Summary
Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.
Abstract
L’angiogenèse est la croissance de nouveaux vaisseaux du système vasculaire préexistante et est un élément important de nombreux processus biologiques, y compris l’embryogenèse et développement, la cicatrisation, la croissance tumorale et les métastases et les maladies cardiovasculaires et oculaires. Modèles efficaces in vitro qui récapitulent la biologie de l’angiogenèse sont nécessaires pour bien étudier ce processus et identifier les mécanismes de régulation qui peuvent être ciblés en fin de compte, de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le dosage de l’angiogenèse perle a été démontré précédemment pour récapituler les étapes multiples de germination endothéliales in vitro. Toutefois, une limitation de ce test est un manque d’endothéliales – interactions cellule murale, qui sont essentiels à la régulation moléculaire et phénotypique des cellules endothéliales function in vivo. Le protocole donné ici présente une méthodologie pour l’intégration de cellules murales dans le dosage de l’angiogenèse perle et montre une association étroite des cellules endothéliales et péricytes au cours de la germination in vitro. Le protocole détaille également une méthodologie de silençage efficace des gènes de cible à l’aide de siARN dans les cellules endothéliales pour études mécanistes. Au total, ce protocole prévoit un test in vitro qui mieux modélise les types de cellules différents impliqués dans l’angiogenèse de germination et fournit une plate-forme plus physiologiquement pertinents pour l’évaluation thérapeutique et découverte de mécanismes de régulation de l’angiogenèse.
Introduction
L’angiogenèse est vital à l’embryogenèse approprié et la cicatrisation des plaies, et il joue aussi des rôles clés dans nombreuses maladies, incluant les cancer progression des maladies coronariennes et1 . 2 , 3 avoir une meilleure compréhension de comment l’angiogenèse se produit au cours du développement normal, et comment elle est réactivée dans des contextes pathologiques, est critique pour le développement du roman, thérapeutique efficace. Fidèle à vitro modèles qui récapitulent les étapes importantes et les types cellulaires impliqués dans l’angiogenèse in vivo sont nécessaires pour permettre aux chercheurs de mieux caractériser les mécanismes moléculaires conduisant l’angiogenèse et faire de nouvelles découvertes dans le règlement endothélial.
Nakatsu et Hughes ont optimisé un test de germination perle subit les nombreuses étapes connues de germination angiogenèse ont démontré que. 4 , 5 l’objectif de la méthode présentée ici est de s’appuyer sur le dosage optimisé par Nakatsu et Hughes en intégrant des perictyes à l’essai, afin que les rôles paracrine et juxtracrine des cellules murales dans les cellules endothéliales de germination peuvent être incorporés dans angiogenèse nouvelles études. Péricytes sont des cellules murales qui sont définies par leur rôle plus près de cellules qui maintiennent un contact physique avec des cellules endothéliales en raison de leur être incorporé dans les membranes basales vasculaires. 6 péricytes et les cellules endothéliales s’engagent dans la diaphonie complexe via les voies y compris Notch de signalisation signalisation, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ et bien d’autres. 7 , 8 modèles de souris déficientes dans ces voies de signalisation démontrent pericyte mauvaise couverture de développer un système vasculaire dans l’embryogenèse, conduisant à un remodelage vasculaire pauvre et système vasculaire dysfonctionnel. 7 en outre, le rôle des péricytes dans l’angiogenèse pathologique est importante mais souvent sous-estimée. Par exemple, une caractéristique unique du système vasculaire tumoral est que les navires sont plus immatures, qui fuit et dysfonctionnelle en raison de la couverture de mauvaise pericyte. 9 il a été suggéré que la présence ou l’absence des péricytes dramatiquement incidence sur le phénotype de la tumeur des vaisseaux sanguins et est un médiateur important de réponses aux anti-angiogéniques et thérapies antitumorales. 9 ainsi, y compris le rôle des péricytes dans des essais in vitro sont la clé pour saisir plus complètement les importants mécanismes de régulation endothéliale.
Bien qu’il existe de nombreux essais in vitro et ex vivo , actuellement utilisés pour étudier l’angiogenèse, il y a des lacunes à considérer dans chacun. Certains, comme la prolifération endothéliale et des essais de migration endothéliale, sont trop simplifiées et de se concentrer sur une seule fonction endothéliale en milieu isolé sur le plastique de culture de tissus. 10 autres épreuves se produisent en plus 3 Dimensions (3D) milieu, tels que le dosage de la formation du tube Matrigel,10 mais ces dosages sont encore trop simpliste et se concentrent davantage sur la capacité des cellules endothéliales à migrer et à former de novo vasculaire Ouvrages d’art, par opposition à la germination de vaisseaux préexistant. En outre, aucun de ces tests intègrent des types cellulaires murales. Il y a ex vivo modèles tels que l’essai d’aorte de bague qui incorporent des péricytes présents dans l’organe hôte, mais les manipulations génétiques de ces modèles sont beaucoup plus difficile en raison de la nécessité de générer des modèles de souris knock-out ou transgéniques de la voies d’intérêt. Le talon du test de germination est idéal car il modélise la germination endothéliale, prolifération, migration et formation même anastomose et lumen dans une matrice 3D. 4 le test permet fidèlement pour évaluation mécaniste des différentes étapes de la germination, tout en permettant la modification génétique directe des cellules endothéliales ou péricytes dans un milieu contrôlé plus nombreux. Les caillots de fibrine contenant les billes de germination peuvent être facilement fixés, colorés et imagés à différents stades de germination ; ces germes peuvent également être placés dans une chambre d’imagerie direct pour effectuer une imagerie en temps réel de la germination. La méthodologie présentée ici est idéale pour l’étude des mécanismes fondamentaux de l’angiogenèse par le biais de phénotypage de profondeur et une analyse approfondie des voies activées au cours de l’angiogenèse.
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Protocol
Jour 1 :
1. transitoire Transfection des cellules endothéliales
- Si vous le souhaitez, réaliser une transfection transitoire de humaine ombilicale veine endothélial cellules (HUVEC) utilisant des oligonucléotides gène réglementaires (p. ex. micro-ARN ou petits ARN interférents (siARN)) et le réactif de lipofectamine appropriées conformément à instructions du fabricant.
Remarque : Ce protocole a eu beaucoup de succès effectuant des transfections inverses avec des séquences de siARN personnalisé et un réactif de transfection commerciale (voir le tableau des matériaux). Les auteurs n’ont pas été testés autres protocoles de transfection et réactifs pour cette analyse. Les étapes de la transfection inverse en utilisant les réactifs cités sont les suivants : - Reconstituer le siARN lyophilisé ou microARN à une concentration de 20 µM dans l’eau libre nucléase.
- Faire des solutions de transfection dans la proportion suivante : 1 mL de n’importe quel média libre de sérum à 9 µL de siARN ou miARN.
- Agiter la solution et laisser incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 18 µL de réactif de transfection dans la solution et l’agiter.
- Laisser la solution d’incubation à température ambiante pendant 20 à 40 min, i ' agitation de la solution toutes les 10 à 15 min pour la durée de l’incubation.
- Alors que la solution de transfection est en incubation, détacher HUVEC en utilisant une solution de détachement de cellules (par exemple, Accutase). Pour un flacon de T175, laver la fiole 10 ml de Phosphate Buffered Saline (PBS) et puis ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire et incuber la fiole à 37 ° C pendant 10 min.
- Ajouter 5 mL de médias complet au ballon T175, retirer la suspension cellulaire de la fiole et centrifuger à 1200 tr/min pendant 3 min.
- Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur vide et Resuspendre le culot cellulaire à une densité de 1 X 106 cellules / mL dans EGM2.
Remarque : Ce protocole a eu beaucoup de succès à l’aide d’endothéliales milieu de croissance cellulaire (EGM2) contenant le kit de balle de facteur de croissance standard ainsi qu’une majoration de 10 % FBS. - Une fois que la solution de transfection a fini en incubation, 1 mL de solution dans une plaque de 10 cm de la plaque et ajouter 1 mL de suspension HUVEC sur le dessus.
- Ajouter 7 mL supplémentaire de support complet pour porter le volume final de la plaque de 10 cm à 9 mL.
- Représentent au moins deux plaques de 10 cm d’une valeur de cellules pour chaque condition de transfection pour s’assurer qu’il y a assez de cellules disponibles pour les étapes ultérieures dans le dosage.
Remarque : Ces conditions donne une concentration finale de travail d’oligonucléotide régulation génique de 20 nM. Les auteurs ont trouvé ces conditions se traduire par une précipitation de 60 à 80 % de l’expression des gènes pour leurs cibles d’intérêt. D’autres chercheurs devrez optimiser les conditions de transfection selon leurs besoins expérimentaux. - L’ajout de post 4 à 6 h de médias de siARN complexes avec les supports complets neufs de l’échange.
Remarque : Ce protocole a été développé à l’aide de passage HUVEC 1-2.
Jour 2
2. couche de perles avec des microporteurs avec des cellules endothéliales
- Reconstituer avec des microporteurs perles (p. ex., Cytodex 3) à une concentration de 60 000 perles/mL dans du PBS et autoclave.
NOTE : les perles avec des microporteurs sont livrés à une concentration d’environ 3 x 106 perles par gramme. Reconstituer les perles à raison de 20 mg de perles par mL de PBS pour obtenir une densité de perles de perles environ 60 000/mL. - Aliquote 1 mL de support complet dans le nombre désiré de tubes de tri cellulaire activé par Fluorescence (FACS) à fond rond.
- Pipeter 20 µL de suspension de perle avec des microporteurs dans chaque tube (attention pour s’assurer que la solution de la perle est bien remis en suspension avant de pipetage).
Remarque : Il y aura probablement une variabilité dramatique dans la concentration finale de travail des perles présentes dans une suspension de perle avec des microporteurs donnée. Perles peuvent facilement adhérer aux parois des contenants de plastique ou de verre qui peuvent altérer considérablement la concentration de perle dans la solution. Le volume plus approprié de perle solution, ajouté au tube de FACS pour chaque lot de suspension de perle avec des microporteurs devront être déterminées empiriquement par l’enquêteur. Les chiffres présentés ici sont destinés à servir plus comme point de départ. Idéalement, conditions doivent être optimisées, il y a 10-20 perles incorporés dans le gel de fibrine / puits dans la plaque 24 puits à la fin de l’essai. Voir les autres discussions dans la section discussion ci-dessous au sujet de l’optimisation d’un nombre de perles pour le dosage. - Détacher transfectées HUVEC 24 h après transfection utilisant la solution de détachement cellulaire comme suit :
- Lavez chaque plaque de 10 cm des cellules avec 5 mL de PBS, puis ajouter 2 mL de la solution de détachement cellulaire et incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 min.
- Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 X 106 cellules/mL dans les médias.
- Ajouter 1 mL de suspension cellulaire (c.-à-d. 1 X 106 HUVEC) dans chaque tube de FACS contenant des perles.
- Agiter délicatement les tubes de FACS toutes les 20 min pour la durée de 4 h à 37 ° C (si en procédant à l’étape 3.4) ou de 2,5 à 3 h (si en procédant à l’étape 3.2).
Remarque : Cette durée et la fréquence d’agitation a été empiriquement déterminée par des chercheurs précédents qui ont optimisé le talon base test de germination. 4 Autres fréquences d’agitation et de la durée de l’étape d’enduit perle n’ont pas été testée par les auteurs.
3. séquentiel revêtement des péricytes sur perles avec des microporteurs HUVEC-enduit
- Commencer le détachement des cellules de 10 t 1/2 (péricytes) à l’aide de la solution de détachement cellulaire (trypsine) comme suit :
- Laver un ballon T175 avec 10 mL de PBS, puis ajouter 5 mL de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Resuspendre 10 t 1/2 à une concentration de 2 X 105 cellules/0.5 mL dans les médias.
Remarque : Les cellules ont été achetés de l’American Type Culture Collection (ATCC).
Remarque : Des cellules de Culture 10 t 1/2 dans la milieu essentiel Minimum (MEM) additionné de 10 % de SVF et 1 % pénicilline streptomycine.
- Après 2,5 à 3 h d’i ' agitation de la perle + solution HUVEC, attendre 5 min pour permettre les perles et HUVEC flottant se déposer au fond du tube.
- Retirez 0,5 mL de médias complet de chaque tube en utilisant une pipette P1000 et ajoutez 2 x 105 10 t 1/2 médias complet dans un volume de 0,5 mL à chaque tube de FACs. Agiter la solution cellulaire et le talon, puis continuer à incuber à 37 ° C. Continuer à agiter toutes les 20 min jusqu'à ce que les perles ont été agitées pour un total de 4 h.
NOTE : Le rapport des HUVEC 5 : 1 pericyte sur les perles est essentielle pour maintenir une couverture appropriée pericyte des vaisseaux.
Remarque : Les étapes alternatives suivantes peuvent être suivis à la place à ce point dans le protocole : - Agiter les perles et HUVEC seulement pendant 4 h.
- Une fois les 4 h de revêtement HUVEC des perles avec des microporteurs terminée, agiter les tubes une dernière fois, attendre 30 à 60 s, puis retirer immédiatement 1,5-1,75 mL de la solution du tube FACS.
Remarque : Cela devrait permettre suffisamment de temps pour la plupart des perles à régler alors que nombreux HUVEC flottant librement dans les médias est supprimés.- Ajouter 2 X 105 10 t 1/2 en milieu complet et porter le volume de la FACS à 2 mL de tube.
- Agiter délicatement les tubes de FACS toutes les 20 minutes pour une heure supplémentaire.
- Une fois l’agitation terminée, doucement agiter les tubes une dernière fois et immédiatement retirer l’ensemble de la solution (2 mL) et ajoutez-le à une plaque de 6 cm. Ajouter 3 mL de médias complète supplémentaire sur chaque plaque et placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
Jour 3
4. préparation des Solutions de Gel de fibrine
- Préparer des solutions de travail d’aprotinine à une concentration de 1 mg/mL dans du PBS et de thrombine à 50 unités/mL.
Remarque : Un stock important de chacune de ces solutions peut être réalisé et conservé à 4 ° C pendant au moins un an. - Préparer une solution fraîche de fibrinogène à une concentration de 2 mg/mL. Faire suffisamment de solution pour avoir 2,5 mL de solution par tube de FACS agité.
- Chauffer la solution dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 10 min permettre à tous du fibrinogène d’entrer dans la solution.
- Ajouter 37,5 µL de solution d’aprotinine par 1 mL de solution de fibrinogène.
- La solution stérile-filtre et mettre de côté à température ambiante.
5. préparation des perles à Implantation de Gel
- Examiner les plats contenant les billes recouvertes avec des microporteurs sous le microscope à l’aide de l’objectif 20 X pour s’assurer que toutes les perles ont été suffisamment enduits par les cellules endothéliales.
- Pipetter, vigoureusement la solution plaquée de cellules à détacher de la plaque de 6 cm et placer la solution dans un tube. Laver la plaque 2 fois X avec support complet et transfert dans le tube pour recueillir toutes les perles résiduelles qui peuvent être collés à la plaque.
- Éviter d’introduire des bulles d’air et utiliser une pipette p1000 pour réduire la contrainte de cisaillement sur les perles d’enduit de cellules endothéliales.
- Si l’évaluation de l’efficacité défiant de siARN dans les cellules endothéliales est nécessaire, à l’étape 2, n’oubliez pas d’avoir une assiette de perles enduits HUVEC uniquement. Puis au cours de cette étape (5.2), détacher les perles et recueillir les résidus que HUVEC fixé à la plaque d’ARN et d’analyse de qPCR.
- Attendre 3 minutes pour permettre les perles dans la solution à déposer au fond du tube.
- Enlevez autant de surnageant possible sans déranger le culot de perle à l’aide d’une pointe de pipette p1000 (ne pas utiliser un aspirateur sous vide).
- Ajouter 1 mL de médias complet dans chaque tube et remettre en suspension les perles.
- Attendre 30 à 60 s pour permettre les perles se déposer au fond. Puis enlever le plus de surnageant comme possible en utilisant une pipette P1000 sans déranger le culot de perle. Ne pas utiliser un aspirateur vide car la probabilité d’enlever accidentellement le culot de perle est décuplée.
- Répéter les étapes 5.5 et 5.6 deux fois. Le but est d’enlever autant de la HUVEC flottant qui ont été détachée de la plaque 6 cm que possible, tout en n’enlevant ne pas trop de perles HUVEC-enduit, qui devraient s’établir plus rapidement que les cellules flottants dans le tube de FACS.
- Ajouter 1 mL de médias complet aux talons.
6. intégration des billes dans un Gel de fibrine recouvertes
- Eliminez autant de médias que possible sans déranger le culot de billes dans chaque tube de FACS à l’aide d’une pipette P1000.
- Remettre en suspension les perles dans 2,5 mL de solution de fibrinogène.
- Pipetter 13 µL de solution de thrombine dans chacun désire bien d’une plaque de fond de verre de 24 puits. Électrodéposition dans une assiette à fond de verre est essentielle pour permettre une imagerie optimale des germes.
Remarque : Ne laissez pas de thrombine assis dans un puits pendant plus de 5-10 min avant l’étape suivante. - Ajouter 0,5 mL de solution de perle/fibrinogène dans chaque puits.
- N’oubliez pas de remettre en suspension dans la solution de perle bien avant le pipetage la solution chaque fois.
- Prendre des précautions pour soigneusement Pipetter directement dans la thrombine déjà présente dans le puits. Lentement Pipetter haut et en bas 2 ou 3 fois pour bien mélanger la solution, en veillant à n’introduit ne pas de bulles d’air.
- N’oubliez pas de changer l’embout de la pipette entre les puits.
- Prendre des précautions à ne pas déplacer ou déranger la plaque à tout moment au cours de la fibrine initiale de coagulation, que tout mouvement susceptible de perturber la formation de gel.
- Laisser la plaque assis dans la hotte pendant 30 min à température ambiante.
- Transvaser avec soin la plaque à un incubateur à 37 ° C pendant 1,5 à 2 h supplémentaires permettre le gel se solidifier complètement
7. électrodéposition fibroblastes surface du Gel de fibrine
- Durant les 30 dernières min de la solidification de gel, détacher les fibroblastes de poumon humain Normal (NHLF) comme suit :
- Laver un ballon T175 des cellules avec 10 mL de PBS, puis ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Remettre en suspension les NHLF à une concentration de 20 000 cellules/mL dans les médias.
Remarque : NHLF cellules peuvent être cultivées avec Dulbecco Eagle modifié (DMEM) additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline streptomycine.
- 1 mL de la suspension de cellules NHLF sur le gel de chaque puits de la plaque et replacez dans l’incubateur.
- Changer de média complet tous les deux jours pendant la durée de l’essai.
8. Observez la germination au cours des 2 à 7 jours après l’implantation de la perle dans le gel de fibrine. La longueur du temps nécessaire à la germination dépendra du nombre de passage et beaucoup de HUVEC.
9. fixation de test de germination
- Une fois que suffisamment de germination s’est produite pour être en mesure de déterminer une différence phénotypique entre les groupes de traitement, lavez tous les puits une fois avec 2 mL de PBS.
- Ajouter 0,5 mL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
- Retirez la plaque de l’incubateur et appuyez sur les côtés de la plaque.
Remarque : L’objectif de cette étape est de supprimer autant de cellules NHLF de plus en plus surface du gel de fibrine que possible pour faciliter la pénétration des anticorps dans le gel ainsi que l’imagerie du gel. Le temps d’incubation totale avec solution de détachement cellulaire peut devoir être ajustée afin d’optimiser l’enlèvement de NHLF. Les chercheurs sont avertis de ne pas Incuber le gel pendant une période excessive comme la solution de détachement cellulaire peut pénétrer dans le gel et commencent à perturber les structures endothéliales au sein. - Après avoir retiré une quantité suffisante de cellules NHLF, étancher la solution de détachement cellulaire avec 1 mL de médias complet.
- Aspirer le NHLF et les médias à l’aide d’un aspirateur vide détaché et laver les puits une fois avec 1 mL de PBS.
- Ajouter 300 µL de solution de paraformaldéhyde 2 % dans du PBS à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Enlever la solution de paraformaldéhyde de 2 % et laver chaque puits 3 fois avec 1 mL de PBS pendant 3 min à température ambiante.
Remarque : S’il vous plaît jeter 2 % solution de paraformaldéhyde correctement selon les directives d’hygiène et sécurité (EHS).- Ajouter 1 mL de PBS pour chaque bien et conserver à 4 ° C jusqu’au moment de les teindre ou les germes de l’image.
10. la coloration des test de germination
- Ajouter 300 µL de 0,5 % Triton X 100 dans du PBS à chaque puits et incuber pendant 30 à 45 min à température ambiante.
- À l’aide d’un aspirateur vide, retirez Triton-X100 et laver 3 fois dans du PBS pendant 5 min chacun.
- Ajouter 500 µL de solution à chaque gel de blocage et incuber une nuit à 4 ° C.
Remarque : La solution de blocage est constituée des éléments suivants : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 5 % FBS, 0,1 % tween-20 et 1 % antisérum (utiliser la même espèce d'où proviennent vos Anticorps secondaires) dans du PBS. - Supprimer la solution de saturation de chaque puits et ajouter 300 µL de solution colorante contenant l’anticorps primaire dans chaque puits.
NOTE : La solution colorante est la même que la solution de blocage, mais sans l’antisérum présent. Les auteurs ont réussi à l’incubation avec l’anticorps primaires à des dilutions de 1 : 200 à 1 : 400. - Incuber les anticorps primaires dans la coloration de la solution pendant 24 h à 4 ° C.
- Aspirer la solution de l’anticorps primaire et laver 3 fois au SCT avec 0,5 % tween pendant 20 min à température ambiante avec le doux balancement chaque. Après le troisième lavage, replacez avec tampon de lavage douce et conserver à 4 ° C durant la nuit.
- Incubez avec immunofluorescence secondaire dilué 1/1000 dans la coloration de la solution pendant 2 h à température ambiante.
- Enlever la solution colorante anticorps secondaire et laver 5 fois pendant 20 min chaque avec le SCT contenant 0,5 % tween à température ambiante avec le doux balancement.
- Diluer la tache nucléaire dans du PBS et incuber une nuit à 4 ° C.
Remarque : Ce protocole a eu beaucoup de succès avec 1 : 10000 Hoechst dilué dans du PBS.
Remarque : Il est inutile de retirer la solution de coloration nucléaire avant l’imagerie. - Image en quelques jours de l’achèvement de la souillure pour capter le signal fluorescent optimale.
11. Quantification de l’essai de germination
- Après que les choux ont été imagées, importer les fichiers image dans ImageJ et utilisez l’outil comptage pour compter le nombre de germes, ou l’outil en ligne pour mesurer les longueurs de germer.
NOTE : Germes sont définis comme endothéliales protubérances d’une longueur supérieure ou égale au diamètre de la bille, d'où ils poussent. 11 longueur de germination peut être mesuré par la distance entre le point auquel le germe commence en saillie hors du talon jusqu'à l’extrémité de la pousse. Chou de moyenne longueur par perle et nombre moyen de germes par perle est des mesures utiles pour évaluer les effets phénotypiques de silençage génique dans la germination de l’angiogenèse. Le nombre moyen de billes contenant au moins une pousse par groupe de traitement peut également servir comme une mesure pour évaluer la robustesse de la germination.
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Representative Results
Ce protocole permet une association étroite de la deux cellule types in vitro, et la présence de la péricytes vient compléter l’occurrence de germination (Figure 1 a, B). Le protocole permet également efficace silencieux (par exemple via l’interférence ARN) d’un gène d’intérêt dans un type de cellule d’intérêt comme (VEGFA spécifiquement dans les cellules endothéliales) ou PDGFRβ en péricytes7,12 au cours de l’essai, qui peut se traduire à l’inhibition de la germination phénotype dans le dosage. Nous encourageons les chercheurs employant ce protocole pour exécuter un test cellule seule sprouting standard endothélial en parallèle à l’analyse de germination enduit pericyte à une enquête plus approfondie sur la contribution unique des péricytes dans les fonctions vasculaires et à l’étude des phénotypes.
Les conditions décrites dans le présent protocole sont importantes à respecter afin d’obtenir suffisamment enduit perles (Figure 2 a, B) qui seront en mesure de subir une germination robuste dans le gel de fibrine. Les auteurs ont constaté que l’excès de péricytes (tels que les péricytes enduit à un ratio de 1 10 t 1/2 à 1 HUVEC) résultat pericyte prolifération de l’incapacité de bien et suivantes ensemble à discerner les structures vasculaires distinctes dans le puits.
Figure 1. Péricytes associent étroitement à vaisseaux endothéliales dans le talon du test de germination. (A) essai de germination normalisé avec perles couchés seuls HUVEC. Images de microscopie confocale (B) de la pericyte test de germination démontrent que les péricytes enrouler autour des vaisseaux endothéliales dans l’essai de germination, mais n’entravent pas leur germination. Le bleu est Hoechst (tache nucléaire) ; le rouge est CD31 (endothéliale teinté), et vert est desmine (taches de pericyte). Tous scale barres, 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Enduit perles ont une balle de golf rugueuse, comme l’aspect. Nu avec des microporteurs perles (A) ont une surface complètement lisse, alors que convenablement enduit perles prêts pour l’implantation de gel de fibrine (B) ont un rugueux, golf ball-comme l’aspect. Balance bar, 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole présente une méthode permettant de caractériser les étapes complexes et des interactions cellulaires hétérotypiques de germination angiogenèse en permettant au chercheur d’employer des approches génétiques et d’imagerie, de mener des enquêtes approfondies mécanistes. Lorsque vous effectuez le test, il est essentiel qu’efficace revêtement endothélial des perles se déroule pendant le talon étapes d’agitation. Revêtement endothélial pauvres seront évidente, si les perles ne semblent pas avoir une surface rugueuse comme balle de golf le lendemain matin avant l’implantation de gel et plutôt apparaître complètement lisse. Veiller à ce que les perles sont suffisamment remis en suspension lors de chaque étape de l’agitation en agitant vigoureusement les tubes pour permettre une exposition maximale de la surface de la perle aux cellules endothéliales, mais pas tellement agressif qu’il entraîne les cellules endothéliales déjà joint pour se détacher les perles.
Lorsque vous ajoutez des péricytes dans le dosage, il est essentiel que le ratio de 5 cellules endothéliales à 1 pericyte est maintenu. Un excès de péricytes provoque à proliférer et à dépasser les populations de cellules endothéliales pendant le test, et un déficit en péricytes provoque mauvaise couverture des navires. Si la densité de la cellule appropriée est maintenue mais pericyte mauvaise couverture des navires est toujours observée, agitation durée avec péricytes peut nécessiter d’être modifiée. Il n’est pas recommandé que le nombre de cellules est modifié. Une approche alternative peut être pour enrober les perles avec des cellules endothéliales seulement pendant 4 h, puis retirez les cellules endothéliales des médias en resuspendant le talon et solution cellulaire et en supprimant les médias une fois que les perles sont sont installés, mais avant les cellules sont sont installés , puis ajout de péricytes et agiter toutes les 20 minutes pour une heure supplémentaire.
Lors de l’incorporation les perles couchés dans le caillot de fibrine, il faut aussi ne perturbent ne pas l’intégrité du gel en perturbant la plaque au cours de la formation de caillots. Perturbation de la formation de la matrice peut provoquer un bourgeonnement aberrant. Il est également essentiel d’assurer le maintien de la densité appropriée perle dans le gel. Si la population de perles est trop dense, puis perles à proximité les uns aura une incidence sur la germination des voisins perles et commenceront à pousser les uns envers les autres et s’anastomosent. Selon l’objectif ultime du chercheur et intérêt pour la caractérisation des interactions navire-navire, la densité de perle peut doivent être modifiées. Toutefois, une population hétérogène des perles isolées et des perles à proximité d’un de l’autre le gel peut donner des phénotypes sprouting largement variables. Densité de talon peut être réglée en modifiant le volume de solution de perle aux tubes de FACS a ajouté au cours de l’étape de l’agitation du protocole, ou en modifiant le volume de solution de fibrine utilisé pour remettre en suspension les perles avant l’implantation de gel.
Il est également essentiel que NHLFs sains à une densité de 20 000 cellules / mL sont plaqués sur le dessus de chaque caillot de fibrine. Veuillez noter que l’apport continu de facteurs de croissance fournies par les Division activement NHLFs sont nécessaires pour la germination robuste pendant le test. Conditionné par le NHLF EGM2 n’est pas une solution suffisante. 13 si mauvaise germination est observée pendant l’essai, il est recommandé qu’une nouvelle bouteille de médias complet et un passage nouvel et sain des cellules NHLF sont utilisés.
Bien que cet essai commence à aborder la complexité cellulaire et phénotypique de l’angiogenèse à une résolution plus grande, elle représente toujours un système simpliste par rapport à la vraie, en vivo contexte. En outre, l’angiogenèse sprouting survenant dans ce test ressemble davantage à un contexte sain et physiologique, par opposition à un contexte pathologique par exemple de l’angiogenèse tumorale. Les applications futures de cette méthode peuvent inclure l’introduction des types de cellules supplémentaires (par exemple, les populations de cellules immunitaires qui modulent la réponse angiogénique) également récapituler les interactions cellulaires hétérotypiques impliqués dans ce processus complexe. L’introduction de facteurs de stress externes - comme une tumeur incorporé à proximité les vaisseaux repousse dans le gel de fibrine - pour simuler l’angiogenèse pathologique en vitro peut-être également être employée pour permettre la caractérisation plus poussée, mécaniste de la voies moléculaires activés dans des contextes pathologiques. Ces avances seront importants pour améliorer la capacité des chercheurs à étudier les étapes complexes de l’angiogenèse dans un milieu plus contrôlé, permettant finalement découverte et la caractérisation approfondie plus de nouvelles voies thérapeutiques pour le ciblage angiogenèse pathologique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs Victoria Bautch et Joshua Boucher de discussions utiles et des conseils sur l’optimisation standard perle germination conditions d’essais et un test de germination souillant le protocole. S.H.A. a été financée en partie par une subvention de la National Institute of General Medical Sciences sous prix 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
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- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
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- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
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- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
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