Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57310
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1
1Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Nanoscience Institute, University of Basel, 3BioEM lab, Biozentrum, University of Basel
* These authors contributed equally

Summary

Ett instrument och metoder för beredning av nliter provvolymer för transmissionselektronmikroskopi presenteras. Inga papper-analys steg krävs, så att man undviker de negativa konsekvenser som detta kan ha för proteiner, avsevärt minska prov förlust och möjliggöra analys av enstaka cell lysate för visuell proteomik.

Abstract

På grund av senaste tidens tekniska framsteg blir cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) snabbt en standardmetod för den strukturella analysen av proteinkomplex till atomär upplösning. Protein isolering tekniker och prov förberedelse metoder för EM är dock fortfarande en flaskhals. Ett relativt litet antal (100.000 till några miljoner) enskilda protein partiklar måste avbildas för högupplösta analys av proteiner av den enda partikeln EM strategi, att göra miniatyriserade prov hantering av tekniker och mikroflödessystem principer genomförbart.

En miniatyriserade, papper-blotting fri EM rutnät förberedelse metod för provet förkonditioneringen, EM rutnät priming och efterbearbetning som endast förbrukar nliter-volymer av provet presenteras. Metoden använder en dispenseringssystem med sub-nliter precision kontroll flytande upptag och EM rutnät priming, en plattform för att styra rutnät temperaturen därmed bestämma den relativa fuktigheten ovanför rutnätet EM, och en pick-och-steget-mekanism för prov förglasning. För cryo-EM, ett EM rutnät placeras på temperaturkontrollerade scenen och provet är aspirerade i en kapillär. Kapillär spets är placerad i närheten av rutnät ytan, rutnätet är laddad med provet och överskott är åter aspirerade i microcapillary. Därefter är prov filmen stabiliserad och något tunnas genom kontrollerade vattenavdunstning regleras av förskjutningen av plattform temperaturen i förhållande till daggpunkt. Vid en given punkt utlöses plocka-och-steget mekanismen, snabbt överföra primade EM rutnätet till flytande etan för provet förglasning. Alternativt finns prov-conditioning metoder att förbereda nliter provvolymer för negativa fläcken (NS) EM.

Metoderna som minskar prov konsumtion och undvika strategier som är potentiellt skadliga proteiner, såsom den filterpapper blotting används i konventionella metoder. Dessutom tillåter den minimala mängden prov krävs nya experimentella strategier, såsom snabb prov luftkonditionering, kombination med enskild cell lysis för ”visual proteomik”, eller ”lossless” totala provberedning för kvantitativ analys av komplexa prover.

Introduction

Maskinvara och programvara för den strukturella analysen av proteinkomplex av transmissionselektronmikroskopi (TEM) har massivt avancerade under senare år. De förbättringar som gjorts banade väg för en ”resolution revolution”1,2 och strukturella forskning i grunden förändrat. Revolutionen började med tillkomsten av cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM)3,4, så att utarbetandet av biologiska prover under nära fysiologiska förhållanden samtidigt minska strålning känslighet och förhindra provavdunstning i hög vakuum av överföring elektronmikroskop5. Under de följande åren ökat inkrementell tekniska framsteg successivt upplösningen kan uppnås. Bland dessa innovationer var tillämpningen av fältet-utsläpp guns6,7, och, mer nyligen, förbättrat data analys algoritmer, till exempel högsta sannolikheten metoder8,9. Direkt elektron detektor kameror10,11,12,13, filmläget imaging och medföljande programvara utvecklingen14,15, 16 , 17, förutsatt det slutliga genombrottet som krävs för att uppnå atomär upplösning för biologiska prover av enda Partikelanalys (för en granskning se Cheng, Grigorieff, o.a. 18). vikten av cryo-EM har nyligen erkänts av tilldelning av Nobelpriset i kemi till tre pionjärer.

För att bild ett biologiskt prov av TEM, den metod som används för att ladda EM rutnätet med prov (senare kallad ”grid förberedelse”) måste säkerställa att den resulterande prov lagret (i) är tunt nog (< 100 nm) att undvika omfattande buller av oelastisk eller multiplicera utspridda elektroner, (ii) tål hög vakuum av elektronmikroskopet, och (iii) skyddar biomolekyler från strålskador. Två huvudsakliga metoder används för att uppfylla dessa Semesterpengar: negativa fläcken(NS)19,20 förfaranden (figur 1A) adsorberas provet till en tunn kolfilm, bädda in biomolekyler i amorf tungmetall och sedan Låt enheten torka i luften. Detta är enkel och snabb, och laddade EM rutnäten (senare kallad ”prov grids”) är lätta att lagra och kan förvaras under längre tid (vanligtvis år). I TEM, förberedelserna uppvisar hög kontrast på grund av NS och tolerera högre elektron doser än cryo-preparat, men upplösningen är begränsad till ca 20 Å. Cryo-EM förfaranden (figur 1B) anställa holey kol stöder. En tunn film av provlösningen är sträckte över hålen och rutnätet EM är försatt i en cryogen, oftast flytande etan, att snabbt kyla det under-150 ° C. Resultatet är en amorf, förglasad, 50 till 100 nm tjock film av lösningen i stöd hålen. Denna tunna, amorft film tål hög vakuum i elektronmikroskopet och, i det ideala fallet, bevarar biologiska strukturer i sitt ursprungliga tillstånd. Förfarandet gör det möjligt för biologiska prover som avbildas på högupplösta. Dock förvaras rutnätet provet vid temperaturer under-150 ° C vid alla tidpunkter att undvika devitrification. Det kan avbildas med relativt hög elektron doser på grund av den låga temperaturen, men kontrasten och signal-brus-förhållande är ändå låg. Därför, genomsnitt tekniker utnyttjas för att öka kontrasten och förutsatt att provet är avbildad från olika vinklar, kartan högupplösta tredimensionella (3D) kan rekonstrueras. Vanligaste de och mycket framgångsrika metod för 3D rekonstruktion från och med nu är det enda partikel tillvägagångssättet. För en senare genomgång, se Cheng al.18.

Negativa fläcken TEM (NS-EM) är viktigt för screening och kvalitetskontroll, när hög kontrast behövs eller när det finns endast begränsade mängder prov (adsorption till carbon film generellt koncentrerar provet). Enda partikel cryo-EM är den guld-standard metoden om högupplösta 3D rekonstruktioner av proteinstruktur är avsedd för.

Figure 1
Figur 1: principer av TEM rutnät förberedelse och jämförelse mellan klassiskt (panelen A, B) och en mikroflödessystem strategi (panel C, D). A) klassiskt NS-EM rutnät förberedelse: om 3 µL prov är pipetteras för hand på ett EM rutnät täckt med en kontinuerlig carbon film (senare benämnd som ett 'NS-EM rutnät') (i). Efter inkubation för ca 10 s, filterpapper används för att torka bort överflödig vätska från sida (ii), lämnar den adsorberade biomolekyler i en tunn vattenfilm. Därefter proteinet inkuberas i en tungmetall salt lösning, t.ex., 2% uranyl acetat, för 20 s (iii), och igen vätskan avlägsnas genom att läska från sidan med filterpapper (iv). Slutligen, EM-rutnätet är kvar för att torka i luften. B) klassiskt cryo-EM rutnät förberedelse: om 3 µL prov är pipetteras en hand på en holey carbon film. För att bilda en tunn prov film, avlägsnas överskott vätska genom papper-blotting ansikte-on från ena eller båda sidorna (ii). Rutnätet är slutligen snabbt störtade ner i flytande etan för förglasning (iii). C) NS-EM rutnät förberedelse med cryoWriter setup: A 5 nL volym är aspirerade från provet lager med hjälp av en microcapillary (i). För prov konditionering, är microcapillary spets nedsänkt i luftkonditionering lösning, t.ex., 2% ammoniumacetat. Joner och små molekyler utbyts genom diffusion (ii). Observera att måtten på microcapillary se till att hela processen är diffusion drivs. Proteiner har mycket lägre diffusion konstanter än salt joner och är inte betydligt förlorat24. Slutligen är provet expedieras på rutnätet och tillåtas torka (iii). D) principer av cryo-EM rutnät preparatet med hjälp av cryoWriter-baserade metoden: An EM rutnät täckta av ett holey kol placeras på ytan av en temperatur-kontrollerad plattform och innehas av pincett. Temperaturen i plattformen styrs på en förskjutning från dagg pekar temperatur rutnät miljön. Rutnätet flyttas i förhållande till den microcapillary som innehåller provet och microcapillary sänks tills det är några mikrometer ovanför rutnätet. Därefter är några Polykarbonatet av provet förpackat från det medan scenen flyttas i ett spiralmönster; överflödig vätska är åter aspirerade (i). Efter EM rutnät grundning, microcapillary dras och rutnätet förblir på temperatur kontrollerade plattformen (senare kallad daggpunkt (DP) scenen) för kort tid för att tillåta en kontrollerad mängd prov att avdunsta. För steget frysning, är rutnätet snabbt dras tillbaka från scenen med pincetten (ii), vänt 90 ° i vertikal position och störtade ner i ett cryogen bad (iii) (senare benämnd 'pick-och-steget' mekanismen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tyvärr har inte de rutnät förberedelse metoder för NS och cryo-EM förbättrats avsevärt sedan de uppfanns. Nuvarande nackdelar är den höga samplingsfrekvenser förbrukningen (ca 3 µL av 1 mg/mL protein) och den stora mängden (> 99%) av provet förlorade (figur 1A, B). Den klassiska metoden som används för att förbereda rutnät för cryo-EM är dessutom en hård procedur för proteiner: först, det innebär en omfattande ansikts-på papper-analys steg (figur 1B, ii), och, andra, proteinet är utsatt för gränssnittet luft-vatten för en betydande mängd tid21. Här, en alternativ metod för prov förkonditionering, grid provberedning och efterbehandling (grid torkning eller förglasning) för NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (figur 1D) presenteras. Inställningen för det interna byggda, kallas ”cryoWriter”, använder miniatyriserade prov hantering teknik och mikroflödessystem principer att aspirera, skick och dispensera provet, undvika papper blotting helt och att tillhandahålla alternativa metoder till tunna prover för Cryo-EM. Det avsevärt minskar prov konsumtion och förbättrar användaren-kontroll över provberedning som helhet. Dessutom tillåter metoden nya experimentella tillämpningar; till exempel utarbetande av isolerade biologiska komponenter av enskilda celler i en strategi som kallas ”enda cell visuella proteomik”22,23,24,25.

Protocol

En ”cryoWriter” (figur 2, för detaljer se föregående arbete24,26,27) eller motsvarande instrument krävs för följande protokoll. En lista över leverantörer för huvuddelar och förbrukningsvaror ges i Tabell för material.

1. negativa fläcken (NS) Grid förberedelse

  1. Slå på instrumentet och starta programvaran. Initiera alla nödvändiga moduler (spruta pumpstyrningen, motoriserad stadier, övervakningskameror och daggpunkt scenen).
  2. Cool prov stöd och daggpunkt scenen. Om det behövs, se till att daggpunkten steg temperaturen regleras 1-2 ° C över daggpunkten.
    Obs: Scenen kyls av en kommersiell Peltier enhet med en PID-regulator.
  3. Förbereda NS genom att fylla en 100 eller 200 µL PCR-röret med 100-150 µL av NS (t.ex., kommersiellt tillgängliga 2% metylamin volframhaltigt). Placera röret kyls provet stöd av instrumentet.
  4. Placera provet.
    1. Lägg provet (0,5 - 1 µM) i en 100 eller 200 µL PCR-röret. Om det finns mindre än 50 µL prov skär av botten av en PCR-rör med ett rakblad och använda det som ett prov väl. Detta kommer att säkerställa att microcapillary kan enkelt nå provet.
      Obs: Det är enklast att aspirera prov från 100 eller 200 µL PCR-rör, eftersom den microcapillary som används senare för att aspirera provet är något lutande och resor-höjd z-riktningen är begränsad.
    2. Placera PCR-röret/behållaren kyls provet stöd i instrumentet för att förhindra avdunstning. Alternativt, prover kan vara aspirerade från plattor i Mikroskop scenen övre inkubatorn i rumstemperatur; kyla är inte implementerat för plattor.
  5. Definiera positioner. Joysticken cryoWriter som styr motoriserade xy-scenen och programvara kontrollknappar för linjär x-, y- och z-axeln stadier att placera microcapillary. Använd kameran för att kontrollera placeringen av kapillären.
    1. Flytta microcapillary till reservoaren provet. Doppa spetsen i provet vätskan och spara denna position som ”prov”.
    2. Flytta microcapillary till NS PCR-röret, doppa spetsen i NS lösningen och spara denna position som ”fläcken”.
    3. Placera den microcapillary ungefär 100 µm ovanför mitten av facket där rutnätet EM kommer att placeras och spara denna position som ”grid_save”.
  6. Aspirera prov och vårda det för NS-EM.
    1. Om inte redan installerat, montera en 10-µL spruta (0.46 mm inre diameter) på en precision sprutpumpen.
    2. Limma fast ena änden av en 30 cm lång smält kiseldioxid microcapillary (ytterdiameter 360 µm, innerdiameter 150 µm) till sprutan utlopp.
    3. Anslut den andra änden av microcapillary till en kort (5 cm) lång avsmalnande microcapillary via press fit connector. Den avsmalnande spetsen av den kort microcapillary bildar tubens spets.
    4. Fyll sprutan med avgasade dubbeldestillerat vatten (ddH2O; system vätska) och undvika att bildningen luftbubblor.
    5. Fördela några tiotals Polykarbonatet system vätska och ta bort eventuella droppar från microcapillary med en luddfri vävnad.
    6. Dubbelklicka på den sparade provposition. Detta placerar microcapillary i provet väl. Kapillären är rörliga, dosera 3 x 0,5 nL system vätska strax innan den microcapillary spetsen nedsänkt i provet att förhindra luftbubbla från att bli instängd där (se not 2 nedan).
    7. Aspirera 5 nL av provet.
    8. Dubbelklicka på den sparade NS positionen. Microcapillary är återkallas från provbehållaren och flyttade till NS behållaren automatiskt. Kapillären är rörliga, manuellt dosera 3 x 0,5 nL prov vätska strax innan spetsen nedsänkt i reservoaren att se till att det finns ingen luft bubblor (se not 2 nedan).
      Obs: viktigt: (1) när du byter från strävan att tubens läge eller vice versa, finns en liten förlust i kolv stroke på grund av att glapp i gears of sprutpumpen. Enligt tillverkaren motreaktion av en ny enhet ligger mellan 7 och 12 µm. För våra spruta med fat diameter 0,46 mm innebär detta att 1-2 nL. Därför, 1-2 nL kan ”expedieras”, innan provet dispenserats faktiskt. En liten droppe börjar vanligen, att avsluta den microcapillary spetsen efter den tredje 0,5 nL dispensera steg. (2) en luftbubbla som fångade ovanför/nedanför provet skulle göra dispensering mindre korrekta och förhindra prov luftkonditionering genom diffusion.
    9. Lämna den microcapillary nedsänkt i 3-12 min, beroende på provet buffert och munstycke geometri.
      Obs: Ju högre salt eller fosfat koncentration i bufferten, ju längre krävs nedsänkningstiden. NS diffunderar (relativt snabbt) in i provet kontakten medan bufferten salter (relativt snabbt) och protein (mycket långsammare) diffusa ut. Detta sänker koncentrationen av buffert salter i provet hindrar dem från att utkristalliseras när rutnätet laddade torkar. Ytterligare, fosfat tenderar att bilda en fällning i kombination med NS.
  7. Förbereda ett rutnät och deponera en plats av konditionerat provet.
    1. När provet är att vara villkorat, ta en bit tejp och ett PDMS block och rengör ovansidan av PDMS av applicerar och tar bort tejpen för att säkerställa att det finns inget damm. Placera det PDMS blocket i en petriskål.
      Obs: Nya PDMS block tas från renrum.
    2. Försiktigt plocka upp ett rutnät (t.ex., Cu, 200 eller 400 mesh belagd med Parlodion/C film). Kontrollera att kontakten endast kanten av rutnätet med pincetten. Placera den på ren PDMS blocket med kol filmen uppåt.
    3. Plats PDMS blocket med rutnätet i en glöd-ansvarsfrihet aggregat och glöd ur det för 20 s med 100 W uteffekt vid 0.4 mbar. Lagra rutnätet i en stängd petriskål. Längre glöd ansvarsfrihet gånger allmänhet leda till en större fördelning på provvolymen deponerade på rutnätet. Som ett resultat, fläcken lagret blir tunnare (svagare fläcken).
    4. 1 min innan nedsänkningstiden är upp, greppa rutnätet glöd-urladdat med cryoWriter pincetten. Kontrollera att elektromagneten aktiveras; annars slå på den i programvaran. Montera pincetten på elektromagneten och Använd den manuella micromanipulator skruven för att anpassa rutnätet platt på daggpunkt scenen, carbon film sida upp. Kontrollera att daggpunkten steg temperaturen regleras 1-2 ° C över daggpunkten för att minska avdunstning efter provet är laddad.
    5. När nedsänkningstiden är upp, dubbelklicka på ”grid_save”. Microcapillary spetsen placeras säkert ovanför rutnätet. Manuellt ta den microcapillary spetsen i kontakt med nätet. Lyfta munstycket genom 10 µm och placera den ovan mitten.
      Varning: Några prover som innehåller rengöringsmedel tenderar att flytta upp längs den yttre ytan av microcapillary när vätska dispenserats på grund av den lägre ytspänningen. Det är viktigt att vara mycket nära rutnät ytan för att förhindra sådana förluster.
    6. Dosera 5 nL av provet på rutnätet. På en torr dag, när snabb avdunstning sker vid microcapillary spets, man kan också långsamt avstå tills provet är i den yttersta spetsen, och sedan snabbt expediera 5 nL.
    7. Ta ut microcapillary och låt luftkonditionerade provet torka långsamt på daggpunkt scenen (DP-Stadium).
    8. När provet plats har torkat, ta bort rutnätet och förvara den i rumstemperatur i ett rutnät eller petriskål.
    9. Avstå från 500 nL system vätska från microcapillary och ta bort det med en luddfri vävnad. Spola kapillären 5 gånger med etanol, tvättmedel eller 1 M NaOH. Detta rensar i microcapillary så att den kan användas med olika urval.

2. Cryo rutnät förberedelse

  1. För att förbereda de instrument och prov, Följ steg 1,1 till 1.5 ovan. Om NS inte krävs, utelämna steg 1.3 och 1.5.2. För att utbyta prov bufferten eller villkora provet för cryo-EM genom dialys, t.ex., att minska koncentrationen av buffert salter eller för att införa tillsatser (t.ex., trehalos, rengöringsmedel) Använd önskad bufferten istället för NS i steg 1.3 och 1.5.2.
  2. Förbereda flytande etan i en standard cryo behållare.
    1. Montera den etan cup, cryo box hållare och spindel och fyll behållaren cryogen till brädden med flytande kväve; vanligtvis kräver ca 200 mL. Vänta några minuter tills etan koppen har svalnat och är fri från flytande kväve.
    2. Öppna etan gasolflaskan och sakta låta gasflödets i etan koppen. Låt det fylla med flytande etan tills nivån är 2-3 mm under övre; Detta tar några minuter och kräver ca 5 mL flytande etan.
    3. Ta en cryo-ruta och placera den i en ledig plats i behållaren cryogen.
    4. Ta bort spindeln, locket polystyrol på toppen och placera behållaren cryogen på montering i cryoWriter.
  3. Glow ansvarsfrihet ett EM rutnät.
    1. Ta en bit tejp och ett Polydimetylsiloxan (PDMS) block och rengör ovansidan PDMS av applicerar och tar bort tejpen (tar bort damm). Placera det PDMS blocket i en petriskål.
    2. Försiktigt plocka ett rutnät från rutan rutnät. Kontrollera att kontakten endast kanten av rutnätet med pincetten. Placera den på en ren PDMS-block med holey kol filmen uppåt.
    3. Plats i PDMS blockera med rutnätet i ett plasma renare och plasma-ren rutnät ytan (t.ex. använda 75% Ar/25% H2, power 50 W, trycket 25 mTorr). Placera blocket PDMS med rutnätet glöd-urladdat i en petriskål.
  4. Position i rutnätet i instrumentet
    1. Greppa rutnätet glöd-urladdat med cryoWriter pincetten. Kontrollera att elektromagneten aktiveras; annars slå på den i programvaran. Montera pincetten på elektromagneten och Använd den manuella micromanipulator skruven för att anpassa rutnätet platt på scenen, carbon film sida upp.
    2. Dubbelklicka på ”grid_save”. Justera microcapillary position så att spetsen är ca 10 µm ovanför rutnätet. Kontrollera att microcapillary kan röra sig fritt över nätet utan att röra den någonstans, om nödvändigt återkalla microcapillary några mikrometer.
    3. Gå tillbaka till mitten av rutnätet och spara den nya positionen som ”rutnät”.
      Varning: Korrekt namngivning är obligatoriskt för makro skriptet att fungera.
  5. Skriva provet och plunge-frysa rutnät.
    1. Spola microcapillary med några tiotals Polykarbonatet system vätska och ta bort eventuella droppar från microcapillary med en luddfri vävnad.
    2. Starta makroskript. Makrot kommer att utföra följande steg:
      1. Dosera 5 nL (för att avlägsna eventuella luftbubblor på spetsen) och gå till provposition.
      2. Aspirera 65 nL av provet. Ingjuta 5 nL tillbaka i provet röret. Denna står för system glapp och tillåta synkroniserade skrift, dvs., att säkerställa att dispensering och stage rörelse start på samma gång.
      3. Flytta till ”grid” position.
      4. Initiera 'skriva mönster', som kommer att orsaka microcapillary att flytta över rutnätet samtidigt dispensering 45 nL av provet.
      5. Efteråt, flytta microcapillary tillbaka till mitten av rutnätet, sänka den en annan 10 µm, och dra tillbaka överflödigt prov vätska.
      6. Dra tillbaka microcapillary och stänga av elektromagneten. Detta frigör pincett och initierar steget frysning.
  6. Greppa pincetten och försiktigt släppa magnetiska kortet från kolven. Snabbt överföra rutnätet från etan cup cryogen behållaren som innehåller rutan cryo och placera rutnätet i en ledig plats.

3. single-cell Lysate beredning

  1. Förbereda microcapillaries för elektroporation.
    Obs: De avsmalnande (laser-draget och inspekterade) smält kiseldioxid microcapillaries har en skyddande polyimid beläggning på utsidan, med undantag för tipset, där beläggningen är avbränt bort under processen avsmalnande.
    1. För att bestryka microcapillaries med ett ledande skikt, montera dem i 45° vinkel på en metall järnväg, med spetsarna pekar uppåt. Använd en aluminiumfolie för att avskärma den nedre änden (2 cm) av tips, som obestruket polyimid bildar den bästa tätningen med press-fit kontakterna anställd senare.
    2. Fräsande deponera ett klibbigt lager 20 nm Ti/W, och sedan ett 200 nm tjocka lager av Pt.
  2. Göra den microcapillary spetsen hydrofoba.
    1. Förbereda en 1 M lösning av 1-dodecanethiol i EtOH.
    2. Glöd-urladdning av microcapillary i luft för 1 min med 100 W uteffekt vid 0.4 mbar.
    3. Doppa spetsen av microcapillary i 1 M lösning av 1-dodecanethiol i några timmar (helst över natten).
      Obs: Det är bäst att förbereda tips nymalen en dag före användning.
  3. Installera en ny microcapillary.
    1. Ta microcapillary ur 1-dodecanethiol lösningen, skölj utsidan med etanol och spola insidan med etanol med hjälp av en spruta.
      Obs: Om ingen functionalized microcapillaries tillgängliga, snabbt glöd ansvarsfrihet spetsen på en microcapillary och doppa den i en droppe av kommersiella bil fönster behandling, som är en blandning av PDMS och svavelsyra. Den resulterande hydrofoba funktionalisering är inte lika bra som med 1-dodecanethiol, men vanligen tillräckligt.
    2. Klyva sin obestruket avslutas med en kapillär fräs.
      Obs: Ett rent snitt är viktigt för en god tätning med press-fit connector.
    3. Använd en tandpetare för att tillämpa silver pasta till skarpa gränsen bildas mellan glas och polyimid beläggningen när polyimid beläggningen var avbränt bort av lasern under kapillär dra.
      Obs: Denna förstärkning är nödvändigt eftersom Pt beläggningen är mycket svag i denna region, och elektrisk överledning lätt kan bryta.
    4. Tvätta polyimid slutet av microcapillary med aceton. Lämna en liten droppe av aceton i slutet och infoga det i öppningen av press-fit kontakten. Applicera lätt tryck att bilda en bra tätning.
  4. Kalibrera microcapillary positionen.
    1. Slå på instrumentet och starta programvaran som beskrivs i steg 1,1. Dessutom initiera Mikroskop kameran och funktionsgenerator.
    2. Placera ett glas objektglas i skjut hållaren på mikroskopet.
    3. Lägre i microcapillary nära glasskiva och centrera den över mikroskopet målet tills den visas i mikroskopet kameravyn. Använda x - och y-axeln linjär stadier för att placera spetsen på microcapillary i mitten av bilden. Sedan långsamt sänka spetsen tills den vidrör något glas bilden.
      Varning: Välj mycket små steg (5 µm) mot det slutliga tillvägagångssättet. Spetsen kan annars skadas.
    4. Tryck på knappen ”Kalibrera munstycke”. Detta dras in i microcapillary 40 mm och uppsättningar detta placera som hem position.
  5. Beredning av stämplade PDMS bitar och ITO glider
    1. Blanda PDMS och crosslinker i förhållandet 10:1, häll i en stor petriskål till ett djup av ca 2-3 mm. baka vid 60° C för ett par timmar i en hybridisering inkubator eller liknande enhet.
    2. Med en hammare och en stämpel (12 mm diameter), skära hål i PDMS lagret. Efteråt, använda en skalpell skära ut 2 cm långa fyrkanter eller rektanglar inklusive hålen för att få stämplat bitar som passar på ett objektglas. Vanligtvis, är två stämplade bitar monterade på ett objektglas.
    3. Tvätta PDMS bitarna och ITO bilderna först med tvättmedel och sedan med 70% etanol. Placera dem, våt, i en petriskål och låt etanolen avdunsta helt i en ugn vid 60° C.
    4. Glöd-ansvarsfrihet ITO bilderna för 1 min med 100 W uteffekt vid 0.4 mbar och applicera sedan 1 mL beläggning lösning (t.ex., poly-L-lysin (PLL)). Inkubera i 5 min, ta bort lösningen med en pipett och applicera 1 mL ddH2O. något agitera för 1 min och ta sedan bort den ddH2O med pipett. Låt glasen torka i 60° C.
  6. Förbereda cellkulturen. Följ anhängare-cell odlingsskålar standardprotokoll (t.ex., Arnold, o.a. 24 , 25). utsäde celler på ITO under normal uppdelning/passaging körningar.
    1. Ta en färsk PLL-belagd ITO bild och Lägg en PDMS bit. Utöva vissa påtryckningar att bilda en vattentät försegling. Detta ger små brunnar med bilden som sin bas.
    2. Tillsätt ungefär 300 µL av celler upphängd i färskt medium till PDMS brunnarna. Sådd densiteten bör vara cirka 75 000 celler per brunn.
    3. Inkubera ITO bilderna i 1-2 dagar under standart villkorar.
  7. Förbered för cell lysis experiment:
    1. Pre varm några milliliter av elektroporation bufferten (t.ex., fosfatbuffrad saltlösning (PBS)).
    2. Förbereda set-up för NS-EM rutnät förberedelse
      Obs: Information för att förbereda set-up visas i steg 1,1-1,5 (för NS) eller steg 2.1-2.4 (för cryo). Här beskriver vi de viktigaste stegen för NS-beredning.
      1. Förbereda NS genom att fylla en 100 eller 200 µL PCR-röret med 100-150 µL av NS (t.ex., kommersiellt tillgängliga 2% metylamin volframhaltigt). Placera röret kyls provet stöd av instrumentet.
      2. Flytta microcapillary till NS PCR-röret, doppa spetsen i NS lösningen och spara denna position som ”fläcken”.
    3. Ladda standard Lys parametrarna, t.ex., Lys spänningen.
    4. Ta ITO bilden från inkubatorn och montera den på Mikroskop skäret. Använd två skruvar att fixa bilden på aluminium skäret och säkerställa elektrisk kontakt mellan ITO beläggning av bilden och den elektriskt jordat aluminiumramen.
    5. Ta bort cellodlingsmedium och tvätta två gånger med 300 µL av elektroporation buffert. Hålla cellerna i elektroporation buffert.
    6. Placera aluminium skäret håller ITO bilden i live-cell inkubator scenen på setup.
    7. Leta upp cellkulturen i vyn mikroskopet och välja ett område med inga celler. Närma spetsen till ITO ytan och försiktigt röra vid det, då återta den tip 100 µm och spara positionen som ”celler”.
    8. Snabbt lämna cellkulturen och spola microcapillary spetsen med några tiotals Polykarbonatet system vätska då sätta det i cellkulturen igen. Fördela några Polykarbonatet under nedsänkning i PDMS brunnen så att ingen luft bubblor är instängd på spetsen.
    9. Försiktigt närma sig ITO ytan (initialt, du måste vara på position ”celler”, dvs., 100 µm ovanför ytan). Vid kontakt, återkalla tips 10 µm.
    10. Välj en närliggande cell för Lys. Placera spetsen på microcapillary ovanför den rikta cellen.
  8. Starta makro skriptet för enskild cell Lys.
    1. Namn position i microcapillary bör flyttas till efter en cell har varit framgångsrikt lyserat. Detta kommer att vara NS reservoaren (NS-EM), en avsaltning buffert (cryo-EM) eller EM rutnätet (cryo-EM). Undvik stavfel och tryck på ”ok”.
    2. Makrot fortsätter utan åtgärder från användaren:
      1. (i) den Mikroskop scenen och cell kultur 100 µm flyttas till vänster, en ögonblicksbild av riktade cellen är tagna och 50 nL ddH2O system vätska fördelas från microcapillary. Detta förskjuter och späder ut hög salt bufferten och gäller osmotiska trycket i cellen.
      2. (II) scenen flyttas tillbaka till Placera spetsen ovanför den rikta cellen igen. Fördefinierade spänning burst tillämpas, och efter 500 ms pumpsystemet börjar aspirera 3 nL av provet med en flödeshastighet av 2 µL/min.
      3. (III) scenen flyttas till vänster igen, så att cellen ska inspekteras. Ett fönster visas, frågar efter användarindata.
    3. Säga om steget lysis lyckades eller inte.
      1. Om svaret är nej, ta över, spola microcapillary och rikta en ny cell.
      2. Om svaret är ja, en ögonblicksbild av borttagna (lyserat) cellen tas, och därefter microcapillary flyttas till plats som anges i 3.8.1. Om detta är NS eller en buffert reservoar, använda standardgränssnittet för att dosera 3 x 0,5 nL vätska medan microcapillary går att säkerställa att det inte finns några luftbubblor. Spetsen är nedsänkt i vätskan reservoar av makrot.
        Obs: Du kan fortsätta att vårda provet och förbereda rutnät som förklaras i avsnitt 1.6.9 - 1.7.9 för NS-EM eller avsnitt 2.2-2.6 för cryo-EM. Nedan förklaras gör för NS-grid förberedelse.
    4. Lämna den microcapillary nedsänkt i 8-12 min, beroende på munstycket geometri
      Obs: Högt fosfat koncentrationen i bufferten kräver en längre nedsänkningstiden för luftkonditionering.
    5. Dosera 5 nL i den luftkonditionerade cellen lysate på rutnätet.
    6. Dra tillbaka microcapillary och låt luftkonditionerade provet torra långsamt på daggpunkt scenen (DP-Stadium) reglerade 1-2° C över daggpunkten temperaturen.
    7. Ta bort nätet och förvara den i rumstemperatur i ett rutnät eller petriskål.

Representative Results

Inställningen för ”cryoWriter” utvecklades (avbildade i figur 2) för att testa de miniatyriserade EM rutnät förberedelse-förfaranden som föreslås i figur 1C, D. Figur 2 A visar en översikt över de olika komponenterna monteras på ett inverterat fluorescens Mikroskop. En cell-odling-modul installeras på vänster sida av mikroskopet; en modul för EM rutnät förberedelse ligger till höger. Modulen cell-odling (figur 2B) gör att tillväxten av vidhäftande eukaryota celler och live-cell avbildning av cellkulturen av mikroskopet ljus. Enskilda celler är lyserat av den kombinerade effekten av osmotiska chock, elektroporation och aspiration av cellinnehållet i en microcapillary (figur 2B, figur 6A)24,25. Aspirerade lysate provet kan sedan användas för att förbereda rutnät för NS - eller cryo-EM. Alternativt kan en lager protein lösning i en PCR-röret vara provkällan. Den microcapillary (figur 2B) anställd är ansluten till en hög precision pumpsystem som tillåter provvolymer vara aspirerade och doseras med sub-nL precision. Som anges i protokollen utförs alla prov inom detta microcapillary eller på EM nätet själv utan betydande prov transport. Till exempel används den samma microcapillary att lysera enskilda eukaryota celler, aspirera den lysate, villkora det och slutligen fördela alikvoter på EM rutnät. Grid förberedelse modulen består av en lös DP-steg som gör att temperaturen i rutnätet EM placeras på den för att vara exakt kontrollerad (figur 2C). För NS-TEM, kan rutnätet beredda provet sedan enkelt tas bort från den kalla scenen och tillåtas torka i luft vid rumstemperatur. Den s.k. kaffe-ring-effekter som kan sedan resultera behöver dock undvikas för kvantitativa TEM där protein 'partiklar' räknas. Att göra så, gridteknik torkas långsamt på DP-scenen med en gradvis ökande temperaturgradient för att bromsa vätskeavdunstning. För cryo-EM hålls temperaturen i rutnätet nära daggpunkten; en positiv förskjutning på ° C ungefärligt 8 är valt, att tillåta kontrollerad avdunstning av provet vätskan för tunn film stabilisering och gallring, som kan övervakas av en sensor vid behov26. Efter den valda gallring tiden, en pick-och-steget mekanism aktiveras och provet är förglasat (figur 2C). Observera att denna störta mekanism inte behövs för NS-EM elnät, som lagras i rumstemperatur.

Figure 2
Figur 2: översikt av cryoWriter installationen. A) översikt över inställningen för cryoWriter monterad på en omvänd tända-mikroskopet (1). B) infälld område anges till vänster i panelen A. Cell odlingsskålar fack (2), med en microcapillary (3) för provet manipulation och cell lysis placerad ovanför en miniatyriserade PDMS-baserade cell kultur plattan (4). C) infälld område anges på höger sida i panelen A. 'Pick-och-steget' mekanism. Ett holey carbon film EM rutnät (5) monteras mellan tips av pincett (6) och placerad horisontellt i direkt kontakt med tempererad scenen (7), kallas daggpunkt scenen (DP-steg) i huvudtexten. Steg temperaturen kontrolleras tätt via en PID-regulator och en vattenkyld Peltier-element, att hålla det vid eller nära daggpunkt temperaturen, beroende på den omgivande miljön. DP-scenen (7) är monterad på en motoriserad xy axel att flytta rutnätet i förhållande till microcapillary. Microcapillary själv kan är monterad på en z-scen och sänkas tills det är mycket nära ytan av rutnätet EM och används för att fördela nliter medelstora volymer på prov stödet som täcker den (en kontinuerlig tunt kol lager för NS-EM eller en holey carbon film för cr Yo-EM). Observera att flytande upptag och dispensering utförs med hjälp av en hög precision pumpsystem (8). Portioneras ut vätskan kan distribueras genom att flytta rutnätet i förhållande till microcapillary i ett spiralmönster. För cryo-EM förberedelse överföringar mekanismen pick-och-steget frysning (9) snabbt rutnätet prov-lastat i flytande etan (10) för snabb kylning och prov förglasning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 visar representativa resultat för NS-EM nät förberett med cryoWriter setup. Spetsen på microcapillary var lastat med 5 nL prov från en stamlösning och doppade i en reservoar av NS lösning (2% metylamin volframhaltigt) i flera minuter att möjliggöra diffus utbyte av NS och salt joner (för en teoretisk diskussion se Arnold, et Al. 24). efteråt, konditionerat provet var expedieras på tunna kol filmen av ett NS-EM rutnät och torkas. Figur 3 A visar användningen av en slot rutnät på samma sätt att visualisera komplett droplet-programmet, som krävs för kvantitativa TEM. För att undvika kaffe ring effekten, nymalen glöd-urladdat rutnätet inledningsvis hölls vid daggpunkt temperatur (inget vattenavdunstning) och sedan långsamt värmas upp på DP-scenen. Observera att för de flesta tillämpningar (t.ex., kvalitetskontroll av prov eller strukturell analys) långsam torkning processen inte behövs. Hög kvalitet NS-preparat erhålls utan det, som visas i figur 3B, C. Luftkonditionering tider för fosfatfria låg salt buffertar är runt 3 min, t.ex., med låg salthalt Tris-buffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4 med 50 mM NaCl), som visas i figur 3B använda tobak mosaic virus (TMV) som exempel. Figur 3 C presenterar en fallsituation som TMV var i PBS-bufferten (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4). Fosfat joner bildar övergående kristaller med tungmetall jonerna av NS (se figur 5C), förlänga luftkonditionering tidsåtgången (7 min). Andra tunga metallsalter kan också användas med rutnät förberedelse modul, t.ex., 2% metylamin vanadate eller ammonium molybdat (se även Arnold, o.a. 24). uranyl acetat är dock inte lämplig; crosslinking effekten av denna fläck leder till aggregat om protein provet villkoras i lösning, innan adsorption till en carbon film (se figur 5E)23.

Figure 3
Figur 3: typiska resultat för NS nät förberett med cryoWriter setup som anges i figur 1C. A) översikt bild av en 3 nL droplet expedieras på en slot rutnät efter konditionering med 2% metylamin volframhaltigt. B) TMV i 20 mM TRIS buffert. Infällt visar en 3 x förstoring av den angivna regionen. Anpassad från Arnold, et al.24 (ytterligare behörigheter relaterad till det materialet excerperats bör riktas till ACS). C) tobak mosaic virus (TMV) i PBS-bufferten. Infällt visar en 3 x förstoring av den angivna regionen. Anpassad från Arnold, et al.24 (ytterligare behörigheter relaterad till det materialet excerperats bör riktas till ACS). Skala barer: A, 100 µm, B, 50 nm. C, 80 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Typiska resultat som erhålls för cryo-EM galler förberedd med cryoWriter setup avbildas i figur 4. Panelen 4A visar ett rutnät atlas av området omfattas av förglasat provet. Panelen 4B visar enhetligheten av glaskroppen isen i en valda grid-kortplats. I båda fallen var provet i 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl buffert innehållande 0,05% Fos 14 tvättmedel. Många prover och buffertar testades och en jämförbar hög kvalitet glaskroppen is erhölls, men villkoren är buffert beroende (se också diskussionen i figur 5). Panelen 4C visar apoferritin partiklar och en bacteriophage i Tris-HCl buffert (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7,4) avbildas på hög oskärpa att öka kontrasten. 4D visar en 200 kDa membranprotein stabiliseras av amphipoles.

Figure 4
Figur 4: typiska resultat för cryo-EM nät förberett med cryoWriter setup som anges i figur 1D. Proverna och buffertar varierar i exemplen. Alla prover var lastade på holey kol filmer. A) Collage av översiktsbilder (”grid atlas”) av ett prov som innehåller en 150 kDa membranprotein, peripheryen av glaskroppen isen indikeras med vita pilar. B) förstorad rutnät slot från ett rutnät som tillagas med samma bufferten, visar holey kol filmen med glaskroppen is. Några hål fylls inte med provet buffert som anges med vita pilar. C) Carbon hål med förglasat prov innehållande apoferritin proteinkomplex och bakteriofager. Infällt: dubbla utvidgningen visar svansen av en bacteriophage. Den vita asterisken anger carbon filmen. Observera att bilden spelades med hög oskärpa att öka kontrasten. D) A 200 kDa membranprotein beredas i amphipols. Infällt: en 2 x förstoring av regionen anges visas med ökad kontrast. Skala barer: A, 100 µm, B, 10 µm; C och D, 80 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

CryoWriter inställningen tillåter systematisk screening för EM-grid förberedelse optimala; ett exempel visas i figur 5A (apoferritin i 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). I detta experiment, glaskroppen isen ”gallring” temperatur var varierade, men gallring tiden (dvs, tid klyftan mellan exempelprogrammet och plunge frysning) förblev konstant (1 s). Offset temperaturer (t.ex., 8 K) ska var prov lagret för tjock. Vid högre offset temperaturer, glaskroppen isen i hålen var tunnare (10 K, 12 K), tills i något skede (över 18 K) rutnätet blev helt torra (inte visas). I resultatet presenteras här, en förskjutning av 12 K leder till ett stort homogent område av glaskroppen is som indikeras av de svarta pilarna. Sådan optimering experiment kan utföras med bufferten av det riktade urvalet med hjälp av ”testa” proteiner (såsom apoferritin). De bästa förutsättningarna hittade tillämpas sedan det riktade urvalet. Dessutom rutnät med parametrar långt ifrån optimalt kan ofta kännas igen under förfarandet för utarbetandet och behöver inte kontrolleras i elektronmikroskopet, betydande tidsbesparing. Figur 5 visar också ett galleri av typiska cryo-EM (Panel B) och NS-EM (paneler C-e) artefakter specifika till cryoWriter setup. Cryo-EM rutnätet visas i panelen 5B med TMV i PBS som innehåller 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4, 0.1%DM) var överdrivet förtunnas. Bakgrunden av bilden är grynig eftersom Saltkoncentrationen blev för hög. I allmänhet, verkar det visuella utseendet av ett prov inte vara en linjär funktion av den salt koncentrationen; korn blivit plötsligt framträdande när en tröskelkoncentration nås under gallring processen. Observera att oönskade ämnen kan tas bort genom en luftkonditionering steg före rutnät förberedelse, som beskrivs för NS-EM i protokollet avsnitt 1.6. NS kan orsaka andra artefakter. I exemplet som visas i panelen 5C PBS-bufferten (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) utan provet var luftkonditionerade i 2% metylamin volframhaltigt för 3 min. fällningar och kristaller är uppenbart och utövar omfattande styrkor på kol ytan vilket leder till sprickor. Formuläret fällningar bara i en viss PBS och NS koncentration varierar och kan undvikas genom konditionering provet för längre (jämför figur 3C). 5D visar peripheryen av en dispenserad NS prov droplet uppvisar en ”kaffe ring”. Detta skulle störa kvantitativa, totalt provanalys och kan undvikas genom att bromsa torkningen, dvsgenom att hålla EM rutnätet på dagg pekar temperatur under exempelprogram, och sedan gradvis höja temperaturen för att torka den) (se figur 3A). Panelen 5E (apoferritin i 20 mM HEPES pH 7,0, luftkonditionerade 3 min) visar aktiviteten crosslinking av 2% uranyl acetat fläcken, som inte kan användas till skick protein prover innan de adsorberas till carbon film stöder.

Figure 5
Figur 5: systematiska förändringar och artefakter observerats när cryoWriter set-up användes att förbereda rutnät för NS - och cryo-EM. A) systematiska glaskroppen is tjocklek variation; optimering av rutnät förberedelse för cryo-EM. Offset temperaturen på DP-scenen var varierad (8 K till 12 K) att hålla gallring tidskonstanten (1 s). Pilarna anger i periferin av lagrets provet. B) Salt effekter; alltför starkt koncentrerade, var dvsdet gallring steget långt. Infällt skildrar en 2 x förstoring av den angivna regionen. C) Salt fällningar bildas av PBS-bufferten i närvaro av tunga metallsalter. Prover som innehåller PBS-bufferten måste konditioneras längre än prover i andra buffertar. Här, var PBS-bufferten utan provet luftkonditionering i 2% metylamin volframhaltigt för 3 min, en typisk tid för andra prov buffertar. Observera sprickan i carbon film troligen på grund av de starka krafterna från de fällningar som agerar på tunna stöd under torkningen. D) 'Kaffe ring' effekt. E) Apoferritin luftkonditionerade i 2% uranyl acetat för 3 min. Uranyl joner uppvisar betydande crosslinking aktivitet och apoferritin kluster form stora aggregat. Skala barer: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De små belopp och volym krävs för EM rutnät förberedelse med cryoWriter setup gör att nya typer av experiment. Till exempel kan totala innehållet i en cell samlas och förberett för NS - och cryo-EM. Förfaranden som anges i figur 6A. En vidhäftande, eukaryota cellen (HEK 293) är lyserat av samtidiga elektroporation och prov aspiration (Panel 6A)25. En total volym på 3 nL är aspirerade, som innehåller cellen lysate och behålls i microcapillary för vidare bearbetning. För de NS-EM visas i panelen 6B, utbyttes det cell-odling mediet med PBS-bufferten (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) före cellys. Innehållet i cellen var aspirerade i 3 nL buffert och luftkonditionering i en reservoar av NS som anges i figur 1C för 10 min. efteråt, en 5 nL-volym var förpackat på kontinuerlig kol filmen av ett NS-EM rutnät. Enskilda proteiner, t.ex., fintrådiga aktin och membran fläckar med bifogade proteiner kan kännas igen i bilden. För den cryo-EM, visas i figur6 C, en volym 3 nL var förpackat på ett holey kol EM rutnät utan förnyad strävan att ta bort vätska. Relativt tjocka filmen av provet bildas var i stor utsträckning tunnas innan förglasning. För att göra detta, höjdes DP-steg temperaturen gradvis, start vid daggpunkt temperatur. Gallring processen övervakades av ett realtidssystem sensor-tills en förspecificerad tröskelvärdet nåddes utlösa 'pick-och-steget' mekanismen och prov förglasning (för detaljer se Arnold, o.a. 26). membranstrukturer och proteiner kan kännas igen i bilden.

Figure 6
Figur 6: Single cell visuella proteomik med cryoWriter set-up. A) lys av en vidhäftande eukaryotisk cell. Cellen odlas (1, grön) på ett functionalized, ITO belagd (röd)-glasskiva (2) i en miniatyriserade petri-skålen (3)25. ITO lagret är jordade. Cellen är kontaktad av den microcapillary (4), som är belagda med platina. En inledande osmotiska chock (inte indicerat) ges att underlätta Lys, som utförs genom en serie av elektriska pulser och de skjuvning krafter som utövas under aspiration av cellen lysate. Processen kan övervakas genom ljusmikroskop; mål lins mikroskopet är indicerat (5). För detaljer, se vår tidigare arbete24,25. B) NS-EM bild av lysat från en enskild HEK 293-cell. Trådformiga aktin och membran fläckar med bifogade proteiner är synliga. Panelen anpassad från Arnold, et al.24 (ytterligare behörigheter relaterad till det materialet excerperats bör riktas till ACS). C) Cryo-EM bild av lysat från en enskild HEK 293-cell. Infällt visar en 2 x förstoring av den angivna regionen där typiska membranstrukturer med associerade proteiner syns. Panel C anpassad från Arnold, et al. 26 skala barer: B, 50 nm. C, 80 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

'CryoWriter' instrumentet och de protokoll som krävs för att förbereda prov rutnät för NS - och cryo-EM från nL storlek totala provvolymer och helt undvika det klassiska papper-blotting steget presenteras. Mikroflödessystem principer och en mikromekaniska system kombineras i cryoWriter att göra detta möjligt.

Vår erfarenhet visar att när de miniatyriserade metoder som presenteras i detta manuskript används parametern utrymmet för EM-grid förberedelse är större än för klassiska metoder och under hårdare användarkontroll. Viktigast av allt, gör ökad reproducerbarhet uppnås det möjligt att förhandsgranska med prov buffertsystem, kompletteras med en lättillgänglig test protein, att avgöra de optimala parametrarna innan själva experimentet utförs. Detta håller förbrukningen av provet av intresse till absolut minsta och rekommenderas starkt. Kritiska steg för båda NS - och cryo-EM rutnät beredning är: (i) Priming av pumpsystemet. för sub-nliter volym dispensering, måste systemet vätska (vatten) avgasade och bubble gratis. (ii) exakt kontroll av glöd eller plasma rengöring steg; rutnätet EM ytan egenskaper är avgörande för reproducerbara resultat. (iii) prov luftkonditionering; den tid som krävs för luftkonditionering, t.ex., med NS, beror på bufferttyp, salthalt och koncentration (figur 3), samt på munstycket geometri av den microcapillary24. (iv) avdunstningen för NS-EM förberedelser för kvantitativa EM; kaffe-ring effekten kan förbjuda kvantitativ analys av NS-EM förberedelser och måste undertryckas av långsam avdunstningen som kontrolleras av DP-scenen.

Olika aspekter av presenterade rutnät förberedelse metoder kan kombineras fritt möjliggör utveckling av mångsidiga protokoll för specifika prover. Typiska exempel skulle vara borttagning av en substans som hindrar högupplösta EM, t.ex., glycerol, av en luftkonditionering steg före rutnät förberedelse för cryo-EM; införandet av medlare molekyler, såsom ligander, av konditionering innan gallren är beredda; eller undersökning av enstaka cell lysate av NS - eller cryo-EM (figur 6).

Användning av mikrofluidik och minimal prov beloppen i de presenterade metoderna tar helt bort behovet av papper-analys steg. Detta är en stor fördel, eftersom papper blotting är en hård behandling för proteiner, potentiellt kontaminerande provet med oönskade joner och sin natur leder till massiv prov förlust. Effekter som eventuellt orsakas av luft-vatten gränssnittet för den tunna prov film bildas när cryo-EM prover är beredda på klassiskt sätt undviks däremot, inte när cryoWriter används. Galler passar cryo-EM kan förberedas med en mindre än 0.2 s väntetiden mellan exempelprogrammet och förglasning (inga data anges). Men när proteiner reser några tiondelar av en nanometer i några nanosekunder genom diffusion, finns det fortfarande tillräckligt med tid för dem att kollidera med luft-vatten gränssnittet för en 100 nm tjockt prov film flera gånger. Men mängden proteiner klibbar till luft-vatten-gränssnittet kan minskas betydligt genom dessa kort tid luckor och kan hindra protein denaturering eller begränsas partikel orientering. En annan lovande metod som kan skydda känsliga proteiner från luft-vatten-gränssnittet är att täcka prov filmen av lågmolekylära ytaktiva ämnen. Dessa föreningar kan införas snabbt av en luftkonditionering steg i cryoWriter innan grid förberedelse. Hög yta till volym förhållandet mellan mikroflödessystem system är en ytterligare begränsning av cryoWriter, som prov kan potentiellt förloras genom ospecifikt adsorption till microcapillary ytan och störa kvantitativ analys av partikelräkning. Problemet behandlas i två sätt: för det första provet inte resa långa sträckor inom microcapillary. Faktiskt förblir nliter provvolymen vid kapillär spets under hela behandlingen. Andra ytan att volymförhållandet reduceras ytterligare genom att använda microcapillaries med relativt stora inre diametrar, t.ex., 180 µm. tredje, ytbehandlar av microcapillaries kan vara enkelt passiviseras vid behov, t.ex., genom att behandla dem med kommersiellt tillgängliga polylysine etanol glykoler (PLL-PEG).

Den högupplösta analysen av proteiner av den enda partikel-metod som används i EM kräver endast 100.000 till några miljoner bilder av enskilda protein partiklar. Detta innebär att mikroflödessystem tekniker kan ge tillräckligt proteinkomplex för strukturella undersökningen. En miniatyriserade immuno-nederbörd metod för snabb isolering av proteinkomplex (cirka 1 timme) från minimal cell belopp (ca 40.000 celler) utvecklades tidigare28. Denna metod kommer nu kopplas direkt till förberedelsestadiet miniatyriserade prov av cryoWriter. Det slutliga målet är att utveckla en integrerad mikroflödessystem pipeline för ultrasnabb protein isolering och cryo-EM rutnät beredning som kräver mindre än två timmar sammanlagt. Dessutom framgår av figur 6, minuten mängden och mängden material som behövs för provberedning och nästan lossless luftkonditionering och rutnät arbetsgången uppnås med hjälp av cryoWriter, gör det möjligt att studera proteinet komplex av enskilda celler. Tillsammans, lägga metoden miniatyriserade immuno-nederbörd och cryoWriter grunden för en ny proteomik metod som kallas ”enda cell visuella proteomics”, som vi nyligen visat för heat-shock experiment24. Data analys algoritmer inriktad på analys av ”visuella proteomik” bilder är för närvarande testas.

Disclosures

Författarna Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg och Thomas Braun deklarera följande konkurrerande ekonomiska intressen: cryoWriter konceptet är en del av patentansökan PCT / EP2015/065398 och EP16194230.

Acknowledgments

Författarna vill tacka seminariet av Basels av universitetar Basel för deras stöd, S. A. Müller för kritiska diskussioner och noggrant läsa manuskriptet, A. Fecteau-LeFebvre för tekniskt bistånd med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann för membranprotein testa prover (alla från C-CINA, Basels, universitetar av Basel) och A. Engel, emeritus universitet Basel för sitt inspirerande samtal. Proverna var vänligen tillhandahållen av s. Ringler, M.-A. Mahi, och T. Schwede (Basels, universitetar av Basel), P. Leiman (laboratoriet för strukturbiologi och biofysik, EPFL) och R. Diaz-Avalos (New York strukturell biologi Center, USA). Projektet stöddes av schweiziska nanovetenskap Institute (SNI, projektet P1401, ARGOVIA projekt MiPIS) och schweiziska National Science Foundation (SNF, projektet 200021_162521).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liquid handling
Microcapillary tip New Objective FS360-100-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
FS360-150-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve New Objective CONGAS-1  Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing BGB-Analytik TSP-150375 TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector BGB-Analytik 2525LD Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 
Syringe 10 µl BGB-Analytik HA-80001 Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included) 
Syringe pump controller Cetoni A3921000093 neMESYS controller
Syringe pump dosing unit Cetoni A3921000095 neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor Meltec UFT75-AT Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor Sensorshop24.ch LS7-PT1000-1.0-3L Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller Cooltronic TC2812  PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element Distrelec.ch PE-127-14-15-S 40x40 mm
Water-cooling block - - Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump Digitec.ch 294877 XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block - - Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers PCHC.ch 223050 Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements Distrelec.ch PE-031-10-15-S Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis Dyneos AG M-404.2PD High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller Dyneos AG C-863 Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage Prior Scientific H117EIL5 Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets Supermagnete S-05-08-N Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet Schramme EG1025A02/110 Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet Conrad.ch MST-1630.001 7 Electromagnet control PCB board
Solenoid hub Distrelec.ch HD8286-R-F-24V100% Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers Electron Microscopy Sciences 0302-M5S-PS Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts Thorlabs - -
Various mechanical parts Workshop Biozentrum, University Basel - Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode Thorlabs CPS780S 780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector Thorlabs PDA100A-EC Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM emsdiasum.com DTF-03523 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS Sigma D8537 SIGMA Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2% nanoprobes.com Negative stain vanadium based
NanoW 2% nanoprobes.com Negative stain tungsten based
Software
openBEB The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin) Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrandt, W. Biochemistry: The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  3. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  4. Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).
  5. Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. , (2010).
  6. Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. Electron gun using a field emission source. Rev Sci Instrum. , (2003).
  7. Zemlin, F. Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy. Micron. 25 (3), 223-226 (1994).
  8. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  9. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  10. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat methods. 10, 584-590 (2013).
  11. Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).
  12. Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy. J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).
  13. Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors. J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).
  14. Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  15. Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. Processing of Cryo-EM movie data. Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).
  16. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  17. McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy. J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).
  18. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  19. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  20. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  21. Glaeser, R. M. How good can cryo-EM become. Nat Methods. 13, 28-32 (2016).
  22. Engel, A. in . Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).
  23. Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. Connecting µ-fluidics to electron microscopy. J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).
  24. Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy. ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).
  25. Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).
  26. Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).
  27. Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).
  28. Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).

Tags

Biologi fråga 137 elektronmikroskopi cryo negativa fläcken mikrofluidik prov luftkonditionering visuella proteomik single-cell lysis
Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S.… More

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter