Summary
Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.
Abstract
Angiogénesis es la formación de nuevos vasos de vasculatura preexistente y es un componente importante de muchos procesos biológicos, incluyendo la embriogénesis y desarrollo, la cicatrización de heridas, crecimiento tumoral y metástasis y enfermedades oculares y cardiovasculares. Se necesitan modelos eficaces en vitro que recapitulan la biología de la angiogénesis adecuadamente este proceso de estudio e identificar mecanismos de regulación que pueden ser objeto en definitiva de nuevas estrategias terapéuticas. El análisis de la angiogénesis de grano ha demostrado previamente para recapitular las etapas múltiples de brotes endoteliales in vitro. Sin embargo, una limitación de este ensayo es una falta de endotelial – interacciones célula mural, que son fundamentales para la regulación molecular y fenotípica de células endoteliales función en vivo. El protocolo aquí presenta una metodología para la incorporación de las células murales en el ensayo de grano angiogénesis y muestra una asociación estrecha de las células endoteliales y pericitos durante brotación in vitro. El protocolo también detalla una metodología eficaz silenciamiento de genes de la blanco usando siRNA en las células endoteliales para estudios mecanísticos. En conjunto, este protocolo proporciona un análisis en vitro que más apropiadamente modelos de los tipos de células distintos implicados en brotes de angiogénesis y proporciona una plataforma más fisiológicamente relevantes para la evaluación terapéutica y nuevo descubrimiento de mecanismos de regulación de la angiogénesis.
Introduction
Angiogénesis es vital para la embriogénesis apropiado y la cicatrización de heridas, y también desempeña papeles claves en numerosas enfermedades incluyendo cáncer progresión1 y la arteria coronaria de la enfermedad. 2 , 3 tener una mejor comprensión de cómo se produce la angiogénesis en el desarrollo normal, y cómo se reactiva en contextos patológicos, es fundamental para el desarrollo de la novela, la terapéutica eficaz. Modelos fieles en vitro que recapitulan las etapas importantes y tipos de células implicados en la angiogénesis en vivo son necesarios para permitir que los investigadores mejor caracterizar los mecanismos moleculares conduce angiogénesis y hacer nuevos descubrimientos en la regulación endotelial.
Nakatsu y Hughes han optimizado un ensayo de grano brotes que han demostrado sufre el conocido muchas etapas de brotación angiogénesis. 4 , 5 el propósito del método presentado aquí es aprovechar el análisis optimizado por Nakatsu y Hughes con la incorporación de perictyes en el ensayo, para que las funciones paracrinas y juxtracrine de mural células en células endoteliales brotación pueden ser incorporadas en estudios de novela de la angiogénesis. Pericitos son células murales que se definen por su función como células que mantienen contacto físico con las células endoteliales debido a ser incrustados en la membrana basal vascular. 6 células endoteliales y pericitos participan en complejo la diafonía mediante vías incluyendo muesca de señalización señalización, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ y muchos otros. 7 , 8 modelos de ratón deficientes en estas vías de señalización demuestran pericyte pobre cobertura del desarrollo de la vasculatura en la embriogénesis, conduce a la remodelación vascular pobre y disfuncional vasculatura. 7 además, el papel del pericitos en la angiogénesis patológica es importante pero a menudo subestimada. Por ejemplo, una característica única de la vasculatura del tumor es que los vasos son más inmaduros, con fugas y disfuncional debido a la pobre pericyte cobertura. 9 se ha propuesto que la presencia o ausencia del pericitos dramáticamente afecta el fenotipo de los vasos sanguíneos tumorales y es un importante mediador de las respuestas a las terapias antitumorales y antiangiogénicos. 9 así, incluyendo el papel del pericitos en ensayos en vitro es clave captar más completamente los mecanismos importantes de regulación endotelial.
Aunque hay muchos ensayos in vitro y ex vivo actualmente empleados para estudiar la angiogenesis, hay defectos a considerar en cada uno. Algunos, como la proliferación endotelial y ensayos de migración endotelial, son excesivamente simplificados y se centran en una función endotelial en un entorno aislado en cultivo de tejidos de plástico. 10 otros ensayos ocurren en un entorno (3D) tridimensional 3 más, como el ensayo de formación de tubo de Matrigel,10 pero estos ensayos son todavía excesivamente y centran más en la capacidad de las células endoteliales migran y forman de novo vascular estructuras, en lugar de brotar de la vasculatura preexistente. Además, ninguno de estos ensayos incorporan tipos celulares mural. Hay ex vivo la modelos tales como el ensayo de aorta anillo que incorporan pericitos presentes en el órgano anfitrión, pero manipulación genética de estos modelos es mucho más difícil debido a la necesidad de generar modelos transgénicos o knockout del ratón de la rutas de interés. El grano del ensayo de germinación es ideal porque modelos brotación endotelial, proliferación, migración y formación incluso anastomosis y lumen en una matriz 3D. 4 el ensayo fielmente permite evaluación mecanicista de las muchas diferentes etapas de rebrote, permitiendo aún la modificación genética directa del pericitos en un entorno más controlado o de las células endoteliales. Los coágulos de fibrina que contiene los granos brotes pueden fácilmente fijarse, manchados y reflejados en las diferentes etapas de brotación; Estos brotes pueden también colocarse en una cámara de proyección de imagen vivo para realizar la proyección de imagen en tiempo real de las brotaciones. La metodología presentada aquí es ideal para el estudio de mecanismos básicos de la angiogénesis en fenotipado de profundidad y un análisis exhaustivo de las vías que se activan durante la angiogénesis.
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Protocol
Día 1:
1. transitorios de la transfección de las células endoteliales
- Si lo desea, realizar una transfección transitoria de humano Umbilical vena Endothelial células (HUVEC) usando oligonucleótidos gene-regulatorios (por ejemplo micro-ARN o ARN interferente pequeño (siRNA)) y el reactivo lipofectamine apropiado según instrucciones del fabricante.
Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito realizando inversas transfecciones con secuencias de siRNA personalizado y un reactivo de transfección comercial (véase tabla de materiales). Los autores no han probado otros protocolos de la transfección y reactivos con este ensayo. Los pasos para la transfección inversa utilizando los reactivos enumerados son los siguientes: - Reconstituir el liofilizado siRNAs o microRNA (s) a una concentración de 20 μm en agua libre de nucleasa.
- Hacer soluciones de transfección en la siguiente proporción: 1 mL de cualquier medios libres de suero con 9 μl de siRNA o microRNA.
- Agitar la solución y déjelo incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 18 μL de reactivo de transfección para la solución y agitar.
- Deje que la solución de incubar a temperatura ambiente durante 20-40 min, agitando la solución cada 10 a 15 minutos para la duración de la incubación.
- Mientras que la incubación de la solución de transfección, separar HUVEC con una solución de la separación de la célula (e.g., Accutase). Para un frasco de T175, lavar el matraz con 10 mL de fosfato tampón salino (PBS) y añadir 5 mL de solución de separación celular e Incube el frasco a 37 ° C durante 10 minutos.
- Añadir 5 mL de medio completo al matraz T175, retire la suspensión de células del frasco y centrifugar a 1200 rpm durante 3 minutos.
- Quite el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío y resuspender el precipitado de células en una densidad de 1 X 106 células / mL en EGM2.
Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito usando medio de crecimiento celular endotelial (EGM2) que contiene el kit de bala estándar del factor de crecimiento, así como un 10% FBS. - Una vez que la solución de transfección ha terminado de incubar, 1 mL de solución en una placa de 10 cm de la placa y agregar 1 mL de la suspensión HUVEC en la parte superior.
- Añadir un mL 7 adicional de medios completo para llevar el volumen final de la placa de 10 cm a 9 mL.
- Hacer al menos dos placas de 10 cm vale la pena de células para cada condición de transfección asegurar que se dispone de suficientes células para pasos posteriores en el ensayo.
Nota: Estas condiciones resultan en una concentración final de trabajo de oligonucleótidos regulación gen de 20 nM. Los autores han encontrado estas condiciones para resultar en una caída de 60-80% de la expresión génica para sus objetivos de interés. Otros investigadores deba optimizar condiciones de transfección según sus necesidades experimentales. - Intercambio de medios 4-6 h post añadir complejos de siRNA con medios mas frescos.
Nota: Este protocolo fue desarrollado usando paso HUVEC 1-2.
Día 2
2. capa de granos de la potencia con las células endoteliales
- Reconstituir potencia granos (por ejemplo, 3 Cytodex) a una concentración de granos de 60.000/mL en PBS y autoclave.
Nota: potencia los granos vienen en una concentración de aproximadamente 3 x 106 granos por gramo. Reconstituir los granos en una proporción de 20 mg de perlas por mL de PBS para obtener una densidad de grano de aproximadamente 60.000 cuentas/mL. - Alícuota 1 mL de medio completo en el número de tubos de fluorescencia activada célula clasificación (FACS) de fondo redondo.
- Pipetear 20 μl de la suspensión de grano potencia en cada tubo (tenga cuidado de asegurar que la solución de grano bien serán suspendida antes de pipetear).
Nota: Probablemente habrá dramática variabilidad en la concentración de trabajo final de granos presentes en una suspensión de grano potencia dada. Granos pueden adherirse fácilmente a las paredes de contenedores de plástico y vidrio que pueden alterar enormemente la concentración de grano en la solución. El volumen más adecuado de grano solución agregar al tubo FACS para cada lote de suspensión de grano potencia tendrá que ser determinado empíricamente por el investigador. Los números presentados aquí están destinados a servir más como punto de partida. Idealmente, deben optimizarse las condiciones por lo que hay incrustados en el gel de fibrina por pozo en la placa bien 24 al final del ensayo los granos 10-20. Vea discusión adicional en la sección de discusión abajo sobre optimización de números de cuentas para el ensayo. - Separar transfected HUVEC 24 h post transfección mediante la solución de la separación de células como sigue:
- Lave cada placa de 10 cm de las células con 5 mL de PBS, añadir 2 mL de la solución de la separación celular e Incube las células a 37 ° C durante 10 minutos.
- Resuspender las células a una concentración de 1 X 106 células/mL en los medios de comunicación completa.
- Añadir 1 mL de la suspensión celular (es decir 1 X 106 HUVEC) a cada tubo de FACS que contiene granos.
- Frote suavemente los tubos FACS cada 20 min durante 4 h a 37 ° C (si proceder a paso 3.4) o 2.5 a 3 h (si procede al paso 3.2).
Nota: Esta duración y frecuencia de agitación ha sido empírico determinado por investigadores anteriores que han optimizado el grano básico análisis de germinación. 4 Otras frecuencias de agitación y duración del paso de la capa de grano no ha sido probados por los autores.
3. secuencial capa del pericitos en granos recubiertos de HUVEC potencia
- Comenzar a separar las células 10T1/2 (pericitos) mediante la solución de la separación de la célula (tripsina) como sigue:
- Lavar un frasco T175 con 10 mL de PBS, luego añadir 5 mL de tripsina e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
- Resuspender 10T1/2 en una concentración de 2 X 105 células/0.5 mL en los medios de comunicación completa.
Nota: Las células fueron compradas de la American Type Culture Collection (ATCC).
Nota: 10T1/2 células en cultivo en medio esencial mínimo (MEM) habían suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina estreptomicina.
- Después de 2.5 a 3 h de agitar el grano + solución HUVEC, esperar 5 minutos para permitir que los granos y HUVEC flotante colocar en la parte inferior del tubo.
- Extraer 0,5 mL de medio completo de cada tubo, utilizando una pipeta P1000 y añadir 2 x 105 10T1/2 en media completa en un volumen de 0,5 mL a cada tubo de FACs. Agite la solución de la célula y el grano y luego continuar a incubar a 37 ° C. Seguir agitar cada 20 minutos hasta que los granos han sido agitados para un total de 4 h.
Nota: La proporción de HUVEC 5: 1 pericyte en los granos es esencial para mantener pericyte adecuada cobertura de los vasos.
Nota: Los siguientes pasos alternativos pueden seguirse en su lugar en este punto el protocolo: - Agitar los granos y HUVEC sólo durante 4 horas.
- Una vez que las 4 h de la capa de HUVEC de los granos de la potencia, agitar los tubos una vez, espere 30-60 s, luego inmediatamente saque el tubo de FACS 1.5-1.75 mL de solución.
Nota: Esto debe permitir tiempo suficiente para la mayoría de los granos para resolver mientras se eliminarán muchos HUVEC flotan libremente en los medios de comunicación.- Añadir 2 X 105 10T1/2 en los medios de comunicación completa y llevar el volumen de la FACS tubo hasta 2 mL.
- Frote suavemente los tubos FACS cada 20 min durante una hora adicional.
- Una vez la agitación completa, suavemente agite los tubos una vez y quitar inmediatamente la solución entera (2 mL) y añadir a una placa de 6 cm. Añadir un adicional 3 mL de medio completo a cada plato y colocar las placas en la incubadora de 37 ° C durante la noche.
Día 3
4. preparación de soluciones de Gel de fibrina
- Preparar soluciones de trabajo de aprotinina en una concentración de 1 mg/mL en PBS y trombina 50 unidades/ml.
Nota: Un amplio stock de cada una de estas soluciones puede ser hecho y almacenado a 4 ° C durante al menos un año. - Hacer una solución fresca del fibrinógeno en una concentración de 2 mg/mL. Hacer suficiente solución para tener 2,5 mL de solución por el agitado tubo de FACS.
- Calentar la solución en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos permitir a todos el fibrinógeno en solución.
- Añadir 37.5 μl de solución de aprotinina por 1 mL de solución de fibrinógeno.
- Filtro estéril la solución y reservar a temperatura ambiente.
5. preparación de granos para el implante de Gel
- Examinar los platos que contienen los granos recubiertos de potencia bajo el microscopio utilizando el objetivo 20 X para asegurar que todos los granos han sido suficientemente cubiertos por las células endoteliales.
- Pipetear enérgicamente la solución plateada de las células para separar de la placa de 6 cm y colocar la solución en un tubo. Lave la placa 2 veces más de X con los medios de comunicación completa y transferencia al tubo para recoger todos los granos residual que pueden ser adheridos a la placa.
- Evitar la introducción de burbujas de aire y utilizar una pipeta p1000 para minimizar el estrés de cizalla en los granos recubiertos de células endoteliales.
- Si evaluación de la eficiencia de precipitación de siRNA en las células endoteliales es necesario, en el paso 2, asegúrese de tener un plato de granos recubiertos sólo HUVEC. Durante este paso (5.2), separar los granos y recoger el residuo que HUVEC conectada a la placa para aislamiento de RNA y el análisis de qPCR.
- Esperar 3 minutos para permitir que los granos en la solución para colocar en la parte inferior del tubo.
- Eliminar tanto el sobrenadante como sea posible sin perturbar el sedimento de grano usando una punta de pipeta p1000 (no utilice un aspirador de vacío).
- Añadir 1 mL de medio completo a cada tubo y resuspender los granos.
- Espere 30-60 s para permitir que los granos para instalarse en la parte inferior. Quite tanto el sobrenadante como posible utilizando una pipeta P1000 sin perturbar el sedimento de grano. No utilice un aspirador de vacío como la probabilidad de eliminar accidentalmente el sedimento de grano se incrementa considerablemente.
- Repita los pasos dos veces más de 5.5 y 5.6. El objetivo es eliminar tanto la HUVEC flotante que puede esté desconectada de la placa de 6 cm como sea posible, al no eliminar demasiados granos recubiertos de HUVEC, que deben instalarse en el tubo de FACS más rápidamente que las células flotan libremente.
- Añadir 1 mL de medio completo a los granos.
6. incrustación cubrió los granos en un Gel de fibrina
- Eliminar tanto los medios como sea posible sin perturbar el sedimento de grano en cada tubo, FACS utilizando una pipeta P1000.
- Resuspender los granos en 2,5 mL de solución de fibrinógeno.
- Pipetee 13 μl de solución de trombina en cada uno desea de una placa de 24 pocillos con fondo de cristal. Siembra en una placa con fondo de vidrio es esencial para permitir la proyección de imagen óptimo de los brotes.
Nota: No deje sentado en un pozo de más de 5-10 min antes del siguiente paso de la trombina. - Añadir 0,5 mL de solución de grano/fibrinógeno a cada pocillo.
- Cerciórese de agite la solución grano bien antes de pipetear la solución cada vez.
- Tenga cuidado al Pipetear cuidadosamente directamente a la trombina ya presente en el pozo. Pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces para mezclar bien la solución, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
- Asegúrese de cambiar la punta de la pipeta entre pozos.
- Tener precaución para no mover o alterar la placa en cualquier punto durante la fibrina inicial coagulación, como cualquier movimiento puede alterar la formación del gel.
- Dejar la placa en el capó durante 30 min a temperatura ambiente.
- Cuidadosamente, transferir la placa a una incubadora de 37 ° C para un adicional 1.5-2 h permitir que el gel solidifique completamente
7. galjanoplastia fibroblastos sobre el Gel de fibrina
- Durante los últimos 30 min de la solidificación del gel, separar fibroblastos de pulmón humanos normales (NHLF) como sigue:
- Lavar un frasco T175 de células con 10 mL de PBS, añada 5 mL de solución de separación celular e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
- Suspender NHLF a una concentración de 20.000 células/mL en los medios de comunicación completa.
Nota: Las células NHLF pueden cultivarse con Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1% penicilina estreptomicina.
- 1 mL de la suspensión de células NHLF en el gel de cada pocillo de la placa y volver a colocar en la incubadora.
- Cambiar medios completo cada otro día durante la duración del ensayo.
8. observar brotes en el transcurso de 2 a 7 días después de la implantación del grano en el gel de fibrina. La longitud de tiempo requerido para la germinación depende del pasaje y mucho número de HUVEC.
9. fijación del ensayo de germinación
- Una vez ha ocurrido la germinación suficiente poder determinar una diferencia fenotípica entre grupos de tratamiento, lavar todos los pocillos uno con 2 mL de PBS.
- Agregar 0,5 mL de solución de separación celular en cada pocillo y colocar la placa en una incubadora de 37 ° C durante 5 minutos.
- Retire la placa de la incubadora y toque los lados de la placa.
Nota: El propósito de este paso es eliminar muchas de las células NHLF creciendo en la parte superior del gel de fibrina como sea posible facilitar la penetración del anticuerpo en el gel como la proyección de imagen del gel. El tiempo total de incubación con solución de separación celular puede necesitar ser ajustado para optimizar la eliminación de NHLF. Los investigadores se advirtieron no incubar el gel durante períodos excesivos de tiempo como la solución de la separación de células puede penetrar en el gel y comience a perturbar las estructuras endoteliales dentro. - Una vez que han eliminado una cantidad suficiente de células NHLF, saciar la solución de la separación de células con 1 mL de medio completo.
- Aspirar la independiente NHLF y medios de comunicación utilizando un aspirador de vacío y lavar los pozos una vez con 1 mL de PBS.
- Añadir 300 μL de solución de paraformaldehído al 2% en PBS a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Retirar la solución de paraformaldehído al 2% y lavar cada pozo 3 veces con 1 mL de PBS durante 3 minutos a temperatura ambiente.
Nota: Por favor, disponga de 2% paraformaldehído solución apropiadamente conforme a las directrices de salud ambiental y seguridad (EHS).- Añadir 1 mL de PBS a cada bien y almacenar a 4 ° C hasta el momento la mancha o los brotes de la imagen.
10. tinción del ensayo de germinación
- Añadir 300 μL de 0.5% Triton-X 100 en PBS a cada bien e incube durante 30 a 45 min a temperatura ambiente.
- Utilizando un aspirador de vacío, retire X100 Triton y lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos.
- Agregar 500 μl de solución a gel de bloqueo e incubar durante la noche a 4 ° C.
Nota: La solución de bloqueo se compone de los siguientes componentes: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 y antisuero 1% (uso de la misma especie de donde se derivan sus anticuerpos secundarios) en PBS. - Eliminar la solución de bloqueo de cada pozo y agregar 300 μL de solución de tinción con anticuerpo primario a cada pocillo.
Nota: La solución de tinción es el mismo como la solución de bloqueo, pero sin el antisuero presente. Los autores han tenido éxito incubar con anticuerpos primarios en diluciones de 1: 200 a 1: 400. - Incubar los anticuerpos primarios en la coloración de la solución por 24 h a 4 ° C.
- Aspirar solución de anticuerpo primario y lavar 3 veces en TBS con 0.5% tween 20 min a temperatura ambiente con el suave balanceo. Después del tercer lavado, reemplace con tampón de lavado fresco otra vez y almacenar a 4 ° C durante la noche.
- Incubar con el anticuerpo secundario fluorescente diluido 1: 1000 en la coloración de la solución por 2 h a temperatura ambiente.
- Solución de tinción de anticuerpo secundario de quitar y lavar 5 veces de 20 minutos con TBS que contiene entre 0.5% a temperatura ambiente con el suave balanceo.
- Diluir la mancha nuclear en PBS e incubar durante una noche a 4 ° C.
Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito con 1:10000 Hoechst diluido en PBS.
Nota: No hay para quitar la solución de tinción nuclear antes de la proyección de imagen. - Imagen en unos pocos días de terminar la tinción para captura óptima de la señal fluorescente.
11. cuantificación del ensayo de germinación
- Después de los brotes han sido reflejados, importar los archivos de imagen en ImageJ y utilice la herramienta de conteo para contar el número de brotes, o la herramienta de línea para medir longitudes de brote.
Nota: Brotes se definen como protuberancias endoteliales con una longitud mayor o igual al diámetro del grano que están brotando. 11 longitud de brote puede medirse como la distancia desde el punto en que el brote comienza que sobresale desde el talón hasta la punta de los brotes. Promedio de brotes longitud por grano y número promedio de brotes por grano es parámetros útiles para evaluar los efectos fenotípicos de silenciamiento génico en brotación angiogénesis. El número promedio de granos que contienen al menos un brote por grupo de tratamiento también puede utilizarse como una medida para evaluar la robustez de las brotaciones.
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Representative Results
Este protocolo permite una estrecha asociación de la dos celda tipos in vitro, y la presencia del pericitos complementa la ocurrencia de brotes (figura 1A, B). El protocolo también permite la eficaz silenciamiento (p. ej. mediante ARN de interferencia) de un gen de interés en un tipo de células de interés como (VEGFA específicamente en las células endoteliales) o PDGFRβ en pericitos7,12 durante el ensayo, que puede traducir a la inhibición del fenotipo despunte en el ensayo. Animamos a los investigadores que emplean este protocolo para llevar a cabo un estándar endotelial célula solamente brote ensayo en paralelo con el ensayo despunte pericyte-revestida para investigar más a fondo las contribuciones únicas del pericitos en las funciones vasculares y fenotipos están estudiados.
Las condiciones descritas en este protocolo son importantes para cumplir con el fin de obtener granos suficientemente cubierto (figura 2A, B) que sean capaces de experimentar brotes robustos en el gel de fibrina. Los autores han encontrado que un exceso del pericitos (como pericitos cubierto en una proporción de 1 10T1/2 a 1 HUVEC) resultado en pericyte sobrecrecimiento del todo bien y posterior incapaz de discernir distintas estructuras vasculares dentro del pozo.
Figura 1. Pericitos muy asocian con los vasos endoteliales en el grano del ensayo de germinación. (A) ensayo despunte estándar con los granos recubiertos solamente HUVEC. Imágenes de Microscopía Confocal (B) de la pericyte brotación ensayo demuestran que pericitos envuelven alrededor de los vasos endoteliales en el análisis del brote, pero no entorpezcan su brotación. El azul es Hoechst (tinción nuclear); rojo es CD31 (mancha endotelial), desmina (pericyte mancha) es verde. Todo escalar bares, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Perlas recubiertas tienen una pelota de golf áspera, como aspecto. Granos de potencia desnudo (A) tienen una superficie completamente lisa, mientras que granos adecuadamente cubierto listos para el implante de gel de fibrina (B) tienen un aspecto rugoso, de bola-como golf. Escala de la barra, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo presenta un método para la caracterización de las etapas complejas e interacciones celulares heterotípicos de brotación angiogenesis por lo que permite al investigador a emplear enfoques genéticos y proyección de imagen completa investigaciones mecanicistas. Cuando se realiza el ensayo, es esencial que eficiente recubrimiento endotelial de los granos ocurre durante la cuenta pasos de agitación. Pobre capa endotelial se hará evidente, si los granos no aparecen tienen una superficie áspera de la bola como de golf a la mañana siguiente antes de la implantación de gel y en su lugar aparece completamente lisa. Asegúrese de que las cuentas son suspendidas suficientemente durante cada paso de la agitación por agitar vigorosamente los tubos para permitir la máxima exposición de la superficie de la tira a las células endoteliales, pero no tan agresivamente es causa que las células endoteliales ya adjunta para desprenderse de los granos.
Al agregar pericitos en el ensayo, es esencial que se mantenga la proporción de células endoteliales 5 1 pericyte. Un exceso del pericitos hace que se cubran y superar a las poblaciones de la célula endotelial durante el ensayo, y una deficiencia del pericitos hace poca cobertura de los vasos. Si se mantiene la densidad celular apropiado pero pericyte pobre cobertura de los vasos se observa todavía, tiempo de agitación con pericitos deba modificarse. No se recomienda que el número de células se altera. Una alternativa puede ser para recubrir los granos con las células endoteliales sólo durante 4 horas, luego retire las células endoteliales de los medios de comunicación por Resuspender el grano y solución celular y eliminación de los medios de comunicación una vez que se han asentado los granos pero antes las células se han asentado , entonces agregando en pericitos y agitar cada 20 min durante una hora adicional.
Al incorporar los granos recubiertos en el coágulo de fibrina, también es esencial para no perturbar la integridad del gel interrumpiendo la placa durante la formación de coágulos. Interrupción de la formación de la matriz puede resultar en brotes aberrantes. También es esencial para asegurar que la densidad de grano apropiado se mantiene en el gel. Si la población de granos es demasiado densa, granos en proximidad cercana a una otra afectarán el surgimiento de los vecinos granos y comenzarán a brotar hacia uno otro y anastomizar. Según el objetivo final del investigador y del interés en la caracterización de las interacciones de buque-buque, la densidad de grano deba modificarse. Sin embargo, una población heterogénea de granos aislados y los granos en proximidad cercana a una otra en el gel puede dar fenotipos despunte en gran medida de variables. Densidad de grano se puede ajustar alterando el volumen de grano solución añadida a los tubos de FACS durante la etapa de agitación del Protocolo, o alterando el volumen de solución de fibrina usada para resuspender los granos antes de la implantación de gel.
También es esencial que NHLFs sanos a una densidad de 20.000 células por mL se platean en la parte superior cada coágulo de fibrina. Tenga en cuenta que la fuente continua de factores de crecimiento proporcionada por las NHLFs activamente dividir son necesarias para la brotación sólida durante el ensayo. EGM2 NHLF-condicionada no es una alternativa suficiente. 13 si pobre brotación se observa durante el ensayo, se recomienda que se utiliza una botella fresca de medios completo y un pasaje nuevo y saludable de las células NHLF.
Aunque este ensayo comienza a abordar la complejidad celular y fenotípica de la angiogenesis en una resolución mayor, todavía representa un sistema excesivamente en relación con el realidad, contexto en vivo . Además, la angiogénesis brote que ocurre en este ensayo es más análoga a un contexto fisiológico saludable en contraposición a un contexto patológico como angiogénesis tumoral. Futuras aplicaciones de este método pueden incluir la introducción de tipos de células adicionales (por ejemplo, las poblaciones de células inmunitarias que modulan la respuesta angiogénica) más recapitular las interacciones celulares heterotípicos involucrados en este complejo proceso. La introducción de agentes agresores externos, como un tumor en las proximidades de los vasos despunte en el gel de fibrina - para simular la angiogénesis patológica en vitro puede emplearse también para permitir la caracterización más exhaustiva, mecanicista de la vías moleculares activadas en los contextos patológicos. Estos avances serán importantes para mejorar la capacidad de los investigadores para estudiar las complejas etapas de la angiogénesis en un ambiente más controlado, en última instancia, permitiendo el descubrimiento y la caracterización más detallada de nuevos caminos terapéuticos para apuntar angiogénesis patológica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los Drs. Victoria Bautch y Joshua Boucher para discusiones útiles y asesoramiento en la optimización de cuentas estándar brotación las condiciones analíticas y una brotación prueba de protocolo de tinción. S.H.A. fue apoyado en parte por una subvención de la Instituto Nacional de General médica Ciencias bajo concesión de GM007092 de 5T32.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
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