Summary
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो मनका परख में एक उपंयास प्रस्तुत करता है कि अधिक उचित मॉडल pericytes को शामिल करके vivo अंकुरण angiogenesis में की प्रक्रिया । इस संशोधन मनका परख सक्षम बनाता है और अधिक ईमानदारी endothelial कोशिकाओं और भित्ति कोशिकाओं है कि angiogenesis के लिए महत्वपूर्ण है के बीच heterotypic सेलुलर बातचीत दोहराऊंगा ।
Abstract
Angiogenesis पूर्व मौजूदा vasculature से नए जहाजों की वृद्धि है और embryogenesis और विकास, घाव भरने, ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस, और नेत्र और हृदय रोगों सहित कई जैविक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण घटक है । इन विट्रो मॉडल है कि दोहराऊंगा angiogenesis के जीव विज्ञान के लिए उचित इस प्रक्रिया का अध्ययन और विनियमन है कि अंततः उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए लक्षित किया जा सकता है के तंत्र की पहचान की जरूरत है । मनका angiogenesis परख पहले किया गया है दोहराऊंगा में endothelial अंकुरण के कई चरणों का प्रदर्शन इन विट्रो । हालांकि, इस परख की एक सीमा endothelial की कमी है-भित्ति कोशिका बातचीत, जो vivo मेंendothelial सेल समारोह के आणविक और phenotypic विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं । यहां दिए गए प्रोटोकॉल मनका angiogenesis परख में भित्ति कोशिकाओं के शामिल करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है और endothelial कोशिकाओं और pericytes के एक तंग सहयोग इन विट्रो मेंअंकुरण के दौरान दर्शाता है । प्रोटोकॉल भी यंत्रवत अध्ययन के लिए endothelial कोशिकाओं में सिरना का उपयोग कर लक्ष्य जीन के प्रभावी मुंह बंद करने के लिए एक पद्धति का ब्यौरा । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक इन विट्रो परख है कि अधिक उचित मॉडल विविध कोशिका अंकुरण angiogenesis में शामिल प्रकार प्रदान करता है, और एक और अधिक शारीरिक-चिकित्सीय मूल्यांकन और उपंयास की खोज के लिए प्रासंगिक मंच प्रदान करता है angiogenesis विनियमन के तंत्र ।
Introduction
Angiogenesis उचित embryogenesis और घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह भी कैंसर प्रगति1 और कोरोनरी धमनी रोग सहित कई रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । 2 , 3 कैसे angiogenesis सामांय विकास के दौरान होता है की एक बेहतर समझ होने, और कैसे यह रोग संदर्भों में पुनः सक्रिय है, उपंयास के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, प्रभावी चिकित्सकीय । इन विट्रो मॉडल कि दोहराऊंगा महत्वपूर्ण चरणों और सेल vivo में angiogenesis में शामिल प्रकार के शोधकर्ताओं की अनुमति के लिए बेहतर आणविक angiogenesis ड्राइविंग तंत्र की विशेषताएं और उपंयास खोजों की जरूरत है राज्यात endothelial नियमन.
Nakatsu और ह्यूजेस एक अंकुरित मनका परख कि वे angiogenesis अंकुरण के कई ज्ञात चरणों का प्रदर्शन किया है अनुकूलित है । 4 , 5 यहां प्रस्तुत विधि का उद्देश्य परख में perictyes शामिल करके Nakatsu और ह्यूजेस द्वारा अनुकूलित परख पर बनाने के लिए है, ताकि endothelial कोशिका अंकुरण में भित्ति कोशिकाओं के paracrine और juxtracrine भूमिकाओं में शामिल किया जा सकता है कादंबरी angiogenesis. Pericytes भित्ति कोशिकाओं है कि कोशिकाओं है कि उनके कारण endothelial कोशिकाओं के साथ बंद शारीरिक संपर्क बनाए रखने के रूप में उनकी भूमिका द्वारा परिभाषित कर रहे है संवहनी तहखाने झिल्ली में एंबेडेड रहे हैं । 6 Pericytes और endothelial कोशिकाएं पायदान संकेतन, आंग-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, और कई अन्य सहित सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से जटिल क्रॉस-टॉक में संलग्न हैं । 7 , इन संकेतन रास्ते में कमी 8 माउस मॉडल embryogenesis में vasculature के विकास के गरीब pericyte कवरेज का प्रदर्शन, गरीब संवहनी remodeling और बेकार vasculature के लिए अग्रणी. 7 इसके अलावा, रोग angiogenesis में pericytes की भूमिका महत्वपूर्ण है, लेकिन अक्सर के तहत की सराहना की । उदाहरण के लिए, ट्यूमर vasculature की एक अनूठी विशेषता यह है कि जहाजों अधिक अपरिपक्व हैं, टपका हुआ, और गरीब pericyte कवरेज के कारण बेकार. 9 यह प्रस्ताव किया गया है कि उपस्थिति या pericytes की अनुपस्थिति नाटकीय रूप से ट्यूमर रक्त वाहिकाओं के phenotype प्रभावों और antiangiogenic और अर्बुदरोधी चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ है. 9 इस प्रकार, इन विट्रो परख में pericytes की भूमिका सहित और अधिक पूरी तरह से endothelial विनियमन के महत्वपूर्ण तंत्र पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हालांकि वहां कई विट्रो और पूर्व vivo वर्तमान में angiogenesis अध्ययन करने के लिए कार्यरत परख रहे हैं, वहां कमियों को प्रत्येक में विचार कर रहे हैं । कुछ, जैसे endothelial प्रसार और endothelial प्रवास परख, पीढ़ी सरलीकृत कर रहे है और ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर एक अलग सेटिंग में एक endothelial समारोह पर ध्यान केंद्रित । 10 अंय परख एक और 3 आयामी (3 डी) की स्थापना, ऐसे Matrigel ट्यूब गठन की परख,10 लेकिन इन परख अभी भी अधिक है और endothelial कोशिकाओं की क्षमता पर अधिक ध्यान केंद्रित करने के लिए और प्रवास के रूप में होते है de नोवो संवहन संरचनाओं, के रूप में पूर्व से अंकुरित मौजूदा vasculature का विरोध किया । इसके अलावा, इन परख के कोई भी भित्ति कोशिका प्रकार को शामिल । ऐसे अंगूठी महाधमनी परख कि मेजबान अंग में मौजूद pericytes शामिल कर के रूप में पूर्व vivo मॉडल हैं, लेकिन इन मॉडलों के आनुवंशिक हेरफेर अधिक नॉकआउट या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पैदा करने की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है ब्याज के रास्ते । मनका अंकुरण परख क्योंकि यह मॉडल अंकुरण endothelial, प्रसार, प्रवास, और यहां तक कि एक 3 डी मैट्रिक्स में सम्मिलन और लुमेन गठन आदर्श है । 4 परख श्रद्धालुओं अंकुरण के कई विभिंन चरणों के यंत्रवत आकलन के लिए अनुमति देता है, जबकि अभी भी या तो endothelial कोशिकाओं या pericytes के प्रत्यक्ष आनुवंशिक संशोधन के लिए एक अधिक नियंत्रित सेटिंग में की अनुमति । अंकुरित मोतियों से युक्त फाइब्रिन थक्के आसानी से तय किए जा सकते हैं, दाग, और अंकुरण के विभिन्न चरणों में imaged; ये अंकुरित अंकुरण के रीयल-टाइम इमेजिंग को करने के लिए एक लाइव इमेजिंग चैंबर में भी रखा जा सकता है । पद्धति यहां प्रस्तुत की गहराई phenotyping और angiogenesis के दौरान सक्रिय रास्ते का गहन विश्लेषण के माध्यम से angiogenesis के बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए आदर्श है ।
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Protocol
Day 1:
1. Endothelial कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक
- यदि वांछित, मानव गर्भनाल Endothelial कोशिकाओं का एक क्षणिक अभिकर्मक प्रदर्शन (HUVEC) जीन विनियामक oligonucleotides का उपयोग (जैसे सूक्ष्म RNAs या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना)) और उचित lipofectamine एजेंट के अनुसार निर्माता के निर्देश ।
नोट: इस प्रोटोकॉल महान कस्टम सिरना दृश्यों के साथ रिवर्स transfections प्रदर्शन सफलता मिली है और एक वाणिज्यिक अभिकर्मक रिएजेंट (सामग्री तालिका देखें) । लेखकों ने इस परख के साथ अन्य अभिकर्मक प्रोटोकॉल और रिएजेंट का परीक्षण नहीं किया है । उल्टे अभिकर्मक सूचीबद्ध का उपयोग कर के लिए चरण निंनानुसार हैं: - nuclease मुक्त जल में 20 µ मीटर की एकाग्रता पर lyophilized siRNAs या microRNAs का पुनर्गठन ।
- निम्न अनुपात में अभिकर्मक समाधान करें: सिरना या microRNA के 9 µ l के साथ किसी भी सीरम मुक्त मीडिया की 1 मिलीलीटर.
- समाधान आंदोलन और यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन के लिए अनुमति देते हैं ।
- समाधान और आंदोलन के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के 18 µ एल जोड़ें ।
- समाधान की अनुमति दें 20-40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, समाधान आंदोलन हर 10 से 15 मिनट के लिए मशीन की अवधि के लिए ।
- जबकि अभिकर्मक समाधान मशीन है, एक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग कर अलग HUVEC (उदा, Accutase) । एक T175 कुप्पी के लिए, फास्फेट के 10 मिलीलीटर के साथ कुप्पी धोने (पंजाब) खारा, और फिर सेल टुकड़ी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ने और 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी गर्मी ।
- T175 कुप्पी के लिए पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें, कुप्पी से सेल निलंबन हटाने और 3 मिनट के लिए १२०० rpm पर केंद्रापसारक ।
- एक निर्वात aspirator का उपयोग कर supernatant निकालें और EGM2 में एमएल प्रति 1 एक्स 106 कोशिकाओं के घनत्व पर सेल गोली reसस्पेंड ।
नोट: इस प्रोटोकॉल Endothelial सेल विकास मध्यम (EGM2) मानक वृद्धि कारक गोली किट और साथ ही एक अतिरिक्त 10% FBS युक्त का उपयोग कर महान सफलता मिली है । - एक बार अभिकर्मक समाधान, एक 10 सेमी की थाली में समाधान की प्लेट 1 मिलीलीटर, और शीर्ष पर HUVEC निलंबन की 1 एमएल जोड़ने की मशीन समाप्त हो गया है ।
- 10 सेमी की थाली में अंतिम मात्रा 9 मिलीलीटर लाने के लिए पूर्ण मीडिया के एक अतिरिक्त 7 मिलीलीटर जोड़ें ।
- प्रत्येक अभिकर्मक हालत के लिए कोशिकाओं के लायक कम से २ १० सेमी प्लेट्स बनाने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां पर्याप्त कोशिकाओं को परख में बाद में कदम के लिए उपलब्ध हैं ।
नोट: ये स्थितियां 20 एनएम के जीन विनियामक oligonucleotide के अंतिम कार्य एकाग्रता में परिणाम करती हैं । लेखकों ने इन परिस्थितियों में पाया है कि ब्याज के अपने लक्ष्य के लिए जीन अभिव्यक्ति की 60-80% पछाड़ना में परिणाम है । अंय शोधकर्ताओं को उनकी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन करने की आवश्यकता हो सकती है । - एक्सचेंज मीडिया 4-6 के साथ सिरना परिसरों के एच पोस्ट इसके अलावा ताजा पूरा मीडिया ।
नोट: इस प्रोटोकॉल पारित 1-2 HUVEC का उपयोग कर विकसित किया गया था ।
Day 2
2. Endothelial कोशिकाओं के साथ Microcarrier मोतियों की कोटिंग
- microcarrier मोतियों का पुनर्गठन (जैसे, Cytodex 3) ६०,००० मोतियों की एक एकाग्रता पर और आटोक्लेव में/
नोट: microcarrier मोती लगभग 3 x 10 ग्राम प्रति मोतियों की एक एकाग्रता पर आते हैं । 20 के अनुपात में मोतियों की माला का पुनर्गठन के लिए पंजाब के प्रति मिलीलीटर मोतियों की मिलीग्राम लगभग ६०,००० मोतियों की एक मनका घनत्व प्राप्त/ - Aliquot राउंड तली प्रतिदीप्ति सक्रिय कोशिका छंटाई (FACS) ट्यूबों की वांछित संख्या में पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर ।
- पिपेट 20 एक ट्यूब में microcarrier मनका निलंबन के µ एल (ध्यान रखना सुनिश्चित करें कि मनका समाधान अच्छी तरह से pipetting से पहले reसस्पैंड है) ।
नोट: वहां की संभावना एक दी microcarrier मनका निलंबन में वर्तमान मोतियों की अंतिम कार्य एकाग्रता में नाटकीय परिवर्तनशीलता होगा । मोती आसानी से प्लास्टिक और ग्लास कंटेनर जो बहुत समाधान में मनका एकाग्रता को बदल सकते है के पक्षों का पालन कर सकते हैं । मनका समाधान का सबसे उपयुक्त मात्रा microcarrier मनका निलंबन के प्रत्येक बैच के लिए FACS ट्यूब को जोड़ा जांचकर्ता द्वारा empirically निर्धारित की आवश्यकता होगी । यहां प्रस्तुत संख्या एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में और अधिक सेवा करने के लिए होती हैं । आदर्श रूप में, स्थितियों तो वहां 10-20 मोतियों की परख के अंत में अच्छी तरह से 24 अच्छी थाली में प्रति फाइब्रिन जेल के भीतर एंबेडेड है अनुकूलित किया जाना चाहिए । आगे चर्चा अनुभाग में परख के लिए मोतियों की संख्या के अनुकूलन के बारे में चर्चा देखें । - अलग transfected HUVEC 24 ज पद अभिकर्मक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग निंनानुसार है:
- पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं के प्रत्येक 10 सेमी प्लेट धो लें, और फिर सेल टुकड़ी समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को मशीन ।
- पूर्ण मीडिया में 1 X 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
- सेल सस्पेंशन के 1 मिलीलीटर (यानी 1 X 106 HUVEC) प्रत्येक FACS ट्यूब से युक्त मोतियों को जोड़ें ।
- धीरे FACS ट्यूबों ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच की अवधि के लिए हर 20 मिनट आंदोलन (अगर ३.४ कदम के लिए आगे बढ़ने) या २.५ 3 घंटे (यदि कार्यवाही के लिए ३.२ कदम) ।
नोट: इस अवधि और आंदोलन की आवृत्ति पिछले शोधकर्ताओं जो बुनियादी मनका अंकुरित परख अनुकूलित है द्वारा निर्धारित किया गया empirically गया है । 4 आंदोलन और मनका कोटिंग कदम की अवधि के अंय आवृत्तियों लेखकों द्वारा परीक्षण नहीं किया गया है ।
3. HUVEC-लेपित Microcarrier मोतियों पर Pericytes की अनुक्रमिक कोटिंग
- 10T1/2 कक्ष (pericytes) का उपयोग कर कक्ष टुकड़ी समाधान (trypsin) निम्नानुसार शुरू करें:
- पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ एक T175 कुप्पी धोने, तो 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsin और मशीन के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 2 X 105 कोशिकाओं की एकाग्रता पर 10T1/2 को पूरा मीडिया में 0.5 मिलीलीटर reसस्पेंड ।
नोट: सेल अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) से खरीदा गया था ।
नोट: Culture 10T1/न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) में 2 कोशिकाओं 10% FBS और 1% पेनिसिलिन Streptomycin के साथ पूरक.
- मनका + HUVEC समाधान आंदोलन के 3 ज करने के लिए २.५ के बाद, 5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए मोती और मुक्त अस्थाई HUVEC ट्यूब के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
- एक P1000 पिपेट का उपयोग कर एक ट्यूब से पूरा मीडिया के ०.५ मिलीलीटर निकालें और एक FACs ट्यूब के लिए ०.५ मिलीलीटर की मात्रा में पूरा मीडिया में 2 x 105 10T1/2 जोड़ें । आंदोलन सेल और मनका समाधान और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जारी है । के लिए हर 20 मिनट आंदोलन जारी रखें जब तक मोतियों की कुल के लिए आंदोलन किया गया है 4 ज ।
नोट: 5 HUVEC का अनुपात: मोतियों पर 1 pericyte वाहिकाओं के उपयुक्त pericyte कवरेज बनाए रखने के लिए आवश्यक है ।
नोट: निम्न वैकल्पिक चरणों के बजाय प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर फ़ॉलो किया जा कर सकते हैं: - आंदोलन मोती और HUVEC केवल 4 एच के लिए ।
- एक बार microcarrier मोतियों की HUVEC कोटिंग के 4 ज पूरा हो गया है, एक अंतिम बार ट्यूबों आंदोलन, 30-60 एस रुको, तो तुरंत FACS ट्यूब से समाधान के 1.5-1.75 मिलीलीटर हटा दें ।
नोट: यह मोती के अधिकांश के लिए पर्याप्त समय की अनुमति चाहिए बसने जबकि मीडिया में कई मुक्त अस्थाई HUVEC हटा दिया जाएगा ।- पूरा मीडिया में 2 X 105 10T1/2 मिलीलीटर और FACS ट्यूब की मात्रा लाने के लिए जोड़ें ।
- धीरे एक अतिरिक्त घंटे के लिए FACS ट्यूबों हर 20 मिनट आंदोलन ।
- एक बार आंदोलन पूरा हो गया है, धीरे ट्यूबों एक आखिरी बार आंदोलन और तुरंत पूरे समाधान (2 मिलीलीटर) को हटाने के लिए, और यह एक 6 सेमी की थाली में जोड़ें । प्रत्येक प्लेट के लिए पूरा मीडिया के एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर जोड़ें और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेटों जगह है ।
Day 3
4. फाइब्रिन जेल समाधान की तैयारी
- ५० इकाइयों में 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर aprotinin के कार्य समाधान तैयार करें और thrombin/
ध्यान दें: इन समाधानों में से प्रत्येक का एक बड़ा स्टॉक बनाया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक वर्ष के लिए संग्रहीत किया जाता है । - 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर फाइब्रिनोजेन का एक ताजा समाधान करें । उत्तेजित FACS ट्यूब प्रति समाधान के २.५ मिलीलीटर के लिए पर्याप्त समाधान करें ।
- फाइब्रिनोजेन के सभी समाधान में जाने के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में समाधान गर्म ।
- फाइब्रिनोजेन समाधान के प्रति 1 मिलीलीटर aprotinin समाधान के ३७.५ µ l जोड़ें ।
- बाँझ-समाधान फिल्टर और कमरे के तापमान पर अलग सेट ।
5. जेल आरोपण के लिए मोतियों की तैयारी
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी मोतियों को पर्याप्त रूप से endothelial कोशिकाओं द्वारा लेपित किया गया है 20X उद्देश्य का उपयोग माइक्रोस्कोप के तहत microcarrier लेपित मोतियों युक्त व्यंजन की जांच करें ।
- जोरदार कोशिकाओं के मढ़वाया समाधान पिपेट उंहें 6 से अलग करने के लिए मुख्यमंत्री प्लेट और एक ट्यूब में समाधान जगह है । प्लेट 2x पूरा मीडिया के साथ अतिरिक्त समय धो और ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण सभी अवशिष्ट मोती है कि थाली के लिए पालन किया जा सकता है इकट्ठा करने के लिए ।
- हवा के बुलबुले शुरू करने से बचें और एक p1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए endothelial सेल लेपित मोतियों पर कतरनी तनाव को कम ।
- यदि endothelial कोशिकाओं में सिरना पछाड़ना दक्षता का आकलन की जरूरत है, चरण 2 में, HUVEC की एक थाली केवल लेपित मोतियों के लिए सुनिश्चित हो । फिर इस चरण के दौरान (५.२), मोतियों को अलग करें और आरएनए अलगाव और qPCR विश्लेषण के लिए थाली से जुड़ी अवशिष्ट HUVEC इकट्ठा ।
- समाधान में मोती ट्यूब के नीचे बसने के लिए अनुमति देने के लिए 3 मिनट रुको ।
- मनका गोली एक p1000 पिपेट टिप का उपयोग कर परेशान बिना संभव के रूप में supernatant के रूप में ज्यादा निकालें (एक निर्वात aspirator का उपयोग नहीं करते) ।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
- प्रतीक्षा करने के लिए मोती नीचे बसने के लिए अनुमति देने के लिए 30-60 एस । तो संभव के रूप में supernatant के रूप में ज्यादा दूर मनका गोली परेशान बिना एक P1000 पिपेट का उपयोग कर हटा दें । गलती से मनका गोली निकालने की संभावना के रूप में एक वैक्यूम aspirator का उपयोग न करें बहुत बढ़ जाती है ।
- दोहराएं चरण ५.५ और ५.६ दो अतिरिक्त बार । लक्ष्य के रूप में अधिक से अधिक मुक्त फ़्लोटिंग HUVEC है कि संभव के रूप में 6 सेमी प्लेट से अलग किया गया है दूर करने के लिए है, जबकि भी कई HUVEC-लेपित मोती, जो FACS ट्यूब में और अधिक जल्दी से मुक्त अस्थाई कोशिकाओं को व्यवस्थित करना चाहिए हटाने नहीं है ।
- मोतियों को पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
6. एक फाइब्रिन जेल में लेपित मोती embedding
- एक P1000 पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक FACS ट्यूब में मनका गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा मीडिया के रूप में निकालें ।
- फाइब्रिनोजेन समाधान के २.५ मिलीलीटर में मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
- पिपेट एक 24 अच्छी तरह से गिलास तली हुई प्लेट के प्रत्येक वांछित अच्छी तरह से thrombin समाधान के 13 µ एल । एक गिलास तली हुई प्लेट में चढ़ाना अंकुरित की इष्टतम इमेजिंग को सक्षम करने के लिए आवश्यक है ।
नोट: अगले कदम से पहले एक अच्छी तरह से अधिक 5-10 मिनट के लिए बैठे thrombin मत छोड़ो । - प्रत्येक कुआं के लिए ०.५ मिलीलीटर मनका/फाइब्रिनोजेन समाधान जोड़ें ।
- हो मनका समाधान अच्छी तरह से reसस्पैंड करने से पहले समाधान pipetting करने के लिए हर बार सुनिश्चित करें ।
- सावधानी रखना सावधानी से पहले से ही अच्छी तरह से मौजूद thrombin में सीधे पिपेट । धीरे पिपेट ऊपर और नीचे 2-3 बार अच्छी तरह से समाधान मिश्रण करने के लिए, सावधानी लेने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले परिचय नहीं है ।
- कुओं के बीच पिपेट टिप को बदलने के लिए सुनिश्चित करें ।
- सावधानी से ले जाने के लिए या किसी भी बिंदु पर थाली परेशान नहीं प्रारंभिक फाइब्रिन थक्के के दौरान, के रूप में किसी भी आंदोलन जेल गठन बाधित हो सकता है ।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हुड में बैठे थाली छोड़ दें ।
- सावधानी से एक अतिरिक्त 1.5-2 एच के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए जेल पूरी तरह से जमना अनुमति
7. फाइब्रिन जेल के शीर्ष पर चढ़ाना Fibroblasts
- स्थिर जेल के पिछले 30 मिनट के दौरान, अलग सामांय मानव फेफड़े Fibroblasts (NHLF) के रूप में इस प्रकार है:
- पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं की एक T175 कुप्पी धो लें, तो सेल टुकड़ी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- पूरा मीडिया में २०,००० कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर NHLF reसस्पेंड ।
नोट: NHLF कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% FBS और 1% पेनिसिलिन Streptomycin के साथ पूरक के साथ प्रसंस्कृत किया जा सकता है ।
- प्लेट एक अच्छी तरह से और मशीन में वापस जगह के जेल पर NHLF सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर ।
- बदलें पूरा मीडिया परख की अवधि के लिए हर दूसरे दिन ।
8. फाइब्रिन जेल में मनका आरोपण के बाद 2-7 दिन के पाठ्यक्रम पर अंकुरण की पुण्यतिथि । अंकुरण के लिए आवश्यक समय की लंबाई बीतने और HUVEC के बहुत संख्या पर निर्भर करेगा ।
9. अंकुरण परख का निर्धारण
- एक बार पर्याप्त अंकुरण के लिए उपचार समूहों के बीच एक phenotypic अंतर का निर्धारण करने में सक्षम हो गया है, सभी कुओं को धोने के साथ एक बार पंजाब के 2 मिलीलीटर ।
- एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल टुकड़ी समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में थाली जगह है ।
- मशीन से प्लेट निकालें और प्लेट के किनारों पर टैप करें ।
नोट: इस कदम का उद्देश्य के रूप में जेल में एंटीबॉडी पैठ की सुविधा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जेल के इमेजिंग के लिए संभव के रूप में फाइब्रिन जेल के शीर्ष पर बढ़ रही NHLF कोशिकाओं के रूप में से कई को दूर करने के लिए है । सेल टुकड़ी समाधान के साथ कुल गर्मी समय NHLF हटाने का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । शोधकर्ताओं ने सेल टुकड़ी समाधान जेल में घुसना और भीतर endothelial संरचनाओं बाधित शुरू हो सकता है के रूप में समय की अत्यधिक अवधि के लिए जेल मशीन नहीं करने के लिए आगाह कर रहे हैं । - एक बार NHLF कोशिकाओं की एक पर्याप्त राशि हटा दिया गया है, पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ सेल टुकड़ी समाधान बुझाना ।
- महाप्राण एक वैक्यूम aspirator का उपयोग करते हुए रेग्युलेटर NHLF और मीडिया को एक बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ धो दें ।
- पंजाब में 2% paraformaldehyde समाधान के ३०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
- 2% paraformaldehyde समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से 3 बार धो लो ।
नोट: कृपया 2% paraformaldehyde समाधान उचित रूप से पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा (ईएचएस) दिशा निर्देशों के अनुसार निपटान ।- एक अच्छी तरह से पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 4 ° c पर स्टोर जब तक दाग या अंकुरित छवि के लिए तैयार है ।
10. अंकुरित परख का दाग
- एक अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर 30 से ४५ मिनट के लिए गर्मी के लिए पंजाब में ०.५% ट्राइटन-एक्स १०० के ३०० µ एल जोड़ें ।
- एक निर्वात aspirator का प्रयोग, ट्राइटन-X100 को हटाने और 5 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब में 3 बार धो लो ।
- प्रत्येक जेल के लिए समाधान अवरुद्ध के ५०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
नोट: ब्लॉकिंग समाधान निम्न घटकों से बना है: 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 5% FBS, ०.१% के बीच-20, और 1% आनटिसम (एक ही प्रजाति है जो से अपने माध्यमिक एंटीबॉडी प्राप्त कर रहे हैं का उपयोग करें) पंजाब में. - एक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान निकालें और एक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान दाग के ३०० µ एल जोड़ें ।
नोट: धुंधला समाधान अवरुद्ध समाधान के रूप में ही है, लेकिन आनटिसम वर्तमान के बिना । लेखकों को 1:400 से 1:200 की कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीनिंग सफलता मिली है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए धुंधला समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी गर्मी ।
- महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और धो 20 मिनट के लिए ०.५% के बीच के साथ टीबीएस में 3 बार कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर प्रत्येक । तीसरे धोने के बाद, ताजा धोने बफर के साथ फिर से बदलें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान ।
- फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए धुंधला समाधान में 1:1000 पतला ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला समाधान निकालें और 20 मिनट के लिए 5 बार धो टीबीएस के साथ एक कमरे के तापमान पर कोमल कमाल के साथ ०.५% के बीच युक्त ।
- पंजाब में परमाणु दाग पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
नोट: इस प्रोटोकॉल Hoechst के साथ बड़ी सफलता मिली है पंजाब में 1:10000 पतला ।
नोट: इमेजिंग करने से पहले परमाणु धुंधला समाधान निकालने की कोई आवश्यकता नहीं है । - धुंधला करने के लिए इष्टतम फ्लोरोसेंट संकेत पर कब्जा पूरा करने के कुछ ही दिनों के भीतर छवि ।
11. अंकुरण परख ठहराव
- अंकुरित होने के बाद, छवि फ़ाइलों को ImageJ में आयात करें और अंकुरित लंबाई को मापने के लिए स्प्राउट्स की संख्या, या लाइन टूल की गणना करने के लिए count टूल का उपयोग करे ।
नोट: अंकुरित एक से अधिक लंबाई या मनका जिसमें से वे अंकुरित कर रहे है के व्यास के बराबर के साथ endothelial की दखलंदाजी के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । 11 अंकुरित लंबाई के बिंदु से दूरी के रूप में मापा जा सकता है जिस पर अंकुरित अंकुर की नोक को मनका के बंद फैला हुआ शुरू होता है । मनका प्रति औसत अंकुर लंबाई और मनका प्रति अंकुरित की औसत संख्या अंकुरित angiogenesis में जीन मुंह बंद करने के phenotypic प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोगी मैट्रिक्स हैं । मोतियों की औसत संख्या जिसमें प्रति उपचार समूह कम से कम एक अंकुर भी अंकुरित होने की मजबूती का आकलन करने के लिए एक मीट्रिक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है एक तंग एसोसिएशन के दो सेल प्रकार इन विट्रो में, और pericytes की उपस्थिति (चित्र 1a, बी) अंकुरण की घटना पूरक । प्रोटोकॉल भी प्रभावी मुंह बंद करने (जैसे endothelial कोशिकाओं या PDGFRβ में pericytes में VEGFA के रूप में विशेष रूप से) के हित के एक सेल प्रकार में ब्याज की एक जीन के (आरएनए हस्तक्षेप के माध्यम से उदा)7, 12 परख के दौरानसक्षम बनाता है, जो परख में अंकुरण phenotype के निषेध अनुवाद कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल को रोजगार शोधकर्ताओं के लिए एक मानक endothelial सेल प्रदर्शन करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है-केवल pericyte के समानांतर में अंकुरण परख लेपित अंकुरण परख और अधिक अच्छी तरह से संवहनी कार्यों में pericytes के अद्वितीय योगदान की जांच और phenotypes का अध्ययन किया जा रहा है ।
इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित शर्तों को पर्याप्त रूप से लेपित मोती (चित्रा 2a, ख) कि फाइब्रिन जेल में मजबूत अंकुरण से गुजरना करने में सक्षम हो जाएगा प्राप्त करने के लिए पालन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । लेखकों ने पाया है कि pericytes के एक अतिरिक्त (जैसे pericytes 1 10T1 के अनुपात में लेपित/2 से 1 HUVEC) पूरी तरह से और बाद में अच्छी तरह से अलग संवहनी संरचनाओं विचार अक्षमता के pericyte वृद्धि में परिणाम ।
चित्र 1. Pericytes कसकर मनका अंकुरण परख में endothelial वाहिकाओं के साथ सहयोगी । (एक) HUVEC केवल लेपित मोतियों के साथ मानक अंकुरण परख । (ख) pericyte अंकुरण परख के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां प्रदर्शित करता है कि अंकुरण परख में endothelial जहाजों के आसपास pericytes लपेटो, लेकिन उनके अंकुरण बाधा नहीं है । नीला Hoechst (नाभिकीय दाग) है; लाल CD31 (endothelial दाग) है, और हरे रंग की Desmin (pericyte दाग) है । सभी स्केल सलाखों, ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 2. लेपित मोती एक मोटा, गोल्फ-उपस्थिति की तरह गेंद है । नग्न microcarrier मोती (एक) पूरी तरह से चिकनी सतह है, जबकि उचित लेपित मोती फाइब्रिन जेल आरोपण (ख) के लिए तैयार है एक मोटा, गोल्फ की तरह दिखने की गेंद है । स्केल बार, ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल निस्र्पक के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जटिल चरणों और अंकुरण angiogenesis के heterotypic सेलुलर बातचीत शोधकर्ता को सक्षम करने के लिए आनुवंशिक और इमेजिंग दृष्टिकोण को रोजगार के लिए पूरी तरह से यंत्रवत जांच का संचालन । जब परख प्रदर्शन, यह आवश्यक है कि मोतियों की कुशल endothelial कोटिंग मनका आंदोलन कदम के दौरान जगह लेता है । गरीब endothelial कोटिंग स्पष्ट किया जाएगा, अगर मोतियों को एक गोल्फ की गेंद की तरह किसी न किसी सतह अगली सुबह जेल आरोपण से पहले और इसके बजाय पूरी तरह से चिकनी दिखाई नहीं दिखाई है । ध्यान रखना सुनिश्चित करें कि मोतियों को पर्याप्त रूप से प्रत्येक आंदोलन कदम के दौरान reसस्पैंड कर रहे है जोरदार ट्यूबों के लिए endothelial कोशिकाओं को मनका सतह के अधिकतम प्रदर्शन की अनुमति है, लेकिन इतना आक्रामक है कि यह endothelial कोशिकाओं के कारण पहले से ही नहीं से जुड़ी हो मोतियों से न्यारा.
pericytes को परख में जोड़ते समय यह आवश्यक है कि 1 pericyte तक 5 endothelial कोशिकाओं का अनुपात बनाए रखा जाए । pericytes के एक अतिरिक्त उंहें बढ़ने का कारण बनता है और परख के दौरान endothelial कोशिका आबादी से आगे निकल, और pericytes में एक कमी वाहिकाओं के गरीब कवरेज का कारण बनता है । यदि उपयुक्त कोशिका घनत्व बनाए रखा है, लेकिन वाहिकाओं के गरीब pericyte कवरेज अभी भी मनाया जाता है, pericytes के साथ आंदोलन के समय को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है । यह अनुशंसित नहीं है कि कक्ष संख्याएं परिवर्तित की जाएं । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए केवल 4 घंटे के लिए endothelial कोशिकाओं के साथ मोतियों कोट हो सकता है, तो मनका और सेल समाधान reसस्पैंड और मीडिया को हटाने के एक बार मोतियों की है, लेकिन इससे पहले कि कोशिकाओं बसे है से endothelial कोशिकाओं को हटाने , तो pericytes में जोड़ने और एक अतिरिक्त घंटे के लिए हर 20 मिनट आंदोलन ।
फाइब्रिन थक्का में लेपित मोती embedding, यह भी थक्का गठन के दौरान थाली में खलल न डालें द्वारा जेल की अखंडता को परेशान नहीं करने के लिए आवश्यक है । मैट्रिक्स गठन के विघटन ंयायपालिका अंकुरण में परिणाम हो सकता है । यह भी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि उचित मनका घनत्व जेल में बनाए रखा है । यदि मोतियों की आबादी भी घने है, तो एक दूसरे को करीब निकटता में मोती पड़ोसी मोतियों की अंकुरण को प्रभावित करेगा और एक दूसरे और anastomose की ओर अंकुरित करने के लिए शुरू हो जाएगा । शोधकर्ता और निस्र्पक पोत पोत बातचीत में ब्याज के अंतिम लक्ष्य पर निर्भर करता है, मनका घनत्व को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, जेल के भीतर एक दूसरे के करीब निकटता में अलग मोतियों और मोतियों की एक विषम आबादी मोटे तौर पर चर अंकुरण phenotypes दे सकते हैं । मनका घनत्व मनका समाधान की मात्रा में फेरबदल द्वारा समायोजित किया जा सकता है प्रोटोकॉल के आंदोलन के कदम के दौरान FACS ट्यूबों जोड़ा, या फाइब्रिन समाधान की मात्रा को बदलने के लिए जेल आरोपण से पहले मोतियों को reसस्पेंड किया ।
यह भी आवश्यक है कि २०,००० प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं के घनत्व पर स्वस्थ NHLFs प्रत्येक फाइब्रिन थक्का के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है । कृपया ध्यान दें कि सक्रिय रूप से विभाजित NHLFs द्वारा आपूर्ति की वृद्धि कारकों की सतत आपूर्ति परख के दौरान मजबूत अंकुरण के लिए आवश्यक हैं । NHLF-वातानुकूलित EGM2 पर्याप्त विकल्प नहीं है । 13 अगर गरीब अंकुरण परख के दौरान मनाया जाता है, यह सिफारिश की है कि पूरा मीडिया की एक ताजा बोतल और NHLF कोशिकाओं के एक नए, स्वस्थ बीतने का इस्तेमाल कर रहे हैं ।
हालांकि इस परख के लिए एक बड़ा संकल्प पर सेलुलर और angiogenesis की phenotypic जटिलता पता शुरू होता है, यह अभी भी एक सरलीकृत प्रणाली सच है, vivo संदर्भ में सापेक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, इस परख में होने वाली अंकुरण angiogenesis एक स्वस्थ, शारीरिक संदर्भ के रूप में ट्यूमर angiogenesis के रूप में एक रोग संदर्भ के खिलाफ के रूप में अधिक अनुरूप है । इस विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों अतिरिक्त सेल प्रकार (जैसे प्रतिरक्षा कोशिका आबादी है कि angiogenic प्रतिक्रियाओं को मिलाना के रूप में) की शुरूआत में शामिल हो सकते है heterotypic सेलुलर इस जटिल प्रक्रिया में शामिल बातचीत दोहराऊंगा । बाहरी तनाव का परिचय-फाइब्रिन जेल में अंकुरित जहाजों के लिए करीब निकटता में एंबेडेड ट्यूमर के रूप में-इस तरह के रोग angiogenesis अनुकरण करने के लिए इन विट्रो में भी अधिक पूरी तरह से अनुमति देने के लिए नियोजित किया जा सकता है, के यंत्रवत लक्षण वर्णन रोग संदर्भों में सक्रिय आणविक रास्ते. इन अग्रिमों एक अधिक नियंत्रित सेटिंग में angiogenesis के जटिल चरणों का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं की क्षमता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण होगा, अंततः लक्ष्यीकरण के लिए उपंयास चिकित्सीय रास्ते की खोज और अधिक गहराई के लक्षण वर्णन में सक्षम रोग angiogenesis.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । विक्टोरिया Bautch और उपयोगी चर्चा और मानक मनका अंकुरित परख शर्तों और एक अंकुरित परख दाग प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर सलाह के लिए यहोशू बाउचर । S.H.A. पुरस्कार 5T32 GM007092 के तहत जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से एक अनुदान द्वारा भाग में समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
