Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57312
Automatic Translation
1, 1,2
1Muscle Dynamics Group, Max Planck Institute of Biochemistry, 2Aix Marseille University, CNRS, IBDM

Summary

Her presenterer vi en enkel å bruke og allsidig metode for å utføre live bildebehandling av utviklingsprosesser i generelt og muskel-sene morphogenesis spesielt i levende Drosophila pupae.

Abstract

Musklene sener og skjelettet aktiverer dyr inkludert mennesker for å flytte sine kroppsdeler. Muskel morphogenesis er svært bevart fra dyr til mennesker. Kraftig Drosophila modellsystem kan derfor brukes til å studere konsepter av muskel-sene utvikling som kan også bli brukt til menneskelig muskel biologi. Her beskrive vi i detalj hvordan morphogenesis av voksen muskel-sene systemet kan være lett avbildet i levende, utvikle Drosophila pupae. Derfor kan metoden undersøke proteiner, celler og vev i fysiologiske miljøet. I tillegg til en trinnvis protokoll med nyttige tips gir vi en omfattende oversikt over fluorescently merket markør proteiner som er egnet for å studere muskel-sene systemet. For å markere det allsidige søknadene av protokollen, viser vi eksempel filmer mellom visualisering av langsiktig Morfogenetiske hendelser-forekommer på tidsskalaen for timer og dager-visualisering av kortsiktige dynamisk prosesser som muskelrykninger forekommende i tidsskala sekunder. Samlet bør denne protokollen aktivere leseren å tegning og utføre live bildebehandling eksperimenter for å undersøke muskel-sene morphogenesis i intakt organismen.

Introduction

Muskel-sene apparatet gjør dyr inkludert mennesker for å flytte sine kroppsdeler. Molekylær byggesteinene i muskel-sene systemet er svært bevart. Derfor kan begrepene muskel-sene utvikling relevante for menneskelig muskel biologi, for eksempel muskel morphogenesis, muskel-sene vedlegg og myofibril selv-organisering, studeres bruker Drosophila melanogaster som en lett tilgjengelig modellsystem. Pupal systemet Drosophila har flere eksperimentelle fordeler. Først på pupal scenen-er når voksen musklene er dannet-organismen fastsittende og derfor lett å bildet på et mikroskop løpet av timer eller dager. Andre, mange muskler form nært nok under pupal overflaten slik at de kan avbildes i intakt, delvis gjennomsiktig organismen. Tredje kan musklene undersøkes i sitt naturlige miljø, hvor de er koblet til den danner exoskeleton via sene celler og vev spenning er bygget opp. Dette er ikke mulig i muskel celle kultur systemer. Og til slutt, en overflod av genetisk verktøy finnes i Drosophila. Blant disse er mange fluorescently merket markører at merking av spesifikke celletyper eller subcellular strukturer for bildebehandling i vivo.

Tabell 1 oppsummerer de viktigste markørene brukes for å studere muskel-sene morphogenesis. Det inkluderer markører overexpressed bruker GAL4-UAS-system1 og endogenously merket protein markører2,3,4. Fordelen av GAL4-UAS-systemet er at markørene er generelt uttrykt på høye nivåer, noe som resulterer i et sterkt signal som kan enkelt avbildes i hele-mount pupae. I tillegg kan vev spesifisitet oppnås ved å velge GAL4 drivere nøye. Fordelen med fusion proteiner uttrykt endogene kontroll er at dynamikken i de respektive proteinene kan være studert i vivo, mens de kan også brukes som markører for ulike celletyper eller spesifikke subcellular strukturer, for eksempel ΒPS-Integrin-GFP for muskel vedlegg områder. Sammen gir disse markørene høy fleksibilitet i eksperimentell design og valg av forskning problemer som kan løses nå og i fremtiden.

Merket struktur Markør Uttrykk og lokalisering Klassen Artikkelnummer Kommentar REF.
Muskel Mef2-GAL4 alle myoblasts og alle musklene i alle stadier GAL4 linje BL 27390 5
1151-GAL4 voksen muskel prekursorer og tidlig myotubes til ≈24 h APF GAL4 linje, enhancer felle - 6
Act79B-GAL4 hoppe muskel på differensiering GAL4 linje - 7
Act88F-GAL4 indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF GAL4 linje - 7
Act88F- Cameleon 3.1 indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF Act88F forsterker / arrangøren kjøring Cameleon 3.1 - Ca2 + indikator 8
Act88F-GFP indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) fTRG78 og fTRG10028 4
Ham- nls-GFP voksen muskel forløpere, kjernekraft, til ≈24 h APF i indirekte flygingen musklene Enhancer/arrangøren med nls-GFP reporter - 1,5 kb enhancer fragment 9
MHC-Tau-GFP piskehale som henger i DLM maler og skille muskler Enhancer/arrangøren med Tau-GFP reporter BL 53739 10
ΒTub60D-GFP piskehale som henger i myotubes (f.eks. i indirekte flygingen musklene ≈14 h AFP, sterkt redusere etter ≈48 h APF) GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) fTRG958 4
MHC-GFP (weeP26) sarcomeres (tykke glødetråden) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flygingen musklene fra ≈30 h APF) GFP-felle - Bruk heterozygote, merker en isoformen delsett 11
SLS-GFP sarcomeres (Z-plate) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flygingen musklene fra ≈30 h APF) GFP-felle (FlyTrap linje) - G53, bruk heterozygote 2
Zasp66-GFP Z-plate i alle kroppens muskler GFP-felle (FlyTrap linje) BL 6824 ZCL0663 2 , 12
Zasp52-GFP Z-plate i alle kroppens muskler GFP-felle (FlyTrap linje) BL 6838 G00189 2 , 12
HTS-GFP utgangen bindende; uttrykt i epitel, myoblasts og myotubes GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) fTRG585 4
Dlg1-GFP tarmepitelet veikryss, myoblasts og membraner i musklene i alle stadier GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) fTRG502 4
Muskel vedlegg området ΒPS-Integrin-GFP muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) GFP-knock-i - 13
Talin-GFP og -mCherry muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) GFP-felle (etterligne linje) - 3
Talin-GFP muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) fTRG587 4
Ilk-GFP muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) GFP-felle (FlyTrap linje) Kyoto 110951 (ZCL3111) ZCL3111, ZCL3192 2
Vinc-GFP og -RFP muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) GFP-fusion (transgene) - 13
Sene SR-GAL4 thorax sene celler, gjennom pupal scenen GAL4 linje, enhancer felle BL 26663 homozygous dødelig 14
Muskel og sene DUF-GAL4 muskler og epithelia, tidlig debut GAL4 linje BL 66682 kirre-rP298, grunnlegger celle markør 15
UAS-journalister UAS- GFP-Gma utgangen bindende UAS linje BL 31776 utgangen bindende domene i Moesin del GFP 16
UAS- mCherry-Gma utgangen bindende UAS linje - GMA del mCherry 17
UAS- Lifeact-GFP utgangen bindende UAS linje BL 35544 18
UAS- Lifeact-Ruby utgangen bindende UAS linje BL 35545 18
UAS-CD8-GFP membran bindende UAS linje ulike aksjer, f.eks: BL 32184 19
UAS-CD8-mCherry membran bindende UAS linje BL 27391 og 27392 20
UAS-palm-mCherry membran binde via palmitoylation UAS linje BL 34514 UAS- brainbow 21

Tabell 1: Merket Fluorescently protein markører egnet for studerer muskel-sene morphogenesis i vivo.

Her vi beskrive i detalj hvordan avbilding av muskel-sene morphogenesis i levende pupae kan utføres enkelt og vellykket (figur 1). Alternativt pupae kan være faste, dissekert og immunostained, som tillater bruk av antistoffer også merke proteiner som ingen lever markører er tilgjengelig22. I dette tilfellet er tenkelig kvaliteten generelt høyere fordi det er ingen bevegelse og strukturen av interesse kan plasseres i nærheten av dekkglassvæske. Men disseksjon og fiksering kan føre til skader og molekylære eller vev dynamikk, for eksempel muskel rykninger, kan bare bli studert i den levende organismen.

Protocol

1. etappe Pupae

  1. Definere et kors med 20-40 jomfru kvinner og 20 menn per flaske fly mat (figur 1A). Alternativt, hvis aksjer skal brukes, Vend hver aksje i nye flasker. For å få nok pupae, vurdere å sette opp to flasker pr genotype.
  2. Inkuber flaskene på 25 ° C (eller 27 ° C i henhold til eksperimentell design) for fem til seks dager (figur 1B).
    Merk: Holder bla fluene hver to til tre dager å unngå overbefolkning og sikre en kontinuerlig tilførsel av pupae.
  3. Bruk en våt pensel å samle hvit prepupae fra veggene i flaskene og overføre dem til glass lysbilder (figur 1 c). Igjen iscenesettelsen som pupae nå ønsket alder når du starter live imaging under mikroskopet.
    Merk: Disse prepupae ser ut som eldre pupae i sin form, men de er fremdeles hvit som larver. Utbruddet av skallet scenen er definert som 0 h etter blodsugende dannelse (0 h APF).
  4. Fjerne klumper av fly mat stikker til pupae med våt pensel og orientere ventrale siden av pupae mot glass lysbilde ved hjelp av en stereomicroscope (figur 1 d). Forkaste pupae som fortsatt flytter (for unge) eller som har begynt å bli brun (for gamle). Dette sikrer at alle pupae samme alder (0 - 1 h APF).
  5. Merk lysbildene med genotype, dato og klokkeslett for samlingen. Overføre glass lysbilder til ettall bensin fat hver og legge en papir for å hindre pupae tørker ut (figur 1E).
  6. Lagre pupae i en inkubator ved 25 ° C eller 27 ° C før de når ønsket. Fortsett med neste trinn 1 time før bildebehandling, slik at pupae har ønsket alder når du starter live bildebehandling (trinn 3), for eksempel på 13 h APF for filmen vises i figur 2A-D.
    Merk: Tidligst mulig tid utgangspunktet er etter hodet-eversion av pupae på 8-10 h APF på 27 ° C.

2. Forbered Pupae for Imaging

  1. Kontroller at pupae nå stick til glass lysbilde akkurat som de naturlig stikker til veggene av flaskene på grunn av gjenværende fly mat. Det kreves ingen ekstra limet. Hvis pupae ikke stikke godt nok på grunn av høy luftfuktighet, åpne Petriskål for et par minutter å la dem tørke. Eventuelt overføre dem til dobbeltsidig tape på et glass lysbilde, men dette er vanligvis ikke nødvendig.
  2. Åpne vinduet i pupal tilfelle for avbilding av indirekte flygingen musklene (Finne 1F; Gå til seksjon 2.3 for avbilding av magemusklene.)
    1. Plasser pupae stikker til glass lysbildet med den fremre mot fra forskeren under en stereomicroscope. Juster zooming til 2 X.
    2. Bruke en ende av biologi klasse #5 tang, forsiktig stikk et hull i pupal tilfelle dorsal til vingen der magen slutter, og thorax begynner.
    3. For å skjære åpen pupal saken, forsiktig flytte tang til den fremre delen av thorax langs vingen men unngå skade sårbare fløyen vevet.
      Merk: Hvis væske lekkasjer fra puppe, den er skadet; kaste den og starte på nytt med en annen puppe.
    4. Løft opp delen av pupal saken over thorax med tang og deretter kutte denne delen av med fine, skarp saks på motsatt side av dorsal midtlinjen.
  3. Åpne vinduet i pupal tilfelle ved avbildning av magemusklene (Figur 1G)
    1. Plasser pupae stikker til glass lysbildet med den fremre vendt mot forskeren under en stereomicroscope. Juster zooming til 2 X.
    2. Bruke en ende av biologi klasse #5 tang, forsiktig stikk et hull i pupal tilfelle dorsal til vingen der thorax slutter, og magen begynner.
    3. For å skjære åpen pupal saken, forsiktig flytte tang mot bakre slutten av magen.
      Merk: Hvis væske lekkasjer fra puppe, den er skadet; kaste den og starte på nytt med en annen puppe.
    4. Løft opp delen av pupal saken over magen med tang og deretter kutte denne delen av med fine, skarp saks på motsatt side av dorsal midtlinjen.
  4. Mount Pupae (Figur 1 H)
    1. Bruke en våt pensel for å overføre opptil fem pupae i plast lysbildet med en groove (spesialbygde, reusable, se og liste over materialer). Legg til ett eller to mellomrom coverslips på hver side avhengig av dybden på sporet og tykkelsen på pupae. Legg en liten dråpe vann under hver spacer dekkglassvæske å gjøre det holde seg til lysbildet og la noen plassen mellom groove og avstand-coverslips på hver side.
      Merk: Avstand-coverslips kan også være permanent festet til lysbildet med superlim, på forhånd.
    2. Plasser pupae slik at åpningen i pupal tilfelle vender oppover ved hjelp av pensel. Kontroller nøye plassering av pupae i riktig vinkel for god tenkelig kvalitet. Optimalisere vinkelen for hver vev og utviklingsmessige tidspunkt.
      Merk: En liten mengde vann i sporet gjør plassering av pupae enklere. Avløp overskytende vann med pensel etterpå for å unngå drukning.
    3. Hold en dekkglassvæske (18 x 18 mm) over pupae uten å berøre dem. Plasser små dråper (ca 0,5 µL) 50% glyserol løsning over hvert pupal tilfelle åpningen på dekkglassvæske ved hjelp av en 20 µL pipette.
      Merk: Denne fremgangsmåten sikrer at dråpene har samme avstanden som pupae.
    4. Snu dekkglassvæske og plasser den over pupae for hånd eller ved hjelp av pinsett (standard #5) mens du hviler en side av dekkglassvæske på avstand coverslips ved pupae. Deretter forsiktig slipp dekkglassvæske på pupae. Kontroller at pupal tilfelle åpningene er riktig dekket med 50% glyserol for bildebehandling god og å hindre pupae tørker.
    5. Brett over en slutten av et stykke selvklebende tape og ta det med tang (standard #5) på slutten. Forsiktig plassere båndet slik at det dekker en kant av de øverste dekkglassvæske, avstand coverslip(s) og plast lysbildet på den ene siden. Ikke trykk ned tape, ennå. Først snu lysbildet og gjenta på den andre siden.
    6. Bruk både indeksere fingre for å trykke ned båndet samtidig på begge sider. Denne fremgangsmåten sikrer at pupae ikke er forskyves.
    7. Kontroller om pupae er også i kontakt med dekkglassvæske. For optimal tenkelig kvalitet bør pupae være forsiktig presset under dekkglassvæske. Justere antall spacer coverslips om nødvendig.
    8. Merk lysbildet ved å skrive på selvklebende tape.

3. leve Imaging av Pupae

  1. Den montering tillater avbilding av pupae både invertert mikroskop (figur 1I) og oppreist mikroskop (figur 1J). Spesielt egnet for live bildebehandling skanner AC confocal mikroskop, to-fotonet mikroskop og spinning plate AC confocal mikroskop uansett om de er invertert eller oppreist. Bruke et temperaturkontrollert stadium langsiktige filmer, hvis tilgjengelig.
  2. Bruk av okulære og UV-lampe eller overføring lys, finne en puppe og fokus innenfor puppe.
  3. Bruker kameraet, finner ønsket struktur og justere zoomenivået.
  4. Langsiktig filmer, definere en z-stabel som omfatter strukturen rundt godt (for eksempel indirekte flygingen musklene, vedlegg områdene, sene cellene eller en kombinasjon nevnte) og velger et tidsintervall. Vurdere å gjøre snitt for bedre bildekvalitet. Velg et enkelt z-fly å oppnå en høy bildefrekvens for høyhastighets kortsiktige filmer.
  5. Justere laser makt til å gi best mulig signal, men lite metning. Men kan for høy laser makt skade puppe over tid.
  6. Start bildebehandling og returnere fra tid til annen å se filmen og justere z-stack plasseringen hvis nødvendig.

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyt for live bildebehandling av muskel-sene morphogenesis i Drosophila pupae. Se protokoll for detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Ulike vev kan være fotografert i vivo utvikle fly pupae, noe som gjør dem til et ideelt modellsystem å studere morphogenesis voksen organer. Blant disse er indirekte flygingen musklene, syn epitel inkludert sene cellene, fløyen epitel, magemusklene og hjertet22,23,24,25,26 , 27. her, vi fokuserer på live bildebehandling av muskel og sene morphogenesis. En detaljert beskrivelse av indirekte flight muskel og bukmuskel morphogenesis og flere metoder for å studere muskel biologi i Drosophila, henvise vi leseren til Weitkunat og Schnorrer 201422.

Live bildebehandling av indirekte flygingen musklene

For å studere ble utviklingen av indirekte flygingen musklene dorsolongitudinal musklene (DLMs) og dorsoventral musklene (DVMs), globular Moesin utgangen-bindende domene merket med GFP (UAS -GFP-Gma) uttrykt i alle muskler med Myocyte enhancer faktor 2 (Mef2)-GAL4 sjåfør (figur 2A-D, Filmen S1). Før bildebehandling åpnet et vindu i pupal tilfelle over thorax som vist i figur 1F. På en to-fotonet mikroskop anskaffet z-stabler hvert 20 min 21 h starter på ≈11 h etter blodsugende dannelse (11 h APF). I dette tidsrommet, DLMs (grønn overlegg i figur 2A'-D') først starte vedlegg til sene cellene (figur 2A) og deretter deler mens muskel vedleggene modne (figur 2B). Neste, forkorte myotubes (figur 2C) før de endelig når maksimalt komprimerte scenen på 30 timer APF (figur 2D). Samlet fremhever denne filmen de dramatiske endringene i muskel morfologi på tidsskalaen timer.

Figure 2
Figur 2: Live bildebehandling av indirekte flight muskel og sene morphogenesis. (A-D) Tid poeng fra en to-fotonet film (film S1) ved hjelp av Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma som en markør for utgangen i indirekte flygingen musklene bestående av dorsolongitudinal musklene (DLMs, markert med grønt i A'-D') og dorsoventral musklene ( DVMs, markert med blått i A'-D'). Skala barer er 100 µm. (E-H) tidspunkt fra en to-fotonet film (film S2) ved hjelp av Duf-GAL4UAS-CD8-GFP som en markør for indirekte flygingen musklene og syn epitel inkludert sene celler. Paneler E'-H' vise en overlapping med en modell av muskel-sene på hvert punkt, utheving lenge mobilnettet utvidelsene dannet av sene epitel (rosa) i kontakt med musklene (grønn). Skala barer er 100 µm (estimert størrelsen på fotografert strukturer). (Jeg-L) Tid poeng fra en to-farge, spinning plate AC confocal film (film S3) fokuserer på muskel-sene vedlegg innvielse. Sene cellene er merket med sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) og dorsolongitudinal indirekte flight muskler med Mhc -Tau-GFP (grønn). Skala barer er 10 µm. tid vises som TT etter blodsugende dannelse (APF). Merk at ikke alle filmer ble kjøpt på en temperaturkontrollert scene, derfor utviklingsmessige timing kan avvike. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å studere sene og muskel morphogenesis samtidig, membran-bundet GFP (UAS -CD8-GFP) ble uttrykt ved hjelp av Dumbfounded (Duf)-GAL4 som driver, som er uttrykt både i sene cellene og indirekte flygingen musklene (figur 2E -H, filmen S2). Z stabel ble tatt på en to-fotonet mikroskop hvert 20 min starter på 16 h APF 20 h. Mens myotubes kompakt (grønn overlegg i figur 2E'-H'), senen celler skjemaet lenge mobilnettet utvidelser som forlenge tid (magenta overlegg i figur 2E'-H'). Samlet høydepunkter denne filmen nær samspillet mellom den sene og muskel celler i vivo.

Undersøke muskel-sene samhandling nærmere, ble to farger og høy forstørrelse bilder utført. Pupae med myosin tunge kjede (Mhc)-Tau-GFP i DLMs og UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) drevet av stripe (sr)-GAL4 i sener ble fotografert hver 5 min fra 12t APF 4.5 h på en roterende plate AC confocal mikroskop (figur 2I-L, filmen S3). På 12 h APF migrere myotubes mot deres sene målcellene mens forming lang filopodia på deres tips (figur 2I). Deretter muskel og sene vev interdigitate (figur 2J, K) til en stabil vedlegg. Som vedlegget modnes, færre filopodia form og muskel-sene grensesnittet jevner ut (figur 2 L). Dermed kan to farger og høy forstørrelse bilder brukes å avsløre mobilnettet dynamikken i detalj i den levende organismen.

Live bildebehandling av magemusklene

For live bildebehandling av magemusklene (Figur 3filmen S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP ble brukt som en markør og et vindu ble åpnet over magen i pupal tilfelle som i figur 1G. Ligner indirekte flight muskel filmen representert i figur 2A-D, dannelse og vekst av magemusklene kan følges over mange timer med utvikling (55 h i filmen S4). I denne perioden sikring myoblasts skjemaet voksende myotubes (figur 3A). Myotube tips overføre sine sene mål, og etter at til sene cellene, kontraktile enhetene muskler og sarcomeres, er dannet (figur 3BD).

Figure 3
Figur 3: Live bildebehandling av bukmuskel morphogenesis. (A-D) Tid poeng fra en film (film S4) ved hjelp av Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP som en markør å følge bukmuskel morphogenesis. Paneler A'-E' Vis overlegg med modeller av en bukmuskel sett (grønn) som danner de novo under pupal stadium. Skala barer er 100 µm. tid er angitt som TT APF. Filmen ble kjøpt i romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Live bildebehandling av rykninger muskler

I motsetning til figur 2 og Figur 3, Figur 4 viser muskel dynamikken i tidsskalaen i sekunder: live opptak av muskelsammentrekninger. Pupae uttrykke βPS-Integrin-GFP under endogene kontroll ble fotografert med en gang oppløsning på 0,65 s i et enkelt z-fly på AC confocal mikroskop (Film S5). I eksemplet i Figur 4ble vedlegg nettstedene til tre DVMs (figur 4A) fotografert i 10 min fra 42 h APF. I denne perioden var fem twitch hendelsene observert (figur 4B-F), viser at sarcomeres er allerede montert godt nok til å støtte koordinert sammentrekninger på dette tidspunkt i utvikling. Derfor kan avbilding av muskelrykninger brukes som en funksjonell lese-out for sarcomerogenesis allerede i indirekte flight muskel utvikling28, i motsetning til for eksempel flight tester, som kan bare utføres etter eclosion.

Figure 4
Figur 4: Live bildebehandling av rykninger muskler. (A) første tidspunkt fra en film (film S5) viser rykning av dorsoventral indirekte flygingen musklene på 42 h APF bruker βPS-Integrin-GFP som en markør. I synsfeltet er muskelen vedlegg områder av DVM II 2, DVM III 1 og DVM III 2. (B-F) Farge overlegg av fem personlige rykk begivenheter, hver viser rammen før rikke (magenta) og det første bildet i hendelsen twitch (grønn). Merk at enkelte muskelfibre trekning uavhengig av hverandre. Piler markere rykninger bevegelse. Tid oppløsningen av filmen er 0,65 s. skala barer er 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Live bildebehandling endogenously merket proteiner

Ligner på βPS-Integrin-GFP, en stor samling av fusion proteiner uttrykt i Drosophila endogene kontroll er generert2,3,4. Disse fly linjer kan brukes til å studere for eksempel den subcellular lokaliseringen eller uttrykket profiler av proteiner av interesse. Samlingen er spesielt nyttig hvis spesifikke antistoffer er ikke tilgjengelige eller protein dynamics må være undersøkt i vivo uten fiksering. Figur 5 viser tre eksempler på endogenously uttrykt fusion proteiner fra fly TransgeneOme (fTRG) biblioteket, Hu li tai shao (Hts)-GFP (figur 5A, B), Talin-GFP (figur 5C, D) og βTubulin60D-GFP ( Finne 5E, F). Uttrykket av disse proteinene kan studeres i alle vev som uttrykker dem naturlig. Her viser vi thorax epitel (figur 5AC, E) og indirekte flygingen musklene eller sine vedlegg områder (figur 5BD, F) som eksempler.

Figure 5
Figur 5: Live bildebehandling av endogenously merket proteiner. (A, B) Maksimal anslag av z-stabler av pupae uttrykke Hts-GFP. (C, D) Maksimal anslag av z-stabler av pupae uttrykke Talin-GFP. (E, F) Maksimal anslag av z-stabler av pupae uttrykke βTubulin60D-GFP. Paneler A, C og E Vis thorax epitel på 18, 24 og 18 h APF, henholdsvis, og paneler B, D og F viser indirekte flygingen musklene eller sine vedlegg nettsteder på 30 timer APF. Skala barer er 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Presentert protokollen beskriver hvordan muskel-sene morphogenesis i levende Drosophila pupae bruker en rekke fluorescently merket proteiner. Denne i vivo imaging strategi kan brukes å studere utviklingsprosesser i sitt naturlige miljø av hele organismen.

Det er avgjørende for en vellykket eksperiment for å finne riktig utviklingsmessige tidspunktet å analysere. For eksempel starte dorsolongitudinal indirekte flygingen musklene vedlegg sine sene mål på ≈16 h APF23 mens magemusklene utvikler senere og fest på begge ender bare mellom 30 og 40 h APF26. Følgelig tidligere publisert litteratur skal brukes til å finne riktig tidspunkt utvikling analysere eller hvis vev eller struktur rundt ikke har blitt studert i detalj før, den generelle utviklingen har å være preget første.

For montering pupae på spesialbygde plast lysbildene, er det viktig at sporene har egnede dimensjoner: grooves måtte være 1.0-1,5 mm bred og 0,3 - 0.4 mm dyp. Denne dybde kan justere den nøyaktige avstanden til den beste dekkglassvæske med avstand coverslips etter behov. Minst ett mellomrom dekkglassvæske bør imidlertid brukes å unngå drenering 50% glycerol fra utvalget av kapillære krefter. Riktig posisjonering pupae i sporet krever noen erfaring og skal være optimalisert slik at strukturen av interesse er så nær som mulig til dekkglassvæske.

Hvis et stort antall pupae skal avbildes i et mikroskop-økt, kan alle montert på forhånd og deretter lagret i en inkubator til å sikre riktig utviklingsmessige timing. Pupae skal overleve hele prosedyren og også minst prøve å dra hvis holdt på lysbildet etter bildebehandling. Overlevelse kan brukes som en avlesning sjekke om tenkelig betingelsene skade pupae.

Tenkelig innstillingene skal velges nøye i henhold til eksperimentelle kravene. For kortsiktige filmer må en høy bildefrekvens versus en høy signal-til-støy-forhold være balansert, mens relativt høy laser makt kan brukes uten å skade pupae for mye. Men for langsiktig film, laser makt må holdes på et moderat nivå og pupae bør ikke avbildes kontinuerlig men heller på bestemte tidspunkt, for eksempel hvert 20 min. For å sikre at strukturen av interesse ikke flytte ut av synsfeltet, kan det være nødvendig å justere plasseringen av z-stakken mellom tidspunkt. Vi vet påvirker åpningen av pupal saken sådan ikke utviklingsmessige timing. Et temperaturkontrollert stadium bør imidlertid brukes for langsiktig filmer for å sikre riktig utviklingsmessige timing. Holde disse hensyn i tankene, kan svært informativ filmer skaffes.

Presentert protokollen kan brukes å visualisere ikke bare muskel-sene morphogenesis, men også andre utviklingsland vev, for eksempel fløyen epitel29. Bare tre endringer denne protokollen er nødvendig: (1) åpning av pupal saken over vingen i stedet for syn eller magen, (2) plassering av pupae med vingen mot den øverste dekkglassvæske, og (3) bruk av ulike fluorescerende markør proteiner. Med fremme av CRISPR/Cas9-teknologi, vil mer endogenously merket fluorescerende proteiner være tilgjengelig, fordi det har blitt enklere å målrette endogene loci i Drosophila30,31 , 32. i fremtiden, vil dette tillate Klargjørende dynamikken i mange proteiner, celler og hele vev i fysiologiske miljøet i detalj.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Manuela Weitkunat for oppkjøpet av filmen S3. Vi er takknemlige for Reinhard Fässler for sjenerøs støtte. Dette arbeidet ble støttet av EMBO unge etterforsker Program (F.S.), europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck samfunnet (S.B.L., F.S.), den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille University AMIDEX (F.S.), LabEX-INFORMER (F.S.) og Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Leica MZ6 product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials) - - standard culture medium
paint brush da Vinci 1526Y size 1
microscope slides Thermo Scientific VWR: 631-1303 76 x 26 mm
double-sided tape (optional) Scotch 6651263 12 mm x 6.3 m
petri dishes Greiner Bio-One 632102 94 x 16 mm
paper tissues Th.Geyer 7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard) Fine Science Tools 11251-20 0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) Fine Science Tools 11252-20 0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-02 straight tip
plastic slides with a groove (reusable) custom-built - 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips Marienfeld 107032 18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol Sigma-Aldrich 49781 dilute to 50 % in water
adhesive tape Tesa 57370-02 1.5 mm x 10 m

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
  3. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
  4. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
  5. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
  6. Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
  7. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
  8. Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
  9. Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
  10. Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
  11. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  12. Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
  13. Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
  14. Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
  15. Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
  16. Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
  17. Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
  18. Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  20. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
  21. Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
  22. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  23. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  24. Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
  25. Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  26. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
  27. Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
  28. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
  29. Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
  30. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  31. Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
  32. Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi problemet 132 Live bildebehandling Drosophila pupal utvikling muskel sene sarcomere myofibril vedlegg selvstendig organisasjon
<em>I Vivo</em> Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i <em>Drosophila</em> Pupae
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemke, S. B., Schnorrer, F. In… More

Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (132), e57312, doi:10.3791/57312 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter