Summary
Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.
Abstract
Angiogênese é o crescimento de novos vasos da vasculatura pré-existentes e é um importante componente de muitos processos biológicos, incluindo a embriogênese e desenvolvimento, cicatrização de feridas, crescimento tumoral e metástase e doenças oculares e cardiovasculares. Eficaz em vitro modelos que recapitular a biologia da angiogênese são necessários apropriadamente estudar esse processo e identificar mecanismos de regulação que pode, finalmente, ser alvo de novas estratégias terapêuticas. O ensaio de angiogênese grânulo tem demonstrado anteriormente para recapitular os múltiplos estágios de germinação endotelial in vitro. No entanto, uma limitação deste teste é uma falta de endotelial – interações célula mural, , que são fundamentais para a regulação fenotípica e molecular da célula endotelial funcionam na vivo. O protocolo dado aqui apresenta uma metodologia para a incorporação de células murais o ensaio da angiogênese do grânulo e demonstra uma associação apertada de células endoteliais e pericitos durante a germinação em vitro. O protocolo detalha também uma metodologia para a eficaz silenciamento de genes-alvo usando siRNA em células endoteliais para estudos mecanicistas. No total, este protocolo fornece um ensaio em vitro que mais apropriadamente modela os tipos de célula diversos envolvidos na angiogênese de brotação e fornece uma plataforma mais fisiologicamente relevantes para avaliação terapêutica e romance descoberta de mecanismos de regulação de angiogênese.
Introduction
Angiogênese é vital para a embriogênese apropriado e cicatrização de feridas, e também desempenha papel chave em inúmeras doenças, incluindo câncer doença1 e artéria coronária de progressão. 2 , 3 ter uma melhor compreensão de como a angiogênese ocorre durante o desenvolvimento normal, e como ele é reativado em contextos patológicos, é crítico para o desenvolvimento do romance, terapêutica eficaz. Fiel em vitro modelos que recapitular as etapas importantes e tipos de células envolvidos na angiogênese na vivo são necessários para permitir que os pesquisadores para melhor caracterizar os mecanismos moleculares, dirigindo a angiogênese e fazer novas descobertas no Regulamento endotelial.
Nakatsu e Hughes otimizaram a um ensaio de grânulo brotos que demonstraram ter submetido os vários estágios conhecidos da angiogênese que brota. 4 , 5 o objetivo do método apresentado aqui é construir sobre o ensaio otimizado por Nakatsu e Hughes incorporando perictyes para o ensaio, para que as funções parácrina e juxtracrine de células murais na célula endotelial brotação podem ser incorporadas em estudos de romance angiogênese. Pericitos são células murais que são definidas pelo seu papel como células que mantêm fechem contato físico com células endoteliais devido sua sendo incorporado na membrana vascular do porão. 6 pericitos e células endoteliais engajar em cruz-conversa complexo através de sinalização de vias, incluindo entalhe sinalização, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ e muitos outros. 7 , 8 modelos de Mouse deficientes nessas vias de sinalização demonstram Pericito pobre cobertura de desenvolver vasculatura na embriogênese, levando a remodelação vascular pobre e vasculatura disfuncional. 7 além disso, o papel de pericitos em angiogênese patológica é importante, mas muitas vezes subestimado. Por exemplo, uma característica única da vasculatura do tumor é que os vasos são mais imaturos, gotejantes e disfuncional devido à cobertura de pobre Pericito. 9 foi proposto que a presença ou ausência de pericitos dramaticamente impacta o fenótipo dos vasos sanguíneos do tumor e é um importante mediador das respostas a terapias antitumorais e antiangiogênica. 9 assim, incluindo o papel de pericitos em ensaios em vitro é chave para capturar mais completamente os importantes mecanismos de regulação endotelial.
Embora existam muitos ensaios in vitro e ex vivo atualmente empregados para estudar a angiogênese, existem deficiências a considerar em cada um. Algumas, como a proliferação endotelial e ensaios de migração endotelial, são excessivamente simplificadas e concentrar-se em uma função endotelial em um ambiente isolado na cultura do tecido plástico. 10 outros ensaios ocorrem num mais 3 dimensional (3D) cenário, tais como o ensaio de formação de tubo Matrigel,10 mas estes ensaios são ainda muito simplificados e focar mais na capacidade das células endoteliais, migrar e formar de novo vascular estruturas, em oposição a brotação da vasculatura pré-existente. Além disso, nenhum destes ensaios incorporar tipos de células do mural. Há ex vivo modelos tais como o ensaio de aorta do anel que incorporam pericitos presentes no órgão hospedeiro, mas manipulação genética destes modelos é muito mais difícil devido à necessidade de gerar modelos de rato transgénico ou nocaute do percursos de interesse. O grânulo brotando do ensaio é ideal porque ele modela brotando endotelial, proliferação, migração e formação nem anastomose e lúmen em uma matriz 3D. 4 o ensaio fielmente permite avaliação mecanicista das muitas diferentes fases de brotação, enquanto ainda permitindo a modificação genética direta das células endoteliais ou pericitos em um ambiente mais controlado. Os coágulos de fibrina contendo os grânulos de germinação podem ser facilmente corrigidos, manchados e fotografados em diferentes fases de brotação; esses brotos também podem ser colocados em uma câmara ao vivo de imagem para executar em tempo real imagens de brotação. A metodologia apresentada aqui é ideal para estudar os mecanismos básicos da angiogênese através na fenotipagem de profundidade e análise exaustiva das vias ativado durante a angiogênese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dia 1:
1. transiente transfecção de células endoteliais
- Se desejado, realizar uma transfecção transiente de humano Umbilical veia endoteliais células (HUVEC) usando oligonucleotídeos gene regulamentares (por exemplo, micro-RNAs ou RNA de interferência pequeno (siRNA)) e o reagente lipofectamine apropriado de acordo com instruções do fabricante.
Nota: Este protocolo também teve grande sucesso, realizando transfections reversos com sequências de siRNA personalizada e um reagente de transfeccao comercial (ver tabela de materiais). Os autores não testei outros protocolos de transfecção e reagentes com este ensaio. As etapas para a transfeccao inversa usando os reagentes mencionados são os seguintes: - Reconstitua o liofilizado siRNAs ou microRNAs em uma concentração de 20 µM em água livre de nuclease.
- Fazer do transfection soluções para a seguinte relação: 1 mL de qualquer meios livres de soro com 9 µ l de siRNA ou microRNA.
- Agitar a solução e permitir que incube durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 18 µ l de reagente de Transfeccao para a solução e agitar.
- Permitir que a solução incubar à temperatura de 20-40 min, agitando a solução a cada 10 a 15 min para a duração da incubação.
- Enquanto a solução de transfeccao está incubando, desanexe HUVEC usando uma solução de desprendimento de células (por exemplo, Accutase). Para um balão de T175, lave o frasco com 10 mL de fosfato tamponado salino (PBS), adicionar 5 mL de solução de desprendimento de célula e incubar o frasco a 37 ° C por 10 min.
- Adicionar 5 mL de mídia completa no balão T175, retire a suspensão de eritrócitos do balão e centrifugar a 1200 rpm por 3 min.
- Remover o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e ressuspender as células em uma densidade de 1 X 106 células / mL em EGM2.
Nota: Este protocolo também teve grande sucesso usando endotelial célula crescimento médio (EGM2) que contém o kit de bala do fator de crescimento padrão, bem como um adicional de 10% FBS. - Uma vez a solução de transfeccao terminou incubando, 1 mL de solução em uma placa de 10 cm da placa e adicionar 1 mL de suspensão HUVEC no topo.
- Adicione um adicional 7 mL de mídia completa trouxeram a placa de 10 cm para 9 mL volume final.
- Compõem-se pelo menos duas placas de 10 cm vale das células para cada condição de transfeccao assegurar que existem células suficientes disponíveis para etapas posteriores no ensaio.
Nota: Estas condições resultam em uma concentração final de trabalho do oligonucleotide reguladoras do gene de 20 nM. Os autores encontraram nestas condições para resultar em uma derrubada de 60-80% da expressão do gene para seus destinos turísticos. Outros pesquisadores podem ser necessário otimizar as condições de Transfeccao de acordo com suas necessidades experimentais. - Troca a adição de post de 4-6 h de mídia de siRNA complexos com mídia completa fresco.
Nota: Este protocolo foi desenvolvido usando passagem HUVEC 1-2.
Dia 2
2. revestimento de grânulos de Microcarrier com células endoteliais
- Reconstitua o grânulos de microcarrier (por exemplo, Cytodex-3) em uma concentração de 60.000 grânulos/mL de PBS e autoclave.
Nota: grânulos de microcarrier vêm em uma concentração de aproximadamente 3 x 106 esferas por grama. Reconstitua os grânulos na proporção de 20 mg de grânulos por mL de PBS para obter uma densidade de grânulo de aproximadamente 60.000 grânulos/mL. - Alíquotas de 1ml de mídia completa para o número desejado de tubos redondo de fluorescência ativado celular classificação (FACS).
- Pipete 20 µ l de suspensão de grânulo de microcarrier para cada tubo (cuidar para garantir que a solução do grânulo é resuspended bem antes da pipetagem).
Nota:, Provavelmente haverá variabilidade dramática aumento da concentração de trabalho final de grânulos presentes em uma suspensão de grânulo de determinado microcarrier. Grânulos podem facilmente aderir aos lados dos recipientes de plástico e vidro grandemente podem alterar a concentração da solução do grânulo. O volume mais adequado de solução de grânulo adicionado ao tubo para cada lote de suspensão de grânulo microcarrier FACS precisará ser determinado empiricamente pelo investigador. Os números apresentados aqui são destinados a servir mais como ponto de partida. Idealmente, as condições devem ser otimizadas assim existem grânulos de 10-20 incorporados dentro do gel de fibrina por alvéolo no 24 prato bem no final do ensaio. Ver discussão na seção de discussão abaixo sobre otimização de números de contas para o ensaio. - Desanexe transfectadas HUVEC 24 h post transfeccao usando a solução de desprendimento do celular da seguinte maneira:
- Lavar cada placa de 10 cm de células com 5 mL de PBS, adicionar 2 mL da solução de desprendimento de célula e incube as celulas a 37 ° C por 10 min.
- Ressuspender as células em uma concentração de 1 X 106 células/mL em mídia completa.
- Adicione 1 mL de suspensão de células (ou seja, 1 X 106 HUVEC) para cada tubo de FACS contendo grânulos.
- Suavemente agite os tubos de FACS cada 20 min para a duração de 4 h a 37 ° C, (se avançar para o passo 3.4) ou 2,5 a 3 h (se prosseguir para a etapa 3.2).
Nota: Essa duração e frequência de agitação foi empiricamente determinada por pesquisadores anteriores que otimizaram o básico do grânulo brotando do ensaio. 4 Outras frequências de agitação e durações da etapa de revestimento grânulo não foram testadas pelos autores.
3. revestimento sequencial de pericitos em grânulos revestidos HUVEC Microcarrier
- Começa a desanexação 10T1/2 células (pericitos) usando a solução de desprendimento de célula (tripsina) como segue:
- Lavar um T175 frasco com 10 mL de PBS, em seguida, adicionar 5 mL de tripsina e incubar a 37 ° C por 10 min.
- Resuspenda 10T1/2 em uma concentração de 2 X 105 células/0,5 mL em mídia completa.
Nota: As células foram compradas da coleção de cultura o tipo americano (ATCC).
Nota: 10T1/2 células de cultura em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% FBS e 1% penicilina estreptomicina.
- Depois de 2,5 a 3 h de agitar o grânulo + solução HUVEC, espere 5 min para permitir que os grânulos e flutuante HUVEC repousar no fundo do tubo.
- Remover a 0,5 mL de mídia completa de cada tubo utilizando uma pipeta P1000 e adicionar 2 x 105 10T1/2 nos meios de comunicação completos em um volume de 0,5 mL para cada tubo de FACs. Agitar a solução celular e talão e depois continuar a incubar a 37 ° C. Continue a agitar a cada 20 min, até as contas tem sido agitadas para um total de 4 h.
Nota: A relação de 5 HUVEC: 1 Pericito sobre os grânulos é essencial manter Pericito adequada cobertura dos vasos.
Nota: As seguintes etapas alternativas podem ser seguidas em vez neste momento no protocolo: - Agite os grânulos e HUVEC apenas para 4 h.
- Uma vez concluída a 4 h de revestimento HUVEC dos grânulos microcarrier, agitar os tubos de uma vez, espere 30-60 s, em seguida, imediatamente remover 1,5-1,75 mL da solução do tubo de FACS.
Nota: Isto deve permitir tempo suficiente para a maioria dos grânulos para resolver enquanto muitos HUVEC flutuantes na mídia será removido.- Adicione 2 X 105 10T1/2 nos meios de comunicação completos e leve o volume do FACS tubo até 2 mL.
- Agite suavemente os tubos de FACS cada 20 min por hora adicional.
- Concluído a agitação, suavemente agitar os tubos de uma vez e imediatamente remover toda a solução (2 mL) e adicioná-lo a uma placa de 6 cm. Adicionar um adicional 3 mL de mídia completa para cada prato e coloque as placas na incubadora a 37 ° C durante a noite.
Dia 3
4. preparação de soluções de Gel de fibrina
- Prepare soluções de trabalho de aprotinina na concentração de 1 mg/mL em PBS e trombina em 50 unidades/mL.
Nota: Um grande estoque de cada uma dessas soluções pode ser feito e armazenado a 4 ° C durante pelo menos um ano. - Faça uma solução fresca de fibrinogênio em uma concentração de 2 mg/mL. Fazer bastante solução ter 2,5 mL da solução por tubo de FACS agitado.
- Aquecer a solução em banho-maria 37 ° C durante 10 minutos permitir que todos o fibrinogênio entrar em solução.
- Adicione 37,5 µ l da solução de aprotinina por 1 mL de solução de fibrinogênio.
- Estéril-filtrar a solução e reserve em temperatura ambiente.
5. preparação das contas para implantação de Gel
- Examine os pratos contendo os grânulos revestidos microcarrier sob o microscópio usando o objectivo X 20 para garantir que todos os cordões têm sido suficientemente revestidos por células endoteliais.
- Pipete vigorosamente a solução chapeada de células para desanexá-los da placa de 6 cm e coloque a solução em um tubo. Lave a placa 2 X mais vezes com mídia completa e transferência para o tubo para coletar todos os grânulos residuais que podem ser aderidos à placa.
- Evitar a introdução de bolhas de ar e usar uma pipeta p1000 para minimizar a tensão de cisalhamento sobre os grânulos revestidos de células endoteliais.
- Se avaliar siRNA knockdown eficiência nas células endoteliais é necessária, na etapa 2, assegure-se de um prato de grânulos revestidos somente HUVEC. Então durante esta etapa (5.2), desanexar os grânulos e coletar HUVEC anexado à placa para isolamento de RNA e qPCR análise residual.
- Espere 3 min para permitir que os grânulos na solução para resolver a parte inferior do tubo.
- Retire o máximo do líquido sobrenadante possível sem perturbar o sedimento do grânulo usando uma ponta de pipeta p1000 (não utilize um aspirador a vácuo).
- Adicionar 1 mL de mídia completa a cada tubo e ressuspender os grânulos.
- Espere 30-60 s para permitir que as contas a ajustar-se ao fundo. Em seguida retire o máximo do líquido sobrenadante quanto possível, usando uma pipeta P1000 sem perturbar o sedimento do grânulo. Não utilize um aspirador a vácuo como a probabilidade de remover acidentalmente a pelota do grânulo é muito maior.
- Repita as etapas de 5.5 e 5.6 duas vezes adicionais. O objetivo é remover tanto do HUVEC flutuante que pode ter foi desanexada da placa de 6 cm, quanto possível, enquanto não retira muitos grânulos HUVEC-revestido, que devem resolver no tubo de FACS mais rapidamente do que células de livre flutuação.
- Adicione 1 mL de mídia completa para os grânulos.
6. incorporação revestido grânulos em um Gel de fibrina
- Remova a mídia tanto quanto possível, sem perturbar a pelota do grânulo em cada tubo de FACS utilizando uma pipeta P1000.
- Resuspenda as contas em 2,5 mL de solução de fibrinogênio.
- Pipete 13 µ l da solução de trombina para cada desejado bem de uma placa de 24 poços com fundo de vidro. Chapeamento em um prato com fundo de vidro é essencial para habilitar a imagem ideal dos brotos.
Nota: Não deixe trombina sentado em um poço para mais de 5-10 min antes da próxima etapa. - Adicione 0,5 mL de solução de grânulo/fibrinogênio em cada poço.
- Certifique-se Ressuspender a solução do grânulo bem antes da pipetagem a solução de cada vez.
- Tenha cuidado para não Pipetar cuidadosamente diretamente para a trombina já presente no poço. Pipetar acima e para baixo lentamente 2 - 3 vezes para misturar cuidadosamente a solução, tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar.
- Certifique-se de mudar a ponta da pipeta entre poços.
- Tenha cuidado para não mover ou perturbar a placa em qualquer ponto durante a fibrina inicial de coagulação, pois qualquer movimento pode interromper a formação de gel.
- Deixe o prato sentado no capô durante 30 min à temperatura ambiente.
- Transferir cuidadosamente a placa para uma incubadora de 37 ° C para um h de 1,5-2 adicional permitir que o gel solidificar totalmente
7. chapeamento fibroblastos do gel de fibrina
- Durante o último 30 min de solidificar o gel, desprenda fibroblastos de pulmão humano Normal (NHLF) da seguinte maneira:
- Lavar um balão T175 de células com 10 mL de PBS, em seguida, adicionar 5 mL de solução de desprendimento de célula e incubar a 37 ° C por 10 min.
- Resuspenda NHLF na concentração de 20.000 células/mL em mídia completa.
Nota: As células NHLF podem ser cultivadas com Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1% penicilina estreptomicina.
- 1 mL de suspensão de células de NHLF para o gel de cada poço da placa e coloque de volta na incubadora.
- Mudar a mídia completa todos os dias para a duração do ensaio.
8. observe brotando ao longo de 2-7 dias pós-implante de talão no gel de fibrina. O período de tempo necessário para germinação vai depender a passagem e muito o número de HUVEC.
9. fixação da brota do ensaio
- Brotando uma vez suficiente ocorreu para ser capaz de determinar uma diferença fenotípica entre os grupos de tratamento, lavar todos os poços de uma vez com 2 mL de PBS.
- Adicionar 0,5 mL de solução de desprendimento de células a cada poço e coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 5 min.
- Retirar a placa da incubadora e bata nos lados da placa.
Nota: O objetivo desta etapa é remover o máximo das células NHLF crescendo em cima do gel de fibrina quanto possível facilitar a penetração do anticorpo para o gel, bem como imagens do gel. O tempo de incubação total com solução de desprendimento de célula talvez precise ser ajustado para otimizar a remoção de NHLF. Os investigadores são alertados para não chocar o gel por excessivos períodos de tempo como a solução de desprendimento celular pode penetrar no gel e começar a perturbar as estruturas endoteliais dentro. - Uma vez que uma quantidade suficiente de células NHLF ter sido removido, saciar a solução de desprendimento de célula com 1 mL de mídia completa.
- Aspirar a destacada NHLF e mídia usando um aspirador a vácuo e lavar os poços uma vez com 1 mL de PBS.
- Adicione 300 µ l de solução de paraformaldeído 2% em PBS a cada poço e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
- Remover a solução de paraformaldeído 2% e lave bem 3 vezes com 1 mL de PBS para 3 min à temperatura ambiente.
Nota: Elimine 2% solução de paraformaldeído adequadamente em conformidade com as diretrizes de saúde ambiental e segurança (EHS).- Adicione 1 mL de PBS para cada bem e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para manchar ou imagem as couves.
10. coloração da brota do ensaio
- Adicione 300 µ l de 0,5% Triton-X100 em PBS a cada bem e incubar durante 30 a 45 min à temperatura ambiente.
- Usando um aspirador a vácuo, remova o Triton-X100 e lavar 3 vezes em PBS por 5 min cada.
- Adicionar 500 µ l de solução para cada gel de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: A solução de bloqueio é composta dos seguintes componentes: 1% albumina de soro bovino (BSA), 5% FBS, 0.1% tween-20 e 1% de soro (use a mesma espécie da qual se derivam seus anticorpos secundários) em PBS. - Remover a solução de bloqueio de cada poço e adicione 300 µ l de solução de coloração contendo anticorpo primário a cada poço.
Nota: A solução de coloração é o mesmo como a solução de bloqueio, mas sem o anti-soro presente. Os autores tiveram sucesso incubando com anticorpos primários em diluições de 1: 200 a 1: 400. - Incubar os anticorpos primários na coloração de solução por 24 h a 4 ° C.
- Aspirar a solução de anticorpo primário e lave 3 vezes na TBS com 0.5% tween por 20 min em temperatura ambiente com balanço suave. Após a terceira lavagem, substitua o tampão de lavagem fresca novamente e armazenar a 4 ° C durante a noite.
- Incube com anticorpo secundário fluorescente diluído 1: 1000 na coloração de solução para 2 h à temperatura ambiente.
- Remover a solução de coloração de anticorpo secundário e lavar 5 vezes por 20 min cada com TBS contendo 0.5% tween em temperatura ambiente com balanço suave.
- Diluir o corante nuclear em PBS e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: Este protocolo também teve grande sucesso com a Hoechst diluído 1: 10000 em PBS.
Nota: Não há nenhuma necessidade de remover a solução de coloração nuclear antes da imagem latente. - Imagem dentro de alguns dias de completar a coloração para capturar óptima do sinal fluorescente.
11. ensaio de quantificação de brotação
- Depois de tem sido fotografados os brotos, importar os arquivos de imagem para o ImageJ e usar a ferramenta contagem para contar o número de brotos, ou a ferramenta de linha para medir comprimentos de broto.
Nota: Brotos são definidos como protrusões endoteliais com um comprimento maior que ou igual ao diâmetro da esfera da qual eles estão brotando. 11 sprout comprimento pode ser medido como a distância entre o ponto em que o broto começa projetando-se fora o talão até a ponta do grelo. Média brotam comprimento por grânulo e número médio de brotos por grânulo é úteis métricas para avaliar efeitos fenotípicos de silenciamento de genes na brotação angiogênese. O número médio de grânulos contendo pelo menos um broto por grupo de tratamento também pode ser usado como uma métrica para avaliar a robustez da brotação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo permite uma associação apertada da dois célula tipos in vitro, e a presença dos pericitos complementa a ocorrência de germinação (figura 1A, B). O protocolo também permite eficaz silencioso (por exemplo, através da interferência do RNA) de um gene de interesse em um tipo de célula de interesse, tais como (VEGFA especificamente nas células endoteliais) ou PDGFRβ em pericitos7,12 durante o ensaio, que pode traduzir a inibição da germinação fenótipo no ensaio. Os pesquisadores empregam este protocolo são incentivados a realizar um padrão endotelial célula somente germinação ensaio em paralelo com o ensaio de germinação Pericito-revestido para investigar mais a fundo as contribuições originais de pericitos nas funções vasculares e fenótipos em estudo.
Nas condições descritas no presente protocolo são importantes para aderir a fim de obter grânulos suficientemente-revestido (Figura 2A, B) que serão capazes de se submeter a brotação robusto no gel de fibrina. Os autores descobriram que um excesso de pericitos (tais como pericitos revestidos em uma proporção de 1 10T1/2 a 1 HUVEC) resultado em Pericito supercrescimento de todo bem e subsequente incapacidade de discernir as estruturas vasculares distintas dentro do poço.
Figura 1. Pericitos associam firmemente com vasos endoteliais no grânulo brotando ensaio. (A) ensaio de germinação padrão com grânulos revestidos único de HUVEC. Imagens de microscopia Confocal (B) do Pericito brotando ensaio demonstram que pericitos envolvem em torno de vasos endoteliais no ensaio de germinação, mas não impedem sua brotação. Azul é a Hoechst (mancha nuclear); vermelho é CD31 (endotelial mancha), e verde é Desmin (Pericito mancha). Todos escala bares, 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Grânulos revestidos tem uma bola de golfe áspera, como a aparência. Grânulos microcarrier nu (A) têm uma superfície completamente lisa, enquanto grânulos revestidos adequadamente prontos para implantação de gel de fibrina (B) têm uma áspero, golf bola-como a aparência. Escala da barra, 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo apresenta um método para caracterizar a fases complexas e interacções celulares heterotypic de brotação angiogênese, permitindo que o pesquisador empregar abordagens genéticas e da imagem latente para conduzir investigações mecanicistas minuciosos. Ao realizar o ensaio, é essencial que eficiente revestimento endotelial dos grânulos ocorre durante o grânulo passos de agitação. Revestimento endotelial pobre será feito evidente, se os grânulos parecem não ter uma superfície áspera, como bola de golfe na manhã seguinte, antes da implantação do gel e em vez disso, aparecem completamente Lisa. Tome cuidado para garantir que os grânulos são suficientemente resuspended durante cada etapa de agitação agitando vigorosamente os tubos para permitir que a exposição máxima da superfície do grânulo para as células endoteliais, mas não tão agressivamente que faz com que as células endoteliais já anexado a tornar-se separada dos grânulos.
Ao adicionar pericitos para o ensaio, é essencial que a proporção de 5 células endoteliais para 1 Pericito é mantida. Um excesso de pericitos faz com que o overgrow e ultrapassar as populações de células endoteliais durante o ensaio, e uma deficiência em pericitos causa cobertura deficiente dos vasos. Se a densidade de célula apropriada é mantida, mas pobre Pericito cobertura dos navios é ainda observada, tempo de agitação com pericitos talvez precise ser modificado. Não se recomenda que o número de células é alterado. Uma abordagem alternativa pode ser para revestir os grânulos com células endoteliais apenas por 4 h, em seguida, remover as células endoteliais da mídia por resuspending o grânulo e estabeleceram-se solução de célula e removendo os meios de comunicação, uma vez que os grânulos se instalaram, mas antes as células , em seguida, adicionando em pericitos e agitar a cada 20 min por hora adicional.
Ao incorporar os grânulos revestidos no coágulo de fibrina, é também essencial para não perturbar a integridade do gel por perturbar a placa durante a formação do coágulo. Interrupção da formação de matriz pode resultar em brotação aberrante. Também é essencial para garantir que a densidade adequada do grânulo é mantida no gel. Se a população de grânulos é muito densa, grânulos na proximidade de um outro afetarão o surgimento dos vizinhos grânulos e começarão a brotar para com os outros e se anastomosam. Dependendo do objetivo do pesquisador e interesse em caracterizar as interações de navio-navio, a densidade do grânulo talvez precise ser modificado. No entanto, uma população heterogênea de grânulos isolados e grânulos na proximidade de um outro dentro do gel pode dar fenótipos sprouting amplamente variáveis. Densidade do grânulo pode ser ajustada alterando-se o volume de solução de grânulo adicionado aos tubos de FACS durante a etapa de agitação do protocolo, ou alterando o volume de solução de fibrina usado para Ressuspender as contas antes da implantação do gel.
É também essencial que NHLFs saudáveis, com uma densidade de 20.000 células por mL são banhados em cima de cada coágulo de fibrina. Por favor, note que o fornecimento contínuo de fatores de crescimento fornecido pelos NHLFs ativamente divisórias são necessários para a brotação robusto durante o ensaio. EGM2 NHLF-condicionado não é uma alternativa suficiente. 13 se pobre brotação é observada durante o ensaio, é recomendável que uma garrafa de mídia completa e uma passagem nova, saudável das células NHLF são usados.
Embora este ensaio começa a abordar a complexidade celular e fenotípica da angiogênese em uma resolução maior, ainda representa um sistema simplista em relação ao contexto verdadeiro, na vivo . Além disso, a germinação angiogênese ocorrendo neste ensaio é mais semelhante a um contexto saudável, fisiológico, em oposição a um contexto patológico como angiogênese do tumor. Futuras aplicações desse método podem incluir a introdução de tipos de células adicionais (tais como populações de células imunes que modulam respostas angiogênico) mais recapitular as interações celulares heterotypic envolvidos neste processo complexo. A introdução de estressores externos - como um tumor incorporado em estreita proximidade com os vasos de germinação no gel de fibrina - simular angiogênese patológica em vitro também pode ser empregada para permitir a caracterização mais aprofundada, mecanicista, do vias moleculares ativadas em contextos patológicos. Estes avanços será importantes para melhorar a capacidade dos pesquisadores para estudar as fases complexas da angiogênese em um ambiente mais controlado, em última análise, permitindo a descoberta e mais profunda caracterização da novela caminhos terapêuticos para o direcionamento angiogênese patológica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos os Drs Victoria Bautch e Joshua Boucher discussões úteis e conselhos sobre como otimizar padrão do grânulo brotando condições de ensaio e um ensaio de germinação do protocolo de coloração. S.H.A. foi apoiada em parte por uma concessão do Instituto Nacional de General Medical Ciências, sob 5T32 GM007092 de prêmio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
