Summary
Detta protokoll presenterar en roman i vitro pärla assay som mer modeller på lämpligt sätt processen för i vivo groning angiogenes genom att införliva pericyter. Denna ändring gör det möjligt för bead analysen till mer troget recapitulate heterotypic cellulära interaktioner mellan endotelceller och väggmålning celler som är kritiska för angiogenes.
Abstract
Angiogenes är tillväxten av nya blodkärl från redan existerande kärlsystemet och är en viktig komponent i många biologiska processer, inklusive embryogenes och utveckling, sårläkning, tumörtillväxt och metastasering, och okulär och kardiovaskulära sjukdomar. Effektiv i vitro modeller som recapitulate biologin av angiogenes behövs för att på lämpligt sätt studera denna process och identifiera mekanismer i förordningen som kan riktas i slutändan för nya terapeutiska strategier. Bead angiogenes analysen har visat tidigare för att sammanfatta flera stadier av endothelial groning in vitro-. En begränsning av denna analys är dock avsaknaden av endothelial – väggmålning cell interaktioner, som är nyckeln till molekylär och fenotypiska regleringen av endotelceller fungera i vivo. I protokollet ges här presenterar en metod för införlivandet av väggmålning celler i pärla angiogenes analysen och visar en tight sammanslutning av endotelceller och pericyter under groning in vitro. Protokollet beskrivs också en metod för effektiv ljuddämpning av målgener med siRNA i endotelceller för mekanistiska studier. Helt och hållet, detta protokoll ger ett in vitro- test som lämpligare modeller de olika celltyper som är inblandade i groning angiogenes, och ger en mer fysiologiskt relevant plattform för terapeutiska bedömning och roman upptäckten av mekanismer för angiogenes förordning.
Introduction
Angiogenes är avgörande för lämpliga embryogenes och sårläkning, och den spelar också viktiga roller i många sjukdomar inklusive cancer progression1 och koronar sjukdom. 2 , 3 ha en bättre förståelse för hur angiogenes uppstår under normal utveckling, och hur det reaktiveras i patologisk sammanhang, är avgörande för utveckling av nya, effektiva therapeutics. Trogen i vitro modeller som sammanfatta de viktigaste stegen och celltyper inblandade i angiogenes i vivo behövs för att tillåta forskare att bättre karakterisera de molekylära mekanismer som driver angiogenes och göra nya upptäckter i endotel förordning.
Nakatsu och Hughes har optimerat en spirande pärla analysmetod som de har visat genomgår de många kända stadierna av groning angiogenes. 4 , 5 syftet med metoden presenteras här är att bygga på analysens optimerad av Nakatsu och Hughes genom att införliva perictyes i analysen, så att rollerna parakrin och juxtracrine av väggmålning celler i endotelceller groning kan införlivas i romanen angiogenes studier. Pericyter är väggmålning celler som definieras av deras roll som celler som upprätthåller nära fysisk kontakt med endothelial celler på grund av deras att vara inbyggda i vaskulär basalmembranet. 6 pericyter och endotelceller bedriver komplex överhörning via signalering vägar, inklusive Notch signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ och många andra. 7 , 8 musmodeller bristfällig i dessa signalvägar visar dålig pericyt täckning av utveckla kärlsystemet i embryogenes, vilket leder till dålig vaskulär remodeling och dysfunktionella kärlsystemet. 7 dessutom rollen av pericyter i patologisk angiogenes är viktigt men ofta under-uppskattat. En unik funktion i tumör kärlsystemet är exempelvis att fartygen är mer omogna, läckande och dysfunktionella på grund av dålig pericyt täckning. 9 det har föreslagits att närvaron eller frånvaron av pericyter dramatiskt påverkar fenotypen av tumor blodkärl och är en viktig mediator av Svaren till antiangiogenetisk och antitumöreffekt terapier. 9 således inklusive rollen av pericyter i in vitro- analyser är nyckeln till mer fullständigt fånga de viktiga mekanismerna av endothelial förordning.
Det finns många i vitro och ex vivo analyser för närvarande anställd att studera angiogenes, finns det brister att överväga i varje. Vissa, såsom endothelial spridning och endotel migration-analyser, är alltför förenklad och fokusera på en endotelfunktion i en isolerad miljö på vävnadsodling plast. 10 andra analyser sker i en mer 3 dimensionell (3D) miljö, såsom Matrigel tube bildandet analysen,10 men dessa analyser är fortfarande onyanserade och fokusera mer på förmågan av endotelceller att migrera och bilda de novo vaskulär strukturer, i motsats till groning från redan existerande kärl. Dessutom, ingen av dessa analyser införliva väggmålning celltyper. Det finns ex vivo modeller såsom ring aorta analysen som inkorporerar pericyter närvarande i det mottagande organet, men genetisk manipulering av dessa modeller är mycket mer utmanande på grund av nödvändigheten av att generera knockout eller transgena musmodeller av den vägar av intresse. Kornet groning assay är idealiskt eftersom det modeller endothelial groning, spridning, migration och även anastomos och lumen bildas i en 3D matrix. 4 analysen möjliggör troget mekanistiska bedömning av många olika stadier av groning, samtidigt tillåta för direkta genetisk modifiering av endotelceller eller pericyter i en mer kontrollerad miljö. De fibrin blodproppar som innehåller de spirande pärlorna kan vara enkelt fast, målat och avbildas i olika skeden av groning; dessa groddar kan också placeras i en levande imaging kammare att utföra realtid avbildning av groning. Den metod som presenteras här är idealisk för att studera grundläggande mekanismer av angiogenes via i djup fenotypning och grundlig analys av de vägar som aktiveras under angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1:
1. övergående Transfection av endotelceller
- Om du vill utföra en övergående transfection av mänskliga navel ven Endothelial celler (HUVEC) med hjälp av gen-reglerande oligonukleotider (e.g. micro-RNAs eller små störande RNA (siRNA)) och lämpliga lipofectamine reagens enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Detta protokoll har haft stor framgång utför omvänd transfections med anpassade siRNA sekvenser och kommersiella transfection reagens (se material tabell). Författarna har inte testat andra transfection protokoll och reagenser med denna analys. Stegen för den omvända transfection med reagens som anges är följande: - Rekonstituera frystorkat siRNAs eller mikroRNA vid en koncentration på 20 µM i nuclease gratis vatten.
- Gör transfection lösningar på följande förhållandet: 1 mL av varje serum fria medier med 9 µL siRNA eller mikroRNA.
- Agitera lösningen och låt den Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 18 µL transfection reagens i lösningen och agiterar.
- Låt lösningen att odla i rumstemperatur i 20-40 min, agitera lösningen var 10-15 min under ruvningen.
- Medan transfection lösningen ruvning, lossa HUVEC med en cell avlossning lösning (t.ex., Accutase). För en T175 kolv, tvätta kolven med 10 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS), och tillsätt sedan 5 mL cell avlossning lösning och inkubera kolven vid 37 ° C i 10 min.
- Tillsätt 5 mL av komplett media till T175 kolven, ta bort cellsuspensionen från kolven och centrifugera vid 1200 rpm under 3 minuter.
- Avlägsna supernatanten med hjälp av ett vakuum insugningsventil och resuspendera cellpelleten vid en densitet av 1 X 106 celler per mL i EGM2.
Obs: Detta protokoll har haft stor framgång med hjälp av Endothelial cellen odlingsmedium (EGM2) som innehåller den standard tillväxtfaktor kula kit samt ytterligare 10% FBS. - När transfection lösningen har slutförts ruvning, tallrik 1 mL lösning i en 10-cm tallrik och tillsätt 1 mL HUVEC suspension på toppen.
- Lägga till ytterligare 7 mL av komplett media att få den slutliga volymen i 10-cm plattan till 9 mL.
- Göra upp minst två 10 cm plattor värt av celler för varje transfection villkor att säkerställa att det finns tillräckligt med celler för senare steg i analysen.
Notera: Dessa villkor resultera i arbetande koncentration på genen reglerande oligonukleotiden 20 nM. Författarna har funnit dessa villkor att resultera i en 60-80% knockdown av genuttryck för deras mål av intresse. Andra forskare kan behöva optimera transfection villkor enligt deras experimentella behov. - Utbyta media 4-6 h efter tillägg av siRNA komplex med färska komplett media.
Obs: Detta protokoll utvecklades med passage 1-2 HUVEC.
Dag 2
2. beläggning av Microcarrier pärlor med endotelceller
- Beredes microcarrier pärlor (t.ex., Cytodex 3) vid en koncentration på 60.000 pärlor/mL i PBS och autoklav.
Obs: microcarrier pärlor kommer vid en koncentration på cirka 3 x 106 pärlor per gram. Beredes pärlorna i förhållandet 20 mg pärlor per mL PBS att få en pärla densitet på cirka 60.000 pärlor/mL. - Alikvotens 1 mL komplett media in önskat antal rundkolv fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) rör.
- Överför med pipett 20 µL av microcarrier pärla suspensionen till varje rör (var försiktig att säkerställa att pärla lösningen är väl resuspended före pipettering).
Obs: Det kommer sannolikt att dramatiska variabilitet i slutliga arbetande koncentration av pärlor i en viss microcarrier pärla suspension. Pärlor kan enkelt följa sidorna av plast och glas behållare som kraftigt kan förändra pärla koncentration i lösningen. Mest lämplig volym av pärla lösning tillsätts FACS röret för varje parti av microcarrier pärla suspension kommer att behöva bestämmas empiriskt av prövaren. De siffror som presenteras här är tänkt att fungera mer som utgångspunkt. Villkor bör helst optimeras så finns det 10-20 pärlor inbäddade i fibrin gelen per brunn i 24 väl plattan i slutet av analysen. Se vidare diskussion i diskussionsavsnittet nedan angående optimering av pärlor siffror för analysen. - Lossa transfekterade HUVEC 24 h post transfection använder cell avlossning lösningen enligt följande:
- Tvätta varje 10 cm platta celler med 5 mL PBS, tillsätt 2 mL av cell avlossning lösningen och inkubera cellerna vid 37 ° C i 10 min.
- Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 1 X 106 celler/mL i komplett media.
- Tillsätt 1 mL cellsuspension (dvs 1 X 106 HUVEC) till varje FACS tube innehåller pärlorna.
- Skaka försiktigt FACS rören varje 20 min under 4 timmar vid 37 ° C (om du fortsätter till steg 3,4) eller 2,5-3 h (om fortsätter till steg 3,2).
Obs: Denna varaktighet och frekvens av agitation har empiriskt fastställt tidigare forskare som har optimerat de grundläggande pärla groning assay. 4 Andra frekvenser av agitation och varaktigheter pärla beläggning steget har inte testats av författarna.
3. sekventiell beläggning av pericyter på HUVEC-belagda Microcarrier pärlor
- Börja lossa 10T1/2 celler (pericyter) använder cell avlossning lösningen (trypsin) enligt följande:
- Tvätta en T175 kolv med 10 mL PBS, därefter Tillsätt 5 mL av trypsin och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Återsuspendera 10T1/2 vid en koncentration på 2 X 105 celler/0,5 mL i komplett media.
Obs: Celler köptes från den amerikanska typen kultur samling (ATCC).
Obs: Kultur 10T1/2 celler i minst viktigt Medium (MEM) kompletteras med 10% FBS och 1% Penicillin Streptomycin.
- Efter 2,5-3 h av agitera på pärla + HUVEC lösning, vänta 5 min så att de pärlor och fritt flytande HUVEC sedimentera till botten av röret.
- Ta bort 0,5 mL av komplett media från varje tub med P1000 pipett och Lägg till 2 x 105 10T1/2 i komplett media i en volym om 0,5 mL varje FACs rör. Agitera cell och pärla lösningen och sedan fortsätta att Inkubera vid 37 ° C. Fortsätta att agitera varje 20 min tills pärlorna har varit upprörd för sammanlagt 4 h.
Obs: Förhållandet mellan 5 HUVEC: 1 pericyt på pärlor är väsentligt att upprätthålla lämpliga pericyt täckning av fartygen.
Obs: Följande alternativa steg kan följas i stället på denna punkt i protokollet: - Agitera pärlor och HUVEC endast för 4 h.
- När 4 h av HUVEC beläggning av microcarrier pärlor är klar, agitera rören en sista gång, vänta 30-60 s och sedan direkt ta bort 1,5-1,75 mL lösning från FACS röret.
Obs: Detta bör ge tillräckligt med tid för de flesta av pärlor sedimentera medan många fritt svävande HUVEC i media kommer att tas bort.- Tillsätt 2 X 105 10T1/2 i komplett media och volymen av FACS rör upp till 2 mL.
- Skaka försiktigt FACS rören varje 20 min för en extra timme.
- När den agitera är klar, försiktigt skaka rören en sista gång omedelbart bort hela lösningen (2 mL) och lägga till en 6-cm platta. Lägga till en ytterligare 3 mL komplett media i varje tallrik och placera plattorna i 37 ° C inkubatorn över natten.
Dag 3
4. beredning av Fibrin Gel lösningar
- Förbereda fungerande lösningar av aprotinin vid en koncentration av 1 mg/mL i PBS och trombin på 50 enheter/mL.
Obs: Ett stort lager av var och en av dessa lösningar kan göras och lagras vid 4 ° C i minst ett år. - Göra en ny lösning av fibrinogen vid en koncentration på 2 mg/mL. Gör tillräckligt lösning att ha 2,5 mL lösning per upprörd FACS rör.
- Värm lösningen i ett vattenbad på 37 ° C i 10 min så att alla fibrinogen gå in lösning.
- Tillsätt 37,5 µL av aprotinin lösning per 1 mL fibrinogen lösning.
- Steril-filter lösningen och ställ åt sidan i rumstemperatur.
5. Förbered pärlor för Gel Implantation
- Undersöka de rätter som innehåller microcarrier-belagda pärlorna under lupp med 20 X målet för att säkerställa att alla pärlor har varit tillräckligt belagda av endotelceller.
- Kraftfullt Pipettera guldpläterade lösningen av celler att lossa dem från 6-cm plattan och placera lösningen till en tub. Tvätta plattan 2 X ytterligare gånger med komplett media och överföring till röret att samla alla kvarvarande pärlor som kan följas på plattan.
- Undvika att införa luftbubblor och använda p1000 pipett för att minimera skjuvspänningen på endothelial cellen-belagd pärlor.
- Om bedömningen av siRNA knockdown effektivitet i endotelceller behövs, i steg 2, vara säker på att ha en tallrik med endast HUVEC-belagda pärlor. Sedan under detta steg (5.2), lossa pärlor och samla återstående HUVEC kopplade till plattan för RNA isolering och qPCR-analys.
- Vänta 3 min så att pärlorna i lösningen sedimentera till botten av röret.
- Avlägsna så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelleten pärla med en p1000 pipettspetsen (Använd inte en vakuum hygienfilter).
- Tillsätt 1 mL av komplett media i varje rör och resuspendera pärlorna.
- Vänta 30-60 s för att tillåta pärlor för att bosätta sig i botten. Ta sedan bort så mycket av supernatanten som möjligt med P1000 pipett utan att störa pelleten pärla. Använd inte ett vakuum hygienfilter eftersom sannolikheten för att av misstag ta bort pärla pelleten är kraftigt förhöjd.
- Upprepa steg 5.5 och 5.6 två ytterligare gånger. Målet är att avlägsna så mycket av det fritt flytande HUVEC som kan ha varit fristående från 6-cm plattan som möjligt, och inte ta för många HUVEC-belagda pärlor, som bör reglera i FACS röret snabbare än fritt flytande celler.
- Tillsätt 1 mL komplett media till pärlorna.
6. inbäddning belagda pärlor i en Fibrin Gel
- Ta bort så mycket material som möjligt utan att störa pelleten pärla i varje FACS tub med P1000 pipett.
- Återsuspendera pärlorna i 2,5 mL fibrinogen lösning.
- Pipettera 13 µL av trombin lösning i varje önskade väl av en 24-väl glasbotten tallrik. Plätering i ett glas botten plattan är nödvändigt för att möjliggöra optimal avbildning av groddarna.
Obs: Lämna inte trombin som sitter i en brunn för mer än 5-10 min innan nästa steg. - Tillsätt 0,5 mL pärla/fibrinogen lösning till varje brunn.
- Var noga med att resuspendera pärla lösningen väl före pipettering lösningen varje gång.
- Ta försiktighet att noggrant Pipettera direkt till trombin som redan finns i brunnen. Långsamt Pipettera upp och ner 2 - 3 gånger till grundligt blanda lösningen, tar försiktighet att inte införa några luftbubblor.
- Glöm inte att ändra pipettspetsen mellan brunnar.
- Var försiktig att inte flytta eller störa plattan när som helst under inledande fibrin koagulering, som någon rörelse kan störa gel bildandet.
- Låt plattan sitter i huven för 30 min i rumstemperatur.
- Noggrant överföra plattan till en 37 ° C inkubator för en ytterligare 1,5-2 h att gelen helt stelna
7. plätering fibroblaster ovanpå Fibrin gelen
- Under de sista 30 min av den gelen stelnar, lossa Normal mänsklig lunga fibroblaster (NHLF) enligt följande:
- Tvätta en T175 kolv av celler med 10 mL PBS, därefter Tillsätt 5 mL av cell avlossning lösning och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Återsuspendera NHLF med en koncentration på 20 000 celler/mL i komplett media.
Obs: NHLF celler kan vara odlade med Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS och 1% Penicillin Streptomycin.
- Tallrik 1 mL cellsuspension NHLF på gelen i varje brunn och placera tillbaka i inkubatorn.
- Ändra komplett media varannan dag under hela analysen.
8. Observera groning under loppet av 2-7 dagar efter pärla implantation i fibrin gel. Tidsperiod som krävs för groning beror på passagen och hel antalet HUVEC.
9. fixering av groning Assay
- När tillräcklig groning har inträffat för att kunna avgöra en fenotypisk skillnad mellan behandlingsgrupperna, tvätta alla brunnar en gång med 2 mL PBS.
- Tillsätt 0,5 mL cell avlossning lösning till varje brunn och placera plattan i en 37 ° C inkubator för 5 min.
- Avlägsna plattan från inkubatorn och tryck på sidorna av plattan.
Obs: Syftet med detta steg är att ta bort så många av de NHLF cellerna växer ovanpå fibrin gelen som möjligt för att underlätta antikropp genomträngningen in i gel samt avbildning av gelen. Den totala inkubationstiden med cell avlossning lösning kan behöva justeras för att optimera NHLF borttagning. Forskare varnas inte ruva gelen för överdriven tidsperioder som cellen avlossning lösningen kan tränga in i gelen och börjar störa endothelial strukturerna inom. - När en tillräcklig mängd celler för NHLF har tagits bort, släcka cell avlossning lösningen med 1 mL av komplett media.
- Aspirera den fristående NHLF och media med en vakuum insugningsventil och Tvätta brunnarna en gång med 1 mL PBS.
- Tillsätt 300 µL 2% PARAFORMALDEHYD lösning i PBS i varje brunn och odla i rumstemperatur i 10 min.
- Ta bort 2% PARAFORMALDEHYD lösningen och tvätta vart väl 3 gånger med 1 mL PBS för 3 min i rumstemperatur.
Obs: Vänligen avyttra 2% PARAFORMALDEHYD lösning på lämpligt sätt i enlighet med riktlinjer för miljö och hälsa och säkerhet (EHS).- Tillsätt 1 mL PBS till varje brunn och förvaras vid 4 ° C tills fläcken eller bild groddarna.
10. färgning av groning Assay
- Tillsätt 300 µL 0,5% Triton-X 100 i PBS till varje brunn och inkubera i 30 till 45 minuter i rumstemperatur.
- Använder ett vakuum insugningsventil, ta bort Triton-X100 och tvätta 3 gånger i PBS för 5 min varje.
- Tillsätt 500 µL blockerande lösning till varje gel och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Den blockerande lösningen består av följande komponenter: 1% bovint serumalbumin (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 och 1% antiserum (Använd samma art som din sekundära antikroppar härrör) i PBS. - Ta bort blockering lösningen från varje brunn och tillsätt 300 µL av färglösningen innehållande primär antikropp till varje brunn.
Obs: Färgningslösningen är samma som den blockerande lösningen, men utan antiserumet närvarande. Författarna har haft framgång inkubation med primära antikroppar vid utspädningar av 1: 200 till 1: 400. - Inkubera primära antikroppar i färgning lösning för 24 h vid 4 ° C.
- Aspirera primär antikropp lösningen och tvätta 3 gånger i TBS med 0,5% tween 20 min varje vid rumstemperatur med mild gunga. Ersätt med färska tvättbuffert igen efter den tredje tvätten, och förvaras vid 4 ° C över natten.
- Inkubera med fluorescerande sekundär antikropp utspädd 1: 1000 i färgning lösning för 2 h i rumstemperatur.
- Ta bort sekundär antikropp färgningslösningen och tvätta 5 gånger för 20 min varje med TBS som innehåller 0,5% tween vid rumstemperatur med mild gunga.
- Späd nukleära fläcken i PBS och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Detta protokoll har haft stor framgång med Hoechst utspädd 1:10000 i PBS.
Obs: Finns ingen anledning att ta bort kärn färglösningen före imaging. - Bilden inom några dagar att fullborda färgningen för att fånga optimal fluorescerande signal.
11. groning Assay kvantifiering
- När groddarna har varit avbildad, importera bildfiler i ImageJ och använda räkningsverktyget att räkna antalet groddar eller verktyget linje att mäta sprout längder.
Obs: Groddar definieras som endotelceller utskjutande delar med längd större än eller lika med diametern av den pärlan som de groning. 11 sprout längd kan mätas som avståndet från den punkt vid vilken börjar spira sticker ut utanför kornet till spetsen av spira. Genomsnittliga spira längd per pärla och Genomsnittligt antal skott per pärla är användbara mått för att bedöma fenotypiska effekterna av nedtystning i groning angiogenes. Det genomsnittliga antalet pärlor som innehåller minst en sprout per behandlingsgrupp kan också användas som ett mått för att bedöma robustheten av groning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör en tight sammanslutning av de två cell typer in vitro och förekomsten av pericyter kompletterar förekomsten av groning (figur 1A, B). Protokollet kan också effektivt tysta (t.ex. via RNA-interferens) av en gen av intresse i en celltyp intresse såsom (VEGFA specifikt i endotelceller) eller PDGFRβ i pericyter7,12 under analysen, som kan översätta till hämning av spirande fenotyp i analysen. Forskare som sysselsätter detta protokoll uppmuntras att utföra en standard endothelial cellen-bara piggar analysen parallellt till pericyt-belagd groning analysen att mer noggrant undersöka de unika bidrag av pericyter i vaskulär funktioner och fenotyper som studeras.
Om villkoren i detta protokoll är viktigt att följa för att få tillräckligt överdraget pärlor (figur 2A, B) som kommer att kunna genomgå robust groning i fibrin gel. Författarna har funnit att ett överskott av pericyter (såsom pericyter belagd i ett förhållande av 1 10T1/2 till 1 HUVEC) resultatet i pericyt överväxt av den hela väl och efterföljande oförmågan att urskilja olika vaskulära strukturer i brunnen.
Figur 1. Pericyter tätt associera med endothelial fartyg i pärlan groning assay. (A) Standard groning analys med HUVEC enda belagda pärlor. (B) konfokalmikroskopi bilder av den pericyt groning analys visar att pericyter Linda runt endothelial fartyg i spirande analysen, men inte hindrar deras groning. Blå är Hoechst (nukleära fläcken); rött är CD31 (endotelceller fläck), och gröna är Desmin (pericyt fläcken). Alla skala barer, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Belagda pärlor har en grov, golf-boll som utseende. Nakna microcarrier pärlor (A) har en helt slät yta, medan lämpligt-belagd pärlor redo för fibrin gel implantation (B) har en grov, golf ball-liknande utseende. Skala bar, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenterar en metod för att karakterisera de komplexa steg och heterotypic cellulära interaktioner skottillväxt angiogenes genom att aktivera forskaren att anställa genetiska och bildgivande metoder att genomföra grundlig mekanistiska undersökningar. När du utför analysen, är det viktigt att effektiv endothelial beläggning av pärlor sker under pärlan agitation steg. Stackars endothelial beläggning kommer att göras tydligt, om pärlorna inte verkar ha en golf boll-liknande grov yta nästa morgon före gel implantation och i stället visas helt slät. Se noga till att pärlorna är tillräckligt resuspended under varje agitation steg av kraftigt gnuggande rören för att tillåta maximal exponering av pärla ytan till endotelceller, men inte så aggressivt att det orsakar endotelceller redan kopplade för att lossna från pärlorna.
När du lägger pericyter i analysen, är det viktigt att förhållandet mellan 5 endotelceller till 1 pericyt upprätthålls. Ett överskott av pericyter orsakar dem att växa över och köra om endotelceller befolkningen under analysen, och en brist i pericyter orsakar dålig täckning av fartygen. Om lämpliga cell densiteten bibehålls men dålig pericyt täckning av fartygen är fortfarande observeras, kan agitation tid med pericyter behöva ändras. Det rekommenderas inte att cell nummer ändras. Ett alternativt tillvägagångssätt kan vara att bestryka pärlorna med endotelceller bara för 4 h och sedan ta bort endotelceller från media genom omblandning pärla och cell lösning och ta bort media när pärlorna har fast men innan cellerna har kvittats , sedan lägga i pericyter och agiterade varje 20 min för en extra timme.
Vid inbäddning belagda pärlorna i fibrin koagel, är det också viktigt att inte störa gelen integritet genom att störa plattan under koagelbildning. Störningar av matrix bildandet kan leda till avvikande groning. Det är också viktigt att se till att lämpliga pärla tätheten bibehålls i gelen. Om befolkningen i pärlor är alltför tät, sedan pärlor i nära närhet till varandra påverkar groning av angränsande pärlor och börjar spira gentemot varandra och anastomose. Beroende på det yttersta målet för forskaren och intresset för att karaktärisera fartyg-fartyg interaktioner, kan pärla densiteten behöva ändras. Dock kan en heterogen befolkning av isolerade pärlor och pärlor i nära närhet till varandra inom gelen ge i stort sett rörliga piggar fenotyper. Bead densitet kan justeras genom att ändra volymen pärla lösning lagts till FACS rören under steget agitation i protokollet, eller genom att ändra volymen av fibrin-lösning som används för att resuspendera pärlorna före gel implantation.
Det är också viktigt att friska NHLFs med en täthet av 20 000 celler per mL är pläterade ovanpå varje fibrin clot. Observera att kontinuerlig leverans av tillväxtfaktorer som tillhandahålls av de aktivt delande NHLFs är nödvändiga för robust groning under analysen. NHLF-villkorade EGM2 är inte ett tillräckligt alternativ. 13 om dålig groning observeras under analysen, det rekommenderas att en ny flaska komplett media och en ny, frisk passage av NHLF celler används.
Även om denna analys börjar ta itu med den cellulära och fenotypiska komplexiteten av angiogenes med en större upplösning, utgör det fortfarande ett grovt förenklat system i förhållande till ramen för sant, in-vivo . Dessutom är den spirande angiogenes som förekommer i denna analys mer jämförbar med en hälsosam, fysiologiska sammanhang i motsats till en patologisk sammanhang såsom tumör angiogenes. Framtida tillämpningar av denna metod får inbegripa införandet av ytterligare celltyper (såsom immunceller populationer som modulerar angiogena Svaren) att ytterligare recapitulate heterotypic cellulära interaktioner som deltar i denna komplexa process. Införandet av externa stressfaktorer - till exempel en tumör inbäddade i nära närhet till groning fartyg i fibrin gel - att simulera patologisk angiogenes in vitro- kan även användas för att tillåta mer grundlig, mekanistiska karakterisering av den molekylära vägar aktiveras i sjukliga sammanhang. Dessa framsteg kommer att vara viktiga för att förbättra möjligheten för forskare att studera komplexa stadier av angiogenes i en mer kontrollerad miljö, slutligen möjliggör upptäckten och mer djupgående karakterisering av nya terapeutiska vägar för inriktning patologisk angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Drs. Victoria Bautch och Joshua Boucher för bra diskussioner och rådgivning på att optimera standard pärla groning assay villkor och en spirande assay färgning protokoll. S.H.A. stöddes delvis av ett stipendium från National Institute of General Medical Sciences under tilldela 5T32 GM007092.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
