Summary
Этот протокол представляет Роман в vitro шарик пробирного которые более надлежащим образом моделирует процесс в vivo прорастания ангиогенеза путем включения pericytes. Это изменение позволяет assay шарик к более точно охарактеризовать гетеротипичной клеточных взаимодействий между эндотелиальных клеток и росписи клетки, которые являются критическими для ангиогенеза.
Abstract
Ангиогенез является рост новых судов от ранее существовавших сосудистую и является важным компонентом многих биологических процессов, в том числе эмбриогенеза и развития, заживление ран, рост опухоли и метастазов, и глазной и сердечно-сосудистых заболеваний. Эффективным в vitro модели, которые пилки биологии по ангиогенез необходимо надлежащим образом изучить этот процесс и выявления механизмов регулирования, которые могут быть в конечном итоге направлены роман терапевтических стратегий. Assay ангиогенеза шарик была продемонстрирована ранее напомнить несколько этапов эндотелиальной прорастания в пробирке. Однако, этот assay ограничены отсутствием из эндотелия – росписи клеток взаимодействия, , которые являются ключевыми для молекулярных и фенотипические регулирование эндотелиальных клеток функционировать в естественных условиях. Протокол здесь представляет методологии для включения росписи клеток в assay ангиогенеза шарик и демонстрирует туго ассоциации эндотелиальных клеток и pericytes во время прорастания в пробирке. Протокол также подробно методологию для эффективного подавления целевых генов, с помощью малых интерферирующих РНК в эндотелиальных клетках механистический исследований. Вообще этот протокол обеспечивает пробирного в пробирке , что целесообразнее модели типов различных клеток, участвующих в прорастания ангиогенеза и обеспечивает более физиологически соответствующую платформу для терапевтических оценки и Роман Открытие механизмы регуляции ангиогенеза.
Introduction
Ангиогенез жизненно важное значение для соответствующих эмбриогенеза и заживление ран, и он также играет ключевую роль в многочисленных заболеваний, включая рак прогрессии1 и ишемической болезни. 2 , 3 наличие лучшего понимания как ангиогенез происходит во время нормального развития, и как она активируется в патологических условиях, имеет решающее значение для развития романа, эффективной терапии. Верный в vitro модели, которые резюмировать важные этапы и типы клеток, участвующих в ангиогенеза в естественных условиях необходимы для позволяют исследователям лучше характеризуют молекулярные механизмы вождения ангиогенеза и сделать новые открытия в эндотелиальных регулирования.
Nakatsu и Хьюз оптимизировали прорастания assay шарик, который они продемонстрировали, проходит стадии многие известные прорастания ангиогенеза. 4 , 5 цель метода, представленные здесь — развить assay оптимизирован Nakatsu и Хьюз путем включения perictyes в assay, так что роли паракринными и juxtracrine росписи клеток в эндотелиальных клеток прорастают могут быть включены в Роман ангиогенеза исследования. Pericytes являются росписи клетки, которые определяются их роли как клетки, которые поддерживают закрывать физический контакт с эндотелиальных клеток вследствие их встроенных в сосудистой базальной мембраны. 6 Pericytes и эндотелиальных клеток участвовать в сложных кросс talk через сигнальные пути, включая Notch сигнализации, анг-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ и многие другие. 7 , 8 мыши модели дефицит этих сигнальных путей демонстрации охват бедных перицит развивающихся сосудистую в эмбриогенезе, приводит к плохой сосудистого ремоделирования и неблагополучных сосудистую. 7 Кроме того, роль pericytes в патологический ангиогенез является важным, но часто недооценивают. Например уникальная особенность опухоли сосудистую является, что сосуды более незрелых, Дырявый и неблагополучных из-за плохой перицит покрытия. 9 было предложено что наличие или отсутствие pericytes значительно влияет на фенотип опухоли кровеносных сосудов и является важным посредником ответов антиангиогенных и противоопухолевой терапии. 9 таким образом, включая роль pericytes в в vitro анализов является ключом к более полностью захватить важные механизмы регуляции эндотелия.
Хотя есть много in vitro и ex vivo анализов, в настоящее время работают для изучения ангиогенеза, есть недостатки рассмотреть в каждом. Некоторые, такие как эндотелиальные распространения и эндотелиальных миграции анализов, чрезмерно упрощенный и сосредоточиться на одной функции эндотелия в изолированной обстановке на культуре ткани пластик. 10 другие анализы встречаются в более 3 Настройка трехмерной (3D), такие как assay формирования Matrigel трубки,10 но эти анализы еще упрощенная и больше сосредоточиться на способности эндотелиальных клеток мигрировать и формируют de novo сосудистой структуры, в отличие от прорастания от ранее существовавших сосудистую. Кроме того ни один из этих анализов включают типы росписи клеток. Есть ex vivo модели, такие как assay аорты кольца которые включают pericytes в орган принимающей, но генетическая манипуляция этих моделей является гораздо более сложной в связи с необходимостью создания моделей нокаут или трансгенные мыши пути, представляющих интерес. Шарик прорастания пробирного идеально, потому что он моделирует эндотелиальной прорастания, распространения, миграции и даже анастомоза и Люмене формирования в матрице 3D. 4 assay добросовестно позволяет механистический оценки многих различных этапов прорастания, пока все еще позволяющ для прямой генетической модификации эндотелиальных клеток или pericytes в более контролируемых условиях. Сгустков фибрина, содержащие прорастания бусины можно легко фиксированной, витражи и образы на разных стадиях прорастания; Эти ростки также могут быть помещены в живой тепловизионные камеры для выполнения в реальном времени изображений прорастания. Методологии, представленные здесь идеально подходит для изучения основных механизмов по ангиогенез через в глубине фенотипа и тщательный анализ путей, активирована во время ангиогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
День 1:
1. Переходное Transfection эндотелиальных клеток
- При необходимости, выполните переходных трансфекции из человека пупочной вен эндотелиальных клеток (HUVEC) с использованием гена регуляторные олигонуклеотиды (например микро РНК или малые интерферирующие РНК (siRNA)) и соответствующие lipofectamine реагент согласно инструкциями производителя.
Примечание: Этот протокол имел большой успех, выполняя обратный transfections с пользовательских малых интерферирующих РНК последовательности и коммерческой трансфекции реагента (см. таблица материалов). Авторы не проверял других трансфекции протоколы и реагентов с этот assay. Шаги для обратного трансфекции, с использованием реагентов перечисленные являются следующие: - Воссоздания лиофилизированные малые интерферирующие РНК или микроРНК в концентрации 20 мкм в свободной воды нуклеиназы.
- Сделать трансфекции решения в следующем соотношении: 1 мл любого сыворотки свободных средств массовой информации с 9 мкл siRNA и микроРНК.
- Агитировать решение и позволить ему инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- В решение добавьте 18 мкл Реагента transfection и агитировать.
- Дайте раствору для инкубации при комнатной температуре на 20-40 мин, агитируя решение каждые 10-15 мин на время инкубации.
- В то время как решение трансфекции инкубации, отсоедините HUVEC ячейки отряд раствором (например, Accutase). Для T175 колбу мыть флакон с 10 мл из фосфата буфер солевой (PBS), добавить 5 мл раствора отряд клеток и инкубировать настой при 37 ° C за 10 мин.
- Добавить 5 мл полной СМИ в T175 колбу, удалить суспензию клеток из фляги и центрифуги при 1200 об/мин за 3 мин.
- Удалите с помощью вакуум отсос супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток на плотности 1 Х 106 клеток / мл в EGM2.
Примечание: Этот протокол имела большой успех, используя средство роста эндотелиальных клеток (EGM2) содержащий комплект пуля Стандартный фактор роста, а также с дополнительной 10% FBS. - После решения трансфекции инкубации, пластина 1 мл раствора в 10 см пластины и добавить 1 мл суспензии HUVEC на вершине.
- Добавьте дополнительные 7 мл полной СМИ довести окончательный объем в 10 см пластины до 9 мл.
- Сделать по крайней мере два 10 см пластины стоит клеток для каждого условия трансфекции обеспечить, что есть достаточное количество клеток для последующих шагов в assay.
Примечание: Эти условия приводят к окончательные рабочие концентрации регулирования олигонуклеотида гена 20 Нм. Авторы нашли этих условий приведет к 60-80% нокдаун экспрессии генов для своих целей, представляющих интерес. Другие исследователи может потребоваться оптимизировать трансфекции условий согласно их экспериментальной потребностей. - Обмен СМИ 4-6 ч пост добавлением siRNA комплексов с свежей полной СМИ.
Примечание: Этот протокол был разработан с помощью проход 1-2 HUVEC.
День 2
2. покрытие Microcarrier бусины с эндотелиальных клеток
- Восстановить microcarrier бусы (например, Cytodex-3) в концентрации 60 000 шариков/мл в PBS и автоклав.
Примечание: бусы microcarrier прийти в концентрации примерно 3 х 106 бусин на грамм. Воссоздать бусины в соотношении 20 мг шариков / мл PBS получить шарик плотность около 60000 шариков/мл. - Аликвота 1 мл полной СМИ в нужное количество круглодонные флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) трубок.
- Пипетка 20 мкл суспензии microcarrier шарик в каждую пробирку (Позаботьтесь, чтобы обеспечить, что шарик раствор хорошо высокомобильна до дозирование).
Примечание: Скорее всего будет драматического изменчивости в конечной рабочей концентрации бусы, присутствующих в данной microcarrier бусины подвеска. Бисер можно легко придерживаться стороны пластиковых и стеклянных контейнеров, которые могут значительно изменить бусина концентрации в растворе. Наиболее подходящим объем шарик раствор добавляется СУИМ трубки для каждой партии подвески из бисера microcarrier нужно будет определяться следователь эмпирически. Цифры, представленные здесь, призваны служить больше как отправной точки. В идеале условия должны быть оптимизированы, так есть 10-20 бусин, встроенных в фибрин лари за хорошо в 24 хорошо пластины в конце assay. Увидеть дальнейшее обсуждение в разделе обсуждение ниже относительно оптимизации бусины чисел для assay. - Отсоедините transfected трансфекции HUVEC 24 h пост, используя мобильный отряд решение следующим:
- Мыть каждый 10-см пластины клеток с 5 мл PBS и затем добавить 2 мл раствора отряд клеток и инкубации клеток при 37 ° C за 10 мин.
- Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 Х 106 клеток/мл в полной СМИ.
- Добавьте 1 мл суспензии клеток (т.е. 1 Х 106 HUVEC) к каждой пробке СУИМ, содержащие бусины.
- Аккуратно агитируйте СУИМ трубы каждые 20 минут в течение 4 ч при 37 ° C (если переходить к шагу 3.4) или 2,5-3 ч (если переходить к шагу 3.2).
Примечание: Эта длительность и частота агитации эмпирически определялось предыдущие исследователи, которые оптимизированы основные шарик прорастания assay. 4 Другие частоты агитации и длительности шага покрытие бисера не были протестированы авторами.
3. последовательный покрытие Pericytes на четках HUVEC-покрытием Microcarrier
- Начните, отсоединение 10T1/2 клетки (pericytes), используя мобильный отряд решение (трипсин) следующим образом:
- Мыть T175 флакон с 10 мл PBS, затем добавить 5 мл трипсина и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
- Ресуспензируйте 10T1/2 в концентрации 2 X 105 клеток/0.5 мл в полной СМИ.
Примечание: Клетки были приобретены из американской коллекции типа культуры (ЦУВД).
Примечание: Культура 10T1/2 клетки в минимум основных средних (MEM) дополнены 10% FBS и 1% стрептомицин, пенициллин.
- После 2,5-3 h агитацию шарик + HUVEC решение подождите 5 минут, чтобы позволить бусины и свободно плавающего HUVEC поселиться в нижней части трубки.
- Удаление 0,5 мл полной СМИ из каждой трубки с помощью пипетки P1000 и добавить 2 x 105 10T1/2 в полной СМИ в объеме 0,5 мл в каждую пробирку СУИМ. Агитировать ячейки, бисера и решения и затем продолжать Инкубируйте на 37 ° C. Продолжают волновать каждые 20 мин, до тех пор, пока бисер был взволнован для в общей сложности 4 ч.
Примечание: Отношение 5 HUVEC: 1 перицит на бисер имеет важное значение для поддержания соответствующих перицит освещение судов.
Примечание: Следующие альтернативные действия может следовать вместо этого на данный момент в протоколе: - Агитируйте бусы и HUVEC только за 4 ч.
- После завершения 4 h HUVEC покрытия бисера microcarrier агитировать трубы в последний раз, подождите 30-60 s, а затем немедленно удалить 1,5-1,75 мл раствора из трубки СУИМ.
Примечание: Это должно позволить достаточно времени для большинства бусины поселиться в то время как многие свободно плавающего HUVEC в средствах массовой информации будет удален.- Добавить 2 X 105 10T1/2 в полной СМИ и довести объем СУИМ до 2 мл.
- Аккуратно агитируйте СУИМ трубы каждые 20 мин за дополнительный час.
- После завершения агитацию нежно агитировать трубы последний раз и немедленно удалить весь раствор (2 мл) и добавить его к пластине 6-см. Добавить еще 3 мл полной СМИ на каждой пластине и поместите пластины в инкубаторе 37 ° C на ночь.
День 3
4. Подготовка решения гелем фибрина
- Подготовьте рабочие решения Апротинин в концентрации 1 мг/мл в PBS и тромбина в 50 единиц/мл.
Примечание: Большой запас каждого из этих решений может производятся и хранятся при температуре 4 ° C, по крайней мере на один год. - Сделайте свежий раствор фибриногена в концентрации 2 мг/мл. Сделайте достаточно решение иметь 2,5 мл раствора на взволнованный СУИМ трубки.
- Теплый раствор в ванну воды 37 ° C за 10 мин разрешить все фибриногена вдаваться в раствор.
- 37,5 мкл Апротинин раствора 1 мл раствора фибриногена.
- Стерильными фильтр решение и отложите при комнатной температуре.
5. Подготовка бусы для имплантации гель
- Изучите блюда, содержащие microcarrier покрытием бусины под микроскопом с использованием 20 X цель обеспечить, что все швы достаточно покрытые эндотелиальных клеток.
- Энергично Пипетка покрытием решение клеток, чтобы отсоединить их от 6-см пластины и поместите решение в трубку. Промойте пластины 2 X еще раз с полным средства массовой информации и передать трубку для сбора всех остаточных бусы, которые могут выполняться к пластине.
- Избегать введения воздушные пузыри и использовать p1000 пипетки для сведения к минимуму касательное напряжение на эндотелиальных клеток покрытием бусины.
- Если оценки нокдаун эффективности малых интерферирующих РНК в эндотелиальных клетках, в шаге 2, обязательно иметь тарелку HUVEC-только покрытые бусины. Затем во время этого шага (5.2), отсоединить бисер и собирать остаточной, придаваемое HUVEC пластину для изоляции РНК и ПЦР анализа.
- Подождите 3 мин разрешить бисер в решение поселиться в нижней части трубки.
- Удалить столько супернатанта как можно не нарушая Пелле шарик, с помощью кончика пипетки p1000 (не используйте Вакуумный аспиратор).
- Добавьте 1 mL полной СМИ к каждой пробке и Ресуспензируйте бисер.
- Подождите 30-60 s чтобы бусины оседают на дно. Затем удалите столько супернатанта как можно с помощью пипетки P1000 не нарушая шарик Пелле. Не используйте Вакуумный аспиратор, как значительно возрастает вероятность случайного удаления шарик Пелле.
- Повторите шаги 5.5 и 5.6 еще два раза. Цель заключается в том, чтобы удалить как можно больше свободного плавающего HUVEC, которая возможно была отсоединена от 6-см пластины как можно, не удаляя при этом слишком много HUVEC-покрытием бусы, которые следует урегулировать в СУИМ трубки более быстро, чем свободные клетки.
- Добавьте 1 mL полной СМИ в бисер.
6. Внедрение покрытием бусины в фибрин гель
- Удалите столько средств массовой информации как можно скорее не нарушая Пелле шарик в каждой трубе СУИМ, с помощью пипетки P1000.
- Ресуспензируйте бисер в 2,5 мл раствора фибриногена.
- Пипетка 13 мкл раствора тромбина в каждый желательное хорошо 24-ну пластины прозрачным дном. Покрытие в тарелку с прозрачным дном имеет важное значение для обеспечения оптимального изображения ростки.
Примечание: Не оставляйте тромбиновое, сидя в хорошо для более, чем 5-10 мин до следующего шага. - Добавьте 0,5 мл раствора шарик/фибриногена в каждой скважине.
- Не забудьте Ресуспензируйте шарик решение до хорошо закупорить решение каждый раз.
- Соблюдайте осторожность, чтобы тщательно Пипетка непосредственно в тромбин, уже присутствующие в колодец. Медленно Пипетка вверх и вниз 2 - 3 раза для тщательно перемешайте раствор, принимая осторожностью, чтобы не вводить каких-либо воздушных пузырьков.
- Не забудьте изменить наконечник пипетки между скважинами.
- Возьмите осторожность, чтобы не перемещать или нарушить пластину в любой момент во время первоначального фибрина свертывания, как любое движение может нарушить образование геля.
- Оставьте пластину, сидя в капот на 30 минут при комнатной температуре.
- Тщательно передачи пластины до 37 ° C-инкубатор для дополнительных 1,5-2 ч позволить гель полностью затвердеть
7. покрытие фибробластов поверх фибрина гель
- В течение последних 30 минут застывающих гель отсоедините нормальный фибробластов человека легких (NHLF) следующим образом:
- Мойте колбу T175 клеток с 10 мл PBS, затем добавить 5 мл раствора отряд клеток и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
- Ресуспензируйте NHLF в концентрации 20 000 клеток/мл в полной СМИ.
Примечание: NHLF клетки могут культивируемых с Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% FBS и 1% стрептомицин, пенициллин.
- Пластина 1 мл суспензии клеток NHLF на гель каждой скважины и поместить обратно в инкубаторе.
- Измените полное СМИ каждый день в течение assay.
8. Соблюдайте прорастания в течение 2-7 дней после имплантации шарик в геле фибрина. Продолжительность времени, необходимого для прорастания будет зависеть от прохода и много количество HUVEC.
9. Фиксация прорастания Assay
- После достаточного прорастания произошло иметь возможность определить фенотипические различия между группами лечения, мыть все скважины один раз с 2 мл ФСБ.
- Добавить 0,5 мл раствора отряд клеток в каждой скважине и место пластину в инкубаторе 37 ° C за 5 мин.
- Снять пластину из инкубатора и постучите по стенкам пластины.
Примечание: Этот шаг предназначен для удаления как многие из NHLF клеток, растущих на вершине фибрина гель как можно облегчить антитела проникновения в гель, а также изображений геля. Время всего инкубации клеток отряд решение может потребоваться скорректировать для оптимизации NHLF удаления. Исследователи должны учесть, чтобы не Проинкубируйте гель для чрезмерного периодов времени, как клетки отряд решение может проникать в гель и начать нарушая эндотелиальной структур в рамках. - После того, как были удалены достаточное количество клеток NHLF, утолите клетки отряд решение с 1 мл раствора полной СМИ.
- Аспирационная отдельностоящий NHLF и СМИ, с помощью вакуум отсос и Промыть лунки с 1 мл раствора PBS.
- Добавить 300 мкл параформальдегида 2% раствора в PBS в каждой скважине и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Удалите 2% раствор параформальдегида и мыть каждый хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 3 мин при комнатной температуре.
Примечание: Утилизируйте 2% раствора параформальдегида надлежащим образом в соответствии с руководящих принципов охраны окружающей среды и безопасности (EHS).- Добавьте 1 mL PBS каждый хорошо и хранить при 4 ° C до готовности пятно, или image ростки.
10. Окрашивание прорастания Assay
- Добавьте 300 мкл 0,5% Тритон-X 100 в PBS каждому хорошо и Инкубируйте 30 до 45 минут при комнатной температуре.
- С помощью вакуум Отсос, удалите Тритон-X100 и стирать в PBS 3 раза за 5 мин.
- Добавьте 500 мкл преграждая разрешение для каждого геля и инкубировать на ночь при 4 ° C.
Примечание: Блокирование решение состоит из следующих компонентов: 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 5% FBS, 0.1% tween-20 и 1% антисыворотки (использование того же вида, производными которого являются вторичные антитела) в PBS. - Удалять блокирующие решение от каждой скважины и 300 мкл окрашивание раствора, содержащего основное антитело для каждой скважины.
Примечание: Окрашивание раствора является то же самое как блокирующие решение, но без настоящей антисыворотки. Авторы имели успех, инкубации с первичных антител в разведениях 1: 200 до 1: 400. - Инкубировать первичных антител в окрашивание раствора для 24 ч при 4 ° C.
- Аспирационная основное антитело решения и промойте 3 раза в TBS 0,5% анимации для 20 мин при комнатной температуре с плавное покачивание. После третьей стирки заменить свежий мыть буфера снова и хранить при 4 ° C на ночь.
- Инкубируйте 1: 1000 флуоресцентные вторичное антитело разбавляют в окрашивание раствора для 2 ч при комнатной температуре.
- Удалять вторичное антитело пятная решение и промойте TBS, содержащих 0,5% анимации при комнатной температуре с плавное покачивание 5 раз за 20 мин.
- Разбавить ядерных пятно в PBS и инкубировать на ночь при 4 ° C.
Примечание: Этот протокол имел большой успех в PBS с Hoechst разводят 1: 10000.
Примечание: Существует не нужно удалять ядерной окрашивание раствора до изображений. - Изображение в течение нескольких дней завершение окрашивания захватить оптимального флуоресцентного сигнала.
11. прорастания квантификация Assay
- После того, как были образы ростки, импортировать файлы изображений в ImageJ и используйте инструмент «Счетчик», для подсчета количества ростки, или линия инструмент для измерения длины прорастают.
Примечание: Ростки, определяются как эндотелиальные выступы с длиной больше или равен диаметру шарик, из которого они прорастания. 11 Росток длина может быть измерена как расстояние от точки, в которой Росток начинается, выступающие от борта до кончика Росток. В среднем прорастают длину бисера и среднее количество побегов на шарик, полезные метрики для оценки фенотипические эффекты сайленсинга генов в прорастания ангиогенеза. Среднее количество бусин, содержащие по крайней мере один Росток в группе лечения также может использоваться в качестве метрики для оценки надежности прорастания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет плотно ассоциации двух клеток типы в пробирке, и наличие pericytes дополняет появления всходов (рис. 1A, B). Протокол также позволяет эффективное глушителей (например через РНК-интерференции) гена интереса к ячейке тип интереса, таких как (VEGFA специально в эндотелиальных клетках) или PDGFRβ в pericytes7,12 в ходе анализа, который можно перевести на ингибирование прорастания фенотип в assay. Исследователи, используя этот протокол, предлагается выполнить стандартные эндотелиальных клеток только прорастания пробирного параллельно с покрытием перицит прорастания assay более тщательно исследовать уникальный вклад pericytes в сосудистой функции и фенотипы изучается.
В условиях, описанных в рамках настоящего Протокола важно придерживаться с тем, чтобы получить достаточно покрытием бусины (рисунок 2A, B), которые будут иметь возможность пройти надежные прорастания в геле фибрина. Авторы обнаружили, что избыток pericytes (например, pericytes покрытием в соотношении 1 10T1/2 до 1 HUVEC) результат в перицит разрастание весь хорошо и последующих неспособность различать различных сосудистых структур в колодец.
Рисунок 1. Pericytes тесно связать с эндотелия сосудов в бисера прорастания пробирного. (A) стандартные прорастания пробирного HUVEC только покрытая бисером. (B) Confocal микроскопии изображений перицит прорастания пробирного показывают, что pericytes обернуть вокруг эндотелия сосудов в прорастания assay, но не препятствуют их прорастания. Голубой это Хехст (ядерная пятно); красный CD31 (эндотелиальный пятно), и зеленый десмин (перицит пятно). Все масштаба баров, 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Покрытая бисером имеют грубый, мяч для гольфа как внешний вид. Голые microcarrier бусы (A) имеют совершенно гладкую поверхность, тогда как надлежащим покрытием бусы готовы к имплантации гель фибрина (B) имеют грубый, гольф мяч-вид. Шкалы, 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет метод для характеризующих сложные этапы и гетеротипичной клеточных взаимодействия прорастания ангиогенеза, позволяя исследователь использовать генетические и изображений подходы для проведения тщательных расследований механистическим. При выполнении анализа, важно, что эффективный эндотелиальной покрытие бисера происходит во время шарик агитации шаги. Бедные эндотелиальной покрытие будет производиться очевидным, если бисер не иметь шероховатую поверхность гольф мяч как утром следующего дня до имплантации гель и вместо этого появляются совершенно гладкой. Позаботьтесь, чтобы обеспечить, что бисер достаточно высокомобильна во время каждого шага агитации, активно агитировать трубок позволяет максимальное воздействие шарик поверхности эндотелиальных клеток, но не настолько агрессивно, что он вызывает эндотелиальных клеток уже придает отделяться из бисера.
При добавлении pericytes в assay, важно, что сохраняется соотношение 5 эндотелиальных клеток в 1 перицит. Избыток pericytes причиняет им перерасти и перегнать популяции эндотелиальных клеток во время анализа, и дефицит в pericytes вызывает плохое освещение судов. Если плотность соответствующих ячеек сохраняется, но охват бедных перицит судов по-прежнему наблюдается, время агитации с pericytes может потребоваться изменить. Не рекомендуется, что число клеток меняются. Альтернативный подход может быть пальто бусины с эндотелиальных клеток только за 4 ч, затем удалите эндотелиальных клеток из средств массовой информации, resuspending шарик и мобильные решения и удаление средства массовой информации, после того как бусы поселились, но до клетки поселились , затем добавить в pericytes и агитировать за дополнительный час каждые 20 мин.
При внедрении покрытием бусины в сгусток фибрина, также важно не нарушить целостность геля, нарушая пластину во время сгустков. Нарушение формирования матрицы может привести к ошибочной прорастания. Важно также обеспечивать соответствующий шарик плотность в геле. Если население бусины слишком густой, бусины в непосредственной близости друг к другу повлияет прорастания соседних бисера и начнут прорастать друг к другу и анастомозируют. В зависимости от конечной цели исследователь и интерес к характеристике взаимодействия судно судно плотность шарик может потребоваться изменить. Однако гетерогенных населения изолированных бусины и бисер в непосредственной близости друг к другу в гель может дать основном переменной прорастания фенотипов. Шарик плотности могут быть скорректированы путем изменения объема раствора шарик, добавлены к трубкам СУИМ во время агитации шага протокола, или изменяя объем фибрина решения, используемого для Ресуспензируйте бусы до имплантации гель.
Важно также, что здоровые NHLFs на плотность 20 000 клеток / мл покрыты на вершине каждой фибринового сгустка. Пожалуйста, обратите внимание, что непрерывных поставок факторов роста, поставляемые активного деления NHLFs необходимы для надежной прорастания в assay. NHLF-кондиционером EGM2 не является достаточно альтернативой. 13 если бедных прорастания наблюдается во время анализа, рекомендуется использовать свежий бутылка полный СМИ и новые, здоровые проход NHLF клеток.
Хотя этот assay начинает выступать сотовой и фенотипические сложности по ангиогенез на большее разрешение, он по-прежнему представляет упрощенная системы по отношению к контекст имеет значение true, в естественных условиях . Кроме того прорастания ангиогенеза, происходящих в этот assay более аналогичн к здоровой, физиологических контекст в отличие от патологического контекста например ангиогенез опухоли. Будущего применения данного метода могут включать в себя введение дополнительных ячеек типов (например, население иммунных клеток, которые модулируют ангиогенных ответов) далее напомнить гетеротипичной клеточных взаимодействия участвующих в этот сложный процесс. Введение, внешние раздражители - таких как опухоль, встроенные в непосредственной близости от прорастания судов в фибрин гель - для имитации патологический ангиогенез в пробирке может также использоваться чтобы позволить более тщательно, механистических характеристик молекулярные пути активации в патологических условиях. Эти достижения будут иметь важное значение для повышения способности исследователей для изучения сложных этапов ангиогенеза в более контролируемых условиях, в конечном счете Включение обнаружения и более углубленная характеристика Роман терапевтического пути для ориентации патологический ангиогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Drs. Виктория Bautch и Джошуа Буше за полезные обсуждения и консультации по оптимизации стандартных шарик прорастания пробирного условий и прорастания assay пятнать протокол. S.H.A. частично поддержали грант от национального института Генеральной медицинских наук под награду 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
