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Developmental Biology

Vivo में मांसपेशी की इमेजिंग- Drosophila कोषस्थों में पट्टा Morphogenesis

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57312
Automatic Translation
1, 1,2
1Muscle Dynamics Group, Max Planck Institute of Biochemistry, 2Aix Marseille University, CNRS, IBDM

Summary

यहां, हम एक आसान उपयोग करने के लिए और बहुमुखी विधि सामांय और मांसपेशी में विकासात्मक प्रक्रियाओं की लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए वर्तमान में विशेष रूप से रहने वाले Drosophila कोषस्थों में पट्टा morphogenesis ।

Abstract

tendons और कंकाल के साथ एक साथ मांसपेशियों को अपने शरीर के अंगों को स्थानांतरित करने के लिए मनुष्यों सहित जानवरों को सक्षम । मांसपेशी morphogenesis अत्यधिक मनुष्यों के लिए पशुओं से संरक्षित है । इसलिए, शक्तिशाली Drosophila मॉडल प्रणाली मांसपेशियों की अवधारणाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-पट्टा विकास भी मानव मांसपेशी जीव विज्ञान के लिए लागू किया जा सकता है । यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे वयस्क मांसपेशी की morphogenesis-पट्टा प्रणाली को आसानी से रहने में छवि हो सकती है, Drosophila कोषस्थों विकासशील । इसलिए, विधि प्रोटीन, कोशिकाओं और उनके शारीरिक वातावरण में ऊतकों की जांच की अनुमति देता है । उपयोगी सुझावों के साथ एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल के अलावा, हम फ्लोरोसेंट टैग मार्कर प्रोटीन कि मांसपेशी पट्टा प्रणाली का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल के बहुमुखी अनुप्रयोगों को हाइलाइट करने के लिए, हम उदाहरण के लंबे समय तक morphogenetic घटनाओं के दृश्य से लेकर फिल्मों शो-घंटे और दिनों के समय पैमाने पर होने वाली-अल्पकालिक मांसपेशियों की तरह गतिशील प्रक्रियाओं के दृश्य को हिल सेकंड के समय स्केल पर होने वाली है । एक साथ ले लिया, इस प्रोटोकॉल पाठक डिजाइन करने के लिए सक्षम होना चाहिए और मांसपेशी की जांच के लिए लाइव इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन-बरकरार जीव में पट्टा morphogenesis ।

Introduction

मांसपेशी पट्टा तंत्र मनुष्यों सहित जानवरों को उनके शरीर के अंगों को स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । मांसपेशियों की आणविक इमारत ब्लॉकों-पट्टा प्रणाली अत्यधिक संरक्षण कर रहे हैं । इसलिए, मांसपेशी की अवधारणाओं-पट्टा मानव मांसपेशी जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक, उदाहरण के लिए मांसपेशी morphogenesis, मांसपेशी पट्टा लगाव और myofibril स्वयं संगठन, एक आसानी से सुलभ के रूप में Drosophila melanogaster का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता मॉडल प्रणाली । Drosophila ुपाल प्रणाली कई प्रयोगात्मक लाभ है । सबसे पहले, ुपाल चरण में-जब वयस्क मांसपेशियों का गठन कर रहे है-जीव डंठल है और इसलिए आसान घंटे या भी दिनों की अवधि में एक खुर्दबीन पर छवि के लिए । दूसरा, कई मांसपेशियों के रूप में पर्याप्त ुपाल सतह के नीचे इतना है कि वे बरकरार, आंशिक रूप से पारदर्शी जीव के अंदर छवि हो सकता है बंद । तीसरा, मांसपेशियों को अपने प्राकृतिक वातावरण में जांच की जा सकती है, जहां वे पट्टा कोशिकाओं और ऊतक तनाव के द्वारा गठन exoskeleton से जुड़े रहे है बनाया है । यह मांसपेशी कोशिका संस्कृति प्रणालियों में संभव नहीं है । और अंत में, आनुवंशिक उपकरण के ढेर सारे Drosophilaमें उपलब्ध है । इनमें से कई फ्लोरोसेंट मार्करों कि विशिष्ट कोशिका प्रकार या vivo मेंइमेजिंग के लिए उपसेलुलर संरचनाओं के लेबल की अनुमति है टैग कर रहे हैं ।

तालिका 1 मांसपेशी-पट्टा morphogenesis का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त सबसे महत्वपूर्ण मार्कर को संक्षिप्त करता है । यह GAL4-यूएएस-प्रणाली1 और endogenously टैग प्रोटीन मार्करों2,3,4का उपयोग कर व्यक्त मार्करों शामिल हैं । GAL4-यूएएस-प्रणाली का लाभ यह है कि मार्करों आम तौर पर उच्च स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, एक मजबूत संकेत है कि आसानी से पूरे माउंट कोषस्थों में imaged किया जा सकता में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, ऊतक विशिष्टता GAL4 ड्राइवरों को ध्यान से चुनने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । अंतर्जात नियंत्रण के तहत व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का लाभ यह है कि संबंधित प्रोटीन की गतिशीलता vivo मेंअध्ययन किया जा सकता है, जबकि वे भी विभिन्न सेल प्रकार या विशिष्ट उपसेलुलर संरचनाओं के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता, उदाहरण के लिए, βPS-Integrin-मांसपेशी लगाव साइटों के लिए GFP । साथ में, इन मार्करों प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुसंधान समस्याओं है कि अब और भविष्य में हल किया जा सकता है की पसंद में उच्च लचीलापन प्रदान करते हैं ।

लेबल संरचना मार्कर अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण वर्ग स्टॉक नंबर टिप्पणी रेफरी.
मांसपेशियों Mef2-GAL4 सभी myoblasts और सभी चरणों में सभी मांसपेशियों GAL4 लाइन बीएल २७३९० 5
११५१-GAL4 वयस्क बलवान पुरोगामी र पौ myotubes नभए ≈ २४ ज APF GAL4 लाइन, बढ़ाने वाला जाल - 6
Act79B-GAL4 भेदभाव पर कूदो स्नायु GAL4 लाइन - 7
Act88F-GAL4 अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू GAL4 लाइन - 7
Act88F-Cameleon ३.१ अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू Act88F बढ़ाने/प्रमोटर ड्राइविंग Cameleon ३.१ - Ca2 + संकेतक 8
Act88F-GFP अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) fTRG78 और fTRG10028 4
उसे-एनएलएस-GFP वयस्क मांसपेशी पुरोगामी, परमाणु, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 24 ज APF तक एनएलएस-GFP रिपोर्टर के साथ बढ़ाने/ - १.५ kb बढ़ाने टुकड़ा 9
Mhc-तौ-GFP DLM टेम्पलेट्स में microtubules और मांसपेशियों में अंतर बढ़ाने/ताऊ-GFP रिपोर्टर के साथ प्रमोटर/ बीएल ५३७३९ 10
βTub60D-GFP microtubules में myotubes (उदाहरण के लिए ≈ 14 एच एएफपी से अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में, दृढ़ता ≈ ४८ ज APF के बाद कम) GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) fTRG958 4
Mhc-GFP (weeP26) सभी शरीर की मांसपेशियों में sarcomeres (मोटी रेशा) (जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 30 ज APF से शुरू) GFP-जाल - heterozygous का उपयोग करें, एक isoform सबसेट लेबल 11
Sls-GFP sarcomeres (Z-डिस्क) सभी शरीर की मांसपेशियों में (जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 30 ज APF से शुरू) GFP-जाल (मक्खियों line) - G53, उपयोग heterozygous 2
Zasp66-GFP जेड-डिस्क शरीर की सभी मांसपेशियों में GFP-जाल (मक्खियों line) बीएल ६८२४ ZCL0663 2 , 12
Zasp52-GFP जेड-डिस्क शरीर की सभी मांसपेशियों में GFP-जाल (मक्खियों line) बीएल ६८३८ G00189 2 , 12
Hts-GFP actin बंधनकारक; उपकला, myoblasts और myotubes में व्यक्त GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) fTRG585 4
Dlg1-GFP सभी चरणों में मांसपेशियों में उपकला कोशिका जंक्शनों, myoblasts और झिल्ली GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) fTRG502 4
स्नायु लगाव साइट βPS-Integrin-GFP मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) GFP-नॉक-इन - 13
टलीं-GFP और-mCherry मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) GFP-ट्रैप (लाइन नकल) - 3
टलीं-GFP मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) fTRG587 4
जैसे-GFP मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) GFP-जाल (मक्खियों line) क्योटो ११०९५१ (ZCL3111) ZCL3111, ZCL3192 2
Vinc-GFP और-आरएफपी मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) GFP-फ्यूजन (transgene) - 13
कण्डरा sr-GAL4 छाती पट्टा कोशिकाओं, ुपाल चरण भर में GAL4 लाइन, बढ़ाने वाला जाल बीएल २६६६३ homozygous घातक 14
मांसपेशियों और पट्टा Duf-GAL4 मांसपेशियों और epithelia, जल्दी शुरुआत GAL4 लाइन बीएल ६६६८२ kirre-rP298, संस्थापक सेल मार्कर 15
यूएएस-पत्रकारों यूएएस-GFP-Gma actin बंधनकारक यूएएस लाइन बीएल ३१७७६ GFP से जुड़े Moesin के actin बाइंडिंग डोमेन 16
यूएएस-mCherry-Gma actin बंधनकारक यूएएस लाइन - Gma से जुड़े mCherry 17
यूएएस- Lifeact-GFP actin बंधनकारक यूएएस लाइन बीएल ३५५४४ 18
यूएएस-Lifeact-माणिक actin बंधनकारक यूएएस लाइन बीएल ३५५४५ 18
यूएएस-सीडी-GFP झिल्ली बाइंडिंग यूएएस लाइन विभिंन शेयरों, उदा: बीएल ३२१८४ 19
यूएएस-सीडी-mCherry झिल्ली बाइंडिंग यूएएस लाइन बीएल २७३९१ और २७३९२ 20
यूएएस-खजूर-mCherry palmitoylation के माध्यम से झिल्ली बाइंडिंग यूएएस लाइन बीएल ३४५१४ यूएएस-brainbow 21

तालिका 1: फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मांसपेशी-पट्टा morphogenesis vivo मेंटैग की गईं ।

यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे मांसपेशी की इमेजिंग-कोषस्थों रहने में पट्टा morphogenesis आसानी से किया जा सकता है और सफलतापूर्वक (चित्रा 1) । वैकल्पिक रूप से, कोषस्थों तय किया जा सकता है, विच्छेदित और immunostained, जो एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए भी प्रोटीन लेबल जिसके लिए कोई जीवित मार्करों उपलब्ध है22की अनुमति देता है । इस मामले में, इमेजिंग गुणवत्ता आम तौर पर अधिक है क्योंकि वहां कोई आंदोलन है और ब्याज की संरचना coverslip के करीब निकटता में रखा जा सकता है । हालांकि, विच्छेदन और निर्धारण नुकसान और आणविक या ऊतक गतिशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, मांसपेशी हिल, केवल जीवित जीव में अध्ययन किया जा सकता है ।

Protocol

1. स्टेज कोषस्थों

  1. 20-40 कुंवारी महिलाओं के साथ एक क्रॉस सेट अप करें और फ्लाई फूड(figure 1a) की बॉटल प्रति 20 पुरुषों के बारे में । वैकल्पिक रूप से, अगर शेयरों का इस्तेमाल किया जाएगा, नई बोतलों में प्रत्येक शेयर फ्लिप । पर्याप्त कोषस्थों पाने के लिए, प्रति जीनोटाइप दो बोतलें स्थापित करने पर विचार करें ।
  2. पांच से छह दिनों के लिए (चित्र 1b) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (या 27 डिग्री सेल्सियस प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार) पर बोतलें मशीन ।
    नोट: भीड़ से बचने के लिए हर दो से तीन दिन मक्खियों की शुरआत रखें और कोषस्थों की निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित करें ।
  3. बोतलों की दीवारों से सफेद prepupae इकट्ठा करने के लिए एक गीले ब्रश का प्रयोग करें और उन्हें कांच की स्लाइड्स (फिगर 1C) पर ट्रांसफर कर दें । समय मचान ऐसी है कि कोषस्थों वांछित उंर तक पहुंचने जब माइक्रोस्कोप के तहत जीना इमेजिंग शुरू ।
    नोट: ये prepupae उनके शेप के मामले में उम्रदराज कोषस्थों की तरह दिखते हैं, लेकिन ये अब भी लार्वा की तरह सफेद होते हैं । prepupal चरण की शुरुआत puparium गठन (0 एच APF) के बाद 0 एच के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  4. मक्खी एक गीले ब्रश के साथ कोषस्थों से चिपके हुए भोजन के झुरमुट निकालें और एक stereomicroscope (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर ग्लास स्लाइड की ओर कोषस्थों के ventral पक्ष ओरिएंट. छोड़ कोषस्थों है कि अभी भी (बहुत युवा) चलती है या कि भूरे रंग (बहुत पुराना) बारी शुरू कर दिया है । यह सुनिश्चित करता है कि सभी कोषस्थों एक ही उंर (0-1 ज APF) है ।
  5. स्लाइड को जीनोटाइप, दिनांक और संग्रह के समय के साथ लेबल करें । एक पेट्री डिश के लिए गिलास स्लाइड स्थानांतरण प्रत्येक और बाहर सुखाने (चित्रा 1E) से कोषस्थों को रोकने के लिए एक गीले ऊतक जोड़ें ।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस या 27 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में कोषस्थों स्टोर जब तक वे वांछित उंर तक पहुंचने । इमेजिंग से पहले अगले चरण 1 ज के साथ जारी रखें, ताकि लाइव इमेजिंग (चरण 3) को प्रारंभ करते समय वांछित आयु कोषस्थों है, उदाहरण के लिए 13 ज APF में चित्र 2a-Dमें दिखाई गई मूवी के लिए ।
    नोट: जल्दी से संभव प्रारंभिक समय बिंदु के बाद सिर-eversion 27 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 ज APF में होने वाली कोषस्थों की है ।

2. इमेजिंग के लिए कोषस्थों तैयार करें

  1. सुनिश्चित करें कि कोषस्थों अब कांच स्लाइड के लिए छड़ी की तरह वे स्वाभाविक रूप से अवशिष्ट मक्खी भोजन की वजह से बोतलों की दीवारों से चिपके रहते हैं । कोई अतिरिक्त गोंद की आवश्यकता है । यदि कोषस्थों अच्छी तरह से उच्च आर्द्रता की वजह से छड़ी नहीं है, कुछ मिनट के लिए पेट्री डिश खोलने के लिए उंहें सूखी । वैकल्पिक रूप से, उंहें एक गिलास स्लाइड पर डबल पक्षीय टेप करने के लिए स्थानांतरण, लेकिन आमतौर पर, यह आवश्यक नहीं है ।
  2. अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों की इमेजिंग के लिए ुपाल मामले में खुली खिड़की (चित्र 1F; पेट की मांसपेशियों की इमेजिंग के लिए धारा २.३ के लिए छोड़ें.)
    1. ओरिएंट कोषस्थों एक stereomicroscope के तहत शोधकर्ता से दूर का सामना करना पड़ के साथ कांच स्लाइड से चिपके हुए । 2x के लिए ज़ूम समायोजित करें ।
    2. जीव विज्ञान ग्रेड #5 संदंश के एक छोर का उपयोग करना, धीरे ुपाल के मामले में एक छेद पंख पर प्रहार जहां पेट समाप्त होता है, और छाती शुरू होता है ।
    3. ुपाल मामला खुला टुकड़ा करने के लिए, धीरे पंख के साथ छाती के पूर्वकाल अंत करने के लिए संदंश चाल लेकिन कमजोर पंख ऊतक हानिकारक से बचें ।
      नोट: यदि pupa से द्रव लीक, यह क्षतिग्रस्त है; इसे छोड़ें और किसी भिंन pupa के साथ प्रारंभ करें ।
    4. संदंश के साथ छाती के ऊपर ुपाल मामले की धारा ऊपर उठा और फिर ठीक है, पृष्ठीय midline के विपरीत पक्ष पर तेज कैंची के साथ बंद इस अनुभाग में कटौती ।
  3. पेट की मांसपेशियों की इमेजिंग के लिए ुपाल मामले में खुली खिड़की (चित्रा 1G)
    1. ओरिएंट कोषस्थों एक stereomicroscope के तहत शोधकर्ता के दिशा में सामना करना पड़ के साथ कांच स्लाइड से चिपके हुए । 2x के लिए ज़ूम समायोजित करें ।
    2. जीव विज्ञान ग्रेड #5 संदंश के एक छोर का प्रयोग, धीरे विंग जहां छाती समाप्त होता है, और पेट शुरू होता है ुपाल मामले पृष्ठन में एक छेद प्रहार ।
    3. को ुपाल मामले खुला टुकड़ा, धीरे पेट के पीछे अंत की ओर संदंश चाल ।
      नोट: यदि pupa से द्रव लीक, यह क्षतिग्रस्त है; इसे छोड़ें और किसी भिंन pupa के साथ प्रारंभ करें ।
    4. संदंश के साथ पेट के ऊपर ुपाल मामले की धारा ऊपर उठा और फिर ठीक है, पृष्ठीय midline के विपरीत पक्ष पर तेज कैंची के साथ बंद इस अनुभाग में कटौती ।
  4. माउंट कोषस्थों (चित्र अ.ज)
    1. एक नाली के साथ एक प्लास्टिक स्लाइड के लिए पांच कोषस्थों को हस्तांतरण करने के लिए एक गीला ब्रश का प्रयोग करें (कस्टम-निर्मित, पुन: प्रयोज्य, चर्चा और सामग्री की सूची देखें) । नाली की गहराई और कोषस्थों की मोटाई के आधार पर प्रत्येक पक्ष के लिए एक या दो स्पेसर coverslips जोड़ें. प्रत्येक स्पेसर coverslip नीचे पानी की एक छोटी सी बूंद डाल करने के लिए यह स्लाइड करने के लिए छड़ी और नाली और हर तरफ स्पेसर coverslips के बीच कुछ जगह छोड़ दें ।
      नोट: स्पेसर coverslips भी स्थाई रूप से पहले से सुपर गोंद के साथ स्लाइड करने के लिए, संलग्न किया जा सकता है ।
    2. ओरिएंट कोषस्थों ऐसी है कि ुपाल मामले में खोलने ब्रश का उपयोग कर ऊपर के चेहरे । अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता के लिए सही कोण पर कोषस्थों की सावधान स्थिति सुनिश्चित करें । प्रत्येक ऊतक और विकास के समय बिंदु के लिए कोण का अनुकूलन ।
      नोट: नाली में पानी की एक छोटी राशि कोषस्थों की स्थिति आसान बनाता है । बाद में डूबने से बचने के लिए ब्रश के साथ अतिरिक्त पानी नाली ।
    3. उंहें छूने के बिना कोषस्थों के ऊपर एक coverslip (18 x 18 मिमी) पकड़ो । एक 20 µ l पिपेट का उपयोग कर coverslip पर प्रत्येक ुपाल मामले खोलने के ऊपर छोटी बूंदों (लगभग ०.५ µ l) को ५०% ग्लिसरॉल सॉल्यूशन के स्थान पर रखें ।
      नोट: इस कार्यविधि सुनिश्चित करता है कि कोषस्थों के रूप में समान रिक्ति बूंदों है ।
    4. coverslip पर मुड़ें और हाथ से कोषस्थों या संदंश (मानक #5) का उपयोग करके ऊपर की स्थिति है, जबकि coverslips के बगल कोषस्थों पर coverslip के एक तरफ आराम । अगले, धीरे कोषस्थों पर coverslip ड्रॉप । सुनिश्चित करें कि ुपाल मामले के उद्घाटन अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता के लिए ५०% ग्लिसरॉल के साथ ठीक से कवर कर रहे है और बाहर सुखाने से कोषस्थों को रोकने के लिए ।
    5. चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा के एक छोर पर गुना और उस छोर पर संदंश (मानक #5) के साथ इसे पकड़ो । धीरे टेप जगह ऐसी है कि यह शीर्ष coverslip के एक किनारे, स्पेसर coverslip (ओं) को शामिल किया गया है, और एक तरफ प्लास्टिक स्लाइड । टेप नीचे, अभी तक प्रेस मत करो । पहले, स्लाइड को चारों ओर घुमाएं और दूसरे पक्ष के लिए दोहराएं ।
    6. दोनों किनारों पर एक साथ टेप नीचे प्रेस करने के लिए दोनों सूचकांक उंगलियों का प्रयोग करें । यह प्रक्रिया सुनिश्चित करता है कि कोषस्थों विस्थापित नहीं हैं ।
    7. जांच करें कि क्या कोषस्थों coverslip के साथ संपर्क में हैं । इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता के लिए कोषस्थों धीरे coverslip के नीचे निचोड़ा जाना चाहिए । यदि आवश्यक हो तो स्पेसर coverslips की संख्या समायोजित करें ।
    8. स्लाइड को स्टिकी टेप पर लिख कर लेबल कर ᱶ ।

3. कोषस्थों की लाइव इमेजिंग

  1. बढ़ते विधि दोनों औंधा सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 1I) पर और ईमानदार सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 1J) पर कोषस्थों की इमेजिंग की अनुमति देता है । लाइव इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त फोकल सूक्ष्मदर्शी, दो फोटॉन सूक्ष्मदर्शी और कताई डिस्क फोकल सूक्ष्मदर्शी चाहे वे औंधा या ईमानदार है स्कैनिंग कर रहे हैं । लंबी अवधि की फिल्मों के लिए, यदि उपलब्ध हो तो तापमान नियंत्रित चरण का उपयोग करें ।
  2. नेत्र और एक यूवी लैंप या संचरण प्रकाश का उपयोग कर, एक pupa और pupa अंदर ध्यान का पता लगाएं ।
  3. कैमरा का उपयोग करना, वांछित संरचना खोजने के लिए और ज़ूम स्तर को समायोजित.
  4. लंबे समय तक फिल्मों के लिए, एक जेड-ढेर है कि अच्छी तरह से ब्याज की संरचना शामिल है परिभाषित (उदाहरण के लिए, अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों, उनके लगाव साइटों, पट्टा कोशिकाओं या aforementioned एक संयोजन) और एक समय अंतराल का चयन करें । बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए औसत करने पर विचार करें । उच्च गति, अल्पकालिक फिल्मों के लिए, एक उच्च फ्रेम दर को प्राप्त करने के लिए एक एकल जेड विमान का चयन करें ।
  5. सबसे अच्छा संभव संकेत लेकिन थोड़ा संतृप्ति देने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें । हालांकि, बहुत अधिक लेजर शक्ति समय के साथ pupa नुकसान कर सकते हैं ।
  6. इमेजिंग प्रारंभ करें और समय-समय पर चलचित्र की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो z-स्टैक स्थिति को समायोजित करने के लिए वापस ।

Figure 1
चित्रा 1: मांसपेशी की लाइव इमेजिंग के लिए कार्यप्रवाह-पट्टा morphogenesis में Drosophila कोषस्थों में । विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Representative Results

विभिंन ऊतकों को vivo में फ्लाई कोषस्थों के विकास में imaged किया जा सकता है, उंहें एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाने के लिए वयस्क अंगों के morphogenesis अध्ययन । इनमें अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों, tendons कोशिकाओं सहित छाती उपकला, विंग उपकला, पेट की मांसपेशियों और दिल22,23,24,25,26 , 27. यहां, हम मांसपेशी और पट्टा morphogenesis के लाइव इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित । अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी और पेट की मांसपेशी morphogenesis और अतिरिक्त तरीकों का एक विस्तृत वर्णन के लिए Drosophilaमें स्नायु जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए, हम Weitkunat और Schnorrer २०१४22के लिए पाठक का उल्लेख ।

अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों की लाइव इमेजिंग

dorsolongitudinal मांसपेशियों (DLMs) और dorsoventral मांसपेशियों (DVMs) से मिलकर अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों के दीर्घकालिक विकास का अध्ययन करने के लिए, गोलाकार Moesin actin-बाइंडिंग डोमेन के साथ टैग की गईं GFP (यूएएस-GFP-Gma) सभी में व्यक्त किया गया था स्नायु Myocyte बढ़ाने कारक 2 (Mef2)-GAL4 चालक (चित्रा 2a-D, फिल्म एस1) का उपयोग कर । इमेजिंग करने से पहले, ुपाल मामले में एक खिड़की छाती के ऊपर खोला गया था के रूप में चित्रा 1Fमें दिखाया गया है । एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप पर, जेड-पोट हर 20 मिनट के लिए 21 ≈ 11 puparium गठन (11 एच APF) के बाद एच में शुरू h के लिए अधिग्रहीत किया गया था । इस समय सीमा में, DLMs ( चित्रा 2a'-डी 'में हरे ओवरले) पहले tendons कोशिकाओं (आंकड़ा 2a) के लिए लगाव शुरू और फिर जबकि मांसपेशी संलग्नक परिपक्व (चित्रा बीसी) के विभाजन । अगला, myotubes छोटा (चित्र 2c) जब तक वे अंत में 30 एच APF (चित्रा 2 डी) में अधिक से अधिक संकुचित मंच तक पहुंचने । एक साथ लिया, इस फिल्म के घंटे के समय के पैमाने पर होते हैं कि मांसपेशी आकृति विज्ञान में नाटकीय परिवर्तन पर प्रकाश डाला गया.

Figure 2
चित्रा 2: अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी और पट्टा morphogenesis के लाइव इमेजिंग । (A-D) एक दो-फोटॉन मूवी (फिल्म एस सी) का उपयोग करते हुए Mef2-GAL4, यूएएस-GFP-Gma की अप्रत्यक्ष उड़ान actin मांसपेशियों (dorsolongitudinal, DLMs में हरे रंग में प्रकाश डाला की मांसपेशियों में A' के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग से समय अंक-डी ') और dorsoventral की मांसपेशियों ( DVMs, A'-डी ' में नीले रंग में प्रकाश डाला । पैमाने सलाखों १०० µm. (ई-एच) एक दो फोटॉन फिल्म (फिल्म S2) का उपयोग Duf-GAL4, यूएएस-सीडी-GFP अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों और छाती उपकला सहित tendons कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग से समय अंक हैं । पैनलों E'-एच ' प्रत्येक समय बिंदु पर मांसपेशी पट्टा प्रणाली के एक मॉडल के साथ एक ओवरले दिखाने के लिए, लंबे समय सेलुलर (हरा) मांसपेशियों के साथ संपर्क में पट्टा उपकला (रानी) द्वारा गठित एक्सटेंशन पर प्रकाश डाला । स्केल सलाखों १०० µm (imaged संरचनाओं के आकार से अनुमानित) हैं । (I-L) एक दो रंग, कताई डिस्क फोकल मूवी (मूवी S3) मांसपेशी पर ध्यान केंद्रित-पट्टा लगाव दीक्षा से समय अंक । पट्टा कोशिकाओं sr-GAL4, यूएएस-पाम-mCherry (रानी) और dorsolongitudinal Mhc-ताऊ-GFP (ग्रीन) के साथ अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों के साथ लेबल कर रहे हैं । स्केल पट्टियां 10 µm हैं । समय puparium गठन (APF) के बाद hh: mm के रूप में संकेत दिया है । ध्यान दें कि नहीं सभी फिल्में एक तापमान नियंत्रित मंच पर प्राप्त कर रहे थे, इसलिए, विकास के समय हट जाना हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक ही समय में पट्टा और मांसपेशी morphogenesis अध्ययन के लिए, झिल्ली बंधे GFP (यूएएस-सीडी-GFP) का उपयोग कर व्यक्त किया गया था चुप (Duf)-एक चालक के रूप में GAL4, जो दोनों tendons कोशिकाओं में व्यक्त की है और अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों (चित्रा 2E -एच, फिल्म S2) । एक z-पोट एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप पर लिया गया था हर 20 मिनट के लिए 16 ज APF में शुरू 20 ज । जबकि myotubes कॉम्पैक्ट ( चित्रा 2Eमें ग्रीन ओवरले'-एच '), पट्टा कोशिकाओं लंबे सेलुलर एक्सटेंशन है कि समय के साथ बढ़ाव ( चित्रा 2Eमें रानी ओवरले'-एच '). साथ में ले लिया, इस फिल्म vivo मेंपट्टा और मांसपेशी कोशिकाओं के बीच करीब एक साथ खेलने पर प्रकाश डाला गया ।

मांसपेशी की जांच करने के लिए और अधिक विस्तार में पट्टा संपर्क, दो रंग, उच्च आवर्धन इमेजिंग प्रदर्शन किया गया । कोषस्थों के साथ मायोसिन भारी चैन (Mhc)-ताऊ-GFP में DLMs और यूएएस-palmitoylated-mCherry (यूएएस-खजूर-mCherry) धारी (sr)द्वारा संचालित-tendons में GAL4 हर 5 एक कताई डिस्क पर ४.५ ज के लिए 12 ज APF में शुरू मिनट imaged थे फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2I-एल, मूवी S3) । 12 ज APF में, myotubes उनके tendons लक्ष्य कोशिकाओं की ओर पलायन करते हुए अपने सुझावों पर लंबे समय filopodia बनाने (चित्रा 2I) । बाद में, मांसपेशी और tendons ऊतक interdigitate (चित्रा 2J, कश्मीर) एक स्थिर लगाव बनाने के लिए । के रूप में लगाव परिपक्व, कम filopodia फार्म और मांसपेशी-पट्टा इंटरफेस smoothens (चित्रा 2L) । इस प्रकार, दो रंग, उच्च आवर्धन इमेजिंग रहने वाले जीव में विस्तार से सेलुलर गतिशीलता प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

उदर की मांसपेशियों की लाइव इमेजिंग

पेट की मांसपेशियों की लाइव इमेजिंग के लिए (चित्रा 3, मूवी S4), Mef2-GAL4> यूएएस-सीडी-GFP एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एक खिड़की ुपाल मामले में पेट के ऊपर खोला गया था के रूप में चित्रा 1Gमें विस्तृत. चित्रा 2a-डीमें प्रतिनिधित्व अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी फिल्म के लिए इसी तरह, गठन और उदर की मांसपेशियों के विकास के कई घंटे से अधिक का पालन किया जा सकता (मूवी S4 में ५५ ज) । इस समय के दौरान, myoblasts फ्यूज बढ़ myotubes (चित्रा 3) के रूप में । myotube सुझावों उनके पट्टा लक्ष्य करने के लिए विस्थापित, और पट्टा कोशिकाओं को संलग्न करने के बाद, मांसपेशियों की सिकुड़ा इकाइयों, sarcomeres, (चित्र बी-डी) का गठन कर रहे हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: पेट की मांसपेशी morphogenesis की लाइव इमेजिंग । (A-D) एक फिल्म से समय अंक (फिल्म S4) का उपयोग Mef2-GAL4, यूएएस-सीडी-GFP एक मार्कर के रूप में उदर की मांसपेशी morphogenesis का पालन करने के लिए. पैनलों A'-E ' एक उदर मांसपेशी सेट (हरा) के मॉडल के साथ ओवरले दिखाएँ जो कि ुपाल चरण के दौरान de नोवो बनाता है. स्केल पट्टियाँ हैं १०० µm. Time hh: mm APF के रूप में इंगित है । फिल्म कमरे के तापमान पर अधिग्रहीत किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मांसपेशियों हिल की लाइव इमेजिंग

चित्रा 2 और चित्रा 3के विपरीत, चित्रा 4 सेकंड के समय के पैमाने पर होने वाली मांसपेशी गतिशीलता से पता चलता है: मांसपेशी संकुचन की लाइव रिकॉर्डिंग. कोषस्थों एक्सप्रेस βPS-Integrin-GFP के तहत अंतर्जात नियंत्रण एक z में ०.६५ एस के एक समय संकल्प के साथ imaged थे एक फोकल माइक्रोस्कोप (फिल्म S5पर विमान) । चित्रा 4में प्रदर्शित उदाहरण में, तीन DVMs के लगाव साइटों (चित्रा 4a) 10 मिनट ४२ ज APF में शुरू करने के लिए imaged थे । इस समय के दौरान, पांच चिकोटी घटनाओं मनाया गया (चित्रा 4B-एफ), दिखा रहा है कि sarcomeres पहले से ही अच्छी तरह से इकट्ठा करने के विकास में इस समय बिंदु पर समंवित संकुचन का समर्थन कर रहे हैं । इसलिए, मांसपेशी हिल की इमेजिंग एक कार्यात्मक पढ़ें बाहर sarcomerogenesis के लिए पहले से ही अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों के विकास के दौरान28के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में उदाहरण के लिए उड़ान परीक्षण, जो केवल eclosion के बाद किया जा सकता है के लिए विरोध किया ।

Figure 4
चित्रा 4: मांसपेशियों हिल के लाइव इमेजिंग । (क) पहली बार एक फिल्म (फिल्म S5) से बिंदु ४२ में dorsoventral अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों की हिल दिखा रहा है APF का उपयोग कर βPS-Integrin-GFP एक मार्कर के रूप में । देखने के क्षेत्र में DVM द्वितीय 2, DVM iii 1 और DVM iii 2 की मांसपेशी लगाव साइटों रहे हैं । (ख-च) पांच व्यक्तिगत चिकोटी घटनाओं, चिकोटी (रानी) और चिकोटी घटना (हरे) के पहले फ्रेम से पहले फ्रेम दिखा प्रत्येक के रंग ओवरले । ध्यान दें कि व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर एक दूसरे से स्वतंत्र रूप से चिकोटी । तीर हिल गति पर प्रकाश डाला । फिल्म का समय संकल्प है ०.६५ s. स्केल बार्स 25 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

endogenously टैग की गईं प्रोटीन की लाइव इमेजिंग

βPS-Integrin-GFP के समान, अंतर्जात नियंत्रण के तहत Drosophila में व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का एक बड़ा संग्रह2,3,4उत्पन्न किया गया है । इन फ्लाई लाइनों उदाहरण के लिए उपसेलुलर स्थानीयकरण या ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संग्रह विशेष रूप से उपयोगी है, तो विशेष एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं या बिना किसी निर्धारण के vivo में प्रोटीन गतिशीलता की जांच की जरूरत है । चित्रा 5 endogenously के तीन उदाहरण से पता चलता है फ्लाई TransgeneOme (fTRG) पुस्तकालय, हू ली ताई शाओ (Hts)-GFP (चित्रा 5, बी), टलीं-GFP (चित्रा 5C, डी) से फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त की है और βTubulin60D-GFP ( चित्रा 5E, एफ) । इन प्रोटीन्स की अभिव्यक्ति से उन सभी ऊतकों में अध्ययन किया जा सकता है जो उन्हें स्वाभाविक रूप से अभिव्यक्त करते हैं । यहां, हम छाती उपकला (चित्र 5, सी, ई) और अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों या उनके लगाव साइटों (चित्रा 5B, डी, एफ) उदाहरण के रूप में दिखाते हैं ।

Figure 5
चित्रा 5: endogenously टैग प्रोटीन के लाइव इमेजिंग । (A, B) कोषस्थों व्यक्त Hts-GFP का लिया गया z-स्टैक का अधिकतम अनुमानों । (सी, डी) कोषस्थों व्यक्त टलीं-GFP का लिया गया z-स्टैक का अधिकतम अनुमानों । (E, F) कोषस्थों व्यक्त βTubulin60D-GFP का लिया गया z-स्टैक का अधिकतम अनुमानों । पैनलों ए, सी और ई 18, 24 और 18 एच APF, क्रमशः में छाती उपकला दिखाने के लिए, और पैनलों बी, डी और एफ अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों या 30 ज APF में अपने लगाव साइटों को दिखाते हैं । स्केल बार्स 25 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे छवि मांसपेशी को-पट्टा morphogenesis में रहने वाले Drosophila कोषस्थों के एक किस्म का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग । vivo इमेजिंग रणनीति में यह संपूर्ण जीव के अपने प्राकृतिक वातावरण में विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है सही विकास के समय बिंदु को खोजने के लिए विश्लेषण । उदाहरण के लिए, dorsolongitudinal अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों को ≈ 16 एच APF23 पर अपने पट्टा लक्ष्यों को लगाव शुरू जबकि पेट की मांसपेशियों को बाद में विकसित करने और दोनों सिरों पर संलग्न केवल 30 और ४० एच APF26के बीच । इसके फलस्वरूप पूर्व में प्रकाशित साहित्य को विकास के सही समय बिंदुओं का विश्लेषण करने के लिए खोजना चाहिए या, यदि उसके पहले के ऊतक या संरचना का विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है, तो समग्र विकास के लिए पहले विशेषता की जानी चाहिए.

कस्टम-निर्मित प्लास्टिक स्लाइड पर सफलतापूर्वक बढ़ते कोषस्थों के लिए, यह खांचे उपयुक्त आयाम है कि महत्वपूर्ण है: खांचे १.०-१.५ मिमी चौड़ा और ०.३-०.४ मिमी गहरी होने की जरूरत है । इस गहराई की जरूरत के रूप में स्पेसर coverslips के साथ शीर्ष coverslip के लिए सटीक दूरी का समायोजन करने की अनुमति देता है । हालांकि, कम से कम एक स्पेसर coverslip केशिका बलों द्वारा नमूने से दूर ग्लिसरॉल ५०% draining से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । नाली में कोषस्थों की सही स्थिति कुछ अनुभव की आवश्यकता है और इस तरह है कि ब्याज की संरचना के रूप में coverslip के लिए संभव के रूप में बंद है अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

यदि कोषस्थों की एक बड़ी संख्या में एक खुर्दबीन सत्र में imaged होना चाहिए, वे सब पहले से बढ़ सकता है और फिर एक मशीन में संग्रहित इमेजिंग तक उचित विकासात्मक समय सुनिश्चित करने के लिए । कोषस्थों पूरी प्रक्रिया जीवित रहना चाहिए और भी कम से eclose करने की कोशिश अगर इमेजिंग के बाद स्लाइड पर रखा । जीवित रहने की दर की जांच करने के लिए एक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इमेजिंग शर्तों कोषस्थों नुकसान ।

इमेजिंग सेटिंग्स को प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए । अल्पकालिक फिल्मों के लिए, एक उच्च संकेत बनाम शोर अनुपात एक उच्च फ्रेम दर को संतुलित करने की जरूरत है, जबकि अपेक्षाकृत उच्च लेजर शक्ति कोषस्थों बहुत ज्यादा नुकसान पहुंचाए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, लंबी अवधि की फिल्मों के लिए, लेजर शक्ति को एक मध्यम स्तर पर रखा जाना है और कोषस्थों लगातार नहीं बल्कि निश्चित समय बिंदुओं पर, उदाहरण के लिए, हर 20 मिनट में imaged किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए कि रुचि की संरचना दृश्य के फ़ील्ड से बाहर नहीं जाती है, यह समय बिंदुओं के बीच z-स्टैक की स्थिति को पुनः समायोजन करने के लिए आवश्यक हो सकती है. हमारे ज्ञान के लिए, प्रति ुपाल मामले के उद्घाटन से विकास के समय को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, एक तापमान नियंत्रित चरण लंबी अवधि फिल्मों के लिए उचित विकासात्मक समय सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इन विचारों को ध्यान में रखते हुए, अत्यधिक जानकारीपूर्ण फिल्मों का अधिग्रहण किया जा सकता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल मांसपेशी-पट्टा morphogenesis लेकिन यह भी अंय विकासशील ऊतकों, उदाहरण के लिए, विंग29उपकला की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के लिए केवल तीन संशोधनों की आवश्यकता है: (1) छाती या पेट के बजाय विंग के ऊपर ुपाल मामले के खोलने, (2) शीर्ष coverslip की ओर विंग के साथ कोषस्थों की स्थिति, और (3) अलग फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन का उपयोग करें । CRISPR/Cas9-प्रौद्योगिकी की उंनति के साथ, अधिक से अधिक endogenously टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन उपलब्ध हो जाएगा, क्योंकि यह और अधिक सीधा हो गया है लक्ष्य अंतर्जात loci में Drosophila30,31 , ३२. भविष्य में, यह elucidating कई प्रोटीन की गतिशीलता की अनुमति होगी, कोशिकाओं और उनके शारीरिक वातावरण में पूरे ऊतकों विस्तार में ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम फिल्म S3 के अधिग्रहण के लिए Manuela Weitkunat धंयवाद । हम उदार समर्थन के लिए रेइनहार्ड Fässler के आभारी हैं । यह काम EMBO यंग अंवेषक कार्यक्रम (F.S.), यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (एफ पी/2007-2013)/ERC अनुदान ३१०९३९ (F.S.), मैक्स प्लैंक सोसायटी (S.B.L., F.S.), के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था केंद्र नेशनल डे ला सूक्ष्म Scientifique (CNRS) (F.S.), द एक्सीलेंस इनिशिएटिव ऐक्स-मार्सैय यूनिवर्सिटी AMIDEX (F.S.), द LabEX-सूचित (F.S.) और द Boehringer Ingelheim शौकीन्स (S.B.L.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Leica MZ6 product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials) - - standard culture medium
paint brush da Vinci 1526Y size 1
microscope slides Thermo Scientific VWR: 631-1303 76 x 26 mm
double-sided tape (optional) Scotch 6651263 12 mm x 6.3 m
petri dishes Greiner Bio-One 632102 94 x 16 mm
paper tissues Th.Geyer 7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard) Fine Science Tools 11251-20 0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) Fine Science Tools 11252-20 0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-02 straight tip
plastic slides with a groove (reusable) custom-built - 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips Marienfeld 107032 18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol Sigma-Aldrich 49781 dilute to 50 % in water
adhesive tape Tesa 57370-02 1.5 mm x 10 m

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Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (132), e57312, doi:10.3791/57312 (2018).

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