Summary
Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .
Abstract
Ainsi que les tendons et le squelette, les muscles aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Morphogenèse de muscle est hautement conservée des animaux aux humains. Par conséquent, le puissant système de modèle drosophile permet d’étudier les concepts du développement de muscle-tendon qui peut également être appliquée à la biologie du muscle humain. Ici, nous décrivons en détail comment la morphogénèse du système tendon-muscle adulte peut être facilement photographiée sur la vie, développer des pupes de drosophile . Donc, la méthode permet d’enquêter sur les protéines, les cellules et les tissus dans leur environnement physiologique. Outre un protocole étape par étape avec des conseils utiles, nous donnent un aperçu complet des protéines de marqueur fluorescent étiqueté qui conviennent pour l’étude du système tendon-muscle. Pour mettre en évidence les multiples applications du protocole, nous montrer des films exemple allant de visualisation d’événements morphogénétiques à long terme – qui se produisent à l’échelle de temps des heures et des jours – à la visualisation des manoeuvres dynamiques comme les contractions musculaires qui se produisent sur une échelle de temps de secondes. Globalement, ce protocole devrait permettre au lecteur de concevoir et de réaliser des expériences d’imagerie live pour enquêter sur la morphogenèse muscle-tendon dans l’organisme intact.
Introduction
L’appareil muscle-tendon permet aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Les blocs de construction moléculaires du système tendon-muscle sont très conservés. Par conséquent, concepts du développement de muscle-tendon pertinente pour la biologie du muscle humain, par exemple la morphogenèse muscle muscle-tendon et l’auto-organisation myofibrillaire, peuvent être étudiés à l’aide de Drosophila melanogaster comme un facilement accessible système de modèle. Le système de pupes de drosophile a plusieurs avantages expérimentales. Tout d’abord, au stade nymphal – lorsque les muscles adultes sont constitués – l’organisme est sessile et donc faciles à l’image sur un microscope pendant des heures voire des jours. En second lieu, forme beaucoup de muscles assez sous la surface de pupe proche de sorte qu’ils peuvent être photographiés à l’intérieur de l’organisme intact, partiellement translucide. Troisièmement, les muscles peuvent être étudiées dans leur environnement naturel, où ils sont connectés à l’exosquelette formant par l’intermédiaire de cellules de tendon et tension des tissus est construite. Ce n’est pas possible dans les systèmes de culture des cellules musculaires. Et enfin, il existe une pléthore d’outils génétiques chez la drosophile. Parmi ceux-ci figurent plusieurs marqueurs fluorescent étiquetés permettant l’étiquetage des types spécifiques de cellules ou structures subcellulaires d’imagerie in vivo.
Le tableau 1 résume les principaux marqueurs utilisés pour l’étude de la morphogénèse de muscle-tendon. Il comprend les marqueurs surexprimés utilisant le système GAL4-UAS1 et endogène tag protéines marqueurs2,3,4. L’avantage du GAL4-UAS-système est que les marqueurs sont généralement exprimés à des niveaux élevés, ayant pour résultat un signal fort qui peut facilement être photographié en entier-Montez pupes. En outre, spécificité tissulaire est possible en choisissant soigneusement les pilotes GAL4. L’avantage des protéines de fusion exprimés sous contrôle endogène est que la dynamique des protéines respectifs peut être étudiés en vivo, elles aussi peuvent être utilisés comme marqueurs pour différents types de cellules ou structures subcellulaires spécifiques, par exemple, ΒPS-intégrine-GFP pour sites d’attachement musculaires. Ensemble, ces marqueurs offrent une grande flexibilité dans la conception expérimentale et le choix des problèmes de recherche qui peut être résolu maintenant et dans l’avenir.
| Structure de l’étiquette | Marqueur | Expression et localisation | Classe | Numéro de stock | Commentaire | Réf. | ||||||
| Muscle | Mef2-GAL4 | tous les myoblastes et tous les muscles à tous les stades | GAL4 ligne | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | précurseurs de muscle adulte et des myotubes début jusqu'à ≈24 h CSA | Ligne de GAL4, piège d’enhancer | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | sauter le muscle à la différenciation | GAL4 ligne | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA | GAL4 ligne | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA | Enhancer Act88F / promoteur conduite Cameleon 3.1 | - | Ca2 + indicateur | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA | GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne) | fTRG78 et fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Lui- nls-GFP | précurseurs de muscle adulte, nucléaires, jusqu'à ≈24 h CSA dans les muscles de vol indirect | Enhancer/promoteur avec journaliste nls-GFP | - | fragment de renforceur de 1,5 kb | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | microtubules dans les modèles de DLM et pour différencier les muscles | Enhancer/promoteur avec journaliste Tau-GFP | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | microtubules dans les myotubes (par exemple dans les muscles du vol indirect de h ≈14 AFP, diminuant fortement après ≈48 h CSA) | GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarcomères (filament épais) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA) | GFP-piège | - | Utilisez hétérozygote, un sous-ensemble de l’isoforme des étiquettes | 11 | |||||||
| SLS-GFP | sarcomères (Z-disque) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA) | GFP-trap (ligne FlyTrap) | - | G53, utilisation hétérozygote | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-disque dans tous les muscles du corps | GFP-trap (ligne FlyTrap) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-disque dans tous les muscles du corps | GFP-trap (ligne FlyTrap) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | liaison de l’actine ; exprimée dans l’épithélium, les myoblastes et les myotubes | GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | jonctions de cellules épithéliales, les myoblastes et les membranes dans les muscles à tous les stades | GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Site d’attachement de muscle | ΒPS-intégrine-GFP | sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle. | GFP-knock-in | - | 13 | |||||||
| Talin-GFP et mCherry- | sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle. | GFP-trap (ligne MiMIC) | - | 3 | ||||||||
| Talin-GFP | sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle. | GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| ILK-GFP | sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle. | GFP-trap (ligne FlyTrap) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP et - DP | sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle. | GFP-fusion (transgène) | - | 13 | ||||||||
| Tendon | SR-GAL4 | cellules de tendon de thorax, tout au long de la chrysalide | Ligne de GAL4, piège d’enhancer | BL 26663 | homozygotes létale | 14 | ||||||
| Musculaires et tendineuses | DUF-GAL4 | muscles et épithéliums, précoce | GAL4 ligne | BL 66682 | kirre-rP298, marqueur de cellules fondateur | 15 | ||||||
| SAMU-reporters | SAMU- GFP-Gma | liaison de l’actine | Ligne de SAMU | BL 31776 | domaine de liaison de l’actine de la moésine fusionnée à la GFP | 16 | ||||||
| SAMU- mCherry-Gma | liaison de l’actine | Ligne de SAMU | - | GMA fusionnée à mCherry | 17 | |||||||
| SAMU- Lifeact-GFP | liaison de l’actine | Ligne de SAMU | BL 35544 | 18 | ||||||||
| SAMU- Lifeact-Ruby | liaison de l’actine | Ligne de SAMU | BL 35545 | 18 | ||||||||
| SAMU-CD8-GFP | liaison de la membrane | Ligne de SAMU | divers stocks, par exemple : BL 32184 | 19 | ||||||||
| SAMU-CD8-mCherry | liaison de la membrane | Ligne de SAMU | BL 27391 et 27392 | 20 | ||||||||
| SAMU-palm-mCherry | liaison de la membrane par l’intermédiaire de palmitoylation | Ligne de SAMU | BL 34514 | SAMU- brainbow | 21 | |||||||
Tableau 1 : Tag fluorescent marqueurs protéiques pour l’étude muscle-tendon morphogenèse in vivo.
Ici, nous décrivons en détail comment l’imagerie de la morphogénèse du muscle-tendon en nymphes vivantes peut être effectuée facilement et avec succès (Figure 1). Alternativement, les pupes peuvent être fixés, disséqué et immunomarquage, qui permet en utilisant des anticorps d’également étiqueter les protéines pour lesquelles aucun vivre marqueurs sont disponibles22. Dans ce cas, la qualité d’image est généralement plus élevée, car il n’y a pas de mouvement et la structure d’intérêt peut être placée à proximité immédiate de la lamelle. Cependant, dissection et fixation peuvent mener aux dommages et moléculaire ou dynamique du tissu, par exemple, musculaires, ne peut être étudiée dans l’organisme vivant.
Protocol
1. nymphes de l’étape
- Mettre en place un croisement avec les femelles vierges de 20-40 et environ 20 hommes par bouteille de nourriture volée (Figure 1 a). Alternativement, si les stocks doit servir, mettez chaque stock dans de nouvelles bouteilles. Pour obtenir suffisamment de pupes, pensez à définir deux bouteilles par génotype.
- Incuber les flacons à 25 ° C (ou 27 ° C, selon le protocole expérimental) pendant cinq à six jours (Figure 1 b).
NOTE : Gardez renversant les mouches tous les deux ou trois jours pour éviter la surpopulation et d’assurer un approvisionnement continu des pupes. - Utilisez un pinceau humide pour recueillir les prénymphes blancs des parois des bouteilles et les transférer sur les lames de verre (Figure 1). La mise en scène du temps tel que les nymphes atteignent le désiré d’âge lors du démarrage direct imaging sous le microscope.
Remarque : Ces prénymphes ressemblent à des nymphes âgées en fonction de leur forme, mais elles sont toujours blanches comme des larves. Le début de la phase prénymphal est défini comme 0 h après formation puparium (0 h CSA). - Enlever les amas de nourriture mouche s’en tenir à la chrysalide avec un pinceau humide et orienter la face ventrale de la pupe vers la lame de verre à l’aide d’un stéréomicroscope (Figure 1). Jetez les nymphes qui sont toujours en mouvement (trop jeune) ou qui ont commencé à virer au brun (trop vieux). Cela garantit que toutes les nymphes ont le même âge (0 - 1 h CSA).
- Étiqueter les diapositives avec génotype, date et heure du Recueil. Transférer les lames de verre pour un plat de Pétri et ajouter un chiffon humide pour éviter que les pupes de se dessécher (Figure 1E).
- Stocker les pupes dans un incubateur à 25 ° C ou 27 ° C jusqu'à ce qu’ils atteignent l’âge désiré. Continuer avec les étapes suivantes 1 h avant l’imagerie, afin que les nymphes ont voulu l’âge lors du démarrage direct imaging (étape 3), par exemple à 13 h CSA pour le film illustré à la Figure 2 a-D.
NOTE : Le plus tôt possible temps départ est après tête-éversion de la pupe se produisant à 8-10 h CSA à 27 ° C.
2. préparer les pupes d’imagerie
- Veiller à ce que la pupe est maintenant colle à la lame de verre, comme naturellement, ils collent aux parois des bouteilles à cause de la nourriture mouche résiduelle. Pas de colle supplémentaire n’est requis. Si les nymphes ne collent pas assez bien à cause de la forte humidité, ouvrez la boîte de Pétri pendant quelques minutes pour laisser sécher. Vous pouvez également transférer sur ruban adhésif double-face sur une lame de verre, mais habituellement, ce n’est pas nécessaire.
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Fenêtre ouverte dans la pupe pour l’imagerie des muscles de vol indirect (Figure 1F; Passez à la section 2.3 pour l’imagerie des muscles abdominaux).
- Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure loin le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.
- À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où l’abdomen se termine, et le thorax commence.
- Pour trancher ouvert la pupe, doucement déplacer la pince à l’extrémité antérieure du thorax, le long de l’aile, mais éviter d’endommager les tissus vulnérables aile.
Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe. - Lever de la section de la pupe au-dessus du thorax avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.
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Fenêtre ouverte en pupe pour l’imagerie des muscles abdominaux (Figure 1)
- Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure vers le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.
- À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où finit le thorax et l’abdomen commence.
- Pour trancher ouvert la pupe, déplacez doucement la pince vers l’extrémité postérieure de l’abdomen.
Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe. - Lever de la section de la pupe au-dessus de l’abdomen avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.
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Montage de nymphes (Figure 1 H)
- Un pinceau humide permet de transférer jusqu'à cinq nymphes d’une glissière en plastique avec une rainure (voir Custom-Built, réutilisable, l’analyse et liste des matériaux). Ajouter une ou deux lamelles de cale d’espacement de chaque côté selon l’épaisseur de la pupe et de la profondeur de la rainure. Mettre une petite goutte d’eau sous chaque entretoise lamelle couvre-objet pour le faire coller à la diapositive et laisser de l’espace entre le groove et les lamelles de l’entretoise de chaque côté.
Remarque : Les lamelles de l’entretoise peut également être fixé en permanence à la diapositive avec la super colle, à l’avance. - Orienter les pupes telle que l’ouverture dans la pupe fait face vers le haut à l’aide de la brosse. Assurer un positionnement attentif de la pupe à l’angle correct pour la bonne qualité d’imagerie. Optimiser l’angle pour chaque tissu et chaque point dans le temps du développement.
Remarque : Une petite quantité d’eau dans la rainure rend plus facile de positionnement de la pupe. Égoutter le surplus d’eau avec la brosse ensuite pour éviter la noyade. - Tenir un lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) au-dessus de la pupe sans y toucher. Placer de petites gouttelettes (environ 0,5 µL) de solution de glycérol à 50 % au-dessus de chaque pupe ouvrant sur la lamelle couvre-objet à l’aide d’une pipette 20 µL.
Remarque : Cette procédure s’assure que les gouttelettes ont le même espacement que les nymphes. - Retournez la lamelle et positionnez-le au-dessus de la pupe à la main ou avec une pincette (standard #5) tout en se reposant d’un côté de la lamelle couvre-objet sur l’entretoise lamelles couvre-objet à côté de la pupe. Ensuite, doucement tomber la lamelle sur la pupe. S’assurer que les ouvertures affaire pupes sont correctement couvert avec 50 % de glycérol pour imagerie de bonne qualité et pour éviter que les pupes ne se dessèchent pas.
- Pliez sur une extrémité d’un morceau de ruban adhésif et l’attraper avec une pince (standard #5) à cette fin. Placez délicatement la bande tels qu’elle recouvre une extrémité de la lamelle supérieure, la coverslip(s) de l’entretoise et la lame en plastique sur un côté. N’appuyez pas vers le bas de la bande, encore. Tout d’abord, tournez la diapositive et répéter pour l’autre côté.
- Utiliser deux doigts pour appuyer la bande simultanément sur les deux côtés. Cette procédure garantit que les nymphes ne sont pas déplacés.
- Vérifiez que les nymphes soient bien en contact avec la lamelle. Pour une qualité optimale d’imagerie les pupes doivent être pressés doucement sous la lamelle. Ajuster le nombre de lamelles entretoise si nécessaire.
- L’étiquette de la diapositive en écrivant sur le ruban adhésif.
- Un pinceau humide permet de transférer jusqu'à cinq nymphes d’une glissière en plastique avec une rainure (voir Custom-Built, réutilisable, l’analyse et liste des matériaux). Ajouter une ou deux lamelles de cale d’espacement de chaque côté selon l’épaisseur de la pupe et de la profondeur de la rainure. Mettre une petite goutte d’eau sous chaque entretoise lamelle couvre-objet pour le faire coller à la diapositive et laisser de l’espace entre le groove et les lamelles de l’entretoise de chaque côté.
3. vivre d’imagerie des chrysalides
- La méthode de montage permet l’imagerie de la pupe des microscopes inversés (Figure 1I) tant sur les microscopes verticale (Figure 1J). Particulièrement adapté à l’imagerie live numérisez microscopes confocaux, deux photons microscopes et microscopes confocaux de rotation disque indépendamment de savoir si ils sont inversés ou redressée. Pour les films à long terme, utiliser une étape de contrôle de la température, si disponible.
- À l’aide de l’oculaire et une lampe UV ou la transmission lumineuse, repérez une chrysalide et la mise au point à l’intérieur de la chrysalide.
- À l’aide de la caméra, trouver la structure désirée et ajustez le niveau de zoom.
- Pour les films à long terme, définir une z-pile qui englobe la structure d’intérêt bien (par exemple, les muscles de vol indirect, leurs sites de fixation, les cellules de tendon ou une combinaison de ce qui précède) et choisissez un intervalle de temps. Envisager de faire une moyenne pour une meilleure qualité d’image. Pour les films à grande vitesse, à court terme, choisissez un seul z-plan pour atteindre un taux de rafraîchissement élevé.
- Ajuster la puissance du laser pour donner le meilleur signal possible mais peu de saturation. Cependant, puissance du laser trop élevé peut endommager la nymphe au fil du temps.
- Démarrez l’imagerie et retourner de temps en temps pour vérifier le film et réajuster le positionnement de z-pile si nécessaire.
Figure 1 : flux de travail pour l’imagerie Webcam live de la morphogénèse du muscle-tendon en pupes de Drosophila . Voir le protocole pour plus de détails. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Representative Results
Divers tissus peuvent être imagé in vivo dans le développement des mouches nymphes, ce qui les rend un système modèle idéal pour étudier la morphogenèse des organes adultes. Parmi ceux-ci sont les muscles de vol indirect, l’épithélium de thorax, y compris les cellules de tendon, l’épithélium de l’aile, muscles abdominaux et le coeur22,23,24,25,26 , 27. ici, nous nous concentrons sur l’imagerie Webcam live de la morphogénèse musculaires et tendineuses. Pour une description détaillée des muscles de vol indirect et morphogenèse des muscles abdominaux et des méthodes supplémentaires pour étudier la biologie du muscle chez la drosophile, nous renvoyons le lecteur à Weitkunat et Schnorrer 201422.
Vivre d’imagerie des muscles de vol indirect
Pour étudier le développement à long terme des muscles du vol indirect comprenant les muscles dorsolongitudinaux (DLMs) et les muscles dorsoventral (DVMs), globulaire moésine domaine de liaison de l’actine tag avec GFP (SAMU -GFP-Gma) a été exprimé dans tous les muscles en utilisant le facteur de renforceur de Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 pilote (Figure 2 a-D, Film S1). Avant l’imagerie, une fenêtre dans la pupe a été ouverte au-dessus de la cage thoracique, comme sur la Figure 1F. Sur un microscope biphotonique, z-cheminées ont été acquis toutes les 20 min de 21 h à partir de ≈11 h après formation puparium (11 h CSA). Dans ce laps de temps, les DLMs (vert superpositions en Figure 2 a'-D') tout d’abord ouvrir la pièce jointe aux cellules tendineux (Figure 2 a) et ensuite divisé alors que les attaches musculaires matures (Figure 2 b). Ensuite, les myotubes raccourcir (Figure 2) jusqu'à ce qu’ils atteignent enfin la scène compactée au maximum à 30 h CSA (Figure 2D). Pris ensemble, ce film met en lumière des bouleversements dans la morphologie du muscle qui se produisent à l’échelle de temps d’heures.
Figure 2 : imagerie de la morphogénèse musculaires et tendineuses de vol indirect en direct. (A-D) Fois points d’un film de deux photons (film S1) à l’aide de Mef2-GAL4, SAMU- GFP-Gma comme marqueur pour l’actine dans les muscles de vol indirect consistant en les muscles dorsolongitudinaux (DLMs, surlignés en vert a "-D") et les muscles dorsoventral ( DVMs, surlignés en bleu a "-D"). Barreaux de l’échelle est de 100 µm. (E-H) moments d’un film de deux photons (film S2) à l’aide de Duf-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur des muscles du vol indirect et l’épithélium du thorax dont les cellules du tendon. Panneaux E'-H' afficher une incrustation avec un modèle du système tendon-muscle à chaque moment, mettant en évidence les extensions longues cellulaires formée par l’épithélium du tendon (magenta) en contact avec les muscles (vert). Barreaux de l’échelle est de 100 µm (estimée à partir des dimensions des structures de représentation). (J’ai-L) Fois les points d’un film confocal bicolore, tourne disque (film S3) mettant l’accent sur l’initiation de muscle-tendon accessoire. Les cellules de tendon sont étiquetés avec sr-GAL4SAMU-palm-mCherry (magenta) et le dorsolongitudinaux indirecte vol muscles avec Mhc -Tau-GFP (en vert). Barreaux de l’échelle est de 10 µm. le temps est indiqué comme hh : mm après formation puparium (APF). Notez que pas tous les films ont été acquis sur une étape de contrôle de la température, par conséquent, le calendrier du développement peut-être diverger. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Pour l’étude de morphogenèse tendon et le muscle en même temps, liée à la membrane GFP (SAMU -CD8-GFP) a été exprimé en Dumbfounded (Duf)-GAL4 comme chauffeur, qui s’exprime aussi bien dans les cellules des tendons et des muscles de vol indirect (Figure 2E -H, film S2). Une z-pile a été prise sur un microscope biphotonique toutes les 20 min à partir de 16 h CSA pour 20 h. Alors que les myotubes compact (overlay vert dans la Figure 2E'-H'), le tendon de cellules forme extensions longues cellulaire qui s’allongent avec le temps (magenta superposition dans Figure 2E'-H'). Pris ensemble, ce film met en lumière l’étroite interaction entre le tendon et le muscle cellules in vivo.
Pour étudier l’interaction des muscle-tendon plus en détail, deux couleurs, fort grossissement imagerie a été réalisée. Nymphes avec chaîne lourde de myosine (Mhc)-Tau-GFP dans la DLMs et SAMU -palmitoylées-mCherry (SAMU -palm-mCherry), conduit par stripe (sr)-GAL4 dans les tendons ont été photographié toutes les 5 min à partir de 12 h CSA pendant 4,5 heures sur un disque de rotation microscope confocal (Figure 2I-L, film S3). A 12 h CSA, les myotubes migrent vers leurs cellules cibles de tendon tout en formant de longs filopodes à leur extrémité (Figure 2I). Par la suite, les muscle et le tendon tissus pavimenteuses (Figure 2J, K) pour former une fixation stable. Avec la maturation de la pièce jointe, moins filopodes forme et l’interface de tendon-muscle lisse (Figure 2 L). Ainsi, l’imagerie bicolore, fort grossissement peut être utilisé pour révéler la dynamique cellulaire en détail dans l’organisme vivant.
Vivre la formation image des muscles abdominaux
Pour l’imagerie direct des muscles abdominaux (Figure 3film S4), Mef2-GAL4> SAMU-CD8-GFP a été utilisé comme un marqueur et une fenêtre a été ouverte au-dessus de l’abdomen dans la pupe comme indiqué dans la Figure 1. Comme dans le film de muscles de vol indirect représenté dans la Figure 2 a-D, la formation et la croissance des muscles abdominaux peuvent être suivis au cours de nombreuses heures de développement (h 55 dans film S4). Pendant ce temps, les myoblastes fusionnent pour former de plus en plus les myotubes (Figure 3 a). Les conseils de myotubes migrent vers leurs cibles de tendon, et après avoir branché sur les cellules de tendon, sont forment les unités contractiles des muscles, les sarcomères, (Figure 3 b-D).
Figure 3 : vivre l’imagerie de la morphogénèse des muscles abdominaux. (A-D) Fois les points d’un film (film S4) à l’aide de Mef2-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur pour suivre la morphogenèse des muscles abdominaux. Panneaux A'-E' afficher les superpositions avec les modèles d’un ensemble de muscles abdominaux (vert) qui se forme en reprenant le stade pupal. Barreaux de l’échelle est de 100 µm. le temps est indiqué comme hh : mm CSA. Le film a été acquis à la température ambiante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vivre d’imagerie des contractions des muscles
Contrairement à la Figure 2 et Figure 3, Figure 4 montre la dynamique musculaire survenant à l’échelle de temps de secondes : l’enregistrement live de contractions musculaires. Nymphes exprimant βPS-intégrine-GFP sous contrôle endogène ont été photographiés avec une résolution temporelle de 0,65 s dans un seul plan z sur un microscope confocal (Film S5). Dans l’exemple illustré à la Figure 4, les sites de fixation de trois DVMs (Figure 4 a) ont été projetés pendant 10 min à partir de 42 h CSA. Pendant ce temps, contraction de cinq événements ont été observés (Figure 4 b-F), montrant que les sarcomères sont déjà assemblés assez bien pour soutenir les contractions coordonnées à ce point dans le temps dans le développement. Par conséquent, imagerie des contractions musculaires peut servir une lecture fonctionnelle pour sarcomerogenesis déjà pendant le développement musculaire vol indirect28, par opposition à par exemple essais en vol, qui ne peut être effectuée qu’après l’éclosion.
Figure 4 : imagerie des contractions des muscles en direct. (A) tout d’abord-point dans le temps d’un film (film S5) montrant les contractions des muscles de vol indirect dorsoventral à 42 h CSA en utilisant βPS-intégrine-GFP comme marqueur. Dans le champ de vision est le muscle sites d’attachement de DVM II 2, DVM III 1 et DVM III 2. (B-F) La couleur des superpositions de cinq épreuves individuelles de secousse, chacun montrant le cadre avant la secousse (magenta) et la première image de l’événement de la secousse (vert). Notez que les fibres musculaires individuels se contracter indépendamment les uns des autres. Flèches mettent en évidence le mouvement de contractions. La résolution temporelle du film est de 0,65 s. barres d’échelle sont 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Imagerie des protéines étiquetées de manière endogène en direct
Semblable à βPS-intégrine-GFP, une grande collection de protéines de fusion exprimés chez la drosophile sous contrôle endogène a été généré2,3,4. Ces lignes de mouche peuvent être utilisés pour étudier par exemple la localisation subcellulaire ou les profils d’expression des protéines d’intérêt. La collection est particulièrement utile si les anticorps spécifiques ne sont pas disponibles ou la dynamique des protéines doit être étudiés en vivo sans fixation. La figure 5 illustre trois exemples des protéines de fusion exprimée de façon endogène de la mouche TransgeneOme (fTRG) bibliothèque, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figure 5 a, B), Talin-GFP (Figure 5, D) et βTubulin60D-GFP ( Figure 5E, F). L’expression de ces protéines peut être étudiée dans tous les tissus qui les expriment naturellement. Ici, nous montrons l’épithélium du thorax (Figure 5 aC, E) et les muscles du vol indirect ou leurs sites de fixation (Figure 5 bD, F) comme exemples.
Figure 5 : imagerie Live de façon endogène tag protéines. (A, B) Maximums de prises des pupes exprimant Hts-GFP de z-cheminées. (C, D) Maximums de prises des pupes exprimant Talin-GFP de z-cheminées. (E, F) Maximums de prises des pupes exprimant βTubulin60D-GFP de z-cheminées. Panneaux A, C E montrent l’épithélium du thorax à 18, 24 et 18 h CSA, respectivement et panneaux B, D et F montrent les muscles de vol indirect ou leurs sites de fixation à 30 h CSA. Barreaux de l’échelle est 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le protocole présenté décrit l’image morphogenèse de muscle-tendon vie pupes de drosophile en utilisant une variété de protéines fluorescent étiquetées. Cette in vivo stratégie d’imagerie peut être utilisé pour étudier les processus de développement dans leur milieu naturel de l’organisme tout entier.
Il est crucial pour une expérience réussie trouver le point du développement de bonne heure à analyser. Par exemple, les muscles du vol indirect dorsolongitudinaux initialisent attachement à leurs cibles de tendon à ≈16 h CSA23 tandis que les muscles abdominaux se développent plus tard et les attachent aux deux extrémités qu’entre 30 et 40 h CSA26. Par conséquent, littérature publiée antérieurement doit être utilisée pour trouver les points de bon moment de développement pour analyser ou, si le tissu ou une structure d’intérêt n’a pas été étudiée en détail avant, le développement global doit être caractérisé d’abord.
Pour les nymphes de montage avec succès sur les glissières en plastique sur mesure, il est important que les rainures ont une taille convenable : le rainures doivent être 1,0-1,5 mm de large et 0,3 - 0,4 mm de profondeur. Cette profondeur permet d’ajuster la distance précise de la lamelle supérieure avec entretoise lamelles selon les besoins. Toutefois, au moins une entretoise lamelle devrait servir à éviter de vider le glycérol à 50 % de l’échantillon par des forces capillaires. Le positionnement correct de la pupe dans la rainure nécessite certaines expérience et doivent être optimisées de telle sorte que la structure d’intérêt est aussi proche que possible de la lamelle.
Si un grand nombre de nymphes est censé être photographiée sur la session d’un microscope, ils peuvent tous être montés au préalable et ensuite conservées dans un incubateur jusqu'à l’imagerie afin d’assurer la bonne synchronisation du développement. Les pupes devraient survivre à l’ensemble de la procédure et aussi au moins essayer d’eclose si gardé sur la diapositive après l’imagerie. Le taux de survie peut servir comme une lecture pour vérifier si les conditions d’imagerie nuisent les pupes.
Les paramètres d’imagerie doivent être choisis avec soin selon les conditions expérimentales. Pour les films à court terme, une fréquence d’images élevée par rapport à un rapport signal sur bruit élevé doit être équilibré, alors que la puissance relativement élevée de laser peut être utilisé sans endommager les pupes trop. Toutefois, pour les films à long terme, la puissance du laser doit être maintenu à un niveau modéré et les pupes ne doivent pas être photographiés en permanence mais plutôt à certains moments, par exemple, toutes les 20 min. Pour vous assurer que la structure d’intérêt ne se déplace pas hors du champ de vision, il peut être nécessaire de réajuster le positionnement de la z-pile entre points dans le temps. À notre connaissance, l’ouverture de la pupe en soi n’affecte pas calendrier du développement. Toutefois, une étape à température contrôlée devrait servir pour films à long terme pour assurer la bonne synchronisation du développement. Gardant ces considérations à l’esprit, très instructifs films peuvent être acquises.
Le protocole présenté permet de visualiser non seulement morphogenèse de muscle-tendon, mais aussi d’autres tissus en voie de développement, par exemple, l’aile épithélium29. Seulement trois modifications au présent protocole sont requises : (1) ouverture de la pupe au-dessus de l’aile au lieu du thorax ou l’abdomen, (2) positionnement des nymphes avec l’aile vers la lamelle supérieure et (3) l’utilisation de marqueur fluorescent différentes protéines. Avec l’avancement de la technologie CRISPR/Cas9, plus endogène étiquetés protéines fluorescentes seront disponibles, parce qu’il est devenu plus simple cibler des loci endogènes chez Drosophila30,31 , 32. dans l’avenir, ce qui permettra d’élucider la dynamique de nombreuses protéines, de cellules et de tissus ensemble dans leur environnement physiologique en détail.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Manuela Weitkunat pour l’acquisition de film S3. Nous sommes reconnaissants à Reinhard Fässler pour le soutien généreux. Ce travail a été soutenu par l’EMBO Young Investigator programme (F.S.), le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la Société Max Planck (S.B.L., F.S.), le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l’initiative d’excellence Aix-Marseille Université AMIDEX (F.S.), le LabEX-INFORM (F.S.) et le Fonds de Ingelheim Boehringer (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
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