Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57310
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1
1Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Nanoscience Institute, University of Basel, 3BioEM lab, Biozentrum, University of Basel
* These authors contributed equally

Summary

Et instrument og metoder til udarbejdelse af nanoliter mellemstore prøve diskenheder for transmissions Elektron Mikroskopi er præsenteret. Ingen papir-blotting trin er påkrævet, således at man undgår de skadelige konsekvenser dette kan have for proteiner, betydeligt reducere prøve tab og muliggør analysen af enkelt celle lysate for visuel proteomics.

Abstract

På grund af de seneste teknologiske fremskridt, kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er hurtigt ved at blive en standard metode til den strukturelle analyse af proteinkomplekser til atomic opløsning. Protein isolation teknikker og prøve præparationsmetoder for EM er dog stadig en flaskehals. Et relativt lille antal (100.000 til et par millioner) af individuelle protein partikler skal være afbildet til høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel EM tilgang, at gøre miniaturized prøve håndtering teknikker og mikrofluid principper muligt.

En minituariseret, papir-blotting-gratis EM gitter forberedelse metode for prøven før conditioning, EM gitter priming og efterbehandling, der kun forbruger nanoliter-mængder af prøven er præsenteret. Metoden bruger en udlevering system med sub-nanoliter præcision kontrol flydende udbredelse og EM gitter priming, en platform til at styre den gitter temperatur derved bestemme relative luftfugtigheden over gitteret EM, og en pick-og-springet-mekanisme for prøve vitrifikation. Til cryo-EM, en EM gitter er placeret på den temperatur-kontrollerede fase og prøven er indsugning i et kapillarrør. Kapillar spidsen er placeret i nærhed af gitter overflade, gitteret er fyldt med prøven og overskydende er re indsugning i microcapillary. Efterfølgende er prøve film stabiliseret og lidt tyndet af kontrolleret vand fordampning reguleret af forskydningen af platform temperaturen i forhold til Dugpunktet. På et givent tidspunkt udløses pick og springet mekanisme, hurtigt overføre PRIMES EM gitteret til flydende Ethan for prøven vitrifikation. Alternativt findes prøve-conditioning metoder at forberede negative pletten (NS) EM nanoliter mellemstore prøve diskenheder.

Metoderne, der kraftigt reducere prøve forbrug og undgå tilgange potentielt skadelige til proteiner, såsom filtrerpapir blotting anvendes i konventionelle metoder. Derudover minuscule mængden af prøven kræves giver mulighed for nye eksperimentelle strategier, såsom hurtig prøve conditioning, kombination med én celle lysis for "visuelle proteomics" eller "lossless" samlede prøveforberedelse til kvantitativ analyse af komplekse prøver.

Introduction

Hardware og software til strukturel analyse af proteinkomplekser af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) har massivt Avanceret i løbet af de seneste år. Forbedringerne af banet vej for en "resolution revolution"1,2 og fundamentalt ændret strukturelle forskning. Revolutionen begyndte med fremkomsten af cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM)3,4, giver mulighed for forberedelse af biologiske prøver under tæt på fysiologiske tilstande samtidig reducere stråling følsomhed og forebygge prøven fordampning i det høje vakuum transmissions-elektronmikroskop5. I de følgende år øget incremental teknologiske fremskridt gradvist opløsning opnåelige. Blandt disse nyskabelser var anvendelsen af felt-emission kanoner6,7, og for nylig forbedret data analyse algoritmer, som højst sandsynligt metoder8,9. Direkte elektron detektor kameraer10,11,12,13, filmtilstand imaging og medfølgende software udvikling14,15, 16 , 17, forudsat det endelige gennembrud kræves for at opnå atomare opløsning for biologiske prøver af enkelt partikel analyse (for en anmeldelse Se Cheng, Grigorieff, et al. 18). betydningen af cryo-EM blev for nylig anerkendt ved tildelingen af Nobelprisen i kemi for tre af pionererne.

For at billedet en biologisk prøve af TEM, metoden bruges til at indlæse EM gitter med prøve (efterfølgende benævnt "gitter forberedelse") skal sikre, at det resulterende udsnit lag (i) er tynd nok (< 100 nm) at undgå omfattende støj af uelastisk eller formere sig spredt elektroner, (ii) tåler den høje tomrum af elektron mikroskop, og (iii) beskytter biomolekyler mod strålingsskader. To vigtigste metoder der anvendes til at opfylde disse Sportel: Negative pletten(NS)19,20 procedurer (fig. 1A) adsorberes prøven til en tynd carbon film, integrere biomolekyler i amorfe heavy metal og derefter Tillad forsamlingen til at tørre i luften. Dette er enkel og hurtig, og de indlæste EM gitre (efterfølgende benævnt "prøve gitre") er let at gemme og kan opbevares i længere tid (normalt år). I TEM, forberedelserne udviser stor kontrast på grund af NS og tolererer højere elektron doser end cryo-præparater, men beslutningen er begrænset til ca. 20 Å. Cryo-EM procedurer (fig. 1B) ansætte holey carbon understøtter. En tynd film af prøveopløsningen er strakte sig tværs over hullerne og gitteret EM er kastet ud i en cryogen, normalt flydende Ethan, hurtigt afkøles det under-150 ° C. Resultatet er en amorf, forglasset, 50 til 100 nm-tyk film af løsningen i støtte huller. Denne tynde, amorfe film tåler høje vakuum i elektron mikroskop og, i det ideelle tilfælde bevarer biologiske strukturer i deres hjemstat. Proceduren giver mulighed for biologiske prøver at blive afbildet på høj opløsning. Dog skal gitteret prøven opbevares ved temperaturer nedenfor-150 ° C på alle tidspunkter for at undgå devitrification. Det kan være afbildet med forholdsvis høj elektron doser på grund af den lave temperatur, men kontrasten og signal / støj-forhold er imidlertid lavt. Derfor gennemsnit teknikker er ansat til at øge kontrasten, og forudsat at stikprøven er afbildet fra forskellige vinkler, en høj opløsning tredimensional (3D) kort kan rekonstrueres. De mest almindeligt anvendte og meget vellykket metode til 3D rekonstruktion allerede nu er metoden med enkelt partikel. En nylig gennemgang, finder Cheng på al.18.

Negative pletten TEM (NS-EM) er vigtigt for screening og kvalitetskontrol, når høj kontrast er nødvendig, eller når kun begrænsede mængder af prøven er tilgængelige (adsorption til carbon film generelt koncentrerer prøven). Enkelt partikel cryo-EM er guld-standard metode hvis høj opløsning 3D rekonstruktioner af protein struktur er rettet til.

Figure 1
Figur 1: principper af TEM gitter forberedelse og sammenligning mellem klassisk (panelet A, B) og en mikrofluid tilgang (panel C, D). A) klassisk NS-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted i hånden på en EM gitter dækket med en kontinuerlig carbon film (efterfølgende benævnt en 'NS-EM grid') (i). Efter inkubation i ca. 10 s, filtrerpapir bruges til at skamplet væk den overskydende væske fra side (ii), forlader den adsorberede biomolekyler i en tynd vand film. Efterfølgende, proteinet er inkuberes i en heavy metal saltopløsning, f.eks., 2% uranyl acetat, for 20 s (iii), og igen væsken fjernes ved at duppe fra side ved hjælp af filtrerpapir (iv). Endelig, EM-grid er overladt til tørre i luften. B) klassisk cryo-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted af en hånd på en film fra holey kulstof. For at danne en tynd sample film, fjernes den overskydende væske ved papir-duppe ansigtet-på fra én eller begge sider (ii). Endelig er nettet hurtigt kastet ud i flydende Ethan for forglasning (iii). C) NS-EM gitter forberedelse ved hjælp af opsætningen af cryoWriter: A 5 nL volumen er indsugning fra prøve lager ved hjælp af en microcapillary, (i). For eksempel conditioning, er microcapillary spidsen nedsænket i conditioning løsning, fx2% ammoniumacetat. Ioner og små molekyler der udveksles ved diffusion (ii). Bemærk, at dimensionerne af microcapillary sikre, at hele processen er diffusion drevet. Proteiner har meget lavere diffusion konstanter end salt ioner og er ikke betydeligt tabt24. Endelig er prøven udleveres på nettet og lov til at tørre (iii). D) principper af cryo-EM gitter forberedelse ved hjælp af cryoWriter-baseret metode: en EM gitter dækket med en holey carbon film er placeret på overfladen af en temperatur-kontrollerede platform og besiddelse af pincet. Platformen er Temperaturstyret ved en forskydning fra dugpunkt temperatur af nettet miljøet. Gitteret er flyttet i forhold til den microcapillary, der indeholder prøven og microcapillary sænkes, indtil det er nogle få mikrometer over nettet. Efterfølgende, er et par nanoliters af prøven udleveret fra det mens scenen er flyttet i en spiral mønster; overskydende væske er re indsugning (i). Efter EM gitter grunding, microcapillary er trukket tilbage og gitteret forbliver på den temperatur kontrollerede platform (efterfølgende benævnt dugpunkt (DP) fase) for en kort tid at give en kontrolleret mængde af prøven til at fordampe. For springet frysning, er gitteret hurtigt trukket tilbage fra scenen med pincet (ii), vendt 90 ° til lodret position og kastet ud i en cryogen bad (iii) (efterfølgende benævnt 'pick-og-springet' mekanisme). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Desværre, forbedret gitter forberedelse metoderne til NS og cryo-EM har ikke væsentligt, siden de blev opfundet. Nuværende ulemper er høj sample forbrug (ca. 3 µL af protein, 1 mg/mL) og den store mængde (> 99%) af prøven mistede (figur 1A, B). Desuden, den klassiske metode bruges til at forberede cryo-EM gitre er en barsk procedure for proteiner: først, det indebærer en omfattende ansigt-på papiret-blotting trin (figur 1B, ii), og det andet protein er udsat for luft-vand-grænseflade for en betydelig mængde tid21. Her, en alternativ metode til prøven forudgående konditionering, prøve gitter forberedelse og efterbehandling (gitter tørring eller vitrifikation) for NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (fig. 1D) er præsenteret. Den in-house bygget setup, kaldet "cryoWriter", bruger miniaturized prøve håndtering teknologi og mikrofluid principper Aspirér, tilstand og give afkald på prøve, undgå papir blotting helt og at give alternative metoder til tynde prøver for Cryo-EM. Det betydeligt reducerer forbruget af prøven og forbedrer bruger-kontrol over prøveforberedelse som helhed. Desuden metoden giver mulighed for nye eksperimentelle programmer; forberedelse af isolerede biologiske komponenter af individuelle celler i en tilgang, kaldet "enkelt celle visuelle proteomics"22,23,24,25.

Protocol

En "cryoWriter" (figur 2, for nærmere oplysninger se tidligere arbejde24,26,27) eller tilsvarende instrumentering kræves for følgende protokoller. En liste over leverandører til de vigtigste dele og forbrugsvarer er givet i Tabel af materialer.

1. negative pletten (NS) gitter forberedelse

  1. Tænd apparatet og starte softwaren. Initialisere alle nødvendige moduler (sprøjten pumpe controller, motoriseret stadier, overvågningskameraer og dugpunkt fase).
  2. Cool prøve støtte og dugpunkt scenen. Hvis det er nødvendigt, sikre at dugpunkt fase temperatur reguleres 1-2 ° C over Dugpunktet.
    Bemærk: Scenen er køles af en kommerciel Peltier enheden med en PID-controller.
  3. Forberede NS ved at udfylde en 100 eller 200 µL PCR rør med 100-150 µL af NS (fx, kommercielt tilgængelige 2% methylamin tungstate). Røret anbringes på den afkølede prøve støtte af instrumentet.
  4. Anbring prøven.
    1. Sætte prøven (0,5 - 1 µM) i en 100 eller 200 µL PCR rør. Hvis mindre end 50 µL af prøven er tilgængelige, skære ned i bunden af en PCR rør med et barberblad og bruge det som en prøve godt. Dette vil sikre, at microcapillary kan nemt komme til prøven.
      Bemærk: Det er nemmest at Aspirér prøver fra 100 eller 200 µL PCR rør, fordi microcapillary bruges senere til at Aspirér prøven vippes lidt og rejse-højde z-akse retningen er begrænset.
    2. PCR rør/beholderen anbringes på den afkølede prøve støtte i instrument til at forhindre fordampning. Alternativt, prøver kan være indsugning fra godt plader i mikroskop fase top inkubator ved stuetemperatur; køling er ikke implementeret for godt plader.
  5. Definere positioner. Joystikket cryoWriter der styrer motoriseret xy-fase og software kontrolknapper for den lineære x-, y- og z-aksen faser til at placere microcapillary. Bruge kameraet til at kontrollere placeringen af kapillar.
    1. Flytte microcapillary at prøve reservoir. Fordyb spids i sample væsken og gemme denne position som "prøve".
    2. Flytte microcapillary til NS PCR rør, fordybe spidsen i NS løsning og gemme denne position som "pletten".
    3. Placer microcapillary omtrent 100 µm ovenfor midten af slot hvor gitteret EM vil blive placeret og gemme denne stilling som "grid_save".
  6. Opsug prøve og betingelse det til NS-EM.
    1. Hvis ikke allerede er installeret, skal du montere en 10 µL sprøjte (0,46 mm indre diameter) på en præcision sprøjten pumpe.
    2. Lim ene ende af en 30 cm lang smeltet silica microcapillary (ydre diameter 360 µm, indre diameter 150 µm) til sprøjte stikkontakten.
    3. Tilslut den anden ende af microcapillary til et kort (5 cm) lang koniske microcapillary via pressen passer stik. Den koniske spids af den korte microcapillary danner den udlevering spids.
    4. Fyld sprøjten med afgassede dobbeltdestilleret vand (ddH2O; system væske) og undgå dannelsen af luftbobler.
    5. Undvære et par snese nanoliters system væske og fjerne enhver dråber fra microcapillary med en fnugfri serviet.
    6. Dobbeltklik på den gemte prøve holdning. Dette placerer microcapillary i prøven godt. Mens kapillar er bevægende, give afkald på 3 x 0,5 nL system væske lige før microcapillary spids er nedsænket i prøve at forhindre luftboble fra at være fanget der (se note 2 nedenfor).
    7. Aspirat 5 nL af prøven.
    8. Dobbeltklik på den gemte NS holdning. Microcapillary er trukket tilbage fra prøvebeholder og flyttede til NS reservoir automatisk. Mens kapillar er bevægende, manuelt afkald på 3 x 0,5 nL prøve væske lige før spidsen er nedsænket i reservoiret for at sikre, at der ingen luft bobler (se note 2 nedenfor).
      Bemærk: vigtigt: (1) når du skifter fra aspiration til udlevering tilstand eller vice versa, der er et lille tab i stempelslag grund til modreaktion i gear af sprøjten pumpe. Ifølge producenten, tilbageslag i en ny enhed ligger mellem 7-12 µm. For vores sprøjte med en tønde diameter på 0,46 mm oversætter denne til 1-2 nL. Derfor, 1-2 nL kan være "udleveret", før prøven er rent faktisk udleveres. En lille dråbe starter som regel, at afslutte microcapillary spidsen efter den tredje 0,5 nL dispensere trin. (2) en luftboble fanget over/under prøven ville gøre udlevering mindre præcis og forhindre prøve konditionering ved diffusion.
    9. Forlade microcapillary nedsænket i 3-12 min, afhængig af prøvebuffer og dyse geometri.
      Bemærk: Jo højere salt og/eller fosfat koncentration i buffer, jo længere den nødvendige fordybelse tid. NS diffunderer (forholdsvis hurtigt) ind i prøven plug mens buffer salte (forholdsvis hurtigt) og protein (meget langsommere) diffust ud. Dette sænker koncentrationen af buffer salte i prøve at forhindre dem fra crystallizing når indlæst gitteret tørrer. Yderligere, fosfat har tendens til at danne et bundfald i kombination med NS.
  7. Forberede et gitter og deponere en plet af konditioneret prøven.
    1. Mens prøven er der aircondition, tage et stykke selvklæbende tape og en PDMS blok og ren oversiden af PDMS ved at anvende og fjerne tapen til at sikre, at der er ingen støv. Sætte PDMS blok i en petriskål.
      Bemærk: Nye PDMS blokke er taget fra den rene rum.
    2. Omhyggeligt afhente et gitter (fxCu, 200 eller 400 mesh belagt med Parlodion/C film). Sørg for at røre kun kanten af gitteret med pincet. Placer den på den rene PDMS blok med carbon filmen vender opad.
    3. Sted PDMS blok med gitter i en luft glød-udledning enhed og glød decharge det for 20 s med 100 W strøm på 0,4 mbar. Gemme gitteret i en lukket petriskål. Længere glød decharge gange generelt føre til en større spredning af den deponerede prøve volumen på nettet. Som følge heraf laget pletten bliver tyndere (svagere plet).
    4. 1 min før nedsænkning-tiden er gået, forstå glød-udledes nettet med cryoWriter pincet. Sørg for en elektromagnet er tændt; ellers slå den til i softwaren. Montere pincet på elektromagnet og bruge manuel micromanipulator skruen til at justere gitteret fladt på dugpunkt scenen, carbon film side op. Sørg for, at dugpunkt fase temperatur reguleres 1-2 ° C over dugpunkt til at reducere antallet af fordampning efter prøven er indlæst.
    5. Når nedsænkning-tiden er gået, skal du dobbeltklikke på "grid_save". Microcapillary spidsen placeres sikkert over gitteret overflade. Manuelt bringe microcapillary spidsen i kontakt med nettet. Løft dysen ved 10 µm og Placer det over midten.
      Forsigtighed: Nogle prøver, der indeholder vaske-og rengøringsmidler har tendens til at bevæge sig op langs den ydre overflade af microcapillary, når væsken er udleveret på grund af den lavere overfladespænding. Det er vigtigt at være meget tæt på gitteret overflade for at forhindre sådanne tab.
    6. Dispensere 5 nL prøve på nettet. En tør dag, hvor hurtig fordampning finder sted på microcapillary spidsen, kan man også langsomt dispensere indtil prøven er på meget spids og derefter hurtigt dispensere 5 nL.
    7. Trække microcapillary og lad konditioneret prøven tørre langsomt på dugpunkt fase (DP-fase).
    8. Når prøve stedet har tørret, fjerne gitteret og opbevar den ved stuetemperatur i en gitter- eller petriskål.
    9. Undvære 500 nL system væske fra microcapillary og fjerne det med en fnugfri serviet. Skyl en kapillær 5 gange med ethanol, vaskemiddel eller 1 M NaOH. Denne renser microcapillary så den kan bruges med en anden prøve.

2. Cryo gitter forberedelse

  1. For at forberede instrument og prøve, Følg trin 1.1 til 1.5 beskrevet ovenfor. Hvis der ikke kræves NS, Udelad trin 1.3 og 1.5.2. For at udveksle prøvebuffer eller betingelse prøve for cryo-EM af dialyse, f.eks., at reducere koncentrationen af buffer salte eller for at indføre tilsætningsstoffer (f.eks., trehalose, vaske-og rengøringsmidler) bruge den ønskede buffer i stedet for NS i trin 1.3 og 1.5.2.
  2. Forberede flydende Ethan i en standard cryo container.
    1. Samle Ethan cup, cryo boks indehaveren og spider og fylde cryogen container til randen med flydende kvælstof; som regel kræver ca. 200 mL. Vent et par minutter indtil Ethan cup er afkølet og er fri for flydende kvælstof.
    2. Åbn Ethan gasflaske og langsomt lade gasstrømmen i Ethan cup. Lad det fylde med flydende Ethan, indtil de er 2-3 mm under toppen; Dette tager et par minutter og kræver ca. 5 mL flydende Ethan.
    3. Tage en cryo boks og placere det i en fri slot i cryogen beholder.
    4. Fjerne edderkoppen, låget polystyrol lægges ovenpå og cryogen beholderen anbringes på montering i cryoWriter.
  3. Glød decharge en EM gitter.
    1. Tag et stykke selvklæbende tape og en Polydimethylsiloxan (PDMS) blok og rengør oversiden PDMS ved at anvende og fjerne den selvklæbende tape (fjerner støv). Sætte PDMS blok i en petriskål.
    2. Omhyggeligt vælge et gitter fra boksen gitter. Sørg for at røre kun kanten af gitteret med pincet. Placer den på en ren PDMS blok med holey carbon filmen vender opad.
    3. Sted PDMS blokere med gitter i en plasma renere og plasma-clean gitter overflade (fx bruge 75% Ar/25% H2, power 50 W, pres 25 mTorr). Sted PDMS blok med glød-udledes nettet i en petriskål.
  4. Placer gitteret i apparatet
    1. Forstå glød-udledes nettet med cryoWriter pincet. Sørg for en elektromagnet er tændt; ellers slå den til i softwaren. Montere pincet på elektromagnet og bruge manuel micromanipulator skruen til at justere gitteret fladt på scenen, carbon film side op.
    2. Dobbeltklik på "grid_save". Justere microcapillary position, så spidsen er ca. 10 µm over gitteret overflade. Sørg for, at microcapillary kan bevæge sig frit over nettet uden at røre det hvor som helst, hvis nødvendigt trække microcapillary nogle få mikrometer.
    3. Gå tilbage til midten af gitteret og gemme den nye position som "grid".
      Forsigtighed: Korrekte navngivningen er obligatorisk for makro scriptet til at arbejde.
  5. Skrive prøve og springet-freeze gitter.
    1. Skyl microcapillary med et par snese nanoliters system væske og fjerne enhver dråber fra microcapillary med en fnugfri serviet.
    2. Start makroscript. Makroen vil udføre følgende trin:
      1. Dispensere 5 nL (for at fjerne eventuelle luftbobler på spidsen) og gå til prøve position.
      2. Aspirat 65 nL af prøven. Indgyde 5 nL tilbage i prøveglas. Dette regnskab for system modreaktion og tillade synkroniserede skriftligt, dvs., for at sikre, at udlevering og iscenesætte bevægelse start på samme tid.
      3. Flyt til "grid" position.
      4. Indlede skriftligt mønster, som vil forårsage microcapillary til at flytte på tværs af nettet, samtidig udlevering 45 nL af prøven.
      5. Bagefter, flytte microcapillary tilbage til midten af gitteret, sænke det en anden 10 µm, og trække overskydende prøve væske.
      6. Trække microcapillary og slukke en elektromagnet. Dette frigiver pincet og indviede springet frysning.
  6. Greb pincet og omhyggeligt frigive den magnetiske adapter fra stemplet. Hurtigt overføre nettet fra Ethan cup i cryogen beholder indeholdende boksen cryo og placere gitteret i en fri slot.

3. enkelt-celle Lysate forberedelse

  1. Forberede elektroporation microcapillaries.
    Bemærk: Tilspidset (laser-trukket og inspicerede) smeltet silica microcapillaries har en beskyttelse polyimid belægning på ydersiden, undtagen spidsen, hvor belægningen er brændt under den skrå proces.
    1. For at pels microcapillaries med et ledende lag, montere dem i en vinkel på 45° på en metal skinne, med spidsen peger opad. Bruge en aluminiumsfolie for at skærme den nedre ende (2 cm) af tips, som ubestrøget polyimid udgør den bedste tætning med tryk-fit stikkene ansat senere.
    2. Sputter deponere et selvklæbende lag på 20 nm Ti/W, og derefter en 200 nm tykke lag af Pt.
  2. Gøre microcapillary tip hydrofobe.
    1. Forberede en 1 M opløsning af 1-dodecanethiol i EtOH.
    2. Glød-udledning microcapillary i luften i 1 min. med 100 W strøm på 0,4 mbar.
    3. Fordyb spidsen af microcapillary i 1 M opløsning af 1-dodecanethiol for et par timer (helst natten over).
      Bemærk: Det er bedst at forberede tips frisk én dag før brug.
  3. Installere en ny microcapillary.
    1. Fjerne microcapillary fra 1-dodecanethiol løsning, skylles ydersiden med ethanol og skylle indersiden med ethanol ved hjælp af en sprøjte.
      Bemærk: Hvis der findes ingen functionalized microcapillaries, hurtigt glød decharge spidsen af en microcapillary og dyppe den i en dråbe af kommercielle bil vindue behandling, som er en blanding af PDMS og svovlsyre. Den resulterende hydrofobe functionalization er ikke så god som med 1-dodecanethiol, men generelt tilstrækkelig.
    2. Kløve sin ubestrøget ende med en kapillær cutter.
      Bemærk: Et rent snit er vigtig for en god tætning med tryk-fit stikket.
    3. Bruge en tandstikker til at anvende sølv pasta til skarpe boarder dannet mellem glas og polyimid belægning, når polyimid belægning var brændt af laser under kapillær trække.
      Bemærk: Denne styrkelse er nødvendigt som Pt belægning er meget svag i denne region, og elektriske ledningsforstyrrelser kan nemt bryde.
    4. Vask polyimid slutningen af microcapillary med acetone. Efterlade en lille dråbe af acetone ved udgangen og indsætte det i blænde til pressen-fit stikket. Anvend let tryk til at danne en god tætning.
  4. Kalibrere microcapillary position.
    1. Tænd apparatet og starte softwaren som beskrevet i trin 1.1. Derudover initialisere mikroskop kamera og funktionsgenerator.
    2. Placere et glas objektglas til lysbilledholderen på mikroskopet.
    3. Lavere microcapillary tæt på glas dias og center det over mikroskop mål indtil det vises i visningen mikroskop kamera. Brug x - og y-akse lineær faser for at placere spidsen af microcapillary i midten af billedet. Derefter langsomt sænke spidsen indtil det rører lidt glas dias.
      Forsigtighed: Vælg meget små skridt (5 µm) til den endelige strategi. Ellers kan blive beskadiget spidsen.
    4. Tryk på knappen "Kalibrer dyse". Dette trækker microcapillary 40 mm, og sæt det position som hjem position.
  5. Forberedelse af stemplet PDMS stykker og ITO dias
    1. Mix PDMS og crosslinker i 10:1 ratio, hæld i en stor petriskål til en dybde på ca 2-3 mm. Bages ved 60° C i et par timer i en hybridisering inkubator eller lignende enhed.
    2. Med en hammer og en stempel (12 mm i diameter), skåret huller i laget PDMS. Bagefter, brug en skalpel til at skære 2 cm lange kvadrater eller rektangler herunder huller for at få stemplet stykker, der passer på et objektglas. Normalt, er to stemplet stykker monteret på et objektglas.
    3. Vask PDMS stykker og ITO dias først med rengøringsmiddel og derefter med 70% ethanol. Placere dem, våd, i en petriskål og lad ethanol fuldt fordampe i en ovn ved 60° C.
    4. Glød-udledning ITO dias i 1 min. med 100 W strøm på 0,4 mbar og derefter anvende 1 mL af belægning løsning (f.eks.poly-L-lysin (PLL)). Inkuber i 5 min, fjerne løsning med en pipette, og Anvend 1 mL af Hedeselskabet2O. lidt agitere for 1 min, og fjern derefter ddH2O ved hjælp af en pipette. Lad dias tørre ved 60° C.
  6. Forberede den cellekultur. Følg standard tilhænger-celle dyrkningsbaserede protokol (f.eks., Arnold, et al. 24 , 25). frø celler på ITO under normale opdeling/passaging løber.
    1. Tag en frisk PLL-belagt ITO dias og tilføje en PDMS stykke. Anvend pres til at danne en vandtæt forsegling. Dette producerer små brønde med diaset som deres base.
    2. Tilsæt ca. 300 µL af celler suspenderet i frisk medium PDMS brønde. Den seeding tæthed bør være omkring 75.000 celler pr. brønd.
    3. Glassene inkuberes ITO i 1-2 dage under standardbetingelser.
  7. Forberede celle lysis eksperiment:
    1. Pre varme et par milliliter af elektroporation buffer (fxfosfatbufferet saltopløsning (PBS)).
    2. Forberede set-up for NS-EM gitter forberedelse
      Bemærk: Detaljer for at forberede set-up er vist i trin 1.1-1.5 (for NS) eller trin 2.1-2.4 (for cryo). Her beskriver vi de vigtigste skridt for NS-forberedelse.
      1. Forberede NS ved at udfylde en 100 eller 200 µL PCR rør med 100-150 µL af NS (fx, kommercielt tilgængelige 2% methylamin tungstate). Røret anbringes på den afkølede prøve støtte af instrumentet.
      2. Flytte microcapillary til NS PCR rør, fordybe spidsen i NS løsning og gemme denne position som "pletten".
    3. Indlæse standard lysis parametre, fx, lysis spænding.
    4. Tage ITO dias fra rugemaskinen og montere den på mikroskop Indsæt. Bruge to skruer til at ordne diasset på aluminium Indsæt og sikre elektrisk kontakt mellem ITO belægning diasset og elektrisk jordet aluminiumsramme.
    5. Fjerne cellekulturmedium og vaskes to gange med 300 µL af elektroporation buffer. Holde cellerne i elektroporation buffer.
    6. Sted aluminium indsætte holding ITO dias i den levende celle inkubator fase på opsætningen.
    7. Find den cellekultur i visningen mikroskop og vælge et område med ingen celler. Tilgang spidsen til ITO overflade og forsigtigt røre det, og derefter trække tip 100 µm og Gem position som "celler".
    8. Hurtigt forlader cellekultur og skylle microcapillary spidsen med et par snese nanoliters system væske og derefter sætte det ind i den cellekultur igen. Undvære et par nanoliters under fordybelse i PDMS brønden at sikre, at ingen luft bobler er fanget på spidsen.
    9. Forsigtigt nærmer ITO overflade (i første omgang, du skal være i position "celler", dvs., 100 µm over overfladen). Ved kontakt, trække tip 10 µm.
    10. Vælg en nærliggende celle for lysering. Placer spidsen af microcapillary over cellen målrettet.
  8. Start scriptet makro for encellede lysering.
    1. Navnet holdning microcapillary skal flyttes til, når en celle har været mængden. Dette vil være NS reservoir (NS-EM), en udvanding buffer (cryo-EM) eller gitteret EM (cryo-EM). Undgå stavefejl og tryk på "ok".
    2. Makroen fortsætter uden indgreb fra brugeren:
      1. i) den mikroskop fase og celle kultur 100 µm flyttes til venstre, et øjebliksbillede af den målrettede celle er taget, og 50 nL ddH2O system væske udleveres fra microcapillary. Dette fortrænger og fortynder det høje salt buffer og gælder osmotisk Tryk for cellen.
      2. II) scenen er flyttet tilbage til Placer spidsen over de målrettede celle igen. Foruddefinerede spænding burst anvendes, og efter 500 ms pumpesystemet begynder at Aspirér 3 nL af prøven med en væskehastighed på 2 µL/min.
      3. III) scenen er flyttet til venstre igen, så cellen skal inspiceres. Et vindue vises, beder om brugerinput.
    3. Sige om lysis skridt var en succes eller ej.
      1. Hvis svaret er nej, tager, skyl microcapillary og målrette en ny celle.
      2. Hvis svaret er ja, et øjebliksbillede af cellen fjernet (lysed) er taget, og bagefter til microcapillary er flyttet til placeringen angivet i 3.8.1. Hvis dette er NS eller en buffer reservoir, brug standard-brugergrænsefladen til at give afkald på 3 x 0,5 nL væske samtidig med microcapillary er på vej til at sikre, at der er ingen luftbobler. Spidsen er nedsænket i reservoir væske af makroen.
        Bemærk: Du kan fortsætte med at betingelse prøven og forberede gitre, som forklaret i punkt 1.6.9 - 1.7.9 for NS-EM eller afsnit 2.2-2.6 for cryo-EM. Nedenfor er de nødvendige skridt til NS-grid forberedelse forklaret.
    4. Forlade microcapillary nedsænket i 8-12 min., afhængigt af den dyse geometri
      Bemærk: Den høje fosfat koncentration i bufferen kræver en længere sættetid til konditionering.
    5. Dispensere 5 nL af cellen konditioneret lysate på nettet.
    6. Trække microcapillary og lad konditioneret prøven tørre langsomt på dugpunkt fase (DP-fase) reguleret 1-2° C over dugpunkt-temperaturen.
    7. Fjerne gitteret og opbevar den ved stuetemperatur i en gitter- eller petriskål.

Representative Results

Opsætningen af "cryoWriter" blev udviklet (skildret i figur 2) for at teste de miniaturized EM gitter forberedelse procedurer foreslås i figur 1C, D. Figur 2 A viser en oversigt over de forskellige komponenter monteret på en invers fluorescens mikroskop. En dyrkning af celle-modulet er installeret på den venstre side af mikroskopet; et modul til EM gitter forberedelse er placeret til højre. Modulet celle-dyrkning (figur 2B) giver mulighed for vækst af vedhængende eukaryote celler og live-celle billeddannelse af cellekultur af den lysmikroskop. Individuelle celler er mængden af den kombinerede virkning af osmotisk chok, elektroporation og aspiration af celleindhold ind i en microcapillary (figur 2B, fig. 6A)24,25. Indsugning lysate prøven kan derefter bruges til at forberede gitre for NS - eller cryo-EM. Alternativt kan en materiel protein løsning i et PCR rør være eksempelkilden. Microcapillary (figur 2B) ansat er forbundet til et high-precision pumpesystem tillader prøve diskenheder til indsugning og undværes sub-nL præcision. Som beskrevet i protokollerne udføres alle prøve forarbejdning inden for denne microcapillary eller på EM gitteret, selv uden betydelige prøve transport. For eksempel, bruges den samme microcapillary til at lyse individuelle eukaryote celler, Opsug den lysate, betingelse det og endelig dispensere delprøver på EM gitre. Gitter forberedelse modul består af en bevægelig DP-fase, der giver mulighed for temperaturen i EM gitteret placeret på det at være netop kontrollerede (figur 2C). For NS-TEM, kan den forbehandlede prøve gitter derefter simpelthen fjernet fra den kolde fase og lov til at tørre i luft ved rumtemperatur. De såkaldte kaffe-ring virkninger, der kan derefter følge skal imidlertid undgås for kvantitative TEM hvor protein 'partikler' tælles. At gøre det, gitre er tørret langsomt på DP-scene ved hjælp af en gradvis stigende temperaturgradient for at bremse flydende fordampning. Til cryo-EM holdes temperatur af gitteret tæt på dugpunkt; en positiv forskydning på ca 8 ° C er valgt, giver mulighed for kontrolleret fordampningen af prøven væske til tynde film stabilisering og udtynding, som kan overvåges af en sensor, eventuelt26. Efter den valgte tyndere tid, en pick og springet mekanisme er aktiveret og prøven er forglasset (figur 2C). Bemærk at denne styrter mekanisme ikke er nødvendig for NS-EM gitre, som oplagres ved stuetemperatur.

Figure 2
Figur 2: oversigt over opsætningen af cryoWriter. A) oversigt over opsætningen cryoWriter monteret på en invers lys-mikroskop (1). B) indsatser på området angivet i venstre side i panelet A. celle dyrkningsbaserede rum (2), med en microcapillary (3) for eksempel manipulation og celle lysis placeret over en minituariseret PDMS-baserede celle kultur plade (4). C) indsatser på området angivet til højre i panelet A. 'Pick-og-springet' mekanisme. En holey carbon film EM gitter (5) er monteret mellem tips pincet (6) og placeret vandret i direkte kontakt med den temperatur-kontrollerede fase (7), nævnt som dugpunkt fase (DP-fase) i hovedteksten. Fase temperatur er stramt kontrolleret via en PID-controller og en vandkølet Peltier-element, at holde det på eller tæt på dugpunkt-temperaturen, afhængigt af det omgivende miljø. DP-fase (7) er monteret på en motoriseret xy-akse til at flytte grid i forhold til microcapillary. Microcapillary selv kan er monteret på en z-fase og sænkes indtil det er meget tæt på overfladen af gitteret EM og bruges til at give afkald på nanoliter mellemstore systemdiskenhederne til prøven støtte dækker det (en kontinuerlig tynd carbon lag for NS-EM eller en holey carbon film for cr yo-EM). Bemærk, at flydende udbredelse og udlevering udføres, ved hjælp af en high-precision pumpesystem (8). Dosisdispenserede væsken kan distribueres ved at flytte grid i forhold til microcapillary i en spiral mønster. Til cryo-EM forberedelse overfører pluk og springet dybfrysning mekanismen (9) hurtigt gitteret prøve-loaded i flydende Ethan (10) for hurtig nedkøling og prøve vitrifikation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 viser repræsentative resultater for NS-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter. Spidsen af microcapillary var fyldt med 5 nL prøve fra en stamopløsning og dyppet i et reservoir af NS løsning (2% methylamin tungstate) til flere minutter at tillade diffuserende udveksling af NS og salt ioner (for en teoretisk diskussion Se Arnold, et al. 24). bagefter, konditioneret prøven blev udleveret på tynd carbon folie af en NS-EM gitter og tørret. Figur 3 A viser brugen af et slot gitter på den samme måde at visualisere den komplette droplet, som kræves for kvantitative TEM. For at undgå kaffe ring virkning, var frisk glød-udledes nettet oprindelig blev afholdt på dugpunkt temperaturen (ingen vand fordampning) og derefter langsomt varmede på DP-scenen. Bemærk, at for de fleste programmer (f.eks., kvalitetskontrol af prøven eller strukturel analyse) denne langsomme-tørring proces ikke er nødvendig. Lang-seriøs NS-præparater er fremstillet uden det, som vist i figur 3B, C. Conditioning gange for fosfatfri lav salt buffere er omkring 3 min, fxmed lavt saltindhold Tris-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4 med 50 mM NaCl), som vist i figur 3B ved hjælp af tobak mosaik virus (TMV) som eksempel. Figur 3 C præsenterer et worst-case scenario, som TMV var i PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4). Fosfat-ioner danne forbigående krystaller med heavy-metal-ioner af NS (Se figur 5C), forlængelse conditioning tid kræves (7 min). Andre heavy metal salte kan også bruges med gitter forberedelse modul, f.eks., 2% methylamin vanadate eller ammonium molybdat (Se også Arnold, et al. 24). uranyl acetat er imidlertid ikke passende; crosslinking virkningen af denne plet fører til aggregater Hvis eksemplet protein der er konditioneret i løsning, før adsorption til en kulstof film (Se figur 5E)23.

Figure 3
Figur 3: typiske resultater for NS gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter, som angivet i figur 1C. A) oversigt over billedet af en 3 nL droplet udleveret på et slot gitter efter konditionering med 2% methylamin tungstate. B) TMV i 20 mM TRIS buffer. Indsatsen viser en 3 x udvidelsen af det angivne område. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). C) tobak mosaik virus (TMV) i PBS buffer. Indsatsen viser en 3 x udvidelsen af det angivne område. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). Skalere barer: A, 100 µm; B, 50 nm; Christensen, 80 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Typiske resultater for cryo-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter er afbildet i figur 4. Panelet 4A viser et gitter atlas af området er omfattet af forglasset prøve. Panelet 4B viser homogeniteten af glasagtige isen i en slot, valgte gitter. I begge tilfælde var prøven i 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl buffer indeholdende 0,05% Fos 14 vaskemiddel. Mange prøver og buffere blev testet og en tilsvarende høj kvalitet glasagtige is var fremstillet, men betingelserne er buffer afhængige (Se også diskussion af figur 5). Panel 4C viser apoferritin partikler og en bacteriophage i Tris-HCl buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4) afbildet på høj defocus at øge kontrasten. Panel 4D viser en 200 kDa membran protein stabiliseres af amphipoles.

Figure 4
Figur 4: typiske resultater for cryo-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter, som angivet i figur 1D. Prøverne og buffere varierer i eksempler vist. Alle prøver blev indlæst på holey carbon film. A) Collage af oversigt billeder ("grid atlas") af en prøve, der indeholder en 150 kDa membran protein, i periferien af den glasagtige is er angivet med hvide pile. B) udvidede gitter slot fra et gitter, tilberedt med de samme buffer, viser holey carbon film med glasagtige is. Nogle huller er ikke fyldt med prøvebuffer som anført af hvide pile. C) Carbon hul med forglasset prøve indeholdende apoferritin proteinkomplekser og Bakteriofager. Indsatser: dobbelt udvidelsen viser halen af en bacteriophage. Den hvide stjerne angiver carbon film. Bemærk, at billedet er optaget med høj defocus at øge kontrasten. D) A 200 kDa membran protein fremstillet i amphipols. Indsatser: en 2 x udvidelsen af den angivne område med øget kontrast. Skalere barer: A, 100 µm; B, 10 µm; C og D, 80 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Opsætningen af cryoWriter giver mulighed for systematiske screening for optimal EM-grid forberedelse betingelser; et eksempel er vist i figur 5A (apoferritin i 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). I dette eksperiment, den glasagtige ice "tyndere" temperatur blev varieret, men den tyndere tid (dvs., tidsforskydninger mellem eksempelprogrammet og springet frysning) forblev konstant (1 s). Ved lave offset temperaturer (f.eks., 8 K) var prøve lag for tyk. Ved højere temperaturer, offset, den glasagtige isen i hullerne var tyndere (10 K, 12 K), indtil på et tidspunkt (over 18 K) gitteret blev helt tør (ikke vist). I resultaterne præsenteres her, en forskydning af 12 K fører til et stort homogene område af glasagtige is som angivet af de sorte pile. Sådanne optimeringseksperimenter kan udføres med buffer af målstikprøven ved hjælp af "teste" proteiner (såsom apoferritin). De bedste betingelser fundet anvendes derefter på målstikprøven. Derudover gitre med parametre langt fra optimalt kan ofte være anerkendt under forberedelse procedure og behøver ikke at blive screenet i elektronmikroskop, betydelig tidsbesparelse. Figur 5 viser også et galleri af typiske cryo-EM (Panel B) og NS-EM (paneler C e) artefakter specifikke til opsætningen af cryoWriter. Cryo-EM gitteret vises i panelet 5B med TMV i PBS, som indeholder 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4, 0.1%DM) var overdrevent tyndet. På baggrund af billedet er kornet, fordi den saltkoncentration blev for høj. Generelt er synes det visuelle udseende af en prøve ikke at være en lineær funktion af saltkoncentration; korn bliver pludselig fremtrædende, når en tærskelkoncentration nås under udtynding proces. Bemærk, at uønskede stoffer kan fjernes ved en conditioning skridt før gitter forberedelse, som beskrevet for NS-EM i protokollens punkt 1.6. NS kan forårsage andre artefakter. I eksemplet vises i panelet 5C, PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) uden prøve var konditioneres i 2% methylamin tungstate i 3 min. bundfald og krystaller er indlysende og udøve omfattende styrker på carbon overfladen fører til revner. Formen bundfald kun i en vis PBS og NS koncentration rækkevidde og kan undgås ved conditioning eksempel for længere (Sammenlign figur 3C). Panel 5D viser i periferien af en dosisdispenserede NS prøve droplet udstiller et "kaffe ring". Dette ville forstyrre kvantitative, samlede stikprøve analyse og kan undgås ved at bremse tørringsproces, dvs., ved at holde EM gitteret ved temperaturen, dugpunkt under eksempelprogram, og derefter gradvist øge temperaturen for at tørre det) Se fig. 3A). Panelet 5E (apoferritin i 20 mM HEPES, pH 7,0, konditioneret 3 min) viser crosslinking aktiviteten af 2% uranyl acetat plet, som ikke kan bruges til betingelse protein prøver, før de er adsorberet til carbon film understøtter.

Figure 5
Figur 5: systematiske ændringer og artefakter observeret Hvornår cryoWriter set-up blev brugt til at forberede gitre for NS - og cryo-EM. A) systematisk glasagtige is tykkelse variation; optimering af gitter forberedelse til cryo-EM. Offset temperaturen i DP-scenen var varieret (8-12 omdr) at holde de tyndere tidsvejning (1 s). Pilene angiver i periferien af prøven lag. B) Salt virkninger; for koncentreret, var dvsdet tyndere skridt for lang tid. Indsatsen skildrer en 2 x udvidelsen af det angivne område. C) Salt bundfald dannet af PBS buffer i overværelse af tungmetal salte. Prøver som indeholder PBS buffer skal konditioneres længere end prøver i andre buffere. Her, var PBS buffer uden prøve aircondition i 2% methylamin tungstate i 3 min, en typisk tid til andre prøve buffere. Bemærk knæk i carbon filmen sandsynligvis på grund af de stærke kræfter fra bundfald handler på den tynde støtte under tørringen. D) 'Kaffe ring' effekt. E) Apoferritin aircondition i 2% uranyl acetat for 3 min. Uranyl ioner udviser betydelig crosslinking aktivitet og apoferritin klynger form store aggregater. Skalere barer: A, 80 µm; B, 80 nm Christensen, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den lille mængde og volumen kræves til EM gitter forberedelse ved hjælp af opsætningen af cryoWriter gør det muligt for nye typer af eksperimenter. For eksempel kan de samlede indhold af en enkelt celle indsamlet og udarbejdet for NS - og cryo-EM. Proceduren, der er angivet i figur 6A. En vedhængende, eukaryote celle (HEK 293) er mængden af samtidige elektroporation og prøve aspiration (Panel 6A)25. En samlet maengde paa 3 nL er indsugning, som indeholder cellen lysate, og er bevaret i microcapillary til videre bearbejdning. For NS-EM vist i panelet 6B, blev celle dyrkning mediet udvekslet med PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) før celle lysering. Indholdet af cellen var indsugning i 3 nL buffer og aircondition i et reservoir af NS som angivet i figur 1C i 10 min. bagefter, et 5 nL volumen var udleveret på kontinuerlig carbon folie af en NS-EM gitter. Individuelle proteiner, fx, trådformede actin og membran pletter med vedlagte proteiner kan genkendes i billedet. Til cryo-EM, vist i figur6 C, et volumen på 3 nL blev udleveret på et holey carbon EM gitter uden fornyet ønske om at fjerne væske. Den forholdsvis tyk film af prøven dannet blev udførligt tyndet før vitrifikation. For at gøre det, var DP-fase temperatur gradvist øget, startende fra dugpunkt temperaturen. Den udtynding proces blev overvåget af en real-time sensorsystem, indtil en forhånd fastsat grænse var nået udløser 'pick-og-springet' mekanisme og prøve vitrifikation (for detaljer se Arnold, et al. 26). membran strukturer og proteiner kan genkendes i billedet.

Figure 6
Figur 6: enkelt celle visuelle proteomics ved hjælp af cryoWriter set-up. A) Lysis af en enkelt vedhængende eukaryote celle. Cellen er vokset (1, grøn) på en functionalized, ITO belagt (rød) glas-dias (2) i en minituariseret petriskål (3)25. Laget ITO er jordforbundet. Cellen er kontaktet af microcapillary (4), som er belagt med platin. En første osmotisk chok (ikke angivet) er givet til lette lysis, som udføres af en række elektriske impulser og shear styrker udøves under aspiration af cellen lysate. Processen kan overvåges af lysmikroskopi; mål linsen af mikroskopet er angivet (5). For detaljer, se vores tidligere arbejde24,25. B) NS-EM billede af lysate fra en enkelt HEK 293 celle. Trådformede aktin og membran pletter med vedlagte proteiner er synlige. Panelet tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). C) Cryo-EM billede af lysate fra en enkelt HEK 293 celle. Indsatsen viser en 2 x udvidelsen af den angivne region hvor typisk membran strukturer med tilhørende proteiner er synlige. Panelet C tilpasset fra Arnold, et al. 26 skala barer: B, 50 nm; Christensen, 80 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

'CryoWriter' instrument og de protokoller, der kræves for at forberede prøve gitre for NS - og cryo-EM fra nL størrelse samlede stikprøve diskenheder og helt undgå den klassiske papir-blotting trin præsenteres. Mikrofluid principper og et micromechanical system er kombineret i cryoWriter at gøre dette muligt.

Vores erfaring viser, at når de miniaturized metoder præsenteres i dette håndskrift er anvendt, parameter plads til EM-grid forberedelse er større end for klassiske metoder og under strammere brugerkontrol. Vigtigere, gør øget reproducerbarhed opnåede det muligt at pre-skærm med prøven buffersystem, suppleret med en let tilgængelige test protein til at bestemme de optimale parametre, før den faktiske eksperiment udføres. Dette holder forbruget af stikprøven af interesse til et absolut minimum og kan varmt anbefales. Kritiske trin for både NS og cryo EM gitter forberedelse er: (i) Priming pump system; for sub-nanoliter volumen udlevering, skal systemet væske (vand) være afgassede og boble gratis. (ii) præcis kontrol af glød decharge eller plasma rengøring skridt; gitteret EM overflade egenskaber er afgørende for reproducerbare resultater. (iii) stikprøve conditioning; den tid, der kræves til konditionering, fxmed NS, afhænger på buffer type, salt indhold og koncentration (figur 3), samt på dysen geometri microcapillary24. (iv) fordampning satser for NS-EM forberedelserne til kvantitative EM; kaffe-ring virkning kan forbyde kvantitativ analyse af NS-EM præparater, og skal blive undertrykt ved langsom fordampning satser kontrolleret af DP-scenen.

Forskellige aspekter af præparationsmetoder præsenteres gitter kan kombineres frit, så udviklingen af alsidig protokoller for særlige prøver. Typiske eksempler ville være fjernelse af et stof, der forhindrer høj opløsning EM, fx, glycerol, af en conditioning skridt før gitter forberedelse til cryo-EM; indførelsen af mægleren molekyler, såsom ligander, af conditioning før gitrene tilberedes; eller undersøgelse af enkelt celle lysate af NS - eller cryo-EM (figur 6).

Brugen af mikrofluidik og minimal prøve beløbene i de præsenterede metoder fjerner helt behovet for papir-blotting trin. Dette er en stor fordel, fordi papir blotting er en barsk behandling for proteiner, potentielt forurenende prøve med uønskede ioner og i sagens natur fører til massive prøve tab. På den anden side undgås effekter potentielt forårsaget af grænsefladen luft-vand af tynde prøve filmen dannes når cryo-EM prøver er forberedt på den klassiske måde ikke når cryoWriter der bruges. Grid egnet til cryo-EM kan være forberedt med en mindre end 0,2 s ventetiden mellem eksempelprogrammet og vitrifikation (data ikke vist). Men som proteiner rejser et par tiendedele af et nanometer i et par nanosekunder ved diffusion, der er stadig nok tid for dem til at kollidere med luft-vand-interface af en 100 nm tykke sample film flere gange. Men mængden af proteiner stikning til grænsefladen luft-vand kan reduceres væsentligt ved at fugerne kort tid og kan forhindre protein denaturering eller begrænset partikel orientering. En anden lovende tilgang, der kan beskytte følsomme proteiner fra grænsefladen luft-vand er til at dække sample film af lavmolekylære overfladeaktive stoffer. Disse forbindelser kan indføres hurtigt af en conditioning skridt i cryoWriter før gitter forberedelse. Høj overflade-til-volumen forholdet mellem mikrofluid systemer er en yderligere begrænsning af cryoWriter, som prøven kan potentielt være tabt af uspecifik adsorption til microcapillary overflade og forstyrre kvantitativ analyse af partikel tælling. Problemet er behandlet på to måder: først, prøven ikke rejse lange afstande inden for microcapillary. Faktisk forbliver nanoliter sample volumen på kapillær spidsen under hele behandlingen. Andet overflade til volumen-forholdet reduceres yderligere ved hjælp af microcapillaries med relativt stort indre diameter, fx, 180 µm. for det tredje, overflader på microcapillaries kan let passivated, om nødvendigt, fxved at behandle dem med kommercielt tilgængelige polylysine ethanol glykoler (PLL-PIND).

Høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel tilgang anvendes i EM kræver kun 100.000 til et par millioner billeder af individuelle protein partikler. Dette betyder, at mikrofluid teknikker kan give nok proteinkomplekser for den strukturelle undersøgelse. En minituariseret immuno-nedbør metode til hurtig isolering af proteinkomplekser (omkring 1 time) fra minimal celle beløb (ca. 40.000 celler) blev udviklet tidligere28. Denne metode vil nu være direkte knyttet til miniaturized prøve forberedelsen af cryoWriter. Det endelige mål er at udvikle en integreret mikrofluid pipeline for ultra-hurtig protein isolation og cryo-EM gitter forberedelse, der kræver mindre end to timer i alt. Desuden, som det fremgår af figur 6, minut mængde og mængden af materiale til forberedelse af prøver og næsten tabsfri conditioning og gitter forberedelse procedure opnås ved hjælp af cryoWriter, gøre det muligt at studere proteinet komplekser af individuelle celler. Sammen, lægge metoden miniaturized immuno-nedbør og cryoWriter fundamentet for en ny proteomics metode kaldet "enkelt celle visuelle proteomics", som vi for nylig demonstreret for heat-shock eksperimenter24. Data analyse algoritmer gearet til analyse af "visual proteomics" billeder er i øjeblikket ved at blive testet.

Disclosures

Forfatterne Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg og Thomas Braun erklære følgende konkurrerende finansielle interesser: cryoWriter koncept er en del af patentansøgningen PCT / EP2015/065398 og EP16194230.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke workshop af Biozentrum af Universitet Basel for deres støtte, S. A. Müller for kritiske diskussioner og nøje læsning af manuskript, A. Fecteau-LeFebvre for teknisk bistand med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann for membran protein teste prøver (alt fra C-CINA, Biozentrum, universitetet i Basel) og A. Engel, emeritus Universitet Basel for sin inspirerende samtaler. Prøver var venligst leveret af P. Ringler, M.-A. Mahi, og T. Schwede (Biozentrum, universitetet i Basel), P. Leiman (laboratorium for strukturel biologi og Biofysik, EPFL) og R. Diaz-Avalos (New York strukturel biologi Center, USA). Projektet blev støttet af den schweiziske Nanoscience Institut (SNI, projekt P1401, ARGOVIA projekt MiPIS) og den schweiziske National Science Foundation (SNF, projekt 200021_162521).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liquid handling
Microcapillary tip New Objective FS360-100-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
FS360-150-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve New Objective CONGAS-1  Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing BGB-Analytik TSP-150375 TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector BGB-Analytik 2525LD Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 
Syringe 10 µl BGB-Analytik HA-80001 Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included) 
Syringe pump controller Cetoni A3921000093 neMESYS controller
Syringe pump dosing unit Cetoni A3921000095 neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor Meltec UFT75-AT Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor Sensorshop24.ch LS7-PT1000-1.0-3L Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller Cooltronic TC2812  PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element Distrelec.ch PE-127-14-15-S 40x40 mm
Water-cooling block - - Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump Digitec.ch 294877 XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block - - Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers PCHC.ch 223050 Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements Distrelec.ch PE-031-10-15-S Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis Dyneos AG M-404.2PD High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller Dyneos AG C-863 Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage Prior Scientific H117EIL5 Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets Supermagnete S-05-08-N Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet Schramme EG1025A02/110 Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet Conrad.ch MST-1630.001 7 Electromagnet control PCB board
Solenoid hub Distrelec.ch HD8286-R-F-24V100% Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers Electron Microscopy Sciences 0302-M5S-PS Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts Thorlabs - -
Various mechanical parts Workshop Biozentrum, University Basel - Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode Thorlabs CPS780S 780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector Thorlabs PDA100A-EC Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM emsdiasum.com DTF-03523 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS Sigma D8537 SIGMA Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2% nanoprobes.com Negative stain vanadium based
NanoW 2% nanoprobes.com Negative stain tungsten based
Software
openBEB The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin) Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrandt, W. Biochemistry: The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  3. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  4. Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).
  5. Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. , (2010).
  6. Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. Electron gun using a field emission source. Rev Sci Instrum. , (2003).
  7. Zemlin, F. Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy. Micron. 25 (3), 223-226 (1994).
  8. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  9. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  10. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat methods. 10, 584-590 (2013).
  11. Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).
  12. Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy. J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).
  13. Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors. J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).
  14. Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  15. Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. Processing of Cryo-EM movie data. Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).
  16. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  17. McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy. J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).
  18. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  19. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  20. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  21. Glaeser, R. M. How good can cryo-EM become. Nat Methods. 13, 28-32 (2016).
  22. Engel, A. in . Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).
  23. Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. Connecting µ-fluidics to electron microscopy. J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).
  24. Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy. ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).
  25. Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).
  26. Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).
  27. Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).
  28. Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).

Tags

Biologi sag 137 elektronmikroskopi cryo negative pletten mikrofluidik prøve conditioning visuelle proteomics encellede lysis
Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S.… More

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter