Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

doi: 10.3791/57312 Published: February 6, 2018

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

Abstract

השרירים יחד עם הגידים, השלד מאפשרים בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. מורפוגנזה שריר מאוד כולו מבעלי חיים לבני אדם. לכן, שיטת מודל דרוזופילה ניתן ללמוד מושגים של פיתוח שרירים-הגיד כי ניתן להחיל גם הכוח האנושי לביולוגיה. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך מורפוגנזה של מערכת השריר למבוגרים-הגיד יכול בקלות לדימות חיי, פיתוח הגלמים דרוזופילה . לפיכך, השיטה מאפשרת לחקור חלבונים, תאים ורקמות בסביבה הפיזיולוגית שלהם. בנוסף פרוטוקול צעד אחר צעד עם עצות מועילות, אנו מספקים סקירה מקיפה של חלבונים סמן מתויגות fluorescently המתאימים הלומדים מערכת השריר-גיד. כדי להבליט את היישומים תכליתי של הפרוטוקול, אנחנו מקרינים סרט דוגמה החל ויזואליזציה של אירועים morphogenetic לטווח ארוך – המתרחשים על ציר הזמן של שעות וימים – כדי ויזואליזציה של תהליכים דינאמיים לטווח קצר כמו רעד שרירי המתרחשים סרגל זמן של שניות. יחדיו, פרוטוקול זה צריך לאפשר לקורא לעצב ולבצע הדמיה לחיות ניסויים על חקירת גיד השריר מורפוגנזה באורגניזם ללא פגע.

Introduction

המנגנון גיד השריר מאפשר בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. אבני הבניין מולקולרית של מערכת השריר-גיד מאוד נשמרים. לכן, המושגים של גיד השריר פיתוח שרלוונטית הכוח האנושי ביולוגיה, לדוגמה מורפוגנזה שריר, גיד השריר המצורף, ארגון עצמי myofibril, ניתן יהיה ללמוד באמצעות דרוזופילה melanogaster כמו נגישה בקלות מערכת מודל. מערכת הגולמי דרוזופילה יש מספר יתרונות ניסיוני. ראשית, על השלב הגולמי – כאשר השרירים למבוגרים נוצרות – האורגניזם הוא sessile וקל לכן תמונה על מיקרוסקופ על פני תקופה של שעות או אפילו ימים. שנית, רבים טופס השרירים קרוב מספיק מתחת לפני השטח הגולמי כך הם יכולים לדימות בתוך האורגניזם ללא פגע, שקוף חלקית. שלישית, השרירים יכול ייחקרו בתוך הסביבה הטבעית שלהם, הם מחוברים ויוצרים שלד חיצוני באמצעות גיד תאים בהם המתח רקמות נבנית. . זה לא אפשרי במערכות תרבות תא השריר. לבסוף, שפע של כלים גנטיים זמינה בדרוזופילה. בין אלה הם סמנים מתויגות fluorescently רבות המאפשרות תיוג של סוגי תאים מסוים או מבני subcellular עבור דימות in vivo.

טבלה 1 מסכמת את סמני החשוב ביותר עבור מורפוגנזה גיד השריר. זה כולל סמני overexpressed באמצעות ה GAL4-UAS-מערכת1 ו מתויג endogenously חלבון סמני2,3,4. היתרון של GAL4-UAS-המערכת הוא כי סמני מתבטאים בדרך כלל ברמה גבוהה, וכתוצאה מכך אות חזק זה יכול בקלות לדימות בכולה-הר הגלמים. בנוסף, ירידה לפרטים רקמות יכולה להיות מושגת על-ידי בחירה GAL4 נהגי בזהירות. היתרון של חלבונים פיוז'ן לידי ביטוי בשליטה אנדוגני הוא כי הדינמיקה של החלבונים המתאימים ניתן למדה ויוו, בעוד הם יכולים לשמש גם סמנים לסוגי תאים שונים או מבנים subcellular ספציפיים, לדוגמה, ΒPS-אינטגרין-GFP לאתרים המצורפים שריר. . יחד, סמנים אלה מספקות גמישות גבוהה עיצוב ניסיוני, הבחירה של מחקר בעיות יכולות להיפתר עכשיו ובעתיד.

מבנה עם תוויות סמן הביטוי ולוקליזציה מחלקה מספר מניות תגובה Ref.
שריר Mef2-GAL4 כל myoblasts ואת כל השרירים בכל שלבי GAL4 קו BL 27390 5
1151-GAL4 מבשרי שריר למבוגרים, myotubes מוקדמת עד ≈24 h APF GAL4 קו, משפר מלכודת - 6
Act79B-GAL4 לקפוץ שריר על בידול GAL4 קו - 7
Act88F-GAL4 שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF GAL4 קו - 7
Act88F- Cameleon 3.1 שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF Act88F משפר יזם נהיגה Cameleon 3.1 - Ca2 + מחוון 8
Act88F-GFP שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף) fTRG78, fTRG10028 4
GFP - nls אותו מבשרי שריר למבוגרים, גרעיני, עד ≈24 h APF בשרירי טיסה עקיף משפר/יזם עם הכתב nls-GFP - פרגמנט משפר 1.5 kb 9
Mhc-טאו-GFP microtubules DLM תבניות, המבדילים השרירים משפר/יזם עם טאו-GFP כתב BL 53739 10
ΒTub60D-GFP microtubules ב- myotubes (למשל, שרירי תעופה עקיף של ≈14 h AFP, הפחתת בחריפות לאחר ≈48 h APF) GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף) fTRG958 4
Mhc-GFP (weeP26) sarcomeres (עבה פילמנט) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF) GFP-השמנה - השתמש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, תוויות תת-קבוצה של isoform 11
Sls-GFP sarcomeres (Z-דיסק) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF) GFP-השמנה (לגלי קו) - G53, שימוש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים 2
Zasp66-GFP Z-דיסק של כל השרירים בגוף GFP-השמנה (לגלי קו) BL 6824 ZCL0663 2 , 12
Zasp52-GFP Z-דיסק של כל השרירים בגוף GFP-השמנה (לגלי קו) BL 6838 G00189 2 , 12
. השודדים-GFP אקטין מחייב; לידי ביטוי אפיתל, myoblasts, myotubes GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף) fTRG585 4
Dlg1-GFP צמתי תא אפיתל, myoblasts וממברנות שרירים בכל שלבי GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף) fTRG502 4
האתר המצורף שריר ΒPS-אינטגרין-GFP שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) GFP-טוק-ב - 13
Talin-GFP ו- mCherry שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) GFP-השמנה (לחקות קו) - 3
Talin-GFP שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף) fTRG587 4
אפשריים-GFP שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) GFP-השמנה (לגלי קו) קיוטו 110951 (ZCL3111) ZCL3111, ZCL3192 2
יקבלו-GFP ו- RFP שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) GFP-פיוז'ן (transgene) - 13
גיד sr-GAL4 תאי גיד החזה, לאורך כל השלב הגולמי GAL4 קו, משפר מלכודת BL 26663 homozygous קטלני 14
שריר וגיד Duf-GAL4 השרירים ואת epithelia, התפרצות מוקדמת. GAL4 קו BL 66682 kirre-rP298, מייסד תא סמן 15
UAS-כתבים UAS- GFP-Gma איגוד אקטין קו UAS BL 31776 תחום הכריכה אקטין Moesin דבוקה GFP 16
UAS- mCherry-Gma איגוד אקטין קו UAS - Gma דבוקה mCherry 17
UAS- Lifeact-GFP איגוד אקטין קו UAS BL 35544 18
UAS- Lifeact-רובי איגוד אקטין קו UAS BL 35545 18
UAS-CD8-GFP איגוד ממברנה קו UAS מניות שונות, למשל: BL 32184 19
UAS-CD8-mCherry איגוד ממברנה קו UAS BL 27391 ו 27392 20
UAS-דקל-mCherry ממברנה מחייב דרך palmitoylation קו UAS BL 34514 UAS- brainbow 21

טבלה 1: מתויגות Fluorescently סמני חלבונים מתאימים ללמוד גיד השריר מורפוגנזה ויוו.

כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך ניתן לבצע הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב חי הגלמים ומוצלחת (איור 1). לחלופין, ניתן לתקן הגלמים, גזור, immunostained, אשר מאפשר באמצעות נוגדנים לתייג גם חלבונים אשר לא גרה סמני הינם זמינים22. במקרה זה, איכות הדמיה היא בדרך כלל גבוה יותר כי יש תנועה, ניתן למקם את המבנה של עניין בסמיכות coverslip. אולם, ניתוח של קיבוע יכול להוביל לנזק ומולקולרית או דינמיקה רקמות, לדוגמה, עוויתות שרירים, יכול להילמד רק בתוך האורגניזם החי.

Protocol

1. שלב הגלמים

  1. להגדיר את צלב עם 20-40 בתולה נקבות וזכרים כ-20 לכל בקבוק של אוכל לעוף (איור 1 א'). לחלופין, אם ייעשה שימוש במניות, להעיף כל מניה לתוך בקבוקים חדשים. כדי לקבל מספיק הגלמים, שקול להגדיר שני בקבוקים לכל גן # מושגים בסיסיים.
  2. תקופת דגירה את הבקבוקים-25 ° C (או 27 ° C לפי הדגם ניסיוני) של 5-6 ימים (איור 1B).
    הערה: תמשיך לדפדף הזבובים כל שלושה ימים כדי למנוע צפיפות יתר ולהבטיח אספקה רציפה של הגלמים.
  3. להשתמש במברשת רטובה לאסוף prepupae לבן מן הקירות של הבקבוקים ולהעביר אותם על השקופיות זכוכית (איור 1C). הגיע הזמן הזמני כך הגלמים להשיג את הרצוי גיל בעת התחלת חיים הדמיה במיקרוסקופ.
    הערה: prepupae האלה נראים כמו גלמים מבוגרת מבחינת צורתם, אבל הם עדיין לבן כמו הזחלים. תחילת השלב prepupal מוגדר 0 h לאחר היווצרות puparium (0 h APF).
  4. להסיר גושים של אוכל לטוס נדבקות הגלמים עם מברשת רטובה, אוריינט הצד הבטני של הגלמים לעבר השקופית זכוכית באמצעות של stereomicroscope (איור 1D). למחוק את הגלמים זה עדיין עוברים (גם צעירים) או זה החלו להיות חומים (זקן). פעולה זו מבטיחה כי כל גלמי יש באותו הגיל (0 - 1 h APF).
  5. תווית של השקופיות עם גנוטיפ, התאריך והשעה של אוסף. להעביר את השקופיות זכוכית אחד פטרי כל ולהוסיף ממחטה רטובה כדי למנוע הגלמים מתייבש (איור 1E).
  6. חנות הגלמים בתוך אינקובטור 25 ° C או 27 ° C עד שיגיעו לגיל הרצוי. להמשיך לשלבים הבאים h 1 לפני הדמיה, כך הגלמים יש את הרצוי גיל בעת הפעלת הדמיה בשידור חי (שלב 3), לדוגמה בשעה 13h APF בשביל הסרט שמוצג איור 2A-D.
    הערה: המוקדם ריאלי הזמן ונקודת ההתחלה היא לאחר ראש-eversion של הגלמים המתרחשים 8-10 h APF ב-27 º c

2. מכינים את הגלמים עבור הדמיה

  1. ודא כי הגלמים עכשיו לדבוק השקופית זכוכית בדיוק כמו הם מקל באופן טבעי הקירות של הבקבוקים בגלל שאריות אוכל לעוף. דבק נוספת נדרשת. אם הגלמים לא מקל מספיק טוב בגלל לחות גבוהה, פתח את צלחת פטרי למשך כמה דקות לאפשר להן להתייבש. לחלופין, להעביר אותם ל סרט הדבקה דו-צדדי על משטח זכוכית, אך בדרך כלל, זה לא נחוץ.
  2. חלון פתוח במקרה הגולמי עבור הדמיה של שרירי תעופה עקיף (איור 1F; דלג לסעיף 2.3 עבור הדמיה של שרירי הבטן).
    1. אוריינט הגלמים נדבקות השקופית זכוכית עם הפונה הקדמי הרחק החוקר תחת stereomicroscope. כוונן את הזום 2 X.
    2. משתמש קצה אחד של ביולוגיה כיתה #5 מלקחיים, בעדינות דקרו לתוך החקירה הגולמי הגבי לאגף מסתיים בבטן, בית החזה מתחילה.
    3. כדי לחתוך פתח את התיק הגולמי, בעדינות להזיז את המלקחיים לקצה הקדמי של בית החזה לאורך האגף אך למנוע נזק לרקמת הכנף פגיע.
      הערה: אם נוזל ידלוף מן הגולם, ניזוק; למחוק אותו ולהתחיל מחדש עם גולם שונים.
    4. להרים את המקטע של המקרה הגולמי מעל בית החזה עם המלקחיים, ואז לחתוך את סעיף זה בעזרת מספריים בסדר, חדים בצד השני של הקו האמצעי הגבי.
  3. חלון פתוח במקרה הגולמי עבור הדמיה של שרירי הבטן (איור 1 ג'י)
    1. אוריינט הגלמים נדבקות השקופית זכוכית עם הפונה הקדמי לכיוון החוקר תחת stereomicroscope. כוונן את הזום 2 X.
    2. משתמש קצה אחד של ביולוגיה כיתה #5 מלקחיים, בעדינות דקרו לתוך החקירה הגולמי הגבי לאגף מסתיים בית החזה, הבטן מתחילה.
    3. כדי לחתוך פתח את התיק הגולמי, הזז בעדינות המלקחיים לקראת הקצה האחורי של הבטן.
      הערה: אם נוזל ידלוף מן הגולם, ניזוק; למחוק אותו ולהתחיל מחדש עם גולם שונים.
    4. להרים את המקטע של המקרה הגולמי מעל הבטן עם המלקחיים, ואז לחתוך את סעיף זה בעזרת מספריים בסדר, חדים בצד השני של הקו האמצעי הגבי.
  4. הגלמים הר (איור 1 H)
    1. השתמש במברשת רטובה להעברת הגלמים עד חמישה לשקופית פלסטיק עם חריץ (לפי הזמנה, לשימוש חוזר, ראה דיון ורשימת חומרים). להוסיף coverslips מרווח אחד או שניים בכל צד בהתאם העומק של groove ואת העובי של הגלמים. לשים טיפה קטנה של מים מתחת לכל coverslip מרווח כדי להפוך אותו לדבוק השקופית ולהשאיר קצת מקום בין החריץ על coverslips מרווח בכל צד.
      הערה: coverslips מרווח יכול גם להיות לצמיתות מצורף אל השקופית עם דבק סופר, מראש.
    2. אוריינט הגלמים כזה כי הפתח במקרה הגולמי פונה כלפי מעלה באמצעות המברשת. ודא מיצוב זהיר של הגלמים בזווית הנכונה עבור איכות הדמיה טובה. למטב את הזווית עבור כל רקמות ונקודת הזמן התפתחותית.
      הערה: כמות קטנה של מים ב- groove הופך מיצוב של הגלמים קל יותר. מרוקנים את המים העודפים עם המברשת לאחר מכן כדי למנוע טביעה.
    3. החזק של coverslip (18 פרק 18 מ מ) מעל הגלמים מבלי לגעת בהם. תרסיס (כ- 0.5 µL) של 50% גליצרול פתרון מעל כל מקרה הגולמי הנפתחות coverslip באמצעות פיפטה 20 µL של המקום.
      הערה: הליך זה מבטיח כי טיפות יש את המרווח זהה כמו הגלמים.
    4. . תהפוך את coverslip ומקם אותה מעל הגלמים ביד או בעזרת מלקחיים (#5) בזמן מנוחה צד אחד של coverslip על coverslips מרווח ליד הגלמים. בשלב הבא, ירידה בעדינות את coverslip על הגלמים. ודא כי הפתחים במקרה הגולמי, מכוסים כהלכה גליצרול 50% עבור איכות הדמיה טובה וכדי למנוע הגלמים מתייבשת.
    5. מקפלים קצה אחד של פיסת סקוטש ולתפוס את זה עם מלקחיים (#5) בקצה הזה. מניחים בעדינות את הקלטת כזה כי זה מכסה את קצה אחד של coverslip העליון של coverslip(s) את מרווח, השקופית פלסטיק בצד אחד. אל תלחץ הקלטת, עדיין. ראשית, תסתובב השקופית וחזור עבור הצד השני.
    6. השתמש בשתי אצבעות אינדקס כדי לחץ כלפי מטה הקלטת בו זמנית בשני הצדדים. הליך זה מבטיח כי הגלמים הם לא שנעקרו מבתיהם.
    7. בדוק אם הגלמים נמצאים גם coverslip. לקבלת איכות הדמיה מיטבית הגלמים צריך בעדינות להתמצות מתחת coverslip. להתאים את מספר מרווח coverslips במידת הצורך.
    8. תווית בשקופית על-ידי כתיבה בקלטת דביק.

3. חיים הדמיה של הגלמים

  1. שיטת הרכבה מאפשרת הדמיה של הגלמים על הפוך מיקרוסקופים (איור 1I), וגם על זקוף מיקרוסקופים (איור 1J). במיוחד מתאים עבור סריקת הדמיה חיה מיקרוסקופ קונפוקלי, מיקרוסקופ שני הפוטונים, מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב ללא קשר אם הם הם הפוכים או זקוף. סרטים לטווח ארוך, להשתמש במה מבוקרי טמפרטורה אם הם זמינים.
  2. באמצעות את העינים, מנורת UV או שידור אור, אתר של גולם ונוחות בתוך הגולם.
  3. שימוש במצלמה, למצוא את המבנה הרצוי, התאימו את רמת הזום.
  4. סרטים לטווח ארוך, להגדיר z-מחסנית שמקיף את המבנה של עניין טוב (לדוגמה, השרירים טיסה עקיף, האתרים שלהם מצורף, תאי גיד או שילוב האמור), לבחור מרווח זמן. שקול עושה ממוצע של איכות תמונה טובה יותר. סרטים במהירות גבוהה, לטווח קצר, בחרו z-מטוס בודד כדי להשיג קצב מסגרות גבוה.
  5. התאם את עוצמת הלייזר כדי לתת את האות האפשרי הטוב ביותר אבל רוויה קטנה. עם זאת, עוצמת הלייזר גבוהה מדי עלולה לגרום נזק הגולם לאורך זמן.
  6. להתחיל הדמיה ולחזור מפעם לפעם לבדוק את הסרט, להתאים מחדש את מיקום z-מחסנית במידת הצורך.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה עבור הדמיה חיה של גיד השריר מורפוגנזה ב הגלמים דרוזופילה . ראה פרוטוקול לקבלת פרטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Representative Results

רקמות שונות יכולים להיות שבעורך ויוו בפיתוח הגלמים לעוף, הפיכתם מערכת מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה איברים למבוגרים. בין אלה הם השרירים טיסה עקיף, האפיתל החזה כולל תאי גיד, האפיתל כנף, שרירי הבטן, הלב22,23,24,25,26 , 27. כאן, אנו מתמקדים הדמיה חיה של שריר וגיד מורפוגנזה. לקבלת תיאור מפורט של טיסה עקיף שריר, שריר הבטן מורפוגנזה ושיטות נוספים ללמוד ביולוגיה השריר ב דרוזופילה, אנו מכנים את הקורא Weitkunat ו- Schnorrer 201422.

חיים הדמיה של שרירי תעופה עקיף

לימוד פיתוח ארוכת טווח של השרירים טיסה עקיף המורכב של השרירים dorsolongitudinal (DLMs) ואת השרירים dorsoventral (DVMs), Moesin הכדוריים אקטין מחייב תחום מתויג עם GFP (UAS -GFP-Gma) בא לידי ביטוי בכל השרירים באמצעות Myocyte משפר פקטור 2 (Mef2)-הנהג GAL4 (איור 2 א-D, הסרט S1). לפני הדמיה, חלון במקרה הגולמי נפתח מעל בית החזה, כפי שמוצג באיור 1F. במיקרוסקופ שני הפוטונים, z-במחסן נרכשו בכל 20 דקות עבור h 21 החל מ- ≈11 h לאחר היווצרות puparium (11 h APF). במסגרת זמן זו, DLMs (ירוק כיסויי איור2 א'-D') קודם ליזום מצורף אל תאי גיד (איור 2 א) ולאחר מכן תפצל בזמן הקבצים המצורפים שריר בוגר (איור 2B). בשלב הבא, myotubes לקצר (איור 2C) עד שיגיעו לבסוף הבמה מקסימאלית הדחוס ב 30 אבני APF (איור דו-ממדי). יחדיו, הסרט הזה מדגיש כי השינויים הדרמטיים של שריר מורפולוגיה המתרחשות על ציר הזמן של שעות.

Figure 2
איור 2: לחיות הדמיה של טיסה עקיף שריר וגיד מורפוגנזה. (י-ם) נקודות מתוך סרט שני הפוטונים (סרט S1) באמצעות Mef2זמן-GAL4, UAS- GFP-Gma כסמן של אקטין בשרירי טיסה עקיף המורכב של השרירים dorsolongitudinal (DLMs, מודגשים בירוק א' '-D'), (את השרירים dorsoventral DVMs, מוארים בכחול א' '-ד' '). גודל ברים הם 100 מיקרומטר. (E-H) זמן נקודות סרט שני הפוטונים (סרט S2) באמצעות Duf-GAL4UAS-CD8-GFP כסמן שרירי תעופה עקיף, לרבות גיד תאי האפיתל החזה. פנלים E'-H' הצג כיסוי עם מודל של מערכת השריר-גיד בכל נקודה בזמן, הדגשת בהרחבות זמן רב תאית הנוצרת על-ידי האפיתל גיד (מגנטה) בקשר עם השרירים (ירוק). גודל ברים הם 100 מיקרומטר (משוער לפי גודל מבני הדמיה). (אני-L) זמן נקודות מסרט שני צבעים, ספינינג דיסק קונאפוקלית (סרט S3) התמקדות גיד השריר מצורף חניכה. תאי גיד מסומנים בכיתוב sr-GAL4UAS-דקל-mCherry (מגנטה), את dorsolongitudinal עקיף טיסה שרירי עם Mhc -טאו-GFP (ירוק). גודל ברים הם 10 מיקרומטר. הזמן מסומן בתור hh: mm לאחר היווצרות puparium (APF). שים לב כי לא כל הסרטים נרכשו על הבמה מבוקרי טמפרטורה, לכן, תזמון התפתחותי עלול לסטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לימוד מורפוגנזה בגיד ו שרירים בו זמנית, ממברנה מכורך GFP (UAS -CD8-GFP) בא לידי ביטוי באמצעות Dumbfounded (Duf)-GAL4 כנהג, הבאה לידי ביטוי הן ב התאים הגיד והשרירים טיסה עקיף (איור 2E -H, הסרט S2). Z-מחסנית צולמה במיקרוסקופ שני הפוטונים כל 20 דקות החל מ- 16 ה APF עבור 20 h. ואילו myotubes קומפקטי (כיסוי ירוק באיור 2E'-H'), הגיד תאים הרחבות זמן הסלולר טופס להאריך עם הזמן (כיסוי מגנטה ב 2E איור'-H'). יחדיו, הסרט הזה מדגיש הגומלין קרוב בין ה גיד ושרירים תאים ויוו.

לחקור אותו גיד השריר אינטראקציה בפירוט רב יותר, בוצעה הדמיה שני צבעים, ההגדלה גבוהה. הגלמים עם שרשרת כבדה צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc)-טאו-GFP ב DLMs ו UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -דקל-mCherry) מונעים על ידי פס (sr)-GAL4 ב הגידים היו עם תמונה כל 5 דקות החל מ- 12 שעות APF במשך 4.5 h בדיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2I-L, הסרט S3). ב 12 שעות APF, myotubes נודדים לכיוון תאי היעד שלהם גיד תוך יצירת filopodia ארוך-הטיפים (איור 2I). לאחר מכן, שריר וגיד הרקמות interdigitate (דמות 2J, K) כדי ליצור קובץ מצורף יציב. כפי המצורף מתבגר, פחות filopodia טופס וממשק גיד השריר smoothens (איור 2 L). לפיכך, הדמיה שני צבעים, ההגדלה גבוהה יכול לשמש כדי לחשוף דינמיקה סלולר בפירוט האורגניזם החי.

חיים הדמיה של שרירי הבטן

עבור הדמיה חיה של שרירי הבטן (איור 3הסרט S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP שימש כסמן ונפתח חלון מעל הבטן במקרה הגולמי כמו מפורט ב איור 1 ג'י. בדומה לסרט שריר טיסה עקיף מיוצג באיור 2A-D, ההיווצרות והגידול של שרירי הבטן ניתן בעקבות במשך שעות רבות של פיתוח (h 55 ב S4 הסרט). במהלך תקופה זו, myoblasts הפתיל טופס גדל myotubes (איור 3 א). העצות myotube להגר ממטרותיהם גיד, לאחר צירוף אל תאי גיד, נוצרות היחידות כויץ של השרירים, sarcomeres, (איור 3B-D).

Figure 3
איור 3: לחיות הדמיה של שריר הבטן מורפוגנזה. (י-ם) נקודות מתוך סרט (סרט S4) באמצעות Mef2זמן-GAL4UAS-CD8-GFP כסמן לעקוב מורפוגנזה שריר הבטן. לוחות א '-ה ' הצג שכבות-על של מודלים של ערכה שריר הבטן (ירוק) המהווה de novo במהלך השלב הגולמי. גודל ברים הם 100 מיקרומטר. הזמן מסומן בתור hh: mm APF. הסרט נרכשה בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חיים הדמיה של בפקעת השרירים

בניגוד איור 2 ו- 3 איור, איור 4 מראה dynamics שרירים המתרחשים על ציר הזמן של שניות: הקלטה חיה של התכווצות שרירים. הגלמים לבטא βPS-אינטגרין-GFP תחת שליטה אנדוגני היו עם תמונה עם רזולוציה זמן של 0.65 s ב- z-מטוס בודד במיקרוסקופ קונפוקלי (S5 הסרט). בדוגמה המוצגת באיור4, האתרים מצורף של שלוש DVMs (איור 4A) היו עם תמונה 10 דקות החל מ- 42 h APF. בתקופה זו העיוות חמישה אירועים נצפו (איור 4B-F), מראה כי sarcomeres הם כבר התאספו מספיק טוב כדי לתמוך התכווצויות מתואמת בשלב זה הזמן בפיתוח. לפיכך, הדמיה של רעד שרירי יכול לשמש read-out תפקודית sarcomerogenesis כבר במהלך הטיסה עקיף שרירים פיתוח28, בניגוד למשל טיסה בדיקות, אשר יכול להתבצע רק לאחר וגיחתו.

Figure 4
איור 4: חיים הדמיה של בפקעת השרירים. (א) קודם הזמן-נקודת מסרט (סרט S5) מציג בפקעת של שרירי תעופה עקיף dorsoventral ב 42 h APF באמצעות βPS-אינטגרין-GFP כסמן. בתוך שדה הראייה הם השריר מצורף אתרים של DVM II 2, DVM III 1 ו 2 השלישי (אנגלית). (B-נ) צבע שכבות-על חמישה אירועים עווית בודדים, כל אחד מציג את המסגרת לפני העווית (מגנטה) ואת המסגרת הראשונה של האירוע עווית (ירוק). שימו לב כי סיבי השריר בודדים עווית בנפרד אחד מהשני. חצים להדגיש את התנועה עוויתות. הפתרון הזמן של הסרט הוא הם 0.65 סרגלי קנה מידה ס' 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חיים הדמיה של חלבונים מתויגות endogenously

דומה βPS-אינטגרין-GFP, אוסף גדול של חלבונים פיוז'ן לידי ביטוי דרוזופילה תחת שליטה אנדוגני היה שנוצר2,3,4. קווים אלה לעוף ניתן ללמוד לדוגמה subcellular לוקליזציה או את פרופילי ביטוי של חלבונים עניין. האוסף שימושי במיוחד אם נוגדנים ספציפיים אינם זמינים או דינמיקה חלבון צריך ובדוקים ויוו בלי קיבוע. איור 5 מציג שלוש דוגמאות של פיוז'ן endogenously ביטוי חלבונים מספריית TransgeneOme (fTRG) לעוף, Hu li shao טאי (Hts)-GFP (איור 5 א, ב'), Talin-GFP (איור 5C, D) וβtubulin60d-GFP ( איור 5E, F). הביטוי של חלבונים אלה ניתן יהיה ללמוד ברקמות כל לבטא אותם באופן טבעי. . הנה, אנחנו מראים האפיתל בית החזה (איור 5AC, E) ואת השרירים טיסה עקיף או האתרים שלהם מצורף (איור 5BD, F) כדוגמאות.

Figure 5
איור 5: הדמיה חיה של endogenously מתויג חלבונים. (A, B) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא Hts-GFP. (C, D) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא Talin-GFP. (E, F) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא βTubulin60D-GFP. לוחות A, C ו- E במופע האפיתל החזה 18, 24, 18 h APF, בהתאמה, לוחות B, D ו- F להראות את השרירים טיסה עקיף או האתרים שלהם מצורף ב 30 אבני APF. גודל ברים הם 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול הציג מתאר כיצד תמונת גיד השריר מורפוגנזה חי הגלמים דרוזופילה באמצעות מגוון של חלבונים fluorescently מתויגות. זה ויוו הדמיה אסטרטגיה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים פיתוחיים בסביבתם הטבעית של האורגניזם כולו.

זה הכרחי עבור ניסוי יירוט מוצלח לאתר את הנקודה הנכונה זמן התפתחותית לנתח. לדוגמה, שרירי תעופה עקיף dorsolongitudinal ליזום מצורף אל המטרות שלהם גיד-≈16 h APF23 בזמן שרירי הבטן לפתח מאוחר יותר ולצרף משני הכיוונים רק בין 30 ל-40 h APF26. כתוצאה מכך, ספרות שפורסמו קודם לכן יש להשתמש כדי למצוא את הנקודות בזמן הנכון של פיתוח לנתח או, אם רקמות או מבנה עניין לא נחקרה בהרחבה בעבר, ההתפתחות הכללית חייב להיות מאופיין קודם.

על הגלמים הרכבה בהצלחה בשקופיות פלסטיק לפי הזמנה, חשוב החריצים שיש מידות מתאים: חריצים צורך להיות 1.0-1.5 מ מ רחב ו- 0.3 - 0.4 מ מ עמוק. לעומק הזה מאפשרת כוונון המרחק המדויק coverslip העליון עם מרווח coverslips כנדרש. עם זאת, coverslip מרווח אחד לפחות אמור לשמש כדי למנוע ייבוש של גליצרול 50% מן המדגם על-ידי כוחות נימי. למקם נכון את הגלמים ב- groove דורש קצת ניסיון צריך להיות מותאם כזה כי המבנה של עניין הוא הכי קרוב ככל האפשר כדי coverslip.

אם מספר גדול של הגלמים אמור לדימות בהפעלה מיקרוסקופ אחד, הם יכולים כל להיות מותקן מראש, ולאחר מכן מאוחסנים בתוך אינקובטור עד הדמיה כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. הגלמים עליו לשרוד את כל ההליך, גם לפחות לנסות eclose אם שמר על השקופית לאחר דימות. שיעור ההישרדות יכול לשמש את הבדיקה כדי לבדוק אם התנאים הדמיה לפגוע הגלמים.

ההגדרות הדימות צריך להיבחר בקפידה בהתאם לדרישות ניסיוני. סרטים לטווח קצר, קצב גבוה לעומת יחס אות לרעש גבוה צריך להיות מאוזן, בעוד צריכת חשמל גבוהה יחסית לייזר יכול לשמש מבלי להזיק הגלמים מדי. עם זאת, סרטים לטווח ארוך, עוצמת הלייזר יש להישמר ברמה מתונה, הגלמים צריך לא לדימות באופן רציף אלא בנקודות מסוימות הזמן, לדוגמה, כל 20 דקות. כדי להבטיח כי המבנה של עניין לא זזה מתוך בתחום התצוגה, ייתכן צורך להתאים מחדש את מיקום z-המחסנית בין נקודות זמן. לידע שלנו, פתיחת התיק הגולמי כשלעצמה אינה משפיעה על תזמון התפתחותית. עם זאת, שלב מבוקרי טמפרטורה אמור לשמש לסרטים לטווח ארוך כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. שמירה על שיקולים אלה בחשבון, סרטים מאוד אינפורמטיבי ניתן לרכוש.

פרוטוקול שהוצגו ניתן להמחיש לא רק מורפוגנזה גיד השריר, אלא גם רקמות מתפתחות אחרות, לדוגמה, האגף אפיתל29. רק שלושה שינויים בפרוטוקול זה נדרשים: (1) פתיחה של המקרה הגולמי מעל הכנף במקום בית החזה או בבטן, (2) מיקום של הגלמים עם האגף לכיוון של coverslip העליון ו- (3) שימוש שונה פלורסנט סמן חלבונים. עם ההתקדמות של CRISPR/Cas9-הטכנולוגיה, חלבונים פלורסנט מתויג יותר endogenously יהיו זמינים, כי זה הפך להיות יותר ישירה למטרה לוקוסים אנדוגני ב דרוזופילה30,31 , 32. בעתיד, זה יאפשר שחקרתי את הדינמיקה של מספר חלבונים, תאים ורקמות כולו בסביבה הפיזיולוגית שלהם בפירוט.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים מנואלה Weitkunat על רכישת הסרט S3. אנחנו מודים Reinhard Fässler לתמיכה נדיבה. עבודה זו נתמכה על ידי EMBO יאנג החוקר התוכנית (יצירות), המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / 310939 גרנט ERC (יצירות), חברת מקס פלנק (S.B.L., יצירות), את המרכז הלאומי דה לה רשרש של (CNRS) (יצירות), יוזמה מצוינות AMIDEX באוניברסיטת אקס-מרסיי (יצירות), הודיעו LabEX (יצירות) ו- Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Leica MZ6 product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials) - - standard culture medium
paint brush da Vinci 1526Y size 1
microscope slides Thermo Scientific VWR: 631-1303 76 x 26 mm
double-sided tape (optional) Scotch 6651263 12 mm x 6.3 m
petri dishes Greiner Bio-One 632102 94 x 16 mm
paper tissues Th.Geyer 7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard) Fine Science Tools 11251-20 0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) Fine Science Tools 11252-20 0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-02 straight tip
plastic slides with a groove (reusable) custom-built - 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips Marienfeld 107032 18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol Sigma-Aldrich 49781 dilute to 50 % in water
adhesive tape Tesa 57370-02 1.5 mm x 10 m

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  2. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98, (26), 15050-15055 (2001).
  3. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8, (9), 737-743 (2011).
  4. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
  5. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176, (1), 143-148 (1996).
  6. Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124, (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
  7. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361, (2), 191-207 (2012).
  8. Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103, (11), 4311-4315 (2006).
  9. Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9, (1), e1003195 (2013).
  10. Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1, (5), 705-715 (2001).
  11. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165, (3), 1433-1441 (2003).
  12. Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9, (3), e1003342 (2013).
  13. Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25, (7), 847-857 (2015).
  14. Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12, (5), 751-766 (2007).
  15. Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1, (5), 691-703 (2001).
  16. Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239, (2), 215-228 (2001).
  17. Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
  18. Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192, (2), 307-319 (2011).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22, (3), 451-461 (1999).
  20. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343, (6173), 1244624 (2014).
  21. Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14, (5), 526-534 (2012).
  22. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68, (1), 2-14 (2014).
  23. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24, (7), 705-716 (2014).
  24. Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
  25. Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  26. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144, (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
  27. Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6, (4), 360-375 (2006).
  28. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144, (Pt A), 92-101 (2017).
  29. Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
  30. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194, (4), 1029-1035 (2013).
  31. Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4, (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
  32. Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111, (29), E2967-E2976 (2014).
<em>אין ויוו</em> הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב <em>דרוזופילה</em> הגלמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (132), e57312, doi:10.3791/57312 (2018).More

Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (132), e57312, doi:10.3791/57312 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter