أن الخرز هي حراكه بما فيه الكفاية خلال كل خطوة الانفعالات بشدة التحريض هذه الأنابيب للسماح بأقصى قدر من التعرض لسطح حبة إلى خلايا بطانية، ولكن ليس ذلك قوة أنه يتسبب في الخلايا غشائي الفعل تعلق لتصبح بعيدة عن الخرز.
عند إضافة بيريسيتيس إلى المقايسة، من الضروري الإبقاء على نسبة خلايا بطانية 5 إلى 1 بيريسيتي. وجود فائض بيريسيتيس يسبب لهم كسا وتجاوز سكان غشائي الخلايا أثناء الفحص، ويسبب قصورا في بيريسيتيس التغطية السيئة للسفن. إذا كان يتم الاحتفاظ بكثافة الخلية المناسبة لكن لا يزال يلاحظ تغطية بيريسيتي الفقيرة من السفن، وقت الانفعالات مع بيريسيتيس قد تحتاج إلى تعديل. من غير المستحسن أن يتم تغيير أرقام الخلية. نهج بديل قد تكون لمعطف الخرز مع خلايا بطانية فقط من أجل ح 4، ثم إزالة خلايا بطانية من وسائل الإعلام التي ريسوسبيندينج حبة واستقروا حل الخلية وإزالة وسائل الإعلام في حالما استقر الخرز ولكن قبل الخلايا ، ثم إضافة في بيريسيتيس والتحريض كل 20 دقيقة لمدة ساعة إضافية.
عند تضمين الخرز المغلفة بجلطة فيبرينوجين، من الضروري أيضا عدم الإزعاج سلامة الهلام بتعطيل اللوحة أثناء تشكيل جلطة. قد يؤدي تعطيل تشكيل المصفوفة الشاذة تنتشر. من الضروري أيضا لضمان المحافظة على كثافة حبة المناسبة في الهلام. إذا كان سكان حبات كثيفة جداً، ثم الخرز بالقرب من بعضها البعض سوف يؤثر تنتشر المجاورة الخرز وسوف تبدأ تنبت تجاه بعضهم بعضا وأناستوموسي. اعتماداً على الهدف النهائي للباحث والفائدة في وصف التفاعلات سفينة-سفينة، كثافة حبة قد تحتاج إلى تعديل. ومع ذلك، قد تعطي عدد سكان غير متجانسة معزولة الخرز والخرز على مقربة من بعضها البعض داخل الجل تعمل تبرعم متغير إلى حد كبير. ويمكن تعديل كثافة حبة بتغيير حجم حبة الحل إضافة إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية خلال الخطوة الانفعالات للبروتوكول، أو عن طريق تغيير حجم حل فيبرينوجين المستخدمة في ريسوسبيند الخرز قبل زرع هلام.
من الضروري أيضا أن يتم مطلي نهلفس صحية في كثافة الخلايا 20,000 كل مل على رأس كل فيبرينوجين جلطة. يرجى ملاحظة أن الضرورية لتنتشر قوية أثناء الفحص إمدادات مستمرة من عوامل النمو التي توفرها نهلفس الفاصل بنشاط. EGM2 مكيفة نهلف ليس بديلاً كافياً. 13 إذا الفقيرة تنتشر لوحظ خلال المقايسة، من المستحسن أن تستخدم زجاجة جديدة من وسائل الإعلام كاملة وفقرة جديدة وصحية من الخلايا نهلف.
على الرغم من أن هذا الفحص يبدأ معالجة تعقيد الخلوية والمظهرية للأوعية بدقة أكبر، فإنه لا يزال يمثل نظام المفرطة بالنسبة لسياق صحيح، في فيفو . وباﻹضافة إلى ذلك، تولد الأوعية تبرعم التي تحدث في هذا التحليل يماثل أكثر إلى سياق صحية وفسيولوجيه بدلاً من سياق مرضية مثل الأورام تولد الأوعية. التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب قد تشمل الأخذ بأنواع الخلايا الإضافية (مثل السكان الخلايا المناعية التي تعدل استجابات الأوعية) أن الخص زيادة التفاعلات الخلوية الغيروية تشارك في هذه العملية المعقدة. يجوز أيضا إدخال الضغوطات الخارجية-مثل وجود ورم مضمن بالقرب من سفن تبرعم في جل فيبرينوجين-لمحاكاة الأوعية باثولوجي في المختبر للسماح لتوصيف أكثر دقة والميكانيكية المسارات الجزيئية المنشط في سياقات المرضية. هذه التطورات ستكون هامة لتحسين قدرة الباحثين على دراسة مراحل معقدة من الأوعية في وضع أكثر من التي تسيطر عليها، في نهاية المطاف تمكين اكتشاف وتوصيف متعمقة أكثر من رواية السبل العلاجية لاستهداف الأوعية باثولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور فيكتوريا بوتش وباوتشر جوشوا لإجراء مناقشات مفيدة وإسداء المشورة بشأن تحسين حبة القياسية تنتشر في ظروف المقايسة ومقايسة تبرعم تلطيخ البروتوكول. S.H.A. تدعمها جزئيا بمنحه من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة تحت جائزة 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
