Summary
Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.
Abstract
Angiogenese ist das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßsystem und ist ein wichtiger Bestandteil von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und Entwicklung, Wundheilung, Tumorwachstum und Metastasierung, und Augen und Herz-Kreislauf-Krankheiten. Wirksam in-vitro- Modelle, die die Biologie der Angiogenese rekapitulieren sind erforderlich, entsprechend diesen Prozess zu studieren und Mechanismen der Regulierung, die letztlich ausgerichtet werden können für neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Die Perle-Angiogenese-Assay, der mehrere Phasen der Endothelzellen sprießen rekapitulieren zuvor nachgewiesen in-vitro-. Eine Einschränkung des Assays besteht jedoch ein Mangel von Endothel-Funktion Wandbild Zell-Interaktionen, die Schlüssel für die molekulare und phänotypische Regulierung der Endothelzellen sind in Vivo. Das Protokoll hier stellt eine Methodik für die Einbeziehung der Fototapete Zellen in der Wulst-Angiogenese-Assay und zeigt eine enge Vereinigung von Endothelzellen und Perizyten während der Keimung in Vitro. Das Protokoll enthält auch eine Methode zur effektiven verstummen der Zielgene mit SiRNA in Endothelzellen für mechanistische Studien. Insgesamt bietet dieses Protokolls einen in-vitro- Test, der passender Modelle der verschiedenen Zelltypen sprießen Angiogenese beteiligt, und bietet eine physiologisch relevanten Plattform für therapeutische Beurteilung und neuartige Entdeckung Mechanismen der Angiogenese-Verordnung.
Introduction
Angiogenese ist wichtig, entsprechende Embryogenese und Wundheilung, und es spielt auch Schlüsselrollen bei zahlreichen Erkrankungen einschließlich Krebs Fortschreiten1 und koronare Krankheit. 2 , 3 ein besseres Verständnis der wie Angiogenese auftritt während der normalen Entwicklung, und wie es in pathologischen Situationen reaktiviert wird ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger, wirksame Therapeutika. Treu in-vitro- Modelle, die die wichtigsten Stationen und Zelltypen Angiogenesis in Vivo beteiligt rekapitulieren sind notwendig, um Forscher besser charakterisieren die molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu fahren und neue Entdeckungen machen lassen in Endothelzellen Verordnung.
Nakatsu und Hughes haben eine sprießende Wulst-Assay optimiert, die sie gezeigt haben, die vielen bekannten Phasen der Angiogenese sprießen erfährt. 4 , 5 die hier vorgestellte Methode soll bauen auf den Test von Nakatsu und Hughes durch die Einbeziehung von Perictyes in der Probe, so optimiert, dass die parakrine und Juxtracrine Rollen der Fototapete Zellen in Endothelzellen sprießen einbezogen werden können neuartige Angiogenese Studien. Dadurch werden Fototapete Zellen, die durch ihre Rolle definiert sind, wie Zellen, die pflegen Körperkontakt mit Endothelzellen durch ihre Einbettung in die vaskuläre Basalmembran schließen. 6 Perizyten und Endothelzellen betreiben komplexe Übersprechen über Signalwege einschließlich Kerbe Signaltechnik, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ und viele andere. 7 , 8 -Maus-Modellen einen Mangel an diese Signalwege zeigen schlechte Pericyte Abdeckung Gefäßsystem in Embryogenese, führt zu schlechten Gefäße Umgestaltung und dysfunktionalen Gefäßsystem zu entwickeln. 7 darüber hinaus ist die Rolle der Perizyten im pathologischen Angiogenese wichtig, aber oft unterschätzt. Ein einzigartiges Merkmal des Tumors Gefäßsystem ist beispielsweise, dass die Schiffe unreif, undichte und dysfunktionalen aufgrund schlechter Pericyte Abdeckung sind. 9 es wurde vorgeschlagen, dass das Vorhandensein oder Fehlen von Perizyten dramatisch wirkt sich auf den Phänotyp von Tumor-Blutgefäßen und ein wichtiger Vermittler der Reaktionen auf Anti-angiogenetische und Antitumor-Therapien ist. 9 so ist Schlüssel zu mehr vollständige Erfassung der wichtigen Mechanismen der endothelialen Verordnung einschließlich der Rolle der Perizyten in in-vitro- Tests.
Zwar gibt es viele in-vitro- und Ex-Vivo Tests beschäftigt, Angiogenese zu studieren, gibt es Mängel in jedem betrachten. Einige, wie endotheliale Proliferation und endotheliale Migration Assays werden übermäßig vereinfacht und konzentrieren sich auf eine endotheliale Funktion in einer isolierten Umgebung auf Gewebekultur Kunststoff. 10 andere Assays treten in eine weitere 3 dimensionale (3D) Einstellung, wie Matrigel Rohr Bildung Assay,10 aber diese Tests immer noch stark vereinfacht sind und konzentrieren sich mehr auf die Fähigkeit der Endothelzellen zu migrieren und bilden de Novo vaskuläre Strukturen, im Gegensatz zu sprießen aus bereits bestehenden Gefäßsystem. Darüber hinaus enthalten keines dieser Assays Wandbild Zelltypen. Es gibt ex Vivo Modelle wie die Ring-Aorta-Assay, die Perizyten im Host-Orgel zu integrieren, zu tun, aber genetische Manipulation dieser Modelle ist viel schwieriger, wegen der Notwendigkeit der Generierung von Knockout oder transgenen Mausmodellen von der Wege von Interesse. Das Korn sprießen Assay ist ideal, weil es Endothelzellen sprießen, Proliferation, Migration und sogar Anastomose und Lumen Bildung in einer 3D Matrix Modelle. 4 der Assay erlaubt treu mechanistischen Bewertung von den vielen verschiedenen Phasen des sprießen, wobei noch für direkte genetische Modifikation von Endothelzellen oder Perizyten in einer mehr kontrollierten Umgebung. Das Fibrin gerinnt, enthält die sprießenden Perlen leicht fixiert, gefärbt, und abgebildet in verschiedenen Stadien der Keimung; Diese Sprossen können auch in einer live imaging Echtzeit-Bildgebung von Keimen führen platziert werden. Die hier vorgestellte Methodik ist ideal für das Studium der grundlegenden Mechanismen der Angiogenese durch in Tiefe Phänotypisierung und gründliche Analyse der Wege bei der Angiogenese aktiviert.
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Protocol
Tag 1:
(1) transiente Transfektion von Endothelzellen
- Falls gewünscht, führen Sie eine transiente Transfektion der menschlichen Nabelschnur Vein Endothelial Zellen (HUVECS) mit gen-regulatorische Oligonukleotide (z. B. Mikro-RNAs oder kleine interferierende RNA (SiRNA)) und das entsprechende Lipofectamine Reagenz nach Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Dieses Protokoll hat großen Erfolg reverse Transfektionen mit benutzerdefinierten SiRNA-Sequenzen und einem kommerziellen Transfection Reagens (siehe Materialtabelle) durchführen. Die Autoren haben nicht andere Transfektion Protokolle und Reagenzien mit dieser Assay getestet. Die Schritte für die umgekehrte Transfektion mit den Reagenzien aufgeführt sind wie folgt: - Wiederherzustellen Sie lyophilisierter SiRNAs oder Micro-RNAs in einer Konzentration von 20 µM im freien Wasser Nuklease.
- Machen Transfektion Lösungen im folgenden Verhältnis: 1 mL Serum freie Medien mit 9 µL SiRNA oder MicroRNA.
- Rühren Sie die Lösung und lassen Sie es für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- 18 µL Transfection Reagens der Projektmappe hinzufügen und rühren.
- Lassen Sie die Lösung alle 10 bis 15 min bei Raumtemperatur für 20-40 min, rühren die Lösung für die Dauer der Inkubation auszubrüten.
- Während die Transfektion Lösung Inkubation ist, lösen Sie HUVECS mit einer Zelle Ablösung Lösung (z.B.Accutase). Waschen Sie für eine Flasche T175 die Flasche mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und dann fügen Sie 5 mL der Zelle Ablösung Lösung und inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C für 10 min.
- T175-Flasche fügen Sie 5 mL komplette Medien hinzu, entfernen Sie die Zellsuspension vom Kolben und Zentrifuge bei 1200 u/min für 3 min.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Aufschwemmen der Zelle Pellet bei einer Dichte von 1 X 106 Zellen pro mL in EGM2.
Hinweis: Dieses Protokoll hatte großen Erfolg mit Endothelial Zelle Wachstum (EGM2)-haltigem Medium der standard Wachstumsfaktor-Kugel-Kit sowie zusätzlich 10 % FBS. - Sobald die Transfektion Lösung Inkubation beendet, 1 mL der Lösung in einer 10-cm-Platte-Platte, und fügen Sie 1 mL der Suspension HUVECS an der Spitze.
- Fügen Sie eine zusätzliche 7 mL komplette Medien bringen das Endvolumen in der 10-cm-Platte auf 9 mL.
- Mindestens zwei 10 cm Platten einen Wert von Zellen für jede Transfektion Bedingung um sicherzustellen, dass für spätere Schritte in der Probe gibt es genügend Zellen bilden.
Hinweis: Diese Bedingungen führen zu eine Endkonzentration von Arbeiten von gen regulatorischen Oligonukleotid von 20 nM. Die Autoren haben diese Bedingungen ergeben einen Zuschlag von 60-80 % der Genexpression für ihre Ziele von Interesse gefunden. Andere Forscher müssen möglicherweise Transfektion Bedingungen experimentell bedarfsgerecht zu optimieren. - Tauschen Sie die Medien 4-6 h Post Zugabe von SiRNA-komplexe mit frischen komplette Medien.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde entwickelt mit Durchgang 1-2 HUVECS.
Tag2
2. Beschichtung von Microcarrier Perlen mit Endothelzellen
- Bereiten Sie Microcarrier Perlen (z.B., Cytodex 3) in einer Konzentration von 60.000 Perlen/mL PBS und Autoklaven.
Hinweis: Microcarrier Perlen kommen in einer Konzentration von ca. 3 x 106 Perlen pro Gramm. Bereiten Sie die Perlen in einem Verhältnis von 20 mg Perlen pro mL PBS eine Perle-Dichte von ungefähr 60.000 Perlen/mL zu erhalten. - Aliquoten 1 mL der komplette Medien in die gewünschte Anzahl von runden Talsohle Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS) Röhren.
- Pipette 20 µL Microcarrier Wulst Suspension in jedem Röhrchen (Achten Sie darauf, sicherzustellen, dass die Perle Lösung gut vor dem Pipettieren Nukleinsäuretablette ist).
Hinweis: Es werden wahrscheinlich dramatische Variabilität in die Endkonzentration Arbeiten aus Perlen in einer bestimmten Microcarrier Wulst Suspension vorhanden. Perlen können leicht an den Seiten des Kunststoff- und Glasbehältnissen haften die Wulst-Konzentration in der Lösung stark verändern können. Das am besten geeignete Volumen der Wulst Lösung hinzugefügt, um die FACS-Röhre für jede Charge Microcarrier Wulst Aussetzung müssen durch den Prüfarzt empirisch ermittelt werden. Die hier vorgestellten Zahlen sollen mehr als Ausgangspunkt dienen. Im Idealfall sollten Bedingungen optimiert werden, so gibt es 10-20 Perlen eingebettet in das Fibrin-Gel pro Bohrloch in der 24-well-Platte am Ende des Tests. Sehen Sie weitere Diskussion im Diskussion Abschnitt unten zur Optimierung der Perlen-Nummern für den Assay. - Lösen Sie transfizierten HUVECS 24 h Post Transfektion mit der Zelle Ablösung Lösung wie folgt:
- Jede 10-cm-Platte von Zellen mit 5 mL PBS, waschen und dann 2 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und die Zellen bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Die Zellen in einer Konzentration von 1 X 106 Zellen/mL in komplette Medien aufzuwirbeln.
- Fügen Sie 1 mL Zellsuspension (d. h. 1 X 106 HUVECS) zu jedem FACS-Röhrchen mit Perlen.
- Schütteln Sie sanft die FACS-Rohre alle 20 min für die Dauer von 4 h bei 37 ° C (wenn in Schritt 3.4 ausgehend) oder 2,5 bis 3 h (Wenn Schritt 3.2).
Hinweis: Diese Dauer und Häufigkeit der Agitation empirisch festgestellt wurde von früheren Forschern, die das grundlegende Korn sprießen Assay optimiert haben. 4 Andere Frequenzen Agitation und Dauer der Wulst Beschichtung Schritt wurden von den Autoren nicht getestet.
(3) sequentielle Beschichtung von Perizyten auf HUVECS-beschichtete Microcarrier Perlen
- Begin 10T1/2 Zellen (Perizyten) mit der Zelle Ablösung Lösung (Trypsin) wie folgt lösen:
- Waschen Sie eine T175-Flasche mit 10 mL PBS, dann fügen Sie 5 mL Trypsin und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- 10T1/2 in einer Konzentration von 2 X 105 Zellen/0,5 mL in komplette Medien aufzuwirbeln.
Hinweis: Zellen wurden von der amerikanischen Art Kultur Sammlung (ATCC) erworben.
Hinweis: 10T1/2 Zellkulturen im Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
- Warten Sie nach 2,5 bis 3 h rühren die Perle + HUVECS Lösung 5 min um die Perlen und frei schwebenden HUVECS sich an der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.
- Jedes Rohr mit einer Pipette P1000 0,5 mL der komplette Medien entnehmen und jedes FACs-Rohr 2 x 105 10T1/2 komplette Medien in ein Volumen von 0,5 mL hinzufügen. Die Zelle und Wulst Lösung schütteln und dann weiterhin bei 37 ° c inkubieren Weiter alle 20 Minuten rühren, bis die Perlen für eine Gesamtmenge von 4 h aufgeregt worden sind.
Hinweis: Das Verhältnis von 5 HUVECS: 1 Pericyte auf den Perlen unbedingt geeignete Pericyte Abdeckung der Schiffe zu erhalten.
Hinweis: Die folgenden alternativen Schritte können stattdessen an dieser Stelle im Protokoll verfolgt werden: - Schütteln Sie Perlen und HUVECS nur für 4 h.
- Sobald die 4 h der HUVECS Beschichtung der Microcarrier Perlen abgeschlossen ist, rühren Sie die Rohre ein letztes Mal, warten Sie 30-60 s, dann umgehend entfernen Sie 1,5-1,75 mL der Lösung aus der FACS-Tube.
Hinweis: Dies sollte genügend Zeit für den Großteil der Perlen zu begleichen, während viele freischwebende HUVECS in den Medien entfernt werden können.- 2 X 105 10T1/2 komplette Medien und bringen das Volumen der FACS Rohr bis zu 2 mL.
- Schütteln Sie sanft die FACS-Rohre alle 20 min eine weitere Stunde.
- Nach Abschluss der Rühren sanft agitieren Sie die Rohre ein letztes Mal sofort entfernen Sie die gesamte Lösung (2 mL) und eine 6-cm-Platte hinzufügen. Jede Platte eine zusätzliche 3 mL komplette Medien hinzu, und legen Sie die Platten in den Inkubator 37 ° C über Nacht.
Tag3
4. Vorbereitung der Fibrin-Gel-Lösungen
- Bereiten Sie funktionierende Lösungen von Aprotinin in einer Konzentration von 1 mg/mL in PBS und Thrombin 50 Einheiten/ml.
Hinweis: Ein großer Vorrat an jede dieser Lösungen kann gemacht und bei 4 ° C für mindestens ein Jahr gespeichert. - Machen Sie eine frische Lösung von Fibrinogen, in einer Konzentration von 2 mg/mL. Machen Sie genug Lösung 2,5 mL Lösung pro aufgeregt FACS-Röhre haben.
- Wärmen Sie die Lösung im Wasserbad 37 ° C für 10 min damit alle Fibrinogen in Lösung gehen.
- Fügen Sie 37,5 µL Aprotinin Lösung pro 1 mL Fibrinogen-Lösung.
- Steril-Filter die Lösung und bei Zimmertemperatur beiseite.
5. Vorbereitung Perlen Gel Implantation
- Untersuchen Sie die Speisen mit Microcarrier beschichteten Perlen unter dem Mikroskop mit 20 X Objektiv um sicherzustellen, dass alle Perlen von Endothelzellen ausreichend beschichtet sind.
- Energisch pipette die vergoldete Lösung von Zellen zu trennen sie von der 6-cm-Platte, legen Sie die Lösung in ein Gefäß. Waschen Sie die Platte 2 X weitere Male mit komplette Medien und Transfer in das Rohr, alle restliche Perlen zu sammeln, die die Platte eingehalten werden kann.
- Vermeiden Sie Einführung von Luftblasen zu und mit einer Pipette p1000 um Schubspannung auf die endothelialen Zellen beschichtet Perlen zu minimieren.
- Wenn Bewertung SiRNA Knockdown Effizienz in den endothelialen Zellen, werden Sie in Schritt 2 erforderlich ist, achten Sie darauf, einen Teller mit nur HUVECS beschichtete Perlen haben. Dann während dieses Schrittes (5.2), lösen Sie die Perlen und sammeln Sie den Rest, die, den HUVECS auf den Teller für RNA Isolation und qPCR Analyse beigefügt.
- Warten Sie 3 min um die Perlen in die Lösung, sich an der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.
- Entfernen Sie so viel des Überstands wie möglich ohne zu stören die Wulst Pellet mit einer Pipettenspitze p1000 (Vakuum-Sauger nicht verwenden).
- Jedes Rohr 1 mL der komplette Medien hinzufügen und erneut die Perlen.
- Warten Sie 30-60 s um die Perlen sich nach unten zu ermöglichen. Dann entfernen Sie so viel des Überstands wie möglich mit Hilfe einer Pipette P1000 ohne störende Wulst Pellet. Verwenden Sie ein Vakuum-Sauger nicht, da die Wahrscheinlichkeit, dass versehentlich entfernen die Wulst Pellet erheblich erhöht wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6 zwei weitere Male. Ziel ist es, so viel von den frei schwebenden HUVECS zu entfernen, die abgetrennt haben kann von der 6-cm-Platte wie möglich, beim Entfernen nicht zu viele HUVECS-beschichtete Perlen, die in der FACS-Röhre schneller als freischwebende Zellen begleichen sollte.
- Die Perlen 1 mL der komplette Medien hinzufügen.
(6) einbetten Perlen in einem Fibrin-Gel beschichtet
- Entfernen Sie so viele Medien wie möglich ohne zu stören die Wulst Pellet in jedem FACS-Röhrchen mit einer Pipette P1000.
- Die Perlen in 2,5 mL Fibrinogen Lösung aufzuwirbeln.
- Pipette 13 µL Thrombin-Lösung in jedem Wunsch auch von einer 24-Well-Platte Glasboden. Beschichtung in einem Glasbodenboot Teller unbedingt ermöglichen optimale Bildgebung der Sprossen.
Hinweis: Lassen Sie nicht Thrombin sitzen in einem gut für mehr als 5 bis 10 min vor dem nächsten Schritt fort. - 0,5 mL Korn/Fibrinogen-Lösung in jede Vertiefung hinzugeben.
- Achten Sie darauf, die Perle Lösung gut vor dem Pipettieren der Lösung jedes Mal erneut.
- Vorsicht, sorgfältig pipette direkt in das Thrombin bereits in den Brunnen vorhanden. Langsam pipette rauf und runter 2-3mal mischen Sie die Lösung, wobei Vorsicht, keine Luftblasen einzuführen.
- Achten Sie darauf, die Pipettenspitze zwischen Brunnen zu ändern.
- Vorsicht nicht verschieben oder die Platte an jedem beliebigen Punkt während der anfänglichen Fibrin, die Blutgerinnung, stören, jede Bewegung die Gelbildung gestört werden kann.
- Lassen Sie die Platte sitzt in der Haube für 30 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie sorgfältig die Platte in einem 37 ° C Inkubator für weitere 1,5-2 h, das Gel vollständig erstarren lassen
7. Beschichtung Fibroblasten auf das Fibrin-Gel
- Während der letzten 30 min Gel erstarren lösen Sie normale menschliche Lunge Fibroblasten (NHLF) wie folgt:
- Waschen eine T175-Flasche von Zellen mit 10 mL PBS, dann fügen Sie 5 mL der Zelle Ablösung Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 10 min.
- NHLF in einer Konzentration von 20.000 Zellen/mL in komplette Medien aufzuwirbeln.
Hinweis: NHLF Zellen können werden kultiviert mit Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
- Platte 1 mL der NHLF Zellsuspension auf das Gel der jedes gut und setzen Sie wieder in den Inkubator.
- Komplette Medien täglich für die Dauer des Tests zu wechseln.
8. beachten Sie sprießen im Laufe von 2-7 Tagen nach der Implantation der Wulst in das Fibrin-Gel. Die Länge der Zeitaufwand für die Keimung hängt von der Passage und viele Anzahl von HUVECS.
9. Befestigung von sprießen Assay
- Sobald ausreichend sprießen aufgetreten ist, um einen phänotypischen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen bestimmen zu können, waschen Sie alle Brunnen einmal mit 2 mL PBS.
- Jedes gut 0,5 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzu und legen Sie die Platte in einem Inkubator 37 ° C für 5 Minuten.
- Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und tippen Sie auf den Seiten der Platte.
Hinweis: Dieser Schritt soll möglichst viele der NHLF Zellen auf das Fibrin-Gel wie möglich Antikörper Eindringen in das Gel sowie Bildgebung des Gels zu erleichtern zu entfernen. Die gesamte Inkubationszeit mit Zelle Ablösung Lösung müssen möglicherweise angepasst werden, um NHLF Entfernung zu optimieren. Forscher sind gewarnt, nicht das Gel für übermäßig lange Zeit brüten, wie die Zelle Ablösung Lösung kann in das Gel dringen und beginnen, stören die endothelialen Strukturen innerhalb. - Sobald eine ausreichende Menge an NHLF Zellen entfernt wurden, stillen Sie Zelle Ablösung Lösung mit 1 mL komplette Medien.
- Aspirieren Sie, freistehende NHLF und Medien mit einer Vakuum-Sauger, und waschen Sie der Brunnen einmal mit 1 mL PBS.
- Jedes gut 300 µL 2 % Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer hinzu und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Entfernen Sie die 2 % Paraformaldehyd Lösung und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit 1 mL PBS für 3 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Bitte entsorgen Sie 2 % Paraformaldehyd Lösung entsprechend im Einklang mit Umwelt und Gesundheit und Sicherheit (EHS) Richtlinien.- Fügen Sie 1 mL PBS jeweils gut und bei 4 ° C bis zu färben oder die Sprossen-image speichern.
10. Färbung der Assay sprießen
- Fügen Sie 300 µL 0,5 % Triton X-100 mit PBS-Puffer für jeden gut und 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Mit Hilfe einer Vakuum-Sauger, Triton-X100 und waschen Sie 3 Mal für 5 min in PBS.
- Fügen Sie 500 µL Lösung für jedes Gel zu blockieren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Die Sperre Lösung setzt sich aus folgenden Komponenten: 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 5 % FBS, 0,1 % Tween-20 und 1 % Antiserum (verwenden der gleichen Spezies, von denen Ihr Sekundärantikörper abgeleitet sind) mit PBS-Puffer. - Blockierende Lösung aus jedem Bohrloch entfernen und Hinzufügen von 300 µL der Färbelösung mit Primärantikörper in jede Vertiefung.
Hinweis: Die Färbelösung ist dasselbe wie die blockierende Lösung, aber ohne das Antiserum vorhanden. Die Autoren hatten Erfolg brüten mit Primärantikörpern bei Verdünnungen von 1: 200 bis 1: 400. - Inkubieren Sie Primärantikörper in Färbelösung für 24 Stunden bei 4 ° c
- Aspirieren Sie Primärantikörper Lösung und waschen Sie 3 Mal in TBS mit 0,5 % Tween 20 min bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln zu. Nach der dritten Wäsche mit frischen Waschpuffer wieder zu ersetzen, und über Nacht bei 4 ° C lagern.
- Mit fluoreszierenden Sekundärantikörper verdünnt 1: 1000 in Färbelösung für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie Sekundärantikörper Färbelösung zu und waschen Sie 5 Mal für 20 min mit TBS mit 0,5 % Tween bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln.
- Nukleare Fleck in PBS verdünnen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Dieses Protokoll hatte großen Erfolg mit Hoechst verdünnt 1: 10000 mit PBS-Puffer.
Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit, nukleare Färbelösung vor Bildgebung zu entfernen. - Bild innerhalb weniger Tage der Vollendung, die Färbung um optimale Fluoreszenzsignal zu erfassen.
11. sprießen Assay Quantifizierung
- Nachdem die Sprossen abgebildet haben, ImageJ importieren Sie die Image-Dateien und verwenden Sie das Zählungswerkzeug um die Anzahl der Sprossen oder Linienfunktion, sprießen Längen zu messen.
Hinweis: Sprossen sind definiert als endotheliale Vorsprünge mit einer Länge größer als oder gleich dem Durchmesser des Wulstes, aus denen sie sprießen. 11 Sprout Länge kann als der Abstand zwischen dem Punkt gemessen werden, bei dem die sprießen beginnt ragt aus der Perle an der Spitze der Sprosse. Durchschnittliche Länge pro Korn sprießen und durchschnittliche Anzahl der Sprossen pro Perle sind nützliche Metriken zu phänotypische Auswirkungen der Gen-silencing in sprießen Angiogenese zu beurteilen. Die durchschnittliche Anzahl der Perlen, enthält mindestens ein Sprößling pro behandelten Gruppe kann auch als Metrik verwendet werden, um zu beurteilen, die Robustheit der sprießen.
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglicht eine enge Verbindung von zwei Zelle Arten in-vitro- und das Vorhandensein von den Perizyten ergänzt das Auftreten von Keimen (Abb. 1A, B). Das Protokoll ermöglicht auch effektiv zum Schweigen (z.B. über RNA-Interferenz) eines Gens von Interesse in einer Zelle Art von Interesse wie (VEGFA speziell in Endothelzellen) oder PDGFRβ in Perizyten7,12 während der Probe, die Hemmung der sprießenden Phänotyp in der Probe übersetzen können. Forscher, die mit diesem Protokoll werden aufgefordert, einen standard endothelialen Zelle nur sprießenden Assay parallel zur Pericyte-beschichtete sprießende Assay gründlicher untersuchen die einzigartigen Beiträge von Perizyten in den vaskulären Funktionen ausführen und Phänotypen untersucht.
In diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen sind wichtig zur Einhaltung, um ausreichend beschichtet Perlen (Abb. 2A, B) zu erhalten, die robuste sprießen in das Fibrin-Gel zu unterziehen können. Die Autoren haben festgestellt, dass ein Übermaß an Perizyten (z. B. Perizyten beschichtet in einem Verhältnis von 1 10T1/2, 1 HUVECS) Ergebnis in Pericyte Überwucherung der gesamten gut und die anschließende Unfähigkeit zu deutlichen vaskuläre Strukturen innerhalb der gut zu erkennen.
Abbildung 1: Perizyten fest verbinden mit endothelialen Schiffe in das Korn sprießen Assay. (A) Standard sprießende Assay mit HUVECS nur beschichtete Perlen. (B) konfokalen Mikroskopie-Bilder von der Pericyte sprießen Assay zeigen, dass Perizyten-around endotheliale Schiffe in die sprießende Assay Wrap, aber nicht daran, ihre sprießen hindern. Blau ist Hoechst (nukleare Fleck); Rot ist CD31 (endotheliale Fleck), und grün ist Desmin (Pericyte Fleck). Alle skalieren Bars, 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beschichtete Perlen haben einen rauen, Golfball aussehen. Nackt Microcarrier Perlen (A) haben eine völlig glatte Oberfläche, während entsprechend beschichtet Perlen bereit für Fibrin Gel Implantation (B) eine grobe, Golf Ball-wie Aussehen haben. Skala bar, 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Charakterisierung der komplexen Phasen und Zellkulturmodells zellulären Interaktionen von sprießen Angiogenese durch die Aktivierung des Forschers, genetische und bildgebende Methoden eingehende mechanistische Untersuchungen zu beschäftigen. Bei der Durchführung des Tests muss effizient endotheliale Beschichtung der Perlen während der Wulst Agitation Schritte stattfindet. Armen endotheliale Beschichtung erfolgt offensichtlich, wenn die Perlen nicht angezeigt werden, haben eine Golf Ball-wie raue Oberfläche am nächsten Morgen vor der Implantation Gel und stattdessen erscheint völlig glatt. Achten Sie darauf, dass die Perlen ausreichend bei jedem Schritt der Erregung Nukleinsäuretablette sind durch kräftig rühren die Rohre um maximale Belichtung der Perle Oberfläche der Endothelzellen zu ermöglichen, aber nicht so aggressiv, daß es bewirkt, die Endothelzellen bereits dass angebracht, um von den Perlen gelöst werden.
Wenn Perizyten Assays hinzu, ist es wichtig, dass das Verhältnis von 5 Endothelzellen, 1 Pericyte beibehalten wird. Ein Übermaß an Perizyten bewirkt, dass sie überwuchern und überholen die endotheliale Zell-Populationen während des Tests, und ein Mangel an Perizyten verursacht schlechte Abdeckung der Schiffe. Wenn die entsprechenden Zelldichte ist gepflegt, aber Armen Pericyte Abdeckung der Schiffe wird weiterhin beobachtet, kann Unruhe Mal mit Perizyten müssen geändert werden. Es wird nicht empfohlen, dass die Zelle Zahlen geändert werden. Ein alternativer Ansatz kann werden die Perlen mit Endothelzellen nur für 4 h zu beschichten, dann entfernen Sie die Endothelzellen aus den Medien von resuspending der Wulstes und Zelle-Lösung und die Medien zu entfernen, sobald die Perlen niedergelassen haben, aber bevor die Zellen haben sich niedergelassen , dann in Perizyten hinzufügen und rühren alle 20 min eine weitere Stunde.
Wenn die beschichteten Perlen in das Fibrin-Gerinnsel einbetten, ist es auch wichtig, nicht die Integrität des Gels stören durch Unterbrechung der Plattenrandes während der Bildung von Blutgerinnseln. Störung der die Matrixbildung führen aberranten sprießen. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Wulst-Dichte im Gel erhalten bleibt. Wenn die Bevölkerung von Perlen zu dicht ist, dann Perlen in unmittelbarer Nähe zueinander beeinträchtigt das sprießen der benachbarten Perlen und beginnt zu sprießen einander gegenüber und anastomosieren. Je nach das Endziel des Forschers und Interesse bei der Charakterisierung von Schiff-Schiff-Interaktionen müssen die Wulst Dichte geändert werden. Eine heterogene Bevölkerung von isolierten Perlen und Perlen in unmittelbarer Nähe zueinander in das Gel geben jedoch weitgehend Variable sprießende Phänotypen. Perle-Dichte kann durch das Volumen der Wulst Lösung hinzugefügt, um die FACS-Röhren während der Erregung Schritt des Protokolls zu verändern oder verändern das Volumen der Fibrin-Lösung verwendet, um die Perlen vor der Implantation Gel Aufschwemmen eingestellt werden.
Es ist auch wichtig, dass gesunde NHLFs bei einer Dichte von 20.000 Zellen pro mL auf jeder Fibrin-Gerinnsel überzogen sind. Bitte beachten Sie, dass die kontinuierliche Versorgung mit Wachstumsfaktoren geliefert durch die aktiv teilenden NHLFs für robuste sprießen während des Tests erforderlich sind. NHLF-konditionierte EGM2 ist keine ausreichende Alternative. 13 wenn schlechte Keimung während des Tests beobachtet wird, empfiehlt es, dass eine frische Flasche komplette Medien und einer neuen, gesunden Passage der NHLF Zellen verwendet werden.
Obwohl dieser Test beginnt an den zellulären und phänotypischen Komplexität der Angiogenese in einer größeren Auflösung, stellt immer noch eine vereinfachte System im Vergleich zu wahren, in Vivo Kontext dar. Darüber hinaus ist die sprießende Angiogenese, die in diesem Test mehr analog zu einem gesunden, physiologischen Kontext im Gegensatz zu einem pathologischen Kontext wie Tumor-Angiogenese. Zukünftige Anwendungen dieser Methode gehören die Einführung von zusätzlichen Zelltypen (z. B. Immunzelle Bevölkerungen, die Angiogenese Reaktionen modulieren) um weitere rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen beteiligt in diesem komplexen Prozess. Die Einführung von externen Stressoren - wie ein Tumor, eingebettet in unmittelbarer Nähe der sprießenden Schiffe in das Fibrin Gel - pathologischen Angiogenese in Vitro zu simulieren kann auch eingesetzt werden, um eine gründlichere, mechanistischen Charakterisierung von ermöglichen die molekulare Signalwege aktiviert in pathologischen zusammenhängen. Diese Fortschritte werden wichtig für die Verbesserung der Fähigkeit der Forscher, die komplexen Phasen der Angiogenese in einer mehr kontrollierten Umgebung, letztlich ermöglicht Entdeckung und mehr detaillierte Charakterisierung der neuartige therapeutische Wege für targeting zu studieren pathologischen Angiogenese.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Victoria Bautch und Joshua Boucher für hilfreiche Gespräche und Beratung bei Optimierung standard Wulst sprießen Assay-Bedingungen und eine sprießende Assay Färbeprotokoll. S.H.A. wurde teilweise unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences unter 5T32 GM007092 zu vergeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
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