Summary
Denne protokol præsenterer en roman i vitro perle assay, mere passende modeller proces i vivo spiring angiogenese ved at indarbejde pericytes. Denne ændring gør det muligt for perle assay til mere trofast sammenfatte Heterotypiske cellulære vekselvirkninger mellem endotelceller og vægmaleri celler, der er kritiske for angiogenese.
Abstract
Angiogenese er vækst af nye fartøjer fra allerede eksisterende vaskulatur og er en vigtig komponent i mange biologiske processer, herunder embryogenese og udvikling, sårheling, tumorvækst og metastase, og okulær og hjerte-kar-sygdomme. Effektiv in vitro- modeller, at sammenfatte biologi af angiogenese er behov for passende studere denne proces og identificere ordninger for regulering, der i sidste ende kan målrettes til romanen terapeutiske strategier. Perle angiogenese assay har tidligere vist sig for at sammenfatte de flere stadier i endothelial spiring in vitro-. Imidlertid en begrænsning i denne analyse er en mangel i endothelial-vægmaleri celle interaktioner, , som er nøglen til den molekylære og fænotypiske forordning i endothelial celle funktion i vivo. Protokol her præsenterer en metodologi til indbygning af vægmaleri celler i perle angiogenese assay og demonstrerer en stram association i endothelial celler og pericytes under spirende in vitro. Protokollen også detaljer en metode til effektiv hæmning af target gener med siRNA i endothelial celler til Mekanistiske undersøgelser. Helt, denne protokol giver et in vitro- forsøg, der mere passende modeller af forskellige celletyper involveret i spiring angiogenese, og giver en mere fysiologisk relevante platform for terapeutisk vurdering og roman opdagelse af mekanismer af angiogenese forordning.
Introduction
Angiogenese er afgørende for passende embryogenese og sårheling, og det også spiller vigtige roller i talrige sygdomme herunder kræft progression1 og koronar arterie sygdom. 2 , 3 at have en bedre forståelse af hvordan angiogenese opstår under normale udvikling, og hvordan det er genaktiveret i patologisk sammenhænge, er afgørende for udviklingen af roman, effektiv terapi. Trofaste in vitro- modeller, at sammenfatte de vigtige etaper og celletyper involveret i angiogenese i vivo er nødvendige for at give forskere bedre karakterisere de molekylære mekanismer kørsel angiogenese og gøre nye opdagelser i endothelial forordning.
Nakatsu og Hughes har optimeret en spirende perle assay, som de har udvist, gennemgår de mange kendte stadier af spiring angiogenese. 4 , 5 formålet med metoden præsenteres her er at bygge videre på analysen optimeret ved Nakatsu og Hughes ved at indarbejde perictyes i analysen, således at rollerne paracrine og juxtracrine af vægmaleri celler i endothelial celle spiring kan integreres i Roman angiogenese undersøgelser. Pericytes er vægmaleri celler, der er defineret af deres rolle som celler, der opretholder tæt fysisk kontakt med endotelceller på grund af deres indlejret i den vaskulære basalmembranen. 6 Pericytes og endotelceller deltage i komplekse cross-talk via signalering veje herunder Notch signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ og mange andre. 7 , 8 musemodeller mangelfuld i disse signaling veje vise dårlige pericyte dækning for at udvikle Vaskulaturen i embryogenese, fører til dårlig vaskulære remodellering og dysfunktionelle Vaskulaturen. 7 Derudover pericytes i patologisk angiogenese rolle er vigtig, men ofte under-værdsat. For eksempel er en unik feature i tumor Vaskulaturen at fartøjerne er mere umodne, utæt og dysfunktionelle på grund af dårlige pericyte dækning. 9 det er blevet foreslået, at tilstedeværelsen eller fraværet af pericytes dramatisk påvirker Fænotypen af tumor blodkar og er en vigtig mediator af svar til antiangiogenic og antitumor behandlingsformer. 9 således, herunder rollen, som pericytes i in vitro- assays er nøglen til mere helt fange de vigtige mekanismer i endothelial forordning.
Selvom der er mange i vitro og ex vivo assays i øjeblikket ansat til at studere angiogenese, er der mangler i hver. Nogle, såsom endotel spredning og endotel migration assays, er alt for forenklet og fokusere på én endotelfunktion i isolerede omgivelser på vævskultur plast. 10 andre assays forekomme i en mere 3-dimensionelle (3D) indstilling, såsom Matrigel tube dannelse assay,10 men disse assays er stadig forsimplede og fokusere mere på muligheden for i endothelial celler til at migrere og danne de novo vaskulære strukturer, i modsætning til spiring fra allerede eksisterende Vaskulaturen. Desuden, ingen af disse assays indarbejde vægmaleri celletyper. Der er ex vivo modeller såsom ring aorta assay der indarbejde pericytes stede i host-orgel, men genmanipulation af disse modeller er meget mere udfordrende på grund af nødvendigheden af at skabe knockout eller transgene musemodeller for den veje af interesse. Perle spiring assay er ideelt, fordi det modeller endotel spiring, spredning, migration og endda anastomose og lumen dannelse i en 3D matrix. 4 analysen trofast giver mulighed for mekanistisk vurdering af de mange forskellige stadier af spiring, mens det stadig tillader for direkte gensplejsning i endothelial celler eller pericytes i en mere kontrolleret indstilling. Fibrin blodpropper indeholdende de spirende perler kan nemt fast, farves, og afbildet på forskellige stadier af spiring; disse spirer kan også placeres i et live imaging kammer til at udføre real-time imaging af spiring. Den metode, der præsenteres her er ideel til at studere grundlæggende mekanismer af angiogenese gennem i dybde fænotyper og grundig analyse af de veje, aktiveret under angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1:
1. forbigående Transfektion i Endothelial Cells
- Hvis det ønskes, udføre en forbigående Transfektion af humane Umbilical vene Endothelial celler (HUVEC) ved hjælp af gen-regulerende oligonukleotider (f.eks. mikro-RNA'er eller små interfererende RNA (siRNA)) og den relevante lipofectamine reagens ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Denne protokol har haft stor succes udfører omvendt transfections med brugerdefinerede siRNA sekvenser og en kommerciel Transfektion reagens (Se materialer tabel). Forfatterne har ikke testet andre Transfektion protokoller og reagenser med dette assay. Trin for den omvendte Transfektion reagenser opført er som følger: - Rekonstruere frysetørret siRNAs eller MicroRNA i en koncentration på 20 µM i nukleasen gratis vand.
- Gøre Transfektion løsninger på de følgende forhold: 1 mL af enhver serum frie medier med 9 µL af siRNA eller microRNA.
- Agitere løsningen og gør det muligt at Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføje 18 µL Transfektion reagens til løsningen og agitere.
- Tillade løsning til Inkuber ved stuetemperatur i 20-40 min, agiterer løsningen hver 10-15 min i varigheden af inkubationen.
- Mens Transfektion løsning inkubere, frigøre HUVEC ved hjælp af en celle detachement løsning (f.eks.Accutase). For en T175 kolbe, vaske kolben med 10 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS), og derefter tilsættes 5 mL celle distance og inkuberes i kolben ved 37 ° C i 10 min.
- T175 Kolben tilsaettes 5 mL af komplette medier, fjerne cellesuspension fra kolben og centrifugeres ved 1200 rpm i 3 min.
- Fjern supernatanten ved hjælp af et vakuum indsugningsventil og resuspenderes celle med en tæthed på 1 X 106 celler pr. mL i EGM2.
Bemærk: Denne protokol har haft stor succes ved hjælp af endotel celle vækstmedium (EGM2) der indeholder standard vækstfaktor bullet kit samt en yderligere 10% FBS. - Når Transfektion løsning er færdig med at inkubere, plade 1 mL af opløsning i en 10-cm plade, og der tilsættes 1 mL af HUVEC suspension på toppen.
- Tilføje en ekstra 7 mL af komplette medier til at bringe de endelige rumfang i 10 cm plade til 9 mL.
- Udgør mindst to 10 cm plader værd af celler for hver Transfektion betingelse til at sikre, at der er nok celler til de senere trin i analysen.
Bemærk: Disse betingelser resultere i en endelig arbejder koncentration af genet regulerende oligonukleotid 20 nM. Forfatterne har fundet disse betingelser for at resultere i en 60-80% knockdown af genekspression for deres mål af interesse. Andre forskere kan være nødvendigt at optimere Transfektion betingelser efter deres eksperimentelle behov. - Udveksle media 4-6 h post tilsætning af siRNA komplekser med friske komplet media.
Bemærk: Denne protokol blev udviklet ved hjælp af passage 1-2 HUVEC.
Dag 2
2. belægning af Microcarrier perler med Endothelial Cells
- Rekonstruere microcarrier perler (f.eks.Cytodex 3) ved en koncentration på 60.000 perler/mL PBS og autoklave.
Bemærk: microcarrier perler kommer i en koncentration på ca 3 x 106 perler per gram. Rekonstruere perler på et forhold på 20 mg af perler pr. mL PBS til at få en perle massefylde på ca 60.000 perler/mL. - Alikvot 1 mL af komplette medier i det ønskede antal rundbundet fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) rør.
- Med pipette overfoeres 20 µL af microcarrier perle suspension til hver tube (Vær forsigtig til at sikre, at den perle løsning er godt genopslemmes før pipettering).
Bemærk: Der vil sandsynligvis være dramatiske variabilitet i den endelige arbejde koncentration af perler i en given microcarrier perle suspension. Perler kan let holde sig til siderne af plast og glas containere, som kan meget ændre perle koncentration i opløsningen. Den mest passende volumen af perle løsningen føjes til FACS tube for hvert parti af microcarrier perle suspension vil skulle fastlægges empirisk investigator. De her tal er beregnet til at tjene mere som et udgangspunkt. Betingelser bør ideelt set optimeres, så der er 10-20 perler indlejret i fibrin gel pr. brønd i 24 godt pladen i slutningen af analysen. Se yderligere diskussion i diskussion afsnittet nedenfor om optimering af perler tal for analysen. - Frigøre transfekteret HUVEC 24 h post Transfektion bruger celle detachement løsning som følger:
- Vask hver 10 cm plade af celler med 5 mL PBS, og derefter tilsættes 2 mL celle detachement opløsning og inkuberes celler ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend celler i en koncentration på 1 X 106 celler/mL i komplet media.
- Tilsættes 1 mL cellesuspension (dvs. 1 X 106 HUVEC) til hver FACS rør indeholdende perler.
- Forsigtigt agitere FACS rør hvert 20 min for varigheden af 4 h ved 37 ° C (hvis fortsætter til trin 3,4) eller 2,5 til 3 h (hvis fortsætter til trin 3.2).
Bemærk: Denne varighed og hyppighed af agitation er empirisk fastslået ved tidligere forskere, der har optimeret det grundlæggende perle spiring assay. 4 Andre frekvenser af agitation og varigheder af perle belægning skridt er ikke blevet testet af forfatterne.
3. sekventiel belægning af Pericytes på HUVEC-belagte Microcarrier perler
- Begynde at afmonterer 10T1/2 celler (pericytes) ved hjælp af celle detachement løsning (trypsin) som følger:
- Vask en T175 kolbe med 10 mL PBS, derefter tilsættes 5 mL trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend 10T1/2 i en koncentration på 2 X 105 celler/0,5 mL i komplet media.
Bemærk: Celler blev købt fra den amerikanske Type kultur samling (ATCC).
Bemærk: Kultur 10T1/2 celler i Minimum afgørende Medium (MEM) suppleret med 10% FBS og 1% Penicillin Streptomycin.
- Efter 2,5 til 3 h agiterer perle + HUVEC løsning, Vent 5 min. for at tillade perler og frit svævende HUVEC til at bilægge til bunden af røret.
- Fjern 0,5 mL af komplette medier fra hver tube bruger P1000 pipette og tilsæt 2 x 105 10T1/2 i komplet medier i et volumen på 0,5 mL til hver FACs tube. Agitere celle og perle løsning og derefter fortsætte til inkuberes ved 37 ° C. Fortsætte med at agitere hver 20 min. indtil perlerne har været agiterede for i alt 4 h.
Bemærk: Forholdet mellem 5 HUVEC: 1 pericyte på perlerne er af afgørende betydning at opretholde passende pericyte dækning af fartøjer.
Bemærk: Følgende alternative trin kan følges i stedet på dette punkt i protokollen: - Gnub perler og HUVEC kun i 4 h.
- Når 4 h HUVEC belægning af microcarrier perler er færdig, agitere rør en sidste gang, vente 30-60 s, derefter straks fjerne 1,5-1,75 mL opløsning fra FACS tube.
Bemærk: Dette bør give tid nok til de fleste af perlerne at bilægge mens mange frit svævende HUVEC i medierne vil blive fjernet.- Tilføj 2 X 105 10T1/2 i komplet media og bringe mængden af FACS rør op til 2 mL.
- Forsigtigt agitere FACS rør hvert 20 min til en ekstra time.
- Når de agiterer er færdig, forsigtigt agitere rør en sidste gang og straks fjerne hele løsningen (2 mL), og føje det til en 6-cm plade. Tilføje en yderligere 3 mL af komplette medier til hver tallerken og læg pladerne i 37 ° C inkubator natten over.
Dag 3
4. forberedelse af Fibrin Gel løsninger
- Forberede arbejde løsninger af aprotinin i en koncentration på 1 mg/mL i PBS og thrombin på 50 enheder/mL.
Bemærk: Et stort lager af hver af disse løsninger kan være lavet og opbevares ved 4 ° C i mindst et år. - Gør en frisk løsning af fibrinogen i en koncentration på 2 mg/mL. Gøre nok løsning at have 2,5 mL af opløsning pr. ophidset FACS tube.
- Varm løsning i et 37 ° C vandbad i 10 min. så alle af fibrinogen til at gå i opløsning.
- Tilføje 37,5 µL af aprotinin løsning per 1 mL af fibrinogen løsning.
- Sterilt-filter løsningen og der er afsat ved stuetemperatur.
5. at forberede perler Gel Implantation
- Undersøge de retter, der indeholder de microcarrier-belagte perler under mikroskop ved hjælp af de 20 X mål for at sikre, at alle perler har været tilstrækkeligt belagt af endothelceller.
- Energisk afpipetteres forkromet løsning af celler til at frigøre dem fra 6-cm plade og placere løsningen ind i et rør. Vaske pladen 2 X ekstra gange med komplet media og overførsel til glasset til at indsamle alle resterende perler, der kan overholdes på pladen.
- Undgå at indføre luftbobler og bruge p1000 pipette til at minimere shear stress på i endothelial celle-belagt perler.
- Hvis vurderingen siRNA knockdown effektivitet i endothelial celler er påkrævet, i trin 2, skal du have en plade af kun HUVEC-belagte perler. Derefter under dette trin (5.2), frigøre perlerne og indsamle de resterende HUVEC knyttet til plade for RNA isolering og qPCR analyse.
- Vente 3 minutter til at tillade perlerne i løsning at bilægge til bunden af røret.
- Fjern så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre den perle pellet ved hjælp af en p1000 pipette tip (brug ikke en vakuum indsugningsventil).
- Der tilsættes 1 mL af komplette medier til hver tube og resuspend perlerne.
- Vente 30-60 s for at give perlerne til at bilægge til bunden. Derefter fjerne så meget af supernatanten som muligt ved hjælp af en P1000 pipette uden at forstyrre perle pellet. Brug ikke en vakuum indsugningsventil, da sandsynligheden for et uheld at fjerne perle pellet er steget kraftigt.
- Gentag trin 5.5 og 5.6 to ekstra gange. Målet er at fjerne så meget af den frit svævende HUVEC, der kan er blevet skilt fra 6-cm plade som muligt, mens du ikke fjerner for mange HUVEC-belagte perler, som skulle bosætte sig i FACS tube hurtigere end frit svævende celler.
- Der tilsættes 1 mL af komplette medier til perlerne.
6. indlejring belagte perler i en Fibrin Gel
- Fjern så mange medier som muligt uden at forstyrre perle pellet i hver FACS rør ved hjælp af en P1000 pipette.
- Resuspend perlerne i 2,5 mL af fibrinogen løsning.
- Der afpipetteres 13 µL af thrombin løsning i hver ønskede godt af en 24-godt glas-bund plade. Plating i en glas-bund plade er afgørende for at sikre optimal billeddannelse af spirer.
Bemærk: Lad ikke thrombin sidder i en godt for mere end 5-10 min før det næste skridt. - Tilsæt 0,5 mL af perle/fibrinogen løsning til hver brønd.
- Vær sikker på at resuspend perle løsning godt før pipettering løsningen hver gang.
- Tage forsigtighed at omhyggeligt med pipette overfoeres direkte til thrombin allerede er til stede i brønden. Langsomt pipetteres op og ned 2 - 3 gange at blandes grundigt løsning, at tage forsigtighed ikke indføre nogen luftbobler.
- Sørg for at ændre pipette spidsen mellem brønde.
- Være forsigtig ikke flytte eller forstyrre plade på ethvert tidspunkt under indledende fibrin koagulation, som enhver bevægelse kan forstyrre gel dannelse.
- Forlade pladen sidder i hætte i 30 min ved stuetemperatur.
- Omhyggeligt overføre pladen til 37 ° C inkubator for en yderligere 1,5-2 h til at tillade gel fuldt størkne
7. plating fibroblaster på toppen af Fibrin Gel
- I løbet af de sidste 30 min af gel solidifying, frigøre Normal menneskelig lunge fibroblaster (NHLF) som følger:
- Vaske en T175 kolbe af celler med 10 mL PBS, derefter tilsættes 5 mL celle distance og inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend NHLF i en koncentration på 20.000 celler/mL i komplet media.
Bemærk: NHLF celler kan dyrkes med Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1% Penicillin Streptomycin.
- Plade 1 mL cellesuspension NHLF på gelen i hver brønd og placere tilbage i inkubatoren.
- Ændre komplet media hver anden dag for varigheden af analysen.
8. Overhold spiring i løbet af 2-7 dage efter perle implantation i fibrin gel. Længden af tid, der kræves for spiring vil afhænge af den passage og masse antallet af HUVEC.
9. fiksering af spiring Assay
- Når tilstrækkeligt spiring er opstået for at kunne bestemme en fænotypiske forskellen mellem behandlingsgrupper, vaske alle brønde én gang med 2 mL PBS.
- Tilsæt 0,5 mL af celle detachement løsning til hver brønd og pladen anbringes i et 37 ° C inkubator i 5 min.
- Fjerne pladen fra rugemaskinen, og tryk på siderne af pladen.
Bemærk: Formålet med dette trin er at fjerne så mange af de NHLF celler vokser på toppen af fibrin gel som muligt for at lette antistof indtrængen i gel samt billeddannelse af gelen. Den samlede inkubationstiden med celle detachement løsning kan skal justeres for at optimere NHLF fjernelse. Forskere er advaret om at ikke Inkuber gel for overdreven perioder som celle detachement løsning kan trænge ind i gelen og begynde at forstyrre i endothelial strukturer inden for. - Når en tilstrækkelig mængde af NHLF celler er blevet fjernet, slukke celle detachement løsning med 1 mL af komplette medier.
- Opsug den fritliggende NHLF og medier ved hjælp af et vakuum indsugningsventil, og brøndene vaskes en gang med 1 mL PBS.
- Tilsæt 300 µL af 2% PARAFORMALDEHYD løsning i PBS til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
- Fjerne 2% PARAFORMALDEHYD løsning og vaske hver godt 3 gange med 1 mL PBS for 3 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Bortskaf venligst 2% PARAFORMALDEHYD løsning korrekt i overensstemmelse med retningslinjer for miljø og sundhed og sikkerhed (EHS).- Der tilsættes 1 mL PBS til hver godt og opbevares ved 4 ° C indtil klar til at plette eller billede spirer.
10. farvning af spiring Assay
- Tilsæt 300 µL af 0,5% Triton-X 100 i PBS til hver godt og Inkuber i 30 til 45 min ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af et vakuum indsugningsventil, fjerne Triton-X100 og vask 3 gange i PBS i 5 min.
- Tilsæt 500 µL blokerende løsning til hver gel og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Den blokerende løsning består af følgende komponenter: 1% bovint serumalbumin (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 og 1% antiserum (brug de samme arter som din sekundære antistoffer stammer) i PBS. - Fjern blokering løsning fra hver brønd og tilsæt 300 µL af Farvningsopløsningen indeholdende primære antistof til hver brønd.
Bemærk: Farvningsopløsningen er den samme som den blokerende løsning, men uden den nuværende antiserum. Forfatterne har haft succes inkubere med primære antistoffer ved fortyndinger af 1:200 til 1: 400. - Inkuber primære antistoffer i farvning løsning i 24 timer ved 4 ° C.
- Opsug primære antistof løsning og vask 3 gange i TBS med 0,5% tween i 20 min. ved stuetemperatur med blid vuggende. Efter den tredje vask, erstatte med frisk vaskebuffer igen, og opbevares ved 4 ° C natten over.
- Inkuber med fluorescerende sekundær antistof fortyndet 1:1000 i farvning løsning i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjerne sekundær antistof Farvningsopløsningen og vaske 5 gange i 20 min. med TBS indeholdende 0,5% tween ved stuetemperatur med blid vuggende.
- Fortynd nukleare pletten i PBS og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Denne protokol har haft stor succes med Hoechst fortyndet 1: 10000 i PBS.
Bemærk: Der er ingen grund til at fjerne nukleare Farvningsopløsningen før billeddannelse. - Billede inden for et par dage for at fuldføre farvning for at fange optimal fluorescerende signal.
11. spiring Assay kvantificering
- Når spirer har været afbildet, importere billedfiler til ImageJ og bruge optællingsværktøjet til at tælle antallet af spirer eller værktøjet streg til at måle spire længder.
Bemærk: Spirer er defineret som endotel fremspring med en længde, større end eller lig med diameteren af den kugle, hvorfra de spirer. 11 spire længde kan måles som afstanden fra det sted hvor spire begynder udstående ud af perle til spidsen af spire. Gennemsnit spire længde pr. perle og gennemsnitligt antal spirer pr. perle er nyttige målinger til vurdering af fænotypisk virkninger af genhæmning i spiring angiogenese. Det gennemsnitlige antal perler, der indeholder mindst én spire pr. behandling gruppe kan også bruges som en parameter for at vurdere robustheden af spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol giver mulighed for en stram forening af to celle typer in vitro og tilstedeværelsen af pericytes supplerer forekomsten af spirende (figur 1A, B). Protokollen giver også mulighed for effektiv genhæmning (f.eks. via RNA-interferens) af et gen af interesse i en celletype af interesse, såsom (VEGFA specielt i endothelial celler) eller PDGFRβ i pericytes7,12 under analysen, som kan oversætte til hæmning af spirende fænotype i analysen. Forskere beskæftiger denne protokol opfordres til at udføre en standard endotel celle-kun spirende assay parallelt med pericyte-belagt spirende analysen mere grundigt undersøge de unikke bidrag af pericytes i de vaskulære funktioner og fænotyper undersøges.
De betingelser, der er beskrevet i denne protokol er vigtigt at holde sig til for at opnå tilstrækkelig belagte perler (figur 2A, B), der vil være i stand til at gennemgå robust spiring i fibrin gel. Forfatterne har konstateret, at et overskud af pericytes (f.eks. pericytes belagt på en ratio af 1 10T1/2 til 1 HUVEC) resultat i pericyte overvækst af det hele godt og efterfølgende evne til at skelne forskellige vaskulære strukturer i brønden.
Figur 1. Pericytes knyttes tæt endotel fartøjer i perle spiring assay. (A) Standard spirende assay med HUVEC eneste belagte perler. (B) konfokalmikroskopi billeder af pericyte spiring analyse viser, at pericytes wrap i endothelial fartøjer i den spirende assay, men ikke hindrer deres spiring. Blå er Hoechst (nukleare pletten); rød er CD31 (endotel pletten), og grøn er Desmin (pericyte pletter). Alle skala barer, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Belagte perler har en ru, golfbold udseende. Nøgen microcarrier perler (A) har en helt glat overflade, mens passende belagte perler klar til fibrin gel implantation (B) har en ru, golf bold-lignende udseende. Skala bar, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol udgør en metode til at karakterisere de komplekse stadier og Heterotypiske cellulære vekselvirkninger mellem spiring angiogenese af gør det muligt for forskeren at ansætte genetiske og billedbehandling tilgange til grundig Mekanistiske undersøgelser. Når du udfører analysen, er det vigtigt, at effektiv endotel belægning af perlerne finder sted under perlen agitation trin. Dårlig endotel belægning vil blive gjort tydeligt, hvis perlerne ikke synes at have en golf bold-lignende ru overflade næste morgen før gel implantation og i stedet vises helt glat. Sørge for at sikre, at perlerne er tilstrækkeligt genopslemmes under hver agitation trin af kraftigt agitere rør for at give maksimal eksponering af perle overfladen i endothelial celler, men ikke så aggressivt at det forårsager i endothelial celler allerede knyttet til at blive udskilt fra glasperler.
Når du tilføjer pericytes til analysen, er det vigtigt, at forholdet mellem 5 endotelceller til 1 pericyte opretholdes. Et overskud af pericytes får dem til at vokse hen over og overhale i endothelial cellepopulationer under analysen, og en mangel i pericytes forårsager dårlig dækning af fartøjer. Hvis den relevante celle tæthed er opretholdt, men fattige pericyte dækning af fartøjer er stadig observeret kan agitation tid med pericytes skal ændres. Det anbefales ikke at celle numre er ændret. En alternativ fremgangsmåde kan være at belægge perler med endotelceller kun for 4 h, derefter fjerne i endothelial celler fra medierne ved resuspending perle og celle løsning og at fjerne medierne Når perlerne har afgjort men før cellerne har afgjort , derefter tilføje i pericytes og agitere hver 20 min til en ekstra time.
Når indlejring af belagte perler i fibrin blodprop, er det også vigtigt at ikke forstyrre gelen integritet ved at forstyrre pladen under koageldannelse. Afbrydelse af matrix dannelse kan medføre afvigende spiring. Det er også vigtigt at sikre passende perle tæthed i gelen. Hvis befolkningen i perler er for tætte, derefter perler i umiddelbar nærhed af hinanden vil påvirke spiring af tilstødende perler og vil begynde at spire mod hverandre og anastomose. Afhængigt af det endelige mål for forskeren og interesse i kendetegner fartøj-skib interaktioner, kan perle tæthed skal ændres. Imidlertid kan en heterogen population af isolerede perler og perler i tæt nærhed til en anden inden for gelen give i høj grad variable spirende fænotyper. Perle tæthed kan reguleres ved at ændre mængden af perle løsningen føjes til FACS rør under trinnet agitation i protokollen, eller ved at ændre mængden af fibrin løsning anvendes til resuspend perler før gel implantation.
Det er også vigtigt, at sund NHLFs med en tæthed på 20.000 celler pr. mL er belagt på toppen af hver fibrin blodprop. Bemærk venligst at kontinuerlig levering af vækstfaktorer, der leveres af de aktivt dividere NHLFs er nødvendige for robust spiring under analysen. NHLF-aircondition EGM2 er ikke et tilstrækkeligt alternativ. 13 hvis dårlig fremspiring er iagttaget under analysen, anbefales det, at der anvendes en frisk flaske af komplette medier og en ny, sund passage af NHLF celler.
Selv om dette assay begynder at løse den cellulære og fænotypiske kompleksiteten af angiogenese på en større opløsning, udgør det stadig en lemfældig system i forhold til den sande, in vivo sammenhæng. Den spirende angiogenese forekommer i dette assay er derudover mere svarer til en sund, fysiologiske forbindelse i stedet for en patologisk sammenhæng som tumor angiogenese. Fremtidige anvendelser af denne metode kan omfatte indførelse af yderligere celletyper (såsom immun cellepopulationer, at modulere angiogene svar) til yderligere sammenfatte Heterotypiske cellulære vekselvirkninger involveret i denne komplekse proces. Indførelsen af eksterne stressfaktorer - såsom en tumor, der er indlejret i umiddelbar nærhed af de spirende fartøjer i fibrin gel - at simulere patologiske angiogenese in vitro- kan også anvendes til at tillade mere grundig, mekanistiske karakterisering af de Molekylær veje aktiveret i patologisk sammenhænge. Disse fremskridt vil være vigtigt for at forbedre muligheden for forskere at studere de komplekse stadier af angiogenese i en mere kontrolleret indstilling, i sidste ende muliggør registrering og mere dybdegående karakterisering af nye terapeutiske veje for målretning patologiske angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Victoria Bautch og Joshua Boucher for nyttige diskussioner og rådgivning om optimering af standard perle spiring assay betingelser og en spirende assay farvning protokol. S.H.A. var delvist understøttet af et tilskud fra National Institute of General Medical Sciences under tildele 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
