Summary
Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l'angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l'angiogenesi.
Abstract
L'angiogenesi è la crescita di nuovi vasi dal sistema vascolare pre-esistente ed è una componente importante di molti processi biologici, compreso l'embriogenesi e sviluppo, guarigione delle ferite, la crescita del tumore e metastasi e malattie oculari e cardiovascolari. Efficace in vitro modelli che ricapitolano la biologia dell'angiogenesi sono necessari per studiare questo processo in modo appropriato e di identificare i meccanismi di regolazione che possono essere in ultima analisi mirate per nuove strategie terapeutiche. L'analisi di angiogenesi della perla è stato dimostrato in precedenza di ricapitolare le fasi multiple di germogliatura endoteliale in vitro. Tuttavia, una limitazione di questo test è una mancanza di endoteliali – interazioni cellula murale, , che sono la chiave per la regolazione molecolare e fenotipica delle cellule endoteliali funzionano in vivo. Il protocollo dato qui presenta una metodologia per l'incorporazione delle cellule murale il dosaggio di angiogenesi perlina e dimostra una stretta associazione delle cellule endoteliali e periciti durante la germinazione in vitro. Il protocollo dettaglia anche una metodologia efficace silenziamento dei geni bersaglio utilizzando siRNA in cellule endoteliali per studi meccanicistici. Complessivamente, questo protocollo fornisce un'analisi in vitro che in modo più appropriato modelli i tipi di cellule diverse coinvolti nell'angiogenesi di germogliatura e fornisce una piattaforma più fisiologicamente rilevanti per la valutazione terapeutica e romanzo scoperta di meccanismi di regolazione dell'angiogenesi.
Introduction
L'angiogenesi è vitale per l'embriogenesi appropriato e la guarigione della ferita, e svolge anche ruoli chiave nelle numerose malattie compreso la malattia dell'arteria coronaria e1 progressione di cancro. 2 , 3 avere una migliore comprensione di come l'angiogenesi si verifica durante lo sviluppo normale, e come esso viene riattivato in contesti patologici, è fondamentale per lo sviluppo del romanzo, terapeutica efficace. Fedele in vitro modelli che ricapitolano le tappe importanti e tipi cellulari coinvolti nell'angiogenesi in vivo sono necessari per permettere ai ricercatori di meglio caratterizzare i meccanismi molecolari che guidano angiogenesi e fare nuove scoperte in regolazione endoteliale.
Nakatsu e Hughes hanno ottimizzato un saggio di perlina germogliatura che hanno dimostrato subisce delle numerose fasi note di germogliatura angiogenesi. 4 , 5 lo scopo del metodo qui presentato è di costruire, con il dosaggio ottimizzato da Nakatsu e Hughes incorporando perictyes in test, in modo che i ruoli di paracrine e juxtracrine delle cellule murale in germinazione delle cellule endoteliali possono essere incorporati in l'angiogenesi nuovi studi. I periciti sono cellule murale che sono definite dal loro ruolo come cellule che mantengono stretto contatto fisico con le cellule endoteliali a causa del loro essere incorporato nella membrana basale vascolare. 6 cellule endoteliali e periciti impegnano in complesso cross-talk tramite vie tra cui tacca di segnalazione segnalazione, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ e molti altri. 7 , 8 modelli di Mouse carenti in queste vie di segnalazione dimostrano Pericita scarsa copertura di sviluppare il sistema vascolare nell'embriogenesi, che conduce al povero rimodellamento vascolare e sistema vascolare disfunzionale. 7 inoltre, il ruolo dei pericytes nell'angiogenesi patologica è importante ma spesso sottovalutato. Ad esempio, una caratteristica unica del sistema vascolare del tumore è che i vasi sono più immaturi, che perde e disfunzionale dovuto Pericita scarsa copertura. 9 è stato proposto che la presenza o l'assenza dei pericytes drammaticamente urta il fenotipo dei vasi sanguigni del tumore ed è un importante mediatore delle risposte alle terapie antitumorali e antiangiogenici. 9 così, compreso il ruolo dei pericytes in saggi in vitro è la chiave per catturare più completamente i meccanismi importanti di regolazione endoteliale.
Anche se ci sono molti saggi in vitro ed ex vivo attualmente impiegati per studiare l'angiogenesi, ci sono lacune di considerare in ciascuno. Alcuni, come proliferazione endoteliale e saggi di migrazione endoteliale, sono eccessivamente semplificati e concentrarsi su una funzione endoteliale in un ambiente isolato sulla plastica di coltura del tessuto. 10 altri saggi si verificano in un altro 3 dimensionale (3D), come l'analisi di formazione del tubo di Matrigel,10 ma queste analisi sono ancora molto semplificate e concentrano maggiormente sulla capacità delle cellule endoteliali per migrare e formare de novo vascolare strutture, al contrario di germinazione dal sistema vascolare pre-esistenti. Inoltre, nessuno di questi saggi incorporare tipi cellulari murale. Ci sono ex vivo modelli come l'analisi dell'aorta di anello che incorporano i periciti presenti nell'organo ospitante, ma la manipolazione genetica di questi modelli è molto più impegnativo a causa della necessità di generare modelli murini transgenici o knockout della percorsi di interesse. Il tallone di germogliatura dosaggio è ideale perché modella germogliare endoteliale, proliferazione, migrazione e formazione anche l'anastomosi e lumen in una matrice 3D. 4 il dosaggio consente fedelmente meccanicistico valutazione delle molte diverse fasi di germinazione, pur consentendo per diretta modificazione genetica delle cellule endoteliali o pericytes in un ambiente più controllato. I coaguli di fibrina contenente microsfere di germogliatura possono essere facilmente risolto, macchiati e ripreso in diverse fasi di germinazione; questi germogli possono anche essere inseriti in una camera di imaging dal vivo per eseguire la formazione immagine in tempo reale di germogliatura. La metodologia presentata qui è ideale per studiare i meccanismi di base dell'angiogenesi attraverso in phenotyping profondità e analisi approfondita delle vie attivate durante l'angiogenesi.
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Protocol
Giorno 1:
1. transitori di transfezione delle cellule endoteliali
- Se si desidera eseguire una trasfezione transiente di umano ombelicale vena Endothelial cellule (HUVEC) utilizzando oligonucleotidi regolazione genica (es. micro-RNA o short interfering RNA (siRNA)) e il reagente appropriato lipofectamine secondo istruzioni del produttore.
Nota: Questo protocollo ha avuto grande successo esecuzione inversione transfezioni con sequenze di siRNA personalizzato e un reagente di transfezione commerciale (Vedi materiali tavolo). Gli autori non hanno testato altri protocolli di transfezione e reagenti con questo test. I passaggi per la transfezione inversa utilizzando i reagenti elencati sono come segue: - Ricostituire il liofilizzato siRNA o microRNA ad una concentrazione di 20 µM in acqua libera nucleasi.
- Rendere le soluzioni di transfezione con il seguente rapporto: 1 mL di qualsiasi media liberi del siero con 9 µ l di siRNA o microRNA.
- Agitare la soluzione e lasciare Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere alla soluzione 18 µ l di reagente di transfezione e agitare.
- Lasciare la soluzione a incubare a temperatura ambiente per 20-40 minuti, agitando la soluzione ogni 10-15 min per tutta la durata dell'incubazione.
- Mentre la soluzione di transfezione è incubando, staccare HUVEC utilizzando una soluzione di distacco delle cellule (per esempio, Accutase). Per un pallone T175, lavare il matraccio con 10 mL di Phosphate Buffered Saline (PBS) e poi aggiungere 5 mL di soluzione di distacco delle cellule e incubare la beuta a 37 ° C per 10 min.
- Aggiungere 5 mL di terreno completo al pallone T175, rimuovere la sospensione cellulare dalla boccetta e centrifuga a 1200 giri/min per 3 min.
- Rimuovere il supernatante utilizzando un aspiratore e risospendere il pellet cellulare ad una densità di 1 X 106 cellule per mL in EGM2.
Nota: Questo protocollo ha avuto grande successo utilizzando il Medium di crescita cellulare endoteliale (EGM2) che contiene il kit di proiettile di fattore di crescita standard, nonché un ulteriore 10% FBS. - Al termine la soluzione di transfezione di incubazione, piastra 1 mL di soluzione in un piatto di 10 cm e aggiungere 1 mL di sospensione HUVEC sulla parte superiore.
- Aggiungere un ulteriore 7 mL di multimediale completo per portare il volume finale della piastra di 10 cm a 9 mL.
- Costituiscono almeno due piastre di 10cm vale la pena di celle per ogni condizione di transfezione assicurare che ci sono abbastanza cellule disponibili per i passaggi successivi nell'analisi.
Nota: Queste condizioni comportare una concentrazione finale del lavoro di oligonucleotide di regolamentazione gene di 20 nM. Gli autori hanno trovato queste condizioni per provocare un atterramento di 60-80% di espressione genica per le loro destinazioni di interesse. Altri ricercatori potrebbero essere necessario ottimizzare le condizioni di transfezione secondo le proprie esigenze sperimentali. - Scambiare l'aggiunta di post media 4-6 h di siRNA complessi con fresco multimediale completo.
Nota: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando passaggio HUVEC 1-2.
2 ° giorno
2. rivestimento di perline di Microcarrier con le cellule endoteliali
- Ricostituire microcarrier Perline (ad es., Cytodex 3) ad una concentrazione di 60.000 perline/mL in PBS e autoclave.
Nota: microcarrier perline vengono ad una concentrazione di circa 3 x 106 perline per grammo. Ricostituire le perline con un rapporto di 20 mg di perline per mL di PBS per ottenere una densità di perlina di circa 60.000 perline/mL. - Aliquotare 1 mL di completa per i media nel numero desiderato di fondo tondo tubi fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS).
- Pipettare 20 µ l di sospensione tallone microcarrier in ogni provetta (fare attenzione a garantire che la soluzione della perla è ben risospeso prima del pipettaggio).
Nota: Ci sarà probabilmente drammatico variabilità della concentrazione di lavoro finale di perline presenti in una sospensione di perlina di microcarrier dato. Perline possono facilmente aderire ai lati dei contenitori di plastica e di vetro che possono alterare notevolmente la concentrazione di perlina nella soluzione. Il più appropriato volume della soluzione di tallone aggiunto al tubo FACS per ciascun batch di sospensione tallone microcarrier dovrà essere determinata empiricamente dallo sperimentatore. I numeri presentati qui sono destinati a servire più come punto di partenza. Idealmente, dovrebbero essere ottimizzate le condizioni così ci sono 10-20 perle incorporati all'interno del gel di fibrina per pozzetto della piastra di ben 24 alla fine del test. Vedere ulteriori discussioni nella sezione discussione qui sotto per quanto riguarda l'ottimizzazione dei numeri di perline per il dosaggio. - Scollegare trasfettate HUVEC 24 h post transfezione utilizzando la soluzione di distacco delle cellule come segue:
- Lavare ogni piatto di 10 cm di cellule con 5 mL di PBS e poi aggiungere 2 mL di soluzione di distacco delle cellule e incubare le cellule a 37 ° C per 10 min.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 X 106 cellule/mL in completa per i media.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (cioè 1 X 106 HUVEC) ad ogni provetta di FACS contenente microsfere.
- Agitare delicatamente i tubi di FACS ogni 20 min per la durata di 4 ore a 37 ° C (se procedendo al punto 3.4) o 2,5 a 3 h (se procedendo al punto 3.2).
Nota: La durata e la frequenza di agitazione è stato determinato empiricamente da ricercatori precedenti che hanno ottimizzato la base bead dosaggio di germogliatura. 4 Altre frequenze di agitazione e le durate del passo di rivestimento del tallone non sono state testate dagli autori.
3. rivestimento sequenza dei Pericytes su perline rivestite su HUVEC Microcarrier
- Iniziare lo scollegamento 10T1/2 celle (periciti) utilizzando la soluzione di distacco delle cellule (tripsina) come segue:
- Lavare un pallone T175 con 10 mL di PBS, poi aggiungere 5 mL di tripsina e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Risospendere 10T1/2 ad una concentrazione di 2 X 105 cellule/0,5 mL in completa per i media.
Nota: Le cellule sono state acquistate da americano tipo Culture Collection (ATCC).
Nota: Cellule di cultura 10T1/2 nel Medium essenziale minimo (MEM) completati con 10% FBS e 1% penicillina streptomicina.
- Dopo 2,5-3 h di agitazione il tallone + soluzione HUVEC, attendere 5 min per consentire le perline e HUVEC digalleggiante di depositano alla parte inferiore del tubo.
- Rimuovere 0,5 mL di terreno completo da ciascuna provetta usando una pipetta P1000 e aggiungere 2 x 105 10T1/2 media completa in un volume di 0,5 mL per ogni tubo di FACs. Agitare la soluzione cella e tallone e quindi continuare a incubare a 37 ° C. Continuare ad agitare ogni 20 min fino a quando le perline sono state agitate per un totale di 4 h.
Nota: Il rapporto di HUVEC 5: 1 Pericita sui branelli è essenziale mantenere Pericita appropriata copertura dei vasi.
Nota: La seguente procedura alternativa può essere seguita invece a questo punto il protocollo: - Agitano perline e HUVEC solo per 4 h.
- Una volta completato il 4 h di rivestimento HUVEC delle perle microcarrier, agitare i tubi un'ultima volta, attendere 30-60 s, quindi rimuovere immediatamente 1.5-1.75 mL della soluzione dal tubo FACS.
Nota: Questo dovrebbe consentire tempo sufficiente per la maggior parte delle perle mentre molti HUVEC digalleggiante nei media verrà rimosso.- Aggiungere 2 X 105 10T1/2 in completa per i media e portare il volume del FACS tubo fino a 2 mL.
- Agitare delicatamente i tubi di FACS ogni 20 min per un'altra ora.
- Una volta completata l'agitazione, delicatamente agitare i tubi un'ultima volta e immediatamente rimuovere l'intera soluzione (2 mL) e aggiungerlo ad una piastra di 6 cm. Aggiungere un ulteriore 3 mL di multimediale completo per ogni piatto e posizionare le piastre nell'incubatore 37 ° C durante la notte.
3 ° giorno
4. preparazione delle soluzioni di Gel di fibrina
- Preparare soluzioni di lavoro di aprotinina ad una concentrazione di 1 mg/mL in PBS e trombina a 50 unità/mL.
Nota: Un grande magazzino di ognuna di queste soluzioni può essere fatto e conservato a 4 ° C per almeno un anno. - Fare una soluzione fresca di fibrinogeno ad una concentrazione di 2 mg/mL. Rendono abbastanza soluzione avere 2,5 mL di soluzione per tubo FACS agitato.
- Riscaldare la soluzione in bagnomaria a 37 ° C per 10 min consentire a tutti di fibrinogeno entrare nella soluzione.
- 37,5 µ l di soluzione di aprotinina per 1 mL di soluzione di fibrinogeno.
- La soluzione sterile-filtro e messa a riposo a temperatura ambiente.
5. preparazione di perline per l'impianto di Gel
- Esaminare i piatti contenenti le perline rivestite con microcarrier sotto il microscopio con l'obiettivo X 20 per garantire che tutte le perle sono state sufficientemente rivestite dalle cellule endoteliali.
- Pipettare vigorosamente la soluzione placcata delle cellule per staccarli dalla piastra di 6 cm e posizionare la soluzione in una provetta. Lavare la piastra 2 volte X con media completi e trasferimento al tubo per raccogliere tutte le perle di residue che possono essere rispettate la piastra.
- Evitare di introdurre bolle d'aria e utilizzare una pipetta p1000 per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio le perline rivestite da cellule endoteliali.
- Se valutazione siRNA atterramento efficienza nelle cellule endoteliali è necessaria, nel passaggio 2, essere sicuri di avere un piatto di sola HUVEC perline rivestite. Quindi durante questa fase (5,2), staccare le perline e raccogliere il residuo che HUVEC fissato alla piastra di isolamento del RNA e analisi qPCR.
- Attendere 3 minuti per consentire le perline nella soluzione a depositarsi sul fondo del tubo.
- Rimuovere tanto del surnatante possibile senza disturbare il pellet perlina utilizzando un puntale p1000 (non utilizzare un aspiratore).
- Aggiungere 1 mL di multimediale completo in ogni provetta e risospendere le perline.
- Attendere 30-60 s per consentire le perline per depositarsi sul fondo. Quindi rimuovere tanto del surnatante come possibile utilizzando una pipetta P1000 senza disturbare il pellet perlina. Non utilizzare un aspiratore come la probabilità di eliminare accidentalmente il pellet perlina è notevolmente aumentata.
- Ripetere i passaggi da 5.5 e 5.6 due volte. L'obiettivo è quello di rimuovere la maggior quantità delle HUVEC digalleggiamento che state staccate dalla piastra 6 cm come possibile, durante la rimozione non troppe perline rivestite su HUVEC, che dovrebbero risolvere più velocemente rispetto alle cellule digalleggiante nel tubo FACS.
- Aggiungere 1 mL di multimediale completo per le perline.
6. incorporare rivestito perline in un Gel di fibrina
- Rimuovere tanto mezzi possibili senza disturbare il pellet perlina in ciascun tubo di FACS usando una pipetta P1000.
- Risospendere le sfere in 2,5 mL di soluzione di fibrinogeno.
- Pipettare 13 µ l di soluzione di trombina in ogni desiderato bene di una piastra a 24 pozzetti con fondo di vetro. Placcatura in un piatto fondo di vetro è essenziale per l'attivazione ottima formazione immagine dei germogli.
Nota: Non lasciare trombina che si siede in un pozzo per più di 5-10 min prima del passaggio successivo. - Aggiungere 0,5 mL di soluzione di tallone/fibrinogeno in ciascun pozzetto.
- Essere sicuri di Risospendere la soluzione tallone ben prima del pipettaggio la soluzione ogni volta.
- Fare attenzione ad attentamente Pipettare direttamente nella trombina già presente nel pozzo. Su e giù lentamente Pipettare 2 - 3 volte per mescolare bene la soluzione, fare attenzione a non introdurre eventuali bolle d'aria.
- Assicurarsi di modificare la punta della pipetta tra pozzetti.
- Fare attenzione a non spostare o disturbare la piastra in qualsiasi punto durante l'iniziale della fibrina di coagulazione, come qualsiasi movimento potrebbe interferire con la formazione di un gel.
- Lasciare la piastra che si siede nella cappa per 30 min a temperatura ambiente.
- Trasferire con cautela la piastra in un incubatore a 37 ° C per un ulteriore 1,5-2 h consentire il gel solidificare completamente
7. placcatura fibroblasti sulla superficie del Gel di fibrina
- Durante gli ultimi 30 minuti di solidificazione del gel, scollegare fibroblasti di polmone umano normale (NHLF) come segue:
- Lavare un pallone T175 delle cellule con 10 mL di PBS, poi aggiungere 5 mL di soluzione di distacco delle cellule e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Risospendere NHLF ad una concentrazione di 20.000 cellule/mL in completa per i media.
Nota: Le cellule NHLF possono essere coltivate con Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS e 1% penicillina streptomicina.
- Piastra 1 mL della sospensione delle cellule NHLF sul gel di ciascun pozzetto e rimettere nell'incubatrice.
- Modifica supporto completo ogni altro giorno per la durata del test.
8. osservare che spuntano nel corso di 2-7 giorni dopo l'impianto di tallone in gel di fibrina. La lunghezza del tempo necessario per la germinazione dipenderà il numero di passaggio e sacco di HUVEC.
9. fissazione del saggio di germogliatura
- Una volta sufficiente germinazione avvenuta per essere in grado di determinare una differenza fenotipica tra gruppi di trattamento, lavare tutti i pozzetti una volta con 2 mL di PBS.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di distacco delle cellule in ciascun pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 5 min.
- Rimuovere la piastra dall'incubatrice e tocca i lati della piastra.
Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di rimuovere come molte delle cellule NHLF crescere sulla superficie del gel di fibrina come possibile per facilitare la penetrazione dell'anticorpo in gel, nonché di formazione immagine del gel. Il tempo totale di incubazione con soluzione di distacco delle cellule potrebbe essere necessario essere regolata per ottimizzare la rimozione NHLF. I ricercatori sono avvertiti di non Incubare il gel per eccessivi periodi di tempo come la soluzione di distacco delle cellule può penetrare il gel e cominciare a perturbare le strutture endoteliali all'interno. - Una volta che una quantità sufficiente di cellule NHLF sono state rimosse, placare la soluzione di distacco delle cellule con 1 mL di multimediale completo.
- Aspirare il NHLF indipendente e i supporti utilizzando un aspiratore e lavare i pozzetti una volta con 1 mL di PBS.
- Aggiungere 300 µ l di soluzione di paraformaldeide 2% in PBS in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Rimuovere la soluzione di 2% di paraformaldeide e lavare ogni ben 3 volte con 1 mL di PBS per 3 min a temperatura ambiente.
Nota: Si prega di smaltire 2% soluzione di paraformaldeide in modo appropriato conformemente alle linee guida di salute ambientale e sicurezza (EHS).- Aggiungere 1 mL di PBS di ogni bene e conservare a 4 ° C fino al momento di macchia o immagine i germogli.
10. colorazione di germogliatura Assay
- Aggiungere 300 µ l di 0,5% Triton-X100 in PBS ad ogni pozzetto ed incubare per 30-45 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando un aspiratore, rimuovere Triton-X100 e lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere 500 µ l di soluzione per ogni gel di blocco e incubare per una notte a 4 ° C.
Nota: La soluzione bloccante si compone dei seguenti componenti: 1% albumina di siero bovino (BSA), 5% FBS, 0.1% tween-20 e 1% antisiero (utilizzare la stessa specie da cui sono derivati i tuoi anticorpi secondari) in PBS. - Rimuovere la soluzione bloccante da ogni pozzetto e aggiungere 300 µ l di soluzione colorante contenente anticorpo primario in ciascun pozzetto.
Nota: La soluzione colorante è lo stesso come la soluzione bloccante, ma senza l'antisiero presente. Gli autori hanno avuto successo in incubazione con gli anticorpi primari alle diluizioni di 1: 200 a 1: 400. - Incubare gli anticorpi primari nella macchiatura soluzione per 24 h a 4 ° C.
- Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare 3 volte in TBS con tween di 0,5% per 20 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con dolce dondolio. Dopo il terzo lavaggio, sostituire con tampone di lavaggio fresco nuovo e conservare a 4 ° C durante la notte.
- Incubare con anticorpo secondario fluorescente diluito 1: 1000 nella macchiatura soluzione per 2 h a temperatura ambiente.
- Soluzione colorante anticorpo secondario di rimuovere e lavare 5 volte per 20 minuti ciascuno, con TBS contenente 0.5% tween a temperatura ambiente con dolce dondolio.
- Diluire macchia nucleare in PBS e incubare per una notte a 4 ° C.
Nota: Questo protocollo ha avuto grande successo con Hoechst diluito 1: 10000 in PBS.
Nota: Non esiste nessuna necessità di rimuovere la soluzione di macchiatura nucleare prima di formazione immagine. - Immagine di un paio di giorni di completare la macchiatura per catturare il segnale fluorescente ottimale.
11. analisi quantificazione di germogliatura
- Dopo i germogli sono stati imaged, importare i file di immagine in ImageJ e utilizzare lo strumento di conteggio per contare il numero di germogli, o lo strumento linea per misurare la lunghezza del germoglio.
Nota: Germogli sono definiti come sporgenze endoteliale con una lunghezza maggiore o uguale al diametro del tallone da cui essi sono germinazione. 11 lunghezza del germoglio può essere misurata come la distanza dal punto in cui ha inizio il germoglio che sporge fuori il tallone alla punta del germoglio. Media lunghezza per perlina del germoglio e numero medio di germogli al tallone è utili metriche per valutare gli effetti fenotipici di silenziamento genico in germinazione l'angiogenesi. Il numero medio delle perle contenenti almeno un germoglio per gruppo di trattamento utilizzabile anche come una metrica per valutare la robustezza di germogliatura.
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Representative Results
Questo protocollo consente una stretta associazione di due cella tipi in vitro, e la presenza dei pericytes integra l'avvenimento di germogliatura (Figura 1A, B). Il protocollo consente inoltre efficace silenziamento (ad es. tramite l'interferenza del RNA) di un gene di interesse in un tipo di cella di interesse quali (VEGFA specificamente in cellule endoteliali) o PDGFRβ nei periciti7,12 durante il dosaggio, che può equivalere a inibizione della germinazione fenotipo nel dosaggio. I ricercatori che impiegano questo protocollo sono incoraggiati a eseguire un test standard di endothelial cellula-soltanto germogliatura in parallelo con il saggio di germogliatura pericyte-rivestito a indagare più a fondo i contributi unici dei pericytes nelle funzioni vascolari e fenotipi in fase di studio.
Le condizioni descritte all'interno di questo protocollo sono importanti da rispettare al fine di ottenere perle rivestite con sufficientemente (Figura 2A, B) che saranno in grado di subire la germogliatura robusto nel gel di fibrina. Gli autori hanno trovato che un eccesso di periciti (ad esempio di periciti rivestiti con un rapporto di 1 10T1/2 a 1 HUVEC) risultato in crescita eccessiva Pericita dell'intero bene e successiva incapacità di discernere distinte strutture vascolari all'interno del pozzo.
Figura 1. Periciti associano strettamente vasi endoteliali nel tallone dosaggio di germogliatura. (A) analisi di germogliatura Standard con perline rivestite soli HUVEC. Immagini di microscopia confocale (B) del Pericita germogliatura analisi dimostrano che periciti avvolgono intorno ai vasi endoteliali nell'analisi della germinazione, ma non ostacolare la loro germinazione. Blu è Hoechst (macchia nucleare); il rosso è CD31 (macchia endoteliale), e desmina (pericyte macchia) è verde. Tutto bilancia bar, 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Perline rivestite hanno una pallina da golf grezzo, come l'apparenza. Microcarrier nudo perline (A) hanno una superficie completamente liscia, mentre adeguatamente rivestite perline pronte per l'impianto di gel di fibrina (B) hanno un aspetto ruvido, di sfera-come golf. Barra della scala, 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo presenta un metodo per caratterizzare le fasi complesse e interazioni eterotipiche cellulari di germogliatura angiogenesi attivando il ricercatore di impiegare approcci genetici e imaging per condurre indagini approfondite meccanicistiche. Quando si esegue il test, è essenziale che efficiente rivestimento endoteliale delle perle si svolge durante il tallone punti di agitazione. Rivestimento endoteliale poveri saranno evidente, se le perline non sembrano avere una superficie ruvida di golf sfera-come la mattina successiva prima dell'impianto di gel e invece appaiono completamente liscia. Fare attenzione a garantire che le perle sono sufficientemente risospese durante ogni fase di agitazione agitando vigorosamente i tubi per consentire la massima esposizione della superficie della perla per le cellule endoteliali, ma non così aggressivamente che esso induce le cellule endoteliali già attaccato per staccarsi dalle perle.
Quando si aggiungono i periciti in test, è essenziale che il rapporto delle cellule endoteliali 5 a 1 Pericita è mantenuto. Un eccesso di periciti li induce a proliferare e sorpassare le popolazioni delle cellule endoteliali durante l'esecuzione del test, e una carenza nei periciti causa scarsa copertura dei vasi. Se la densità di cella appropriata viene mantenuta ma povero Pericita copertura dei vasi è ancora osservata, tempo di agitazione con periciti potrebbe essere necessario essere modificato. Non è consigliabile che i numeri di cellulare sono alterati. Un approccio alternativo potrebbe essere per rivestire le perle con cellule endoteliali solo per 4 h, quindi rimuovere le cellule endoteliali da parte dei media di risospendere il tallone e soluzione di cella e rimuovere il supporto una volta che le perle sono insediati, ma prima le cellule si sono stabiliti , quindi aggiungendo nei periciti e agitazione ogni 20 min per un'altra ora.
Quando si incorporano i branelli rivestiti nel coagulo di fibrina, è anche essenziale per non disturbare l'integrità del gel interrompendo la piastra durante la formazione del coagulo. Rottura della formazione matrice potrebbero germogliare aberrante. È anche essenziale per garantire che la densità di perlina appropriato è mantenuta nel gel. Se la popolazione di perline è troppo densa, perline in prossimità di uno altro influenzeranno la germogliatura della vicina perline e inizieranno a germogliare uno verso l'altro e anastomotizzare. A seconda l'obiettivo finale del ricercatore e interesse nella caratterizzazione interazioni nave-nave, la densità del tallone potrebbe essere necessario essere modificato. Tuttavia, una popolazione eterogenea di isolato perle e perline in prossimità di un l'altro all'interno del gel può dare in gran parte variabili fenotipi di germogliatura. Densità della perla può essere regolata modificando il volume della soluzione di tallone aggiunto ai tubi FACS durante la fase di agitazione del protocollo, o modificando il volume della soluzione di fibrina utilizzati per risospendere le perline prima dell'impianto di gel.
È anche essenziale che sano NHLFs ad una densità di 20.000 cellule per mL sono placcati in cima a ogni coagulo di fibrina. Siete pregati di notare che il rifornimento continuo di fattori di crescita forniti dalla NHLFs attivamente divisione sono necessari per germinazione robusto durante il dosaggio. EGM2 NHLF-condizionato non è un'alternativa sufficiente. 13 se povero di germogliatura è osservato durante l'esecuzione del test, è consigliabile che una bottiglia fresca di multimediale completo e un passaggio nuovo, sano delle cellule NHLF sono utilizzati.
Anche se questo test incomincia ad affrontare la complessità cellulare e fenotipica dell'angiogenesi ad una risoluzione maggiore, ancora rappresenta un sistema molto semplificato relativo al contesto vero, in vivo . Inoltre, la germogliatura angiogenesi che accadono in questo dosaggio è più simile a un contesto sano, fisiologico in contrasto con un contesto patologico come l'angiogenesi del tumore. Applicazioni future di questo metodo possono includere l'introduzione di tipi di cellule supplementari (ad esempio di popolazioni di cellule immuni che modulano le risposte angiogeniche) ulteriormente ricapitolare le interazioni eterotipiche cellulari coinvolti in questo complesso processo. L'introduzione di fattori di stress esterni - ad esempio un tumore incorporato in prossimità dei vasi che germoglia il gel di fibrina - per simulare l'angiogenesi patologica in vitro può essere impiegato anche per consentire più approfondita, meccanicistico Charakterisierung il vie molecolari attivate nei contesti patologici. Questi progressi saranno importanti per migliorare la capacità dei ricercatori di studiare le complesse fasi dell'angiogenesi in un ambiente più controllato, consentendo in ultima analisi, scoperta e più approfondita caratterizzazione di nuove vie terapeutiche per il targeting angiogenesi patologica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la d. ssa Victoria Bautch e Joshua Boucher per utili discussioni e consigli su come ottimizzare il tallone standard spuntano condizioni di dosaggio e un saggio di germogliatura protocollo di colorazione. S.H.A. è stato sostenuto in parte da una sovvenzione dal National Institute of General Medical Sciences sotto Premio 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
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