Summary
Denne protokollen presenterer en roman i vitro perle analysen som mer hensiktsmessig modeller prosessen med i vivo spirende angiogenese ved å inkludere pericytes. Denne endringen kan perle analysen til mer trofast recapitulate heterotypic mobilnettet samspillet mellom endotelceller og veggmaleri celler som er avgjørende for angiogenese.
Abstract
Angiogenese er veksten av nye fra eksisterende blodkar og er en viktig komponent i mange biologiske prosesser, herunder embryogenesis og utvikling, sårheling, tumor vekst og metastasering, og okulær og hjerte sykdommer. Effektiv i vitro modeller som recapitulate biologi angiogenese er nødvendig å riktig studere denne prosessen og identifisere mekanismer regulere som kan målrettes til slutt for romanen strategier. Perle angiogenese analysen har vist tidligere for å recapitulate flere stadier av endothelial spirende i vitro. En begrensning av denne analysen er imidlertid mangel av endothelial-veggmaleri celle interaksjoner, som er nøkkelen til molekylære og fenotypiske regulering av endothelial celle funksjon i vivo. Protokollen gitt her presenterer en metode for inkorporering av veggmaleri celler perle angiogenese analysen og demonstrerer en stram sammenslutning av endotelceller og pericytes under spirende i vitro. Protokollen også detaljer en metodikk for effektiv stanse målet gener bruke siRNA i endotelceller for mekanistisk studier. Til sammen gir denne protokollen i vitro analysen som mer hensiktsmessig modeller de ulike celletyper i spirende angiogenese, og gir en mer fysiologisk relevante plattform for terapeutisk vurdering og romanen oppdagelsen av mekanismer av angiogenese regulering.
Introduction
Angiogenese er avgjørende for riktig embryogenesis og sårheling, og det også spiller nøkkelroller i mange sykdommer, inkludert kreft progresjon1 og coronary arterien sykdom. 2 , 3 har en bedre forståelse av hvordan angiogenese oppstår under normal utvikling, og hvordan den aktiveres i patologisk sammenhenger, er avgjørende for utviklingen av romanen, effektiv therapeutics. Trofaste i vitro modeller som recapitulate viktige faser og celletyper involvert i angiogenese i vivo er nødvendig for å tillate forskere å karakterisere molekylære mekanismer kjøring angiogenese og gjøre nye funn i endothelial regulering.
Nakatsu og Hughes har optimalisert en spirende perle analysen som de har vist gjennomgår de mange kjente stadiene av spirende angiogenese. 4 , 5 formålet med metoden som presenteres her er å bygge på analysen optimalisert ved Nakatsu og Hughes ved å innlemme perictyes i analysen, slik at freske celler i endothelial celle spirende paracrine og juxtracrine roller kan innlemmes i romanen angiogenese studier. Pericytes er veggmaleri celler som er definert av deres rolle som celler som har nær fysisk kontakt med endotelceller på grunn av deres bygges i vaskulær kjelleren membranen. 6 Pericytes og endotelceller delta i komplekse cross-talk via signalnettverk trasé inkludert hakk signalnettverk, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ og mange andre. 7 , 8 musen modeller mangelfull i disse signalveier viser dårlig pericyte dekning av utvikle blodkar i embryogenesis, fører til dårlig vaskulær remodeling og dysfunksjonelle blodkar. 7 i tillegg rollen pericytes i patologisk angiogenese er viktig men ofte under-verdsatt. For eksempel er en unik funksjon i svulst blodkar at fartøyene er umodne, lekk og dysfunksjonelle på grunn av dårlig pericyte dekning. 9 det har blitt foreslått at tilstedeværelse eller fravær av pericytes dramatisk påvirker fenotypen av svulst blodårer og er en viktig formidler av Svar å antiangiogenic og antitumor terapier. 9 derfor inkludert rollen pericytes i vitro analyser er nøkkelen til mer fullstendig fange viktig mekanismer for endothelial regulering.
Selv om det er mange i vitro og ex vivo analyser for tiden ansatt å studere angiogenese, finnes det mangler å vurdere i hver. Noen som endothelial spredning og endothelial migrasjon analyser, er altfor forenklet og fokusere på en endothelial funksjon i et isolert miljø på vev kultur plast. 10 andre analyser skje i en mer 3 dimensjonale (3D), som Matrigel rør formasjon analysen,10 men disse analyser er fortsatt unyansert og fokusere mer på evnen til endotelceller å overføre og danner de novo vaskulære strukturer, i motsetning til spirende fra eksisterende blodkar. Videre innlemme ingen av disse analyser veggmaleri celletyper. Det er ex vivo modeller som ring aorta analysen som innlemme pericytes i vert orgelet, men genetisk manipulering av disse modellene er mye mer utfordrende på grunn av nødvendigheten av knockout eller transgene musen modeller av den veier rundt. Perlen spirende analysen er ideelt fordi det modeller endothelial spirende, spredning, migrasjon og selv anastomose og lumen formasjon i en 3D matrise. 4 analysen trofast gir mekanistisk vurdering av de mange ulike stadiene av spirende, samtidig gir direkte genmodifisering av enten endotelceller eller pericytes i en mer kontrollert setting. Det fibrin clots som inneholder spirende perlene kan lett fast, beiset og fotografert på ulike stadier av spirende; disse spirer kan også plasseres i en live bildebehandling kammer å utføre sanntid avbilding av spirende. Metodene som presenteres her er ideelt for å studere grunnleggende mekanismer av angiogenese gjennom i dybden phenotyping og grundig analyse av veier aktivert under angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1:
1. forbigående Transfection av endotelceller
- Eventuelt utføre en forbigående transfection av menneskelig Umbilical blodåre Endothelial celler (HUVEC) bruker gen-regulatoriske oligonucleotides (f.eks mikro-RNAs eller lite forstyrrende RNA (siRNA)) og den aktuelle lipofectamine reagensen i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Denne protokollen har hatt stor suksess utfører omvendt transfections med egendefinerte siRNA sekvenser og en kommersiell transfection reagens (se materialer tabell). Forfatterne har ikke testet andre transfection protokoller og reagenser med denne analysen. Fremgangsmåten for den omvendte hva bruke reagensene oppført er som følger: - Rekonstituer lyofiliserte siRNAs eller microRNAs i en konsentrasjon på 20 µM i nuclease gratis vann.
- Gjør hva løsninger på følgende forhold: 1 mL av serum Gratis medier med 9 µL av siRNA eller microRNA.
- Agitere løsningen og la den å ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legg 18 µL av transfection reagensen til løsning og røre.
- Tillate løsningen å ruge ved romtemperatur for 20-40 min, agitating løsningen hvert 10 til 15 min for varigheten av inkubasjon.
- Mens Hva løsningen er incubating, koble HUVEC bruker en celle avdeling løsning (f.eksAccutase). For en T175 kolbe, vaske flasken 10 mL av fosfat bufret saltvann (PBS), og deretter legger 5 mL av cellen avdeling løsning og ruge kolbe ved 37 ° C i 10 min.
- Legge til 5 mL av komplett T175 kolbe, fjerne celle suspensjon fra flasken og sentrifuge 1200 RPM for 3 min.
- Fjern nedbryting bruker et vakuum aspirator og resuspend celle pellet på en tetthet av 1 X 106 celler per mL i EGM2.
Merk: Denne protokollen har hatt stor suksess med endotelial celle vekst Medium (EGM2) som inneholder standard vekstfaktor bullet kit samt ytterligere 10% FBS. - Når Hva løsningen er ferdig rugende, plate 1 mL av løsningen i en 10 cm plate, og Legg 1 mL av HUVEC suspensjon på toppen.
- Legge til en ekstra 7 mL av komplett medier å bringe det siste bindet i 10 cm plate til 9 mL.
- Utgjør minst to 10 cm plater verdt celler for hver transfection tilstand å sikre at det er nok celler tilgjengelig for senere trinn i analysen.
Merk: Disse forholdene medføre en siste arbeider konsentrasjon av genet regulatoriske oligonucleotide 20 nM. Forfatterne har funnet disse betingelsene vil resultere i en 60-80% knockdown av genuttrykk for deres mål av interesse. Andre forskere må optimalisere transfection forholdene deres eksperimentelle behov. - Utveksle media 4-6 h innlegget tillegg av siRNA komplekser med fersk komplett medier.
Merk: Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av passering 1-2 HUVEC.
Dag 2
2. coating av Microcarrier perler med endotelceller
- Rekonstituer microcarrier perler (f.eksCytodex 3) i en konsentrasjon av 60.000 perler/mL i PBS og autoclave.
Merk: microcarrier perler kommer i en konsentrasjon av ca 3 x 106 perler pr. gram. Rekonstituer perlene i forholdet 20 mg av perler per mL PBS å få en perle tetthet av rundt 60.000 perler/mL. - Aliquot 1 mL av komplett media ønsket nummer av rund bunn fluorescens aktivert celle sortering (FACS) rør.
- Pipetter 20 µL av microcarrier perle suspensjon i hver rør (pass slik at perle løsningen er vel resuspended før pipettering).
Merk: Det vil trolig være dramatiske variasjon i siste arbeider konsentrasjonen av perler i en gitt microcarrier perle suspensjon. Perlene kan lett overholde sidene av plast og glass containere som kan sterkt endre bead konsentrasjon i løsningen. Den mest passende mengden perle løsning lagt til FACS røret for hvert sett med microcarrier perle suspensjon må bestemmes empirisk av etterforskeren. Tallene presenteres her er ment å tjene mer som utgangspunkt. Ideelt sett skal betingelsene være optimalisert slik at det er 10-20 perler innebygd i fibrin gel per brønn i 24 godt plate på slutten av analysen. Se ytterligere diskusjon under diskusjon nedenfor om optimalisering av perler tall for analysen. - Koble transfekterte HUVEC 24 h innlegg hva bruker celle avdeling løsningen som følger:
- Vask hver 10 cm plate av celler med 5 mL PBS, og deretter legger 2 mL av cellen avdeling løsningen og ruge cellene på 37 ° C i 10 min.
- Resuspend cellene i en konsentrasjon av 1 X 106 celler/mL i komplett.
- Legge til 1 mL av cellen suspensjon (dvs 1 X 106 HUVEC) hver FACS rør som inneholder perler.
- Forsiktig agitere FACS rør hvert 20 min for varigheten av 4 h 37 ° C (Hvis du går videre til trinn 3.4) eller 2,5 til 3 h (Hvis du går videre til trinn 3.2).
Merk: Denne varigheten og frekvensen for agitasjon er empirisk fastslått av tidligere forskere som har optimalisert grunnleggende perlen spirende analysen. 4 Andre frekvenser av omrøring og varighet av perle belegg trinnet har ikke testet av forfatterne.
3. sekvensiell belegg av Pericytes på HUVEC-belagt Microcarrier perler
- Begynn demontering 10T1/2 celler (pericytes) med cellen avdeling løsningen (trypsin) som følger:
- Vask en T175 kolbe med 10 mL PBS, deretter legge 5 mL av trypsin og ruge ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend 10T1/2 i en konsentrasjon av 2 X 105 celler/0,5 mL i komplett.
Merk: Celler ble kjøpt fra amerikansk Type kultur samling (ATCC).
Merk: Kultur 10T1/2 celler i Minimum viktig Medium (MEM) supplert med 10% FBS og 1% Penicillin Streptomycin.
- Etter 2,5 til 3 h agitating perle + HUVEC løsning, vent 5 min for å tillate perler og frittflytende HUVEC å bosette til bunnen av røret.
- Fjerne 0,5 mL komplett fra hver rør med en P1000 pipette og legge 2 x 105 10T1/2 i komplett medier i et volum på 0,5 mL til hver FACs rør. Agitere cellen og perle løsningen og deretter fortsette å ruge på 37 ° C. Fortsette å agitere hvert 20 min til perlene har blitt opphisset totalt 4 h.
Merk: Forholdet mellom 5 HUVEC: 1 pericyte på perlene er viktig å opprettholde riktig pericyte dekning av fartøyene.
Merk: Følgende alternativ kan følges i stedet på dette punktet i protokollen: - Agitere perler og HUVEC bare for 4 h.
- Når 4 h av HUVEC belegg av microcarrier perler er fullført, agitere rør en siste gang, vente 30-60 s, deretter umiddelbart fjerne 1.5-1,75 mL løsning fra FACS røret.
Merk: Dette bør gjøre nok tid for de fleste av perler å avgjøre mens mange frittflytende HUVEC i media vil bli fjernet.- Legg 2 X 105 10T1/2 i komplett og bringe volumet av FACS rør opp til 2 mL.
- Forsiktig agitere FACS rør hvert 20 min for en ekstra time.
- Når de agiterte er fullført, forsiktig røre rør en siste gang umiddelbart fjerne hele løsningen (2 mL) og legge den til en 6-cm plate. Legge til en ytterligere 3 mL komplett hver plate og plasser platene i inkubator 37 ° C over natten.
Dag 3
4. forberedelse av Fibrin Gel løsninger
- Forbered arbeidet løsninger aprotinin i en konsentrasjon av 1 mg/mL i PBS og trombin på 50 enheter/mL.
Merk: Et stort lager av hver av disse løsningene kan være gjort og lagret på 4 ° C i minst et år. - Lage en ny løsning av fibrinogen i en konsentrasjon av 2 mg/mL. Gjør nok løsning har 2,5 mL løsning per opphisset FACS rør.
- Varm løsningen i et vannbad 37 ° C i 10 min å tillate alle fibrinogen å gå inn i løsningen.
- Legg 37,5 µL aprotinin løsning per 1 mL av fibrinogen løsning.
- Sterile-filter løsningen og sett til side i romtemperatur.
5. forbereder perler Gel implantasjon
- Undersøke rettene som inneholder microcarrier-belagt perlene under mikroskopet med 20 X målet for å sikre at alle perler har vært tilstrekkelig belagt av endotelceller.
- Kraftig Pipetter belagt løsning av celler for å koble dem fra 6 cm plate og plassere løsningen i et rør. Vask plate 2 X ganger med komplett og overføre til røret å samle alle gjenværende perler som kan følges til platen.
- Unngå å innføre luftbobler og bruke en p1000 pipette for å minimere skjæring stress på endothelial celle-belagt perler.
- Hvis vurdere siRNA knockdown effektivitet i endotelceller er nødvendig, i trinn 2, må ha en tallerken med bare HUVEC belagt perler. Deretter under dette trinnet (5,2) koble perler og samle den gjenværende HUVEC knyttet til plate for RNA isolasjon og qPCR analyse.
- Vent 3 min for å tillate perlene i løsningen til å bosette til bunnen av røret.
- Fjerne så mye av nedbryting som mulig uten å forstyrre perle pellet bruker et p1000 pipette tips (ikke bruk et vakuum aspirator).
- Legge til 1 mL av komplett hver rør og resuspend perler.
- Vent 30-60 s å tillate perler å bosette til bunnen. Så fjerne så mye av nedbryting som mulig bruker en P1000 pipette uten å forstyrre perle pellets. Ikke bruk et vakuum aspirator som sannsynligheten for tilfeldigvis fjerne perle pellets er betydelig økt.
- Gjenta trinn 5.5 og 5,6 to ganger. Målet er å fjerne så mye av den frittflytende HUVEC som kan ha vært løsrevet fra 6 cm plate som mulig, mens ikke fjerne for mange HUVEC-belagt perler, som skal slå i FACS røret enn frittflytende celler.
- Legge til 1 mL av komplett perler.
6. innebygging belagt perler i en Fibrin Gel
- Fjern medier så mye som mulig uten å forstyrre den perle pellet i hver FACS rør med en P1000 pipette.
- Resuspend perler i 2,5 mL av fibrinogen løsning.
- Pipetter 13 µL trombin løsning i hver ønsket godt av en 24-vel glass bunn plate. Overflate i et glass bunn platen er avgjørende for muliggjør optimale bildebehandling av spirer.
Merk: Ikke la trombin sitter i en brønn i mer enn 5-10 min før neste trinn. - Legg til 0,5 mL bead/fibrinogen løsning i hver brønn.
- Husk å resuspend perle løsningen godt før pipettering løsningen hver gang.
- Være forsiktig å nøye Pipetter direkte i trombin allerede i brønnen. Sakte Pipetter opp og ned 2 - 3 ganger å grundig blande løsningen, ta forsiktig ikke innføre noen luftbobler.
- Husk å endre pipette spissen mellom brønner.
- Være forsiktig ikke flytte eller forstyrre platen når som helst under første fibrin clotting, som enhver bevegelse kan forstyrre gel dannelsen.
- La platen i panseret i 30 min ved romtemperatur.
- Nøye overføre platen til en 37 ° C inkubator for en ekstra 1,5-2 h å tillate gel å fullt stivne
7. plating fibroblaster over Fibrin Gel
- I løpet av de siste 30 min av gel styrket, koble Normal menneskelig lunge fibroblaster (NHLF) som følger:
- Vask en T175 kolbe celler med 10 mL PBS, deretter legge 5 mL av cellen avdeling løsning og ruge ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend NHLF i en konsentrasjon av 20.000 celler/mL i komplett.
Merk: NHLF celler kan kultivert med Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% Penicillin Streptomycin.
- Plate 1 mL av NHLF celle suspensjon på gel av hver brønn og plassere tilbake i inkubator.
- Endre komplett annenhver dag for varigheten av analysen.
8. se spirende i løpet av 2-7 dager etter perle implantasjon i fibrin gel. Tiden nødvendig for spirende avhenger av passering og mye antall HUVEC.
9. fiksering av spirende analysen
- Når tilstrekkelig spirende har skjedd for å kunne fastslå fenotypiske forskjell behandlingsgrupper, vask alle brønnene én gang med 2 mL PBS.
- Legg til 0,5 mL av cellen avdeling løsning i hver brønn og Plasser platen i en 37 ° C inkubator for 5 min.
- Fjerne platen fra inkubator og trykk sidene av platen.
Merk: Hensikten med dette trinnet er å fjerne så mange av de NHLF cellene vokser oppå fibrin gel som mulig for å lette antistoff gjennomtrengning i gel samt avbilding av gel. Totalt inkubasjon tiden med cell avdeling løsningen må justeres for å optimalisere NHLF fjerning. Forskere er advarte å ikke ruge gel for overdreven perioder celle avdeling løsningen kan trenge inn gel og begynne å forstyrre endothelial strukturene i. - Når en tilstrekkelig mengde NHLF celler har blitt fjernet, slukke celle avdeling løsningen med 1 mL av komplett.
- Sug opp den frittstående NHLF og media bruker et vakuum aspirator, og vask brønnene gang med 1 mL av PBS.
- Legger 300 µL av 2% paraformaldehyde løsning i PBS hver brønn og ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Fjerne 2% paraformaldehyde løsning og vask vel 3 ganger med 1 mL av PBS for 3 min ved romtemperatur.
Merk: Vennligst kast 2% paraformaldehyde løsning riktig i henhold til miljørettet helsevern og sikkerhet (EHS) retningslinjer.- Legg 1 mL av PBS hver vel og lagre på 4 ° C helt klar til å flekken eller image spirer.
10. farging av spirende analysen
- Legge til 300 µL på 0,5% Triton-X 100 i PBS hver godt og ruge i 30 til 45 min ved romtemperatur.
- Bruker et vakuum aspirator, fjerne Triton-X100 og vask 3 ganger i PBS i 5 min.
- Legg til 500 µL av blokkering løsning til hver gel og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Blokkerer løsningen består av følgende komponenter: 1% bovin serum albumin (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 og 1% antiserum (Bruk samme art som din sekundære antistoffer er avledet) på PBS. - Fjerne blokkering løsning fra hver brønn og legger 300 µL av flekker løsning som inneholder primære antistoff i hver brønn.
Merk: Flekker løsningen er den samme som blokkerer løsningen, men uten antiserum tilstede. Forfatterne har hatt suksess rugende med primære antistoffer i fortynninger av 1:200 til 1:400. - Inkuber primære antistoffer i flekker løsning for 24 timer på 4 ° C.
- Sug opp primære antistoff løsning og vask 3 ganger i SS med 0,5% mellom for 20 min hver ved romtemperatur med milde rocking. Erstatte med fersk vaskebuffer igjen etter tredje vask, og lagre på 4 ° C over natten.
- Inkuber med fluorescerende sekundære antistoff fortynnet 1:1000 i flekker løsning for 2 timer ved romtemperatur.
- Fjern sekundær antistoff flekker løsning og vask 5 ganger for 20 min med TBS inneholder 0,5% mellom ved romtemperatur med milde rocking.
- Fortynne kjernefysiske flekken i PBS og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Denne protokollen har hatt stor suksess med Hoechst fortynnet 1:10000 i PBS.
Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne kjernefysiske flekker løsningen før bildebehandling. - Bilde i et par dager å fullføre den flekker å fange optimal fluorescerende signal.
11. spirende analysen kvantifisering
- Etter spirer har blitt avbildet, importere bildefilene til ImageJ og bruke telleverktøyet til å telle antall spirer, eller linje-verktøyet til å måle spire lengder.
Merk: Rosenkål er definert som endothelial utstikkende deler med lengde større enn eller lik diameteren på perlen som de er sprouting. 11 spire lengde kan måles som avstanden fra punktet som spire begynner stikker ut av perlen til spissen av spire. Gjennomsnittlig antall spirer per perle er nyttige beregninger å vurdere fenotypiske virkningene av genet stanse i spirende angiogenese gjennomsnitt spire lengde per perle. Gjennomsnittlig antall perler som inneholder minst ett skudd per behandlingsgruppe kan også brukes som en beregning for å vurdere robust spirende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gir en tett sammenslutning av de to cellen typer i vitro, og tilstedeværelsen av pericytes utfyller forekomsten av spirende (figur 1A, B). Protokollen kan også effektiv stanse (f.eks via RNA-interferens) av en genet av interesse i en celle type interesse for eksempel (VEGFA spesielt i endotelceller) eller PDGFRβ i pericytes7,12 under analysen, som kan oversettes til hemming av spirende fenotypen i analysen. Forskere ansette denne protokollen oppfordres til å utføre en standard endothelial celle-bare spirende analysen parallelt med pericyte-belagt spirende analysen å undersøke grundigere unike bidrag til pericytes i funksjonene vaskulære og fenotyper blir studert.
Forholdene beskrevet i denne protokollen er viktig for å oppnå tilstrekkelig-belagt perler (figur 2A, B) som kan gjennomgå robust spirende i fibrin gel. Forfatterne har funnet som et overskudd av pericytes (for eksempel pericytes belagt i forholdet 1 10T1/2 til 1 HUVEC) resultatet i pericyte overvekst av hele Utforskningsbrønnen og manglende evne til å skjelne mellom forskjellige vaskulære strukturer i brønnen.
Figur 1. Pericytes tett knytte endothelial fartøy i perlen spirende analysen. (A) Standard analysen spirende med HUVEC bare belagt perler. (B) AC Confocal mikroskopi bilder av pericyte spirende analysen viser at pericytes brytes rundt endothelial fartøy i spirende analysen, men ikke hindrer deres spirende. Blue er Hoechst (kjernefysisk flekken); rødt er CD31 (endothelial flekken), og grønne Desmin (pericyte flekk). Alle skalere barer, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bestrøket perler har en grov, golf-ball som utseende. Nakne microcarrier perler (A) har en helt glatt overflate, mens riktig-belagt perler klar for fibrin gel implantasjon (B) har en grov, golf ball-aktig utseende. Skala bar, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en metode for å karakterisere komplekset og heterotypic mobilnettet interaksjoner av spirende angiogenese ved å aktivere forskeren å ansette genetiske og tenkelig tilnærminger til foreta grundig mekanistisk undersøkelser. Når du utfører analysen, er det viktig at effektiv endothelial belegg av perler finner sted under perlen agitasjon trinnene. Dårlig endothelial belegg vil bli gjort tydelig, hvis perler ikke synes å ha en golf ball som grov overflate neste morgen før gel implantasjon og i stedet vises helt glatt. Ta for å sikre at perlene er tilstrekkelig resuspended under hvert agitasjon trinn av kraftig agitating rør for å tillate maksimal eksponering av perle overflaten til endotelceller, men ikke så aggressivt at det forårsaker endotelceller allerede ved for å bli løsrevet fra perler.
Når du legger til pericytes i analysen, er det viktig at forholdet mellom 5 endotelceller til 1 pericyte opprettholdes. Et overskudd av pericytes forårsaker dem til overgrow og innhente endothelial celle populasjoner under analysen, og en mangel på pericytes forårsaker dårlig dekning av fartøyene. Hvis den aktuelle celle tettheten opprettholdes, men dårlig pericyte dekning av fartøyene fortsatt er observert, måtte agitasjon tid med pericytes endres. Det anbefales ikke at cellen tallene er endret. En alternativ tilnærming kan være å coat perler med endotelceller bare for 4 h, og fjerne endotelceller fra media ved resuspending perle og cell løsningen og fjerne media når perlene har avgjort men før cellene har avgjort , deretter legge i pericytes og agitating hver 20 min en ekstra time.
Når bygge belagt perlene i fibrin blodpropp, er det også viktig å ikke forstyrre integriteten til gel ved å forstyrre platen under blodpropp formasjon. Avbrudd av matrix formasjonen kan medføre avvikende spirende. Det er også avgjørende for å sikre at riktige perle tetthet opprettholdes i gel. Hvis befolkningen av perler er for tette, deretter perler i umiddelbar nærhet til hverandre påvirker spirende i nabolandet perler og begynner å spire mot hverandre og anastomose. Avhengig av det endelige målet forsker og interesse for å karakterisere fartøy-fartøy interaksjoner, må perle tetthet endres. Men kan en heterogen befolkning på isolerte perler og perler i umiddelbar nærhet til hverandre i gel gi hovedsakelig variabel spirende fenotyper. Perle tetthet kan justeres ved å endre volumet av perle løsning lagt til FACS rør under omrøring trinnet av protokollen, eller ved å endre volumet av fibrin løsning brukes til å resuspend perler før gel implantasjon.
Det er også viktig at sunn NHLFs på en tetthet av 20.000 celler per mL er belagt på hver fibrin blodpropp. Merk at kontinuerlig tilførsel av vekstfaktorer fra aktivt dele NHLFs er nødvendig for robust spirende under analysen. NHLF-betinget EGM2 er ikke en tilstrekkelig alternativ. 13 hvis dårlig spirende er observert under analysen, anbefales det at en ny flaske komplett og en ny, sunn passasje av NHLF celler brukes.
Selv om denne analysen begynner å løse mobilnettet og fenotypiske kompleksiteten av angiogenese større oppløsning, representerer det fortsatt en unyansert system i forhold til sann, i vivo sammenheng. I tillegg er den spirende angiogenese forekommer i denne analysen mer analog til en sunn, fysiologiske kontekst i motsetning til en patologisk kontekst som tumor angiogenese. Fremtidige anvendelser av denne metoden kan omfatte flere celletyper (for eksempel immun celle populasjoner som modulerer angiogenic svar) til ytterligere recapitulate heterotypic mobilnettet samhandlingene involvert i denne kompliserte prosessen. Innføringen av eksterne stressorer - som en svulst i nærheten spirende fartøyene i fibrin gel - simulere patologisk angiogenese i vitro kan også brukes til å tillate mer grundig, mekanistisk karakteristikk av den molekylær trasé aktivert i patologisk sammenhenger. Disse fremskrittene vil være viktig for bedre evne til forskere studere komplekset av angiogenese i en mer kontrollert, til slutt aktivere oppdagelse og mer detaljert karakterisering av romanen terapeutisk for målretting patologisk angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Victoria Bautch og Joshua Boucher for nyttig diskusjoner og råd om optimalisering standard perle spirende analysen betingelser og en spirende analysen flekker protokollen. S.H.A. ble delvis støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences under prisen 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
