Summary
今回ライブ イメージング総合筋腱の形態形成における発達過程の特に生活を実行する簡単に使用できる、汎用性の高いメソッドショウジョウバエ蛹。
Abstract
腱と骨格筋は、体の部分を移動する人間を含む動物を有効にします。筋肉の形態形成は、人間を動物から保存性が高い。したがって、筋生物学にも適用することができます筋肉腱の開発の概念を勉強する強力なショウジョウバエモデル システムを使用できます。ここで述べる生活、大人の筋腱系の形態形成を簡単にイメージできる方法ショウジョウバエ蛹を開発します。したがって、メソッドは、タンパク質、細胞、組織の生理学的な環境での調査ができます。役に立つヒントと手順プロトコルに加えて筋腱のシステムを勉強に適している蛍光タグのマーカー蛋白質の包括的な概観を提供します。例の映画長期形成イベントの可視化に至る-時間と筋肉のけいれんのような短期的な動的プロセスの可視化へ-日の時間スケールで発生しているを示すプロトコルの用途を強調するには秒の時間スケールで発生しています。一緒に取られて、このプロトコルを設計し、そのまま体内の筋腱の形態を調査するためライブ イメージング実験を行うには、読者を有効にします。
Introduction
筋腱の装置には、体の部分を移動する人間を含む動物ことができます。筋腱のシステムの分子ブロックは非常に節約されます。したがって、ヒトの筋生物学、筋肉の形態形成、筋腱の添付ファイル、原自己組織化などに関連する筋腱の開発の概念は、ショウジョウバエを使用して、簡単にアクセスできるように学ぶことができます。モデル系。ショウジョウバエの蛹のシステムには、いくつかの実験的利点があります。まず、蛹の段階では-大人の筋肉が形成される-生物は無柄、つまり、簡単に数時間あるいは数日の期間の顕微鏡画像します。第二に、多くの筋肉フォームは蛹の表面の下に十分なを閉じて、そのまま、部分的に半透明の生物の内部イメージを作成することができます。第三に、筋肉は、腱細胞を介して形成外骨格に接続されている、組織の緊張を造り上げ、自然の環境で調べることができます。これは筋肉細胞培養システムで可能ではありません。そして最後に、遺伝的ツールの茄多はショウジョウバエで利用可能。これらの中で、特定の細胞型または生体内イメージングのための細胞レベル下の構造のラベルを付けることができる多くの蛍光タグ マーカーです。
表 1には、筋腱の形態を研究するために使用される最も重要なマーカーがまとめたものです。それは GAL4 UAS システム1を使用して過剰に発現マーカーが含まれています、内生的タグ付きタンパク質マーカー2,3,4。GAL4 UAS システムの利点は、マーカーが全体マウント蛹で簡単にイメージを作成することができます強力な信号で、高レベルで一般に表されることです。さらに、組織特異性は、GAL4 ドライバーを慎重に選択することによって実現できます。内因性制御の下で表現の融合蛋白質の利点は、彼らはまた異なる種類の細胞の特定の細胞内構造マーカーとして使用ができますそれぞれ蛋白質のダイナミクスが,生体内で、することができますたとえば、します。筋肉の付着部位の GFP βPS インテグリン一緒に、これらのマーカーは、実験的なデザインと今と将来に解決できる研究課題の選択に高い柔軟性を提供します。
| ラベルの付いた構造 | マーカー | 式とローカライズ | クラス | 在庫数 | コメント | Ref。 | ||||||
| 筋肉 | Mef2-GAL4 | すべて芽細胞とすべての段階ですべての筋肉 | GAL4 ライン | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | 大人の筋前駆細胞と ≈24 h APF まで初期であります。 | GAL4 エンハンサー トラップ系統の行 | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | 筋分化をジャンプします。 | GAL4 ライン | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | 間接飛翔筋 14 h APF を開始 | GAL4 ライン | - | 7 | ||||||||
| Act88FCameleon 3.1 | 間接飛翔筋 14 h APF を開始 | Act88F エンハンサー/プロモーター駆動 Cameleon 3.1 | - | Ca2 +インジケーター | 8 | |||||||
| Act88F GFP | 間接飛翔筋 14 h APF を開始 | GFP 融合 (フライライン TransgeneOme) | fTRG78 と fTRG10028 | 4 | ||||||||
| 彼は nls GFP | 大人の筋前駆体、原子力、間接飛翔筋の ≈24 h APF まで | エンハンサー/プロモーター nls GFP レポーターと | - | 1.5 kb エンハンサー フラグメント | 9 | |||||||
| Mhc-タウ-GFP | 微小管の DLM テンプレートや筋肉を区別します。 | エンハンサー/プロモーター タウ GFP レポーターと | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D GFP | (例えば、14 h ≈48 h APF 以降後減少を強く AFP から間接飛翔筋) である微小管 | GFP 融合 (フライライン TransgeneOme) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| Mhc GFP (weeP26) | (例えば、間接飛翔筋 ≈30 h APF から始まって) すべての体の筋肉のサルコメア (太いフィラメント) | GFP トラップ | - | ヘテロ接合体を使用して、ラベルのアイソ フォームのサブセット | 11 | |||||||
| Sls GFP | (例えば、間接飛翔筋 ≈30 h APF から始まって) すべての体の筋肉のサルコメア (Z ディスク) | GFP トラップ (ハエトリソウ線) | - | G53、ヘテロ接合体の使用 | 2 | |||||||
| Zasp66 GFP | すべての体の筋肉の Z ディスク | GFP トラップ (ハエトリソウ線) | BL 6824 | ZCL0663 | 2,12 | |||||||
| Zasp52 GFP | すべての体の筋肉の Z ディスク | GFP トラップ (ハエトリソウ線) | BL 6838 | G00189 | 2,12 | |||||||
| Hts GFP | アクチン結合;乏しく、筋芽細胞上皮で表現 | GFP 融合 (フライライン TransgeneOme) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1 GFP | 接合上皮細胞、筋芽細胞とすべての段階で筋膜 | GFP 融合 (フライライン TransgeneOme) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| 筋肉の添付ファイルのサイト | ΒPS-インテグリン-GFP | 筋付着部位 (例えば、開始 ≈18 h AFP 間接飛翔筋) | GFP ノックで | - | 13 | |||||||
| タリン GFP と -mCherry | 筋付着部位 (例えば、開始 ≈18 h AFP 間接飛翔筋) | GFP トラップ (模倣線) | - | 3 | ||||||||
| タリン GFP | 筋付着部位 (例えば、開始 ≈18 h AFP 間接飛翔筋) | GFP 融合 (フライライン TransgeneOme) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| 同類 GFP | 筋付着部位 (例えば、開始 ≈18 h AFP 間接飛翔筋) | GFP トラップ (ハエトリソウ線) | 京都 110951 (ZCL3111) | ZCL3111、ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc GFP と RFP | 筋付着部位 (例えば、開始 ≈18 h AFP 間接飛翔筋) | GFP 融合 (遺伝子) | - | 13 | ||||||||
| 腱 | sr-GAL4 | 胸郭の腱細胞、蛹の段階で | GAL4 エンハンサー トラップ系統の行 | BL 26663 | ホモ接合体致死 | 14 | ||||||
| 筋肉と腱 | Duf-GAL4 | 筋肉、上皮、早期発症 | GAL4 ライン | BL 66682 | kirre-rP298、創始者細胞のマーカー | 15 | ||||||
| UA-レポーター | UA- GFP Gma | アクチン結合 | UAS ライン | BL 31776 | GFP の融合モエシンのアクチン結合ドメイン | 16 | ||||||
| UA- mCherry-Gma | アクチン結合 | UAS ライン | - | Gma の融合 mCherry | 17 | |||||||
| UA-Lifeact GFP | アクチン結合 | UAS ライン | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UA- Lifeact ルビー | アクチン結合 | UAS ライン | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UA-CD8-GFP | 膜結合 | UAS ライン | 様々 な株式、例えば: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UA-CD8-mCherry | 膜結合 | UAS ライン | BL 27391 と 27392 | 20 | ||||||||
| UA-ヤシ-mCherry | パルミトイル化反応によって膜結合 | UAS ライン | BL 34514 | UAbrainbow | 21 | |||||||
表 1: 蛍光タグ勉強して筋腱形態体内に適した蛋白質のマーカー。
我々 は詳細に説明ここでは、簡単かつ成功した生活の蛹の筋腱の形態形成のイメージングを実行する方法 (図 1)。また、蛹を固定することができます、解剖、immunostained 抗体を用いたタンパク質マーカーがないライブにもラベルを付けることができますが利用可能な22。この場合、動きがないと興味の構造を coverslip の近くに配置できるので、画像の品質は一般的に高い。しかし、郭清と固定が損傷し、分子につながることができます。 または組織ダイナミクス、たとえば、筋肉のけいれんは、生きている有機体で学ぶことができます。
Protocol
1. ステージ蛹
- 20-40 の処女の女性と (図 1 a) フライ食品のボトルあたり約 20 男性でクロスを設定します。また、株式を使用する場合は、新しい革袋に各株を反転します。十分な蛹を取得、遺伝子あたり 2 本の設定を検討してください。
- 5 ~ 6 日 (図 1 b) は 25 ° C (または実験デザインによると 27 ° C) でボトルを孵化させなさい。
注: に混雑を避けるため、蛹の連続的な供給を確保するためは、すべて 2 〜 3 日ハエを反転を維持します。 - ウェット ブラシを使用して、ボトルの壁から白い前蛹を収集し、ガラス スライド (図 1) に転送します。蛹は、目的に到達するようにステージングを時間顕微鏡イメージングを起動するときの年齢します。
注: これらの前蛹のように古い蛹の形状が彼らがまだ白い幼虫のよう。前ステージの発症は、蛹殻形成過程 (0 h APF) 後 0 時間として定義されます。 - 湿式ブラシ蛹にこだわってはえの食糧の塊を削除し、実体顕微鏡 (図 1) を使用してスライド ガラスに向かって蛹の腹側を向き。蛹をまだ (若すぎる) 移動または茶色にし始めていることを破棄 (古すぎる)。これはすべて蛹が同じ年齢 (0 ~ 1 h APF) を持っていることを保証します。
- コレクションの遺伝子型、日時、スライドにラベルを付けます。各 1 つのペトリ皿にスライド ガラスを転送し、(図 1E) 乾燥から蛹を防ぐために濡れたティッシュを追加します。
- 希望の年齢に到達するまでは、25 ° C または 27 ° C でインキュベーターで蛹を格納します。1 h を画像、前に次の手順に続行、蛹がある目的 13 h APF図 2A-Dの映画で、例えばライブ イメージング (ステップ 3) を開始するときの年齢します。
注: 27 ° C で 8-10 h APF で発生した蛹の頭裏返し後、最も早く可能な開始時点が
2. 画像の蛹を準備します。
- 同じように彼らは当然のことながら残留はえの食糧のためボトルの壁に固執場合に、蛹は今スライド ガラスにスティックを確認します。余分な接着剤は不要です。蛹は、高湿度のために十分によく付着しない場合、は、乾燥させる、いくつかの分のシャーレを開きます。また、スライド ガラスに両面テープに転送が、通常、これは必要ではありません。
-
間接飛翔筋のイメージングの蛹のケースで開いているウィンドウ(1 階の図;腹部の筋肉のイメージングの 2.3 に進んでください。)
- 顕微鏡下で研究員から前方向きにスライド ガラスに付着蛹に合わせます。2 倍にズームを調整します。
- #5 鉗子を優しくグレード生物学の一方の端を使用して蛹腹部が終了翼背側のケースに穴を突くし、胸郭を開始。
- 蛹のケースを開いてスライス、優しく翼に沿って胸部の前方の端に鉗子を移動が脆弱な翼の組織の損傷を防ぐ。
注: 場合蛹から液が漏れ、それが破損しています。それを破棄し、異なる蛹でやり直します。 - 鉗子と胸郭上蛹の例のセクションを持ち上げて、背側正中線上の反対側に鋭く、とがったハサミをこのセクションを切断します。
-
腹部の筋肉のイメージングのための蛹のケースで開いているウィンドウ(図 1)
- 顕微鏡下の研究者に向けての前方にスライド ガラスに付着蛹に合わせます。2 倍にズームを調整します。
- #5 鉗子を優しくグレード生物学の一方の端を使用して胸郭が終了翼背側の蛹のケースに穴を突くし、腹部を開始。
- 蛹のケースを開いてスライス、やさしく腹部の後端に向かって鉗子を移動します。
注: 場合蛹から液が漏れ、それが破損しています。それを破棄し、異なる蛹でやり直します。 - 鉗子と腹部上蛹の例のセクションを持ち上げて、背側正中線上の反対側に鋭く、とがったハサミをこのセクションを切断します。
-
マウントの蛹(図 1 H)
- 濡れたブラシを使用して、(カスタム、再利用可能な参照してください議論および材料のリスト) の溝にプラスチック製のスライドに最大 5 つの蛹を転送します。溝の深さと蛹の厚さに応じてそれぞれの側に 1 つまたは 2 つのスペーサー coverslips を追加します。スライドに固執し、溝とスペーサー coverslips 間それぞれの側にいくつかのスペースを残すように各スペーサー coverslip の下に水の小滴を置きます。
注: スペーサー coverslips も完全に可能のスーパー接着剤を使用してスライドを事前に。 - 蛹は、蛹のケースの開口部に上向きにブラシを使用して直面しているがように回転します。良い画像品質の正しい角度で蛹の注意位置決めを確認します。各組織および発達の時間ポイントの角度を最適化します。
注: 少量の溝に水が簡単に蛹の位置決め。溺死を避けるためにその後ブラシで余分な水を排出します。 - それらに触れることがなく蛹上記 coverslip (18 x 18 mm) を保持します。小さな水滴 (0.5 μ L) 約 50% のグリセロール溶液 20 μ L ピペットを使用して coverslip に蛹の都度に配置します。
注: この手順により、液滴は蛹と同じ間隔をあります。 - Coverslip を裏返して、蛹や蛹の横にスペーサー coverslips に、coverslip の片側を休んでいる間 (標準 #5) 鉗子を使用して手で上に配置します。次に、蛹に coverslip をゆるやかに降下します。蛹ケース開口部が良好な画像品質と蛹が乾燥するを防ぐために 50% のグリセロールで適切に覆われているを確認します。
- 粘着テープの部分の 1 つの端を折り、その端鉗子 (標準 #5) でそれをつかみます。それはトップの coverslip、スペーサー coverslip(s) および 1 つの側面にプラスチック製のスライドの 1 つのエッジをカバーするように、テープをそっと置きます。押さないでテープ、まだ。まず、スライドの向きを変えるし、反対側に繰り返します。
- 両側同時にテープを押す両手の人差し指を使用します。この手順により、蛹が転置されません。
- 蛹がよく、coverslip と接触しているかどうかを確認します。最適な画像品質のため、coverslip の下に蛹を優しく圧迫する必要があります。必要に応じてスペーサー coverslips 数を調節します。
- スライドをラベル粘着テープに書き込みをします。
- 濡れたブラシを使用して、(カスタム、再利用可能な参照してください議論および材料のリスト) の溝にプラスチック製のスライドに最大 5 つの蛹を転送します。溝の深さと蛹の厚さに応じてそれぞれの側に 1 つまたは 2 つのスペーサー coverslips を追加します。スライドに固執し、溝とスペーサー coverslips 間それぞれの側にいくつかのスペースを残すように各スペーサー coverslip の下に水の小滴を置きます。
3. ライブ蛹のイメージング
- 取り付け方法 (図 1I) 倒立顕微鏡と正立顕微鏡 (図 1 j) の両方蛹のイメージングが可能します。特に、共焦点顕微鏡、2 光子顕微鏡、彼らが反転されているかどうかに関係なく回転ディスク共焦点顕微鏡をスキャン ライブ イメージングに適したまたは直立しました。長期的な映画が、温度制御の段階が使用されます。
- 眼と紫外線ランプまたは透過光を使用して、サナギとサナギの内部フォーカスを探します。
- カメラを使用して、目的の構造を見つけるし、ズーム レベルを調整します。
- 長期的な映画、興味も (間接飛翔筋、その添付ファイルをサイト、腱細胞または前述の組み合わせなど) の構造を含む z スタックを定義し、時間間隔を選択します。優れた画像品質の平均化を行うことを検討してください。高速、短期的な映画、高フレーム レートを達成するために 1 つの z 平面を選択します。
- 最良の信号が少し彩度を与えるためのレーザー出力を調整します。ただし、あまりにも高いレーザー パワーが時間をかけて蛹につながります。
- イメージングを開始、随時映画をチェックし、必要に応じて z スタックの位置を再調整に戻ります。
図 1:ショウジョウバエ蛹の筋腱の形態形成のライブ イメージングのためのワークフロー 。詳細についてはプロトコルを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Representative Results
イメージ体内のハエの蛹、大人器官の形態形成の研究に理想的なモデル システムを作るそれらの開発に様々 な組織ができます。これらのうち、間接飛翔筋、腱細胞を含む胸部上皮、翼上皮、腹部の筋肉と心臓22,23,24,25,26,27します。 ここでは、筋肉や腱の形態のライブ イメージングに着目。間接飛翔筋や腹部の筋肉の形態形成とショウジョウバエ筋生物学を勉強するための追加のメソッドの詳細については、我々 は Weitkunat、いそうろう 2014年22に読者を参照してください。
間接飛翔筋のライブ イメージング
留学 dorsolongitudinal 筋肉 (DLMs) や卵割の筋肉 (獣医師向け) に GFP (UA-GFP-Gma) 球状モエシン アクチン結合ドメインのタグから成る間接飛翔筋の長期的な開発はすべてに表現されました。心筋増強因子 2 (Mef2)を使用しての筋肉-GAL4 ドライバー (図 2 a-d、映画 S1)。イメージング前、蛹の場合ウィンドウは図 1 fに示すように、胸郭上開かれました。2 光子顕微鏡 z スタック蛹殻形成過程 (11 h APF) 後 ≈11 h から始まる 21 時間 20 分毎に買収されました。この時期、DLMs に (図 2 aでオーバーレイをグリーン'-D') 腱細胞 (図 2 a) に添付ファイルを開始し、一方、中高年の筋肉の添付ファイル (図 2 b) を分割します。次に、最終的に 30 h APF (図 2 D) で最大限に締固めの段階に達するまで、乏しくは (図 2) を短きます。一緒に取られて、この映画は、時間のタイム スケール上で発生する筋群の形態の劇的な変化を強調表示します。
図 2: 間接飛翔筋および腱の損傷形態のイメージングのライブします。(A ~ D)時間Mef2を用いた 2 光子映画 (映画 S1) からポイント-GAL4、UAS- GFP-Gma dorsolongitudinal 筋肉から成る間接飛翔筋アクチンのマーカーとして (Dlm で緑色で強調表示 '-D') と背の筋肉 (メモリサーバ、A に青色で強調表示 '-D')。スケール バーは、100 μ m の範囲(E H)時間からポイントDufを用いた 2 光子映画 (映画 S2)-GAL4、UAS-CD8-間接飛翔筋の腱細胞を含む胸部上皮マーカーとして GFP。パネル E'-H' 筋肉 (緑) と接触して腱上皮 (マゼンタ) によって形成された長い携帯電話の拡張子を強調表示各時点で筋腱のシステムのモデルをオーバーレイを表示します。スケール バーは、100 μ m (イメージ構造のサイズから推定) です。(私は-L)筋腱の添付ファイルの開始に焦点を当て、2 色回転ディスク共焦点ムービー (映画 S3) からポイントを時間します。腱細胞がsr付け-GAL4、UAS-ヤシ-mCherry (マゼンタ) と dorsolongitudinal の間接飛翔筋のMhc-タウ GFP (緑) と。スケール バーは、10 μ m. 時間として示される hh:mm 蛹殻形成過程 (APF) の後。温度制御の段階に買収されたすべての映画、発生時期発散したがって、ことに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
同時に腱や筋の形態を研究するため膜結合型 GFP (UA-CD8-GFP) を使用して表現されたDumbfounded (Duf)-、腱細胞と間接飛翔筋 (図 2 e の両方に表現されるドライバーとして GAL4 -H で、映画 S2)。Z スタックは 20 時間 16 h APF から 20 分毎、2 光子励起顕微鏡で撮影されました。乏しくコンパクトながら (図2 e の緑のオーバーレイ'-H')、腱細胞とともに細長いフォーム長い細胞拡張機能 (図2 e マゼンタ オーバーレイ'-H')。一緒に取られて、この映画は、腱と筋肉細胞体内間の近い相互作用を強調表示します。
筋腱の相互作用の詳細を調べるためには、2 色、高倍率のイメージングを行った.ミオシン重鎖 (Mhc)と蛹-タウ-DLMs とUASの GFP パルミトイル-mCherry (UA-ヤシ-mCherry) によって駆動されるストライプ (sr)-腱の GAL4 は回転する円盤上で 4.5 時間 12 h APF から 5 分ごとをイメージしました共焦点顕微鏡 (図 2I-L は、映画 S3)。12 h で APF、乏しくは彼らのヒント (図 2 i) で長い糸状を形成しながら、腱の標的細胞へ移行します。その後、筋肉や腱組織され (図 2 j, K) 安定した添付ファイルを形成します。添付ファイルするにつれて、少ない糸状形態と筋腱インターフェイス (図 2 L) を滑らか。したがって、くわしくは生きている有機体の細胞動態を明らかにするため 2 色、高倍率の画像を使用できます。
腹部の筋肉のライブ イメージング
(図 3、映画 S4)、腹部の筋肉のライブ イメージングMef2-GAL4> UA-CD8-GFP はマーカーとして使用され、ウィンドウで詳細図 1として蛹の場合腹部の上開設。図 2 aDで表される間接飛翔筋の映画と同様に、形成し、腹部の筋肉の成長続くことができる開発 (映画 S4 で 55 h) の多くの時間を。この時間の間に、筋芽細胞は成長する (図 3 a) であるフォームにヒューズします。筋のヒントを腱ターゲットに移行、腱細胞にアタッチした後、サルコメアの筋肉の収縮単位が形成される (図 3 bD)。
図 3: 腹部の筋肉の形態形成の画像をライブします。(A ~ D)時間Mef2を使用してムービー (映画 S4) からポイント-GAL4、UAS-CD8-腹部の筋肉の形態形成に従うマーカーとして GFP。パネル A'-E' 蛹のステージの間にde novoを形作る腹筋セット (緑) のモデルのオーバーレイを表示します。スケール バーは、100 μ m。 時刻は hh:mm APF として示されます。映画は、室温で買収されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
筋肉のけいれんのライブ イメージング
異なり、図 2 図 3図 4に示す秒の時間スケールで発生する筋肉のダイナミクス: 筋収縮のライブ録音。内因性制御の下で βPS インテグリン gfp 蛹 0.65 の時間分解能撮像した共焦点顕微鏡 (映画 S5) に 1 つの z 平面で s。図 4の表示例では、42 h APF から始まる 10 分間 3 メモリサーバ (図 4 a) の添付ファイルのサイトをイメージしました。この時間の間に 5 つの収縮の事象は観察 (図 4 b-F)、サルコメアの開発のこの時点で調整された収縮をサポートする十分既に組み立てを示します。したがって、筋肉のけいれんのイメージングは、既に間接飛翔筋開発28羽化後のみ実行できますたとえば飛行のテストとは対照的の間のプロセス sarcomerogenesis の機能的な読み出しとして使用できます。
図 4: 筋肉のけいれんのイメージングを住んでいます。(A)マーカーとして βPS-インテグリン-GFP を 42 h APF を使用して卵割間接飛翔筋のけいれんを示す映画 (映画 S5) から最初時点。ビューのフィールドは、筋肉 DVM II 2、DVM III 1、DVM III 2 の添付ファイルのサイト。(B F)色 5 つの個々 の筋線維のイベントのオーバーレイ (マゼンタ) の収縮前に、のフレームと収縮イベント (緑) の最初のフレームを表示します。個々 の筋線維は収縮独立して互いに注意してください。矢印は、けいれんの動きを強調表示します。映画の時間分解能は 0.65 s. スケール バーは、25 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
タグ内因蛋白質のライブ イメージング
ΒPS に似ています-インテグリン-GFP、ショウジョウバエの内因性制御の下で表現の融合蛋白質の大規模なコレクションは、生成された2,3、4をされています。これらのフライラインは、たとえば細胞レベル下のローカリゼーションや興味の蛋白質の発現を研究する使用できます。コレクションは、特定の抗体が利用できないまたは蛋白質の原動力を調査生体内で固定せずする必要がある場合に特に便利です。図 5は、フライの TransgeneOme (fTRG) ライブラリ、胡李泰紹 (Hts) から内生に表現された融合タンパク質の 3 つの例を示しています-GFP (図 5 a, B)、タリン GFP (図 5D) と βTubulin60D GFP (図 5 e, F)。当然のことながら、それらを表現するすべての組織にこれらの蛋白質の表現を学ぶことができます。ここでは、例として胸郭の上皮 (図 5 a、C、E) や間接飛翔筋の付着部位 (図 5 b, D, F) を表示します。
図 5: 蛋白質のタグ内因のライブ イメージングします。(B)Z スタック Hts gfp 蛹の撮影の最大の予測。(C, D)Z スタック タリン gfp 蛹の撮影の最大の予測。(E, F)Z スタック蛹 βTubulin60D gfp の撮影の最大の予測。パネル A、C および E それぞれ、18、24、18 h、APF で胸郭上皮を表示し、パネル B、D および F 間接飛翔筋または 30 h APF での添付ファイルのサイトを表示します。スケール バーは、25 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
Discussion
提案するプロトコルは、生活の筋腱の形態形成をイメージする方法をについて説明しますさまざまな蛍光付けられた蛋白質を用いたショウジョウバエ蛹。この生体内イメージング戦略を使用して、全体の生物の自然の環境に発達過程を研究できます。
成功した実験を分析する正しい発達時間ポイントを見つけるために不可欠です。たとえば、dorsolongitudinal 間接飛翔筋は、腹部の筋肉が後で開発、30 と 40 h APF26間のみ両端に接続 ≈16 h APF23で、腱のターゲットに添付ファイルを開始します。その結果、以前に発行された文献を分析する開発のタイミング ポイントを見つけるに使用するまたは、組織または興味の構造は、前に詳細に検討されていないが、全体的な開発では、最初に特徴付けられます。
特注プラスチック スライド上で正常に蛹を取り付け、溝が適切な寸法を持っていることが重要です: 深さ 0.4 mm 1.0 1.5 mm 幅と 0.3 - 溝が必要です。この深さでは、必要に応じてスペーサー coverslips にトップの coverslip までの正確な距離を調整することができます。ただし、少なくとも 1 つのスペーサー coverslip は毛管力によってサンプルから 50% のグリセロールを排出しないように使用必要があります。溝に蛹の正確な位置および興味の構造が、coverslip にできるだけ近くなるように最適化する必要があります経験が必要です。
蛹の多数は 1 つの顕微鏡のセッションでイメージを作成するはずですが、もし彼らすべてあらかじめマウントでき適切な発達のタイミングを確保するためイメージングまでインキュベータに格納されます。蛹必要があります全体のプロシージャを存続してもせめて eclose イメージング後、スライドを保持される場合みてください。生存率は、撮影条件、蛹に損害を与えるかどうかをチェックする、読み出しとして使用できます。
画像の設定は、実験の要件に従って慎重に選択する必要があります。短期的な映画は、高い信号対雑音比と高フレーム レートを比較的高いレーザパワーは、蛹をあまり損なうことがなく使用できますが、バランスを調整する必要があります。しかし、長期的な映画のためのレーザー出力は中程度のレベルで保たれる、特定の時間のポイントは、たとえば、20 分毎にではなく、蛹が継続的にイメージしない必要があります。ビューのフィールドのうち興味の構造が動かないように時間ポイント間 z スタックの位置を再調整する必要がある場合があります。私たちの知る限りでは、蛹のケースの開口部自体は影響しません発生時期。ただし、適切な発達のタイミングを確保するため、長期的な映画の温度制御の段階を使用ください。これらの考慮事項を念頭に置きつつ、非常に有益な映画を得ることができます。
提案するプロトコルは、筋腱の形態形成だけでなく、他の発展途上の組織、たとえば、29の翼の上皮を視覚化する使用できます。このプロトコルへ 3 つしか変更が必要: (1) 胸部や腹部ではなく翼の上蛹のケースを開く、(2) トップ coverslip および (3) の方の羽が蛹の位置異なる蛍光マーカー蛋白質の使用。CRISPR/Cas9-技術の進歩により、タグ内因より多くの蛍光蛋白質になります、簡単ショウジョウバエ30,31の内因性遺伝子座を対象になったので,32. 将来的に、これは多数の蛋白質、細胞、詳細の生理学的環境において全体の組織のダイナミクスの解明により。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
映画 S3 の獲得ありがとうマヌエラ Weitkunat。ラインハルト ・ フェスラーへの寛大な支援に感謝しております。この作業によって、エンボ若い調査官プログラム (f. s.)、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP/2007-2013) の下で欧州研究評議会を支えられた/ERC 助成金 310939 (f. s.)、マックス ・ プランク協会 (エス、f. s.)、センター デ ラ日仏 (CNRS) (f. s.)、エクセレンス イニシアチブはエクス ・ マルセイユ大学 AMIDEX (f. s.)、LabEX 通知 (f. s.) とベーリンガー インゲルハイム フォン (エス)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
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