Summary
מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.
Abstract
אנגיוגנזה הגידול של כלי חדש מ להערכת הקיימת מראש והוא מרכיב חשוב של תהליכים ביולוגיים רבים, כולל מופרה, ריפוי פצעים, הגידול ופיתוח גרורות, עינית ומחלות לב וכלי דם. יעיל במבחנה בדגמי לסכם את הביולוגיה של אנגיוגנזה יש צורך ללמוד את התהליך הזה ולזהות מנגנונים של רגולציה זה ניתן לפלח בסופו של דבר הרומן אסטרטגיות טיפוליות בהתאם. חרוז אנגיוגנזה וזמינותו הוכח בעבר כדי לסכם בשלבים רבים של לבלוב אנדותל במבחנה. אולם, מגבלה של זה וזמינותו היא מחסור של אנדותל – ציור קיר התא אינטראקציות, אשר הם המפתח ברגולציה פנוטיפי המולקולריים של תאי אנדותל לתפקד ויוו. פרוטוקול הנקובים להלן מציג מתודולוגיה שילוב של ציור קיר תאים לתוך חרוז אנגיוגנזה וזמינותו ומדגים קשר חזק של תאי אנדותל, pericytes במהלך נבטי חוץ גופית בתוך. הפרוטוקול מפרט גם במתודולוגיה לביצוע יעיל להחרשת גנים היעד באמצעות siRNA בתאי האנדותל ללימודי מכניסטית. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק assay במבחנה הולם יותר מודלים של סוגי תאים מגוונים מעורב הלבלוב אנגיוגנזה, והוא מספק פלטפורמה פיזיולוגית-רלוונטיים יותר טיפולית מגוונת גילוי הרומן מנגנוני רגולציה אנגיוגנזה.
Introduction
אנגיוגנזה חיוני מופרה המתאים, ריפוי פצעים, היא גם משחקת את תפקידי המפתח רבים מחלות כולל סרטן התקדמות1 ועורקים המחלה. 2 , 3 יש הבנה טובה יותר של כיצד אנגיוגנזה מתרחשת במהלך התפתחות רגילה, כיצד להפעילה בהקשרים פיפטות, הינה קריטית לפיתוח של הרומן, יעיל הרפוי. נאמן במבחנה בדגמי לסכם את השלבים החשובים ואת סוגי תאים מעורב אנגיוגנזה ויוו נדרשים כדי לאפשר לחוקרים כדאי לאפיין את המנגנונים המולקולריים נהיגה אנגיוגנזה, תגליות הרומן בתקנה אנדותל.
Nakatsu ו יוז יש אופטימיזציה של assay חרוז נבטי אשר הם הפגינו עובר בשלבים ידועים רבים של לבלוב אנגיוגנזה. 4 , 5 מטרת השיטה המובאת כאן היא לבנות וזמינותו אופטימיזציה על ידי Nakatsu ו יוז על ידי שילוב perictyes וזמינותו, כך ניתן לשלב את התפקידים paracrine ו- juxtracrine של ציור קיר תאי אנדותל תא הלבלוב ב מחקרים חדשניים אנגיוגנזה. Pericytes הם תאים ציור קיר המוגדרות על-ידי התפקיד שלהם התאים לשמור קרוב מגע פיזי עם תאי אנדותל עקב שלהם להיות מוטבע בתוך קרום המרתף כלי הדם. 6 Pericytes ותאי אנדותל לעסוק מורכבים צולבות לדבר באמצעות איתות המסלולים כולל חריץ איתות, אנג-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, ועוד רבים אחרים. 7 , 8 דגמים העכבר בנכונותם איתות המסלולים האלה מדגימים pericyte המסכן כיסוי של פיתוח להערכת ב מופרה, שמוביל שיפוץ כלי הדם המסכן, להערכת תפקוד לקוי. 7 . בנוסף, התפקיד של pericytes ב אנגיוגנזה פיפטות הוא חשוב, אבל לעתים קרובות מוערכת. לדוגמה, תכונה ייחודית של הגידול להערכת היא כלי הם יותר ילדותי דולפים, לקוי בשל כיסוי עניים pericyte. 9 שהוא הוצע כי נוכחות או היעדרות של pericytes באופן משמעותי משפיע על פנוטיפ של גידול כלי דם והוא מתווך חשוב של תגובות אנטי-אנגיוגנטי וטיפולים antitumor. 9 . לפיכך, כולל התפקיד של pericytes ב במבחנה מבחני הוא מפתח ללכוד יותר לחלוטין על מנגנוני רגולציה אנדותל חשוב.
למרות שיש מבחני במבחנה , לשעבר vivo רבים מועסקים כיום ללמוד אנגיוגנזה, ישנם חסרונות לשקול בכל אחד מהם. כמה, כמו התפשטות אנדותל, מבחני ההעברה אנדותל, הופכות לפשוטות יותר מדי ולהתמקד על פונקציה אחת אנדותל באווירה מבודדת על תרביות רקמה פלסטיק. 10 מבחני אחרים מתרחשים בסביבה עוד 3 מימדי (3D), כגון Matrigel צינור היווצרות וזמינותו,10 אבל מבחני אלה הם עדיין oversimplified להתמקד יותר על היכולת של תאי אנדותל כדי להעביר ויוצרים דה נובו כלי דם מבנים, בניגוד מגיחה להערכת הקיימת מראש. יתר על כן, אף אחד אלה מבחני לשלב סוגי תאים ציור קיר. Ex-vivo מודלים כגון הטבעת אבי העורקים וזמינותו המשלבים pericytes נוכח האיבר המארח, אך מניפולציה גנטית של מודלים אלה הוא מאתגר יותר בשל הצורך של יצירת עכבר נוקאאוט או הטרנסגניים דגמי מסלולים מעניינים. החרוז הלבלוב assay אידיאלי כי זה מודלים הלבלוב אנדותל, הפצה, העברה ו אפילו השקה לומן היווצרות במטריצה תלת-ממד. 4 וזמינותו מאפשר בנאמנות להערכת מכניסטית בשלבים שונים רבים של לבלוב, תוך מתן אפשרות של שינוי גנטי ישיר של תאי אנדותל או pericytes באווירה מבוקרת יותר. קרישי פיברין המכיל את החרוזים נבטי יכול להיות בקלות קבוע, צבעונית, עם תמונה בשלבים שונים של לבלוב; נבטים אלה גם להנחה בתוך תא הדמיה חיה כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של לבלוב. המתודולוגיה המוצגת כאן הינו אידיאלי עבור לימוד מנגנונים בסיסיים של אנגיוגנזה דרך ב phenotyping עומק וניתוח מעמיק של המסלולים מופעלים במהלך אנגיוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
יום 1:
1. ארעי תרביות תאים של תאי אנדותל
- אם רצונך בכך, לבצע תרביות תאים ארעית של האדם הטבור וריד אנדותל תאים (HUVEC) באמצעות רגולציה-ג'ין oligonucleotides (למשל מיקרו-RNAs או RNA קטנים מפריעות (siRNA)) הכימית lipofectamine המתאים על פי הוראות היצרן.
הערה: פרוטוקול זה יש לו הצלחה גדולה ביצוע transfections הפוכה עם רצפי siRNA מותאם אישית, ריאגנט תקנים המסחרי (ראה טבלת חומרים). המחברים לא בחנו אחרים תקנים לפרוטוקולים של ריאגנטים עם זה וזמינותו. השלבים תרביות תאים לאחור באמצעות של ריאגנטים המפורטים להלן: - SiRNAs לשקם lyophilized או מיקרו Rna-ריכוז של 20 מיקרומטר במים חינם נוקלאז.
- הופך תרביות תאים פתרונות-היחס הבא: 1 מ"ל של כל אמצעי אחסון חינם סרום עם µL 9 של siRNA או microRNA.
- להתסיס את הפתרון ולאפשר תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף µL 18 של תרביות תאים ריאגנט לפתרון, להתסיס.
- לאפשר את הפתרון דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20-40 דקות, לזעזע את הפתרון כל 10-15 דקות משך הדגירה.
- בעוד הוא המקננת הפתרון תרביות תאים, ניתוק HUVEC באמצעות פתרון ניתוק התא (למשל, Accutase). בשביל בקבוקון T175, לשטוף את הבקבוק עם 10 מ"ל של פוספט Buffered מלוחים (PBS), הוסף 5 מ של פתרון ניתוק התא ואז דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הוסף 5 מ של מדיה מלאה הבקבוק T175, להסיר את התליה תא מן הבקבוק צנטריפוגה-1200 סל ד למשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק ולאחר resuspend בגדר תא-צפיפות של תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל מ ל EGM2.
הערה: פרוטוקול זה היה הצלחה גדולה משימוש אנדותל תא מדיום הגידול (EGM2) המכיל ערכת כדור רגיל גורם גדילה, כמו גם נוספים 10% FBS. - ברגע הפתרון תרביות תאים סיים המקננת, צלחת 1 מ"ל של פתרון צלחת 10-ס מ, ולהוסיף 1 מ"ל של השעיה HUVEC על העליונה.
- הוסף אוטם 7 נוספים של התקשורת מלאה להביא את עוצמת הקול הסופי בצלחת ס מ-10 מ ל 9.
- להמציא לפחות שתי צלחות 10 ס מ שווה של תאים עבור כל תנאי תרביות תאים להבטיח כי יש מספיק תאים זמינים עבור מאוחר יותר בשלבים וזמינותו.
הערה: תנאים אלה לגרום ריכוז העבודה הסופית של ג'ין oligonucleotide התקינה של 20 ננומטר. החוקרים מצאו תנאים אלה את התוצאה 60-80% נוק-אאוט של ביטוי גנים עבור המטרות שלהם עניין. חוקרים אחרים ייתכן שיהיה צורך לייעל את התנאים תקנים בהתאם לצרכיהם ניסיוני. - החלפת התוספת פוסט 4-6 h מדיה של מתחמי siRNA עם מדיה מלאה טריים.
הערה: פרוטוקול זה פותחה באמצעות מעבר HUVEC 1-2.
יום 2
2. ציפוי של חרוזים Microcarrier עם תאי אנדותל
- לשקם microcarrier חרוזים (למשל, Cytodex 3)-ריכוז של 60,000 חרוזים/mL PBS ו אוטוקלב.
הערה: חרוזים microcarrier לבוא ריכוז של 3 x 106 חרוזים לגרם. לשקם את החרוזים ביחס של 20 מ ג של חרוזים לכל מיליליטר PBS להשיג חרוז צפיפות של 60,000 חרוזים/mL. - Aliquot 1 מ"ל של המדיה מלאה לתוך מספר עגול עם תחתית צינורות פלורסצנטיות מופעל התא מיון (FACS) הרצוי.
- פיפטה 20 µL microcarrier חרוז השעיה לתוך כל שפופרת (שמור על מנת להבטיח כי הפתרון חרוז טוב resuspended לפני pipetting).
הערה: ככל הנראה תהיה השתנות דרמטי ירידה בריכוז העבודה הסופית של חרוזים נוכח השעיה חרוז microcarrier נתון. חרוזים ניתן בקלות לדבוק הצדדים של מיכלי פלסטיק, זכוכית, אשר יכול לשנות באופן משמעותי חרוז ריכוז בפתרון. אמצעי האחסון המתאים ביותר של חרוז פתרון נוסף הצינור FACS עבור כל אצווה של השעיה חרוז microcarrier צריך להיקבע מדעית על ידי החוקר. המספרים המובאים כאן נועדו לשרת יותר כנקודת התחלה. באופן אידיאלי, צריך להיות מותאם תנאים אז יש 10-20 חרוזים מוטבע בתוך הג'ל פיברין לכל טוב בצלחת טוב 24 בסוף וזמינותו. ראה דיון נוסף במקטע דיון להלן לגבי אופטימיזציה של חרוזים מספרים עבור וזמינותו. - ניתוק transfected HUVEC 24 פוסט h תקנים באמצעות הפתרון ניתוק התא כדלקמן:
- לשטוף כל צלחת 10 ס מ של תאים עם 5 מ של PBS, להוסיף 2 מ"ל של הפתרון ניתוק התא ואז דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- Resuspend התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בתקשורת מלאה.
- להוסיף 1 מ"ל של התא השעיה (כלומר עונה 1 פרק 106 HUVEC) כל שפופרת FACS המכילה חרוזים.
- בעדינות להתסיס את הצינורות FACS כל 20 דקות למשך 4 h ב- 37 מעלות צלזיוס (אם ממשיכים לשלב 3.4) או 2.5 עד 3 h (אם ממשיכים לשלב 3.2).
הערה: זה המשך והתדירות של עצבנות מדעית נקבע על ידי חוקרים קודמים למי יש אופטימיזציה החרוז בסיסי הלבלוב וזמינותו. 4 שאר התדרים של עצבנות, המשכים של השלב ציפוי חרוז לא נבדקו על-ידי המחברים.
3. רציפים ציפוי של Pericytes על חרוזים מצופים HUVEC Microcarrier
- בגין ניתוק 10T1/2 תאים (pericytes) באמצעות הפתרון ניתוק התא (טריפסין) כדלקמן:
- לשטוף בקבוקון T175 עם 10 מ"ל ל- PBS, ולאחר מכן הוסף 5 מ של טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- Resuspend 10T1/2-ריכוז של 2 X 105 תאים/0.5 mL בתקשורת מלאה.
הערה: תאים נרכשו מ אמריקה סוג תרבות אוסף (בקרת האוויר).
הערה: תרבות 10T1/2 תאים במינימום הכרחי בינוני (MEM) בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין.
- לאחר 2.5 עד 3 h של המפלגה בהסתה על חרוז + פתרון HUVEC, המתן 5 דקות כדי לאפשר חרוזים בין לתרשים HUVEC להתיישב לתחתית הצינור.
- הסר 0.5 מ"ל של התקשורת מלאה כל שפופרת באמצעות פיפטה P1000 ולהוסיף 2 x 105 10T1/2 בתקשורת מלאה באמצעי אחסון של 0.5 מ ל כל שפופרת FACs. להתסיס את הפתרון תא, חרוז ולאחר מכן להמשיך דגירה ב 37 º C. המשך להתסיס כל 20 דקות עד החרוזים יש היה נסער עבור סכום כולל של 4 שעות.
הערה: היחס בין 5 HUVEC: 1 pericyte על החרוזים הוא חיוני כדי לשמור על הכיסוי המתאים pericyte של כלי.
הערה: השלבים החלופיים הבאים ניתן בעקבות במקום בשלב זה של הפרוטוקול: - להתסיס חרוזים, HUVEC רק במשך 4 שעות.
- לאחר 4 שעות של ציפוי HUVEC של חרוזים microcarrier תושלם, להתסיס הצינורות בפעם האחרונה, המתן 30-60 s ולאחר מכן להסיר לאלתר את 1.5-1.75 מ של פתרון מהצינור FACS.
הערה: זה אמור לאפשר מספיק זמן עבור רוב החרוזים להתיישב בזמן HUVEC לתרשים רבים בתקשורת יוסרו.- להוסיף 2 X 105 10T1/2 בתקשורת מלאה ולהביא את עוצמת הקול של FACS צינור עד 2 מ"ל.
- בעדינות להתסיס הצינורות FACS כל 20 דקות במשך שעה נוספת.
- לאחר לזעזע תושלם, בעדינות להתסיס הצינורות בפעם האחרונה, מיד להסיר את הפתרון כולו (2 מ"ל), ולהוסיף אותו צלחת 6 ס מ. להוסיף אוטם 3 נוספים של התקשורת מלאה כל צלחת, למקם את הצלחות בחממה 37 º C למשך הלילה.
יום 3
4. הכנה של פיברין ג'ל פתרונות
- להכין עבודה פתרונות של aprotinin-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBS ו תרומבין-50 יחידות/mL.
הערה: מלאי גדול של כל אחד הפתרונות יכול להיות עשוי ומאוחסנים ב 4 ° C לפחות לשנה. - הופך פתרון טריים של פיברינוגן-ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. לעשות מספיק לפתרון יש 2.5 מ של פתרון למחזור FACS נסער.
- חממו את הפתרון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאפשר כל פיברינוגן ללכת על פתרון.
- הוסף µL 37.5 בפתרון aprotinin לכל 1 מ"ל של פיברינוגן פתרון.
- מסנן סטרילי הפתרון, להניח בצד בטמפרטורת החדר.
5. הכנת חרוזים ג'ל השרשה
- לבחון את הכלים המכיל את החרוזים מצופים microcarrier תחת המיקרוסקופ באמצעות המטרה X 20 כדי להבטיח כי כל חרוזי יש כבר מספיק מצופה על-ידי תאי אנדותל.
- נמרצות pipette הפתרון מצופים של תאים כדי לנתק אותם מן הלוח 6 ס מ ומניחים את הפתרון לתוך צינור. לשטוף את הצלחת 2 X פעמים נוספות עם תקשורת מלאה, העברת הצינור כדי לאסוף את כל חרוזי שיורית, זה עשוי להיות דבקה את הצלחת.
- להימנע מהחדרה בועות אוויר ולהשתמש פיפטה p1000 כדי למזער את מאמץ גזירה על חרוזים מצופים תא אנדותל.
- אם הערכת יעילות תמונות ציפורים siRNA בתאי אנדותל נחוצה, בשלב 2, ודאו שיש לכם צלחת של חרוזים מצופים HUVEC בלבד. לאחר מכן במהלך שלב זה, (5.2), לנתק את החרוזים, לאסוף את השארית ש-HUVEC מחובר לצלחת RNA בידוד וניתוח qPCR.
- המתן 3 דקות כדי לאפשר את החרוזים בפתרון להתיישב לתחתית הצינור.
- להסיר כמה תגובת שיקוע ככל האפשר מבלי להפריע בגדר חרוז באמצעות טיפ פיפטה p1000 (אל תשתמש ליניקת אבק).
- להוסיף 1 מ"ל של התקשורת מלאה כל שפופרת, resuspend את החרוזים.
- המתן 30-60 s כדי לאפשר את החרוזים ליישב את העניין. ואז להסיר כמה תגובת שיקוע ככל האפשר באמצעות פיפטה P1000 מבלי להפריע בגדר חרוז. אל תשתמש/י ליניקת אבק כמו הסיכוי של בטעות הסרת בגדר חרוז הוא גדל באופן משמעותי.
- חזור על צעדים נוספים 5.5 ו- 5.6 פעמיים. המטרה היא להסיר כמה HUVEC לתרשים זה אולי יש כבר מנותק מהצלחת 6 ס מ ככל האפשר, בעת הסרת לא חרוזים מצופים HUVEC רבים מדי, אשר להסתפק בצינור FACS במהירות רבה יותר מאשר תאים לתרשים.
- להוסיף 1 מ"ל של מדיה להשלים החרוזים.
6. הטמעת מצופה חרוזי פיברין ג'ל
- להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להפריע בגדר חרוז כל צינור FACS באמצעות פיפטה של P1000.
- Resuspend את החרוזים ב 2.5 מ של פיברינוגן פתרון.
- פיפטה 13 µL של תרומבין פתרון לתוך כל הרצוי טוב של צלחת עם תחתית זכוכית 24-. טוב. ציפוי בצלחת תת חיוני עבור המאפשרת הדמיה אופטימלית של הנבטים.
הערה: אל תשאירו תרומבין יושב טוב יותר מ 5-10 דקות לפני השלב הבא. - להוסיף 0.5 מ של חרוז/פיברינוגן פתרון טוב לכל.
- הקפד resuspend הפתרון חרוז טוב לפני pipetting את הפתרון בכל פעם.
- קח זהירות בקפידה פיפטה ישירות לתוך תרומבין כבר נוכח הבאר. לאט לאט פיפטה למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים כדי לערבב ביסודיות את הפתרון, לוקח זהירות כדי לא להציג את כל בועות האוויר.
- הקפד לשנות את הטיפ פיפטה בין בארות.
- קח זהירות כדי לא להעביר או להפריע את הצלחת בשלב כלשהו במהלך פיברין הראשונית קרישה, כמו כל תנועה עשוי לשבש את היווצרות ג'ל.
- להשאיר את הצלחת יושבים בשכונה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר בזהירות את הצלחת חממה 37 ° C עבור h-1.5-2 נוספים לאפשר את הג'ל באופן מלא שבמהלכו
7. ציפוי Fibroblasts על גבי הג'ל פיברין
- במהלך האחרון 30 דקות של ג'ל שהשרף מתהווה, ניתוק רגיל האנושית ריאות Fibroblasts (NHLF) כדלקמן:
- לשטוף את בקבוקון T175 של תאים עם 10 מ"ל ל- PBS, ולאחר מכן הוסף 5 מ של פתרון ניתוק התא, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- Resuspend NHLF-ריכוז של 20,000 תאים למ"ל בתקשורת מלאה.
הערה: תאים NHLF יכול להיות תרבותי עם Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין.
- לוח 1 מ"ל של התליה תא NHLF על גבי הג'ל של כל טוב ומניחים בחזרה בחממה.
- שנה מלאה מדיה בכל יום אחר משך זמן וזמינותו.
8. להתבונן הלבלוב במהלך 2-7 ימים לאחר ההשתלה חרוז הג'ל פיברין. משך הזמן הדרוש להנבטת יהיה תלוי המעבר ומספר גדול של HUVEC.
9. קיבוע של לבלוב Assay
- לאחר הלבלוב מספיק התרחש כדי להיות מסוגל לקבוע הבדל פנוטיפי בין קבוצות הטיפול, לשטוף בארות כל פעם אחת עם 2 מ"ל ל- PBS.
- להוסיף 0.5 מ של פתרון ניתוק התא מכל קידוח ולמקם את הצלחת חממה 37 º C למשך 5 דקות.
- הסר את הלוחית של החממה והקש את צידי הלוח.
הערה: מטרתו של שלב זה היא להסיר כמה שיותר התאים NHLF גוברת על גבי הג'ל פיברין ככל האפשר להקל על נוגדן לחדירה הג'ל, כמו גם הדמיה של הג'ל. זמן הדגירה הכולל פתרון ניתוק התא ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי למטב את הסרת NHLF. החוקרים הם הזהיר כדי לא דגירה הג'ל לפרקי זמן מוגזם כמו הפתרון ניתוק התא עשויים לחדור לתוך הג'ל ולהתחיל לשבש את המבנים אנדותל בתוך. - ברגע כמות מספקת של תאים NHLF הוסרו, להרוות את הפתרון ניתוק התא עם 1 מ"ל של התקשורת מלאה.
- מחוק לגמרי את NHLF ואת מדיה באמצעות ליניקת אבק מנותק, לשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מ"ל ל- PBS.
- להוסיף 300 µL של 2% paraformaldehyde פתרון ב- PBS מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- הסר את הפתרון paraformaldehyde 2%, לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אנא השלך 2% paraformaldehyde פתרון הולם לפי הנחיות בטיחות (EHS) ובריאות הסביבה.- להוסיף 1 מ"ל של PBS אחד טוב ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן כתם או תמונה הנבטים.
10. צביעת מונבטים Assay
- להוסיף 300 µL של 0.5% 100 טריטון-X ב- PBS לכל טוב ואני תקופת דגירה של 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- שימוש של העצמות ואקום, להסיר את טריטון-X100 ולשטוף 3 פעמים ב- PBS למשך 5 דקות.
- להוסיף 500 µL של חסימת לפתרון כל ג'ל, דגירה בין לילה ב 4 º C.
הערה: הפתרון חסימה מורכב של הרכיבים הבאים: 1% אלבומין שור (BSA), 5% FBS, 0.1% tween-20 ולהשתמש 1% בנסיוב (מאותו המין שממנה נגזרים שלך נוגדנים משניים) ב- PBS. - הסרת חסימה פתרון מכל קידוח ולהוסיף 300 µL של פתרון מכתימים המכיל נוגדנים הראשי כדי מכל קידוח.
הערה: הפתרון מכתימים הוא אותו כפתרון חסימה, אך ללא בנסיוב הנוכחי. המחברים היו הצלחה המקננת עם נוגדנים ראשי-דילולים של 1:200 כדי 1:400. - דגירה נוגדני העיקרי מכתים פתרון עבור 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
- האחות נוגדן ראשוני פתרון ולשטוף 3 פעמים ב- TBS עם 0.5% tween למשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין. לאחר לשטוף את השלישי, החלף מאגר טריים לשטוף שוב, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- דגירה עם פלורסנט נוגדנים משניים מדולל 1:1000 ב מכתים פתרון 2 h בטמפרטורת החדר.
- הסרת פתרון מכתימים נוגדנים משניים, לשטוף 5 פעמים במשך 20 דקות עם TBS המכילה 0.5% tween בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין.
- לדלל הכתם גרעינית ב- PBS, דגירה בין לילה ב 4 º C.
הערה: פרוטוקול זה יש לו הצלחה רבה עם 1:10000 Hoechst מדולל ב- PBS.
הערה: יש צורך להסיר את הגרעין מכתימים פתרון לפני הדמיה. - תמונה בתוך ימים ספורים של השלמת ההכתמה ללכוד אופטימלי איתות פלורסנט.
11. הלבלוב Assay כמת
- אחרי שיש כבר עם תמונה הנבטים, לייבא את קבצי התמונה ImageJ ולהשתמש בכלי Count כדי לספור את מספר נבטים, או בכלי שורת למדוד אורכים נבט.
הערה: נבטים מוגדרים כפי בליטות אנדותל באורך גדול או שווה לקוטר של החרוז שממנו הם גדלים. 11 ניתן למדוד אורך נבט כמו המרחק בין הנקודה שבה מתחיל נבט בולטות מתוך החרוז עד לקצה נבט. ממוצע נבט אורך לכל חרוז, המספר הממוצע של נבטים לכל חרוז שימושי מדדים להערכת ההשפעות פנוטיפי של ג'ין להחרשת ב הלבלוב אנגיוגנזה. המספר הממוצע של חרוזים המכילים נבט אחד לפחות לכל קבוצה הטיפול יכול גם לשמש מדד של כדי להעריך את היציבות של לבלוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר חזק התאחדות תא שני סוגי במבחנה, ומשלים הנוכחות של pericytes המופע של נבטי (איור 1 א', ב'). הפרוטוקול מאפשר יעיל שתיקה (למשל באמצעות התערבות RNA) של גנים עניין בסוג התא של עניין כמו (VEGFA במיוחד בתאי האנדותל) או PDGFRβ ב pericytes7,12 גם במהלך וזמינותו, אשר ניתן לתרגם את עיכוב של פנוטיפ נבטי ב וזמינותו. חוקרים העסקת פרוטוקול זה מעודדים לביצוע של תקן אנדותל תא בלבד נבטי assay במקביל וזמינותו נבטי מצופים pericyte לחקור באופן יסודי יותר תרומות ייחודיות של pericytes בפונקציות כלי דם פנוטיפים נחקר.
בתנאים המתוארים בתוך פרוטוקול זה חשובים לדבוק על מנת לקבל חרוזים מצופים מספיק (איור 2 א, ב') יוכל לעבור הלבלוב חזקים הג'ל פיברין. המחברים מצאו כי עודף של pericytes (כמו pericytes מצופה ביחס של 10T1 1/2 ל- 1 HUVEC) תוצאה של pericyte יתר של כל טוב ובעקבות חוסר היכולת להבחין מבנים וסקולרית נפרדות בתוך הבאר.
איור 1. Pericytes בחוזקה לשייך אנדותל כלי החרוז הלבלוב assay. (א) assay נבטי סטנדרטי עם חרוזים מצופים היחידה HUVEC. (B) מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של pericyte לבלוב assay מדגימים כי pericytes לעטוף אנדותל כלי וזמינותו נבטי, אבל לא מפריעים שלהם הלבלוב. . כחול זה Hoechst (הכתם גרעינית); אדום זה CD31 (אנדותל כתם), Desmin (pericyte כתם) הוא ירוק. כל גודל ברים, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. חרוזים מצופים יש כדור גולף קשוח, כמו מראה. Microcarrier עירום חרוזים (א) יש משטח חלק לחלוטין, ואילו חרוזים מצופים כראוי לקראת השרשה ג'ל פיברין (B) יש מראה קשוח, כמו כדור גולף. סולם בר, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה אפיון שלבי מורכבים ואינטראקציות הסלולר heterotypic של לבלוב אנגיוגנזה על-ידי הפיכת החוקר להעסיק גישות גנטיות הדמיה לקיים חקירות יסודיות מכניסטית. בעת ביצוע וזמינותו, זה חיוני כי ציפוי אנדותל יעיל של החרוזים מתרחש בתקופת החרוז עצבנות צעדים. מסכן ציפוי אנדותל ייעשה ניכר, אם החרוזים לא מופיעות יש משטח מחוספס דמוי כדור גולף למחרת בבוקר לפני ההשתלה ג'ל, במקום זאת מופיעים חלקים לחלוטין. . שמור על עצמך כדי להבטיח כי החרוזים הם מספיק resuspended במהלך כל שלב עצבנות מאת נמרצות לזעזע את צינורות כדי לאפשר חשיפה מקסימלית של המשטח חרוז לתאי אנדותל, אבל לא באגרסיביות אז זה גורם תאי אנדותל כבר מצורף להיות מנותק מן החרוזים.
בעת הוספת pericytes לתוך וזמינותו, זה חיוני כי היחס בין לתאי אנדותל 5 1 pericyte נשמר. עודף של pericytes גורמת להם והדבר, לעקוף את אוכלוסיית תאי אנדותל במהלך וזמינותו, וגורמת חוסר pericytes כיסוי עניים של כלי. אם הצפיפות תאים מתאים נשמר, אך עדיין נצפית pericyte המסכן הכיסוי של כלי, עשוי עצבנות זמן עם pericytes צריך להיות שונה. לא מומלץ כי הם שינו את מספרי הטלפון הנייד. גישה אלטרנטיבית עשוי להיות כדי להרגיע את החרוזים עם תאי אנדותל רק במשך 4 שעות, ואז להסיר תאי אנדותל של כלי התקשורת על-ידי resuspending החרוז, פתרון תא והסרה התקשורת לאחר החרוזים התיישבו אך לפני התאים התיישבו , ואז הוספת pericytes, לזעזע את כל 20 דקות במשך שעה נוספת.
בעת הטבעה החרוזים מצופה בקריש פיברין, זה גם חיוני כדי לא להפריע את תקינות הג'ל על ידי לשבש את הצלחת במהלך היווצרות קריש דם. הפרעה של היווצרות מטריקס עלול לגרום הלבלוב חריגה. . זה גם הכרחי כדי להבטיח כי הצפיפות חרוז מתאים נשמר הג'ל. אם האוכלוסיה של חרוזים צפוף מדי, חרוזים בסמיכות אחד לשני ישפיעו על לבלוב השכנה חרוזים, יתחיל נבט אחד עם השני, anastomose. בהתאם המטרה הסופית של חוקר, עניין אפיון כלי-הקיבול אינטראקציות, צפיפות חרוז ייתכן שתצטרך להיות שונה. עם זאת, אוכלוסייה הטרוגנית של מבודדים חרוזים, חרוזים בסמיכות אחד לשני בתוך הג'ל עשוי לתת פנוטיפים נבטי משתנה במידה רבה. ניתן להתאים חרוז בצפיפות על ידי שינוי הנפח של חרוז פתרון נוסף הצינורות FACS במהלך השלב עצבנות של הפרוטוקול, או על ידי שינוי הנפח של פיברין פתרון נהגה resuspend את החרוזים לפני ההשתלה ג'ל.
. זה גם הכרחי כי NHLFs בריא-צפיפות של תאים 20,000 לכל mL הם מצופה מעל כל clot פיברין. אנא שימו לב כי אספקה רציפה של גורמי גדילה שסופק על-ידי NHLFs באופן פעיל שיחצה הדרוש להנבטת חזקים במהלך וזמינותו. EGM2 מיזוג NHLF הוא לא חלופה מספקת. 13 אם הלבלוב המסכן הוא ציין במהלך וזמינותו, מומלץ כי נעשה שימוש בקבוק טרי מדיה מלאה של קטע חדש, בריא של תאים NHLF.
למרות assay הזה מתחיל להתייחס למורכבות הסלולר ואת פנוטיפי של אנגיוגנזה ברזולוציה גדולה יותר, הוא עדיין מייצג מערכת oversimplified ביחס הקשר ויוו אמיתי. בנוסף, אנגיוגנזה נבטי המתרחשים assay זו דומה יותר הקשר בריא, פיזיולוגיים לעומת ההקשר פיפטות כגון אנגיוגנזה. יישומים עתידיים של שיטה זו עשויה לכלול המבוא של סוגי תאים נוספים (כגון אוכלוסיות תאים חיסוניים לווסת את התגובות אנגיוגנזה) כדי לסכם עוד יותר באינטראקציה תאית heterotypic מעורב בתהליך מורכב זה. גם יכול להיות מועסק המבוא של לחצים חיצוניים - כגון גידול מוטבע בסמיכות כלי נבטי הג'ל פיברין - כדי לדמות אנגיוגנזה פיפטות במבחנה כדי לאפשר יסודית יותר, מכניסטית אפיון מסלולים מולקולריים מופעלת בהקשרים פתולוגי. ההתפתחויות הללו יהיה חשוב לשיפור היכולת של החוקרים ללמוד השלבים המורכבים של אנגיוגנזה באווירה מבוקרת יותר, בסופו של דבר המאפשר גילוי של אפיון מעמיק יותר של מסלולים טיפוליים חדשניים עבור מיקוד פיפטות אנגיוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד"ר ויקטוריה Bautch, ג'ושוע בושה על דיונים מועילים, עצות על אופטימיזציה חרוז סטנדרטי הלבלוב assay והתנאים של assay נבטי מכתים פרוטוקול. S.H.A. נתמך בחלקו על ידי מענק של הלאומית המכון כללי רפואי למדעים תחת פרס 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
