Summary
Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.
Abstract
Tendon ve iskelet kasları hayvanlar insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere etkinleştirin. Kas morfogenez hayvanlardan insanlara son derece korunmuş. Bu nedenle, güçlü Drosophila modeli sistemi de insan kas Biyoloji için uygulanabilir kas-tendon geliştirme kavramlarını incelemek için kullanılabilir. Burada, biz ayrıntılı olarak nasıl morfogenez yetişkin kas-tendon sistemi kolayca yaşarken, yansıma Drosophila pupa geliştirme tarif. Bu nedenle, yöntemi proteinler, hücre ve fizyolojik çevre dokularda inceleyen sağlar. Yararlı ipuçları ile adım adım protokolüne ek olarak, biz kas-tendon sistemi eğitimi için uygundur fluorescently tagged marker proteinlerin kapsamlı bir genel bakış sağlar. Çok yönlü uygulamalar Protokolü'nün vurgulamak için biz uzun vadeli morfogenetik olayların görselleştirme arasında değişen-saat ve gün-kas seğirmesi gibi kısa süreli dinamik süreçler görselleştirme için zaman ölçeği üstünde meydana gelen örnek Filmler göstermek saniye zaman ölçeğinde meydana gelen. Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralını tasarlayın ve kas-tendon morfogenez olduğu gibi canlı soruşturma için canlı görüntüleme deneyler yapmak için okuyucu etkinleştirmeniz gerekir.
Introduction
Kas-tendon aparatı insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere hayvan sağlar. Moleküler yapı taşları olan kas-tendon sistemi son derece korunmuş. Bu nedenle, kas-tendon geliştirme için insan kas biyoloji, örneğin kas morfogenez, kas-tendon eki ve myofibril kendi kendine organizasyon, ilgili kavramları Drosophila melanogaster bir kolayca erişilebilir kullanarak okudu modeli sistemi. Drosophila pupa sistem çeşitli deneysel avantajları vardır. Ne zaman yetişkin kasları oluşur-ilk olarak, Pupa-organizma sesil ve bu nedenle basit-e doğru mikroskop üzerinde bir süre içinde saatler ya da günler görüntü aşamasındadır. İkinci olarak, birçok kasları formu kapatmak yeterli pupa yüzey altında böylece sağlam, kısmen saydam organizma içinde yansıma. Üçüncü olarak, kasları nerede tendon hücreleri ile şekillendirme exoskeleton bağlı oldukları ve doku gerilim inşa kendi doğal ortamlarında soruşturma olmaktır. Bu kas hücre kültürü sistemlerinde mümkün değildir. Ve son olarak, genetik araçları bir bolluk Drosophilaiçinde kullanılabilir. Bunlar arasında belirli hücre tipleri veya vivo içindegörüntüleme için hücre altı yapıları etiketlerine göre izin birçok fluorescently etiketli işaretleri.
Tablo 1 kas-tendon morfogenez çalışmak için kullanılan en önemli işaretleri özetler. 1 GAL4 UAS sistemi kullanarak overexpressed işaretleri içerir ve protein işaretleri2,3,4endogenously etiketli. GAL4 UAS sistemin avantajı işaretleri genellikle kolayca bütün Dağı pupa görüntüsü güçlü bir sinyal sonuçlanan yüksek düzeyde ifade olmasıdır. Buna ek olarak, doku özgüllük GAL4 sürücüleri dikkatle seçerek elde edilebilir. Füzyon proteinlerin endojen kontrol altında okudu vivo içindeilgili proteinler dinamikleri olabilir iken onlar da işaretleri farklı hücre tipleri veya belirli hücre altı yapıları için kullanılabilir örneğin avantajdır, βps Integrin GFP kas ek siteler için. Birlikte, bu işaretleri deneysel tasarım ve şimdi ve gelecekte çözülebilir araştırma sorunları çeşitli yüksek esneklik sağlar.
| Etiketli yapısı | Marker | İfade ve yerelleştirme | Sınıf | Stok numarası | Yorum | Ref. | ||||||
| Kas | Mef2-GAL4 | Tüm myoblasts ve tüm aşamalarında tüm kasları | GAL4 hattı | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | Yetişkin kas öncüleri ve ≈24 h APF kadar erken myotubes | GAL4 satır, artırıcı tuzak | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | kas farklılaşma üzerine atlamak | GAL4 hattı | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | GAL4 hattı | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | Act88F artırıcı / organizatörü sürüş Cameleon 3.1 | - | CA2 + göstergesi | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG78 ve fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Onu- nls GFP | Yetişkin kas öncüleri, nükleer, ≈24 h APF dolaylı uçuş kaslarda kadar | artırıcı/organizatörü nls-GFP reporter ile | - | 1,5 kb artırıcı parçası | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | mikrotübüller DLM şablonlar ve kasları ayırt | artırıcı/organizatörü Tau-GFP reporter ile | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | mikrotübüller (örneğin kaslarda dolaylı uçuş ≈14 h AFP, güçlü ≈48 h APF sonra azalan) myotubes içinde | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarcomeres (kalın filaman) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş) | GFP-tuzak | - | heterozigoz kullanın, bir izoformu alt etiketleri | 11 | |||||||
| SLS GFP | sarcomeres (Z-disk) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş) | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | - | G53, heterozigoz kullanımı | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-disk tüm vücut kasları | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-disk tüm vücut kasları | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | aktin bağlama; epitel, myoblasts ve myotubes ifade | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | epitel hücre kavşaklar, myoblasts ve tüm aşamalarında kaslarda membranlar | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Kas ek site | βps-Integrin-GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP knock | - | 13 | |||||||
| Talin GFP ve - mCherry | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-tuzak (taklit satır) | - | 3 | ||||||||
| Talin GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| İlk-GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP ve - RFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-füzyon (transgene) | - | 13 | ||||||||
| Tendon | SR-GAL4 | pupa aşaması boyunca Toraks tendon hücreleri | GAL4 satır, artırıcı tuzak | BL 26663 | homozigoz öldürücü | 14 | ||||||
| Kas ve Tendon | Duf-GAL4 | kas ve epiteli, erken başlangıçlı | GAL4 hattı | BL 66682 | kirre-rP298, kurucusu hücre işaretçisi | 15 | ||||||
| UAS-muhabirler | UAS- GFP-Gma | aktin bağlama | UAS hattı | BL 31776 | aktin bağlayıcı etki Moesin, GFP için erimiş | 16 | ||||||
| UAS- mCherry-Gma | aktin bağlama | UAS hattı | - | MCherry için erimiş Gma | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-GFP | aktin bağlama | UAS hattı | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS- Lifeact-Ruby | aktin bağlama | UAS hattı | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-GFP | membran bağlama | UAS hattı | çeşitli hisse senetleri, örneğin: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | membran bağlama | UAS hattı | BL 27391 ve 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-palm-mCherry | membran bağlama aracılığıyla palmitoylation | UAS hattı | BL 34514 | UAS- brainbow | 21 | |||||||
Tablo 1: Fluorescently protein işaretleri kas-tendon morfogenez vivo içindeçalışmak için uygun ekledi.
Burada, kolayca ve başarılı bir şekilde yaşayan pupa kas-tendon morfogenez görüntüleme nasıl yapılabilir biz ayrıntılı olarak tarif (şekil 1). Alternatif olarak, Pupa sabit olabilir, disseke ve aynı zamanda proteinler işaretleri Hayır canlı için etiketlemek için antikorlar kullanarak sağlar immunostained çoğu kullanılabilir22. Bu durumda, hiçbir hareket ve faiz yapısı coverslip yakın yerleştirildiğinden genellikle daha yüksek görüntü kalitesi. Ancak, diseksiyon ve fiksasyon hasar ve moleküler açabilir veya doku dinamikleri, örneğin, kas seğirmesi, sadece canlı organizma okudu olabilir.
Protocol
1. sahne pupa
- Bir haç ile 20-40 bakire kadın ve şişe başına yaklaşık 20 erkek sinek gıda (şekil 1A) ayarlayın. Alternatif olarak, her hisse senedi hisse senetleri kullanılacaksa yeni şişe ters çevirin. Yeterli pupa elde etmek için iki şişe başına genotip kurmaya çalışın.
- 25 ° C (ya da deneysel tasarım göre 27 ° C) şişe (şekil 1B) 5-6 gündür kuluçkaya.
Not: sinekler her iki veya üç gün aşırı kalabalık önüne geçmek ve pupa sürekli bir tedarik sağlamak için flipping tutmak. - Beyaz prepupae şişeleri duvarlarından toplamak ve cam slaytlara (şekil 1 c) aktarmak için ıslak bir fırça kullanın. Pupa istediğiniz ulaşmak böyle hazırlama zaman yaş mikroskop altında Imaging canlı başlatma sırasında.
Not: Bu prepupae onların şekil açısından büyük pupa gibi görünebilir ama onlar hala larvaları gibi beyaz. Prepupal sahne başlangıcı 0 h puparium oluşumu (0 h APF) sonra tanımlanır. - Sinek gıda pupa için ıslak bir fırça ile yapışmasını kümeleri kaldırmak ve bir stereomicroscope (şekil 1 d) kullanarak cam slayt doğru pupa ventral tarafına gelecek şekilde yönlendirin. Bu hala hareket ediyor (çok küçük) veya kahverengi açmak başlamıştır pupa atmak (çok eski). Bu tüm pupa aynı yaşta (0 - 1 h APF) elde etmenizi sağlar.
- Slaytlar genotip, Tarih ve saat koleksiyonu ile etiketleyin. Cam slaytlar bir petri kabına için her aktarım ve pupa (şekil 1E) kurumasını önlemek için ıslak mendil ekleyin.
- İstenilen yaş gelinceye pupa bir kuluçka 25 ° C veya 27 ° C saklayın. Böylece pupa istenen görüntüleme önce 1 saat sonraki adımlarla devam yaş canlı görüntüleme (Adım 3), örneğin, 13 h APF şekil 2A-Diçinde gösterilen film için başlatma sırasında.
Not: En erken uygun başlangıç zaman baş-eversiyon 8-10 h APF 27 ° C'de meydana gelen pupa, sonra noktasıdır
2. pupa görüntüleme için hazırlayın
- Sadece onlar doğal olarak kalan sinek gıda yüzünden şişeleri duvarlara sopa gibi pupa şimdi cam kaymak için sopa olun. Hiçbir ekstra yapıştırıcı gereklidir. Pupa yeterince yüksek nem nedeniyle sopa değil, petri kabına koyup kuruyuncaya kadar bırakın için birkaç dakika için açın. Alternatif olarak, onları bir cam slayt üzerinde çift taraflı bant aktarım, ama genellikle, bu gerekli değildir.
-
Açık pencere için düşsel dolaylı uçuş kaslarının pupa durumda (1F rakam; Bölüm 2,3 için karın kasları düşsel atlayın.)
- Araştırmacı bir stereomicroscope altında mesafede ön bakan ile cam slayt yapışmasını pupa gelecek şekilde yönlendirin. 2 X zoom ayarlayın.
- Biyoloji bir ucunu kullanarak #5 forseps, yavaşça sınıf bittiği yerde karın kanat dorsal pupa durumda içine bir delik poke ve toraks başlar.
- Pupa durumda açık dilim için hafifçe Toraks ve kanat boyunca anterior sonuna forseps hareket ama savunmasız kanat doku zarar vermemek.
Not: Eğer sıvısının pupa akması, hasar gördü; Bu atın ve yeniden farklı bir pupa ile başlamak. - Forseps ile yukarıda toraks pupa durum bölümünü kaldırın ve sonra bu bölüm dorsal orta hat karşı tarafta ince, keskin makasla kesilmiş.
-
Karın kasları görüntüleme için pupa durumda açık pencere (Şekil 1G)
- Araştırmacı bir stereomicroscope altında doğru ön bakan ile cam slayt yapışmasını pupa gelecek şekilde yönlendirin. 2 X zoom ayarlayın.
- Biyoloji bir ucunu kullanarak #5 forseps, yavaşça sınıf bittiği yerde Toraks kanat dorsal pupa durumda içine bir delik poke ve karın başlar.
- Pupa durumda açık dilim için hafifçe forseps karın arka sonuna doğru hareket ettirin.
Not: Eğer sıvısının pupa akması, hasar gördü; Bu atın ve yeniden farklı bir pupa ile başlamak. - Forseps ile karın üzerinde pupa durum bölümünü kaldırın ve sonra bu bölüm dorsal orta hat karşı tarafta ince, keskin makasla kesilmiş.
-
Mount pupa (Şekil 1 H)
- Islak bir fırça ile bir oluk (özel olarak oluşturulmuş, yeniden kullanılabilir, bkz: tartışma ve malzeme listesi) plastik bir slayt için en çok beş pupa aktarmak için kullanın. Her tarafı oluk derinliği ve pupa kalınlığına bağlı olarak bir veya iki boşluk ekleyici coverslips ekleyin. Küçük bir damla su altında slayt için sopa ve oluk ve spacer coverslips arasında her iki tarafta biraz boşluk bırakın yapmak her yer açıcı coverslip koymak.
Not: Çıta coverslips da kalıcı olarak süper yapıştırıcı, içeren önceden iliştirilebilir. - Öyle ki pupa durumda açılış yukarıya doğru fırça kullanarak yüzleri pupa gelecek şekilde yönlendirin. İyi görüntü kalitesi için doğru açıyla pupa konumlandırma dikkatli olun. Açı her doku ve gelişim süresi noktası için en iyi duruma getirme.
Not: Oluk su küçük bir miktar pupa daha kolay konumlandırma yapar. Daha sonra boğulma önlemek için fırça ile aşırı su tahliye. - Pupa yukarıda bir coverslip (18 x 18 mm) onlara dokunmadan tutun. % 50 gliserol çözüm 20 µL pipet kullanarak coverslip açılış pupa her durumda yukarıda küçük damlacıklar (yaklaşık 0.5 µL) yerleştirin.
Not: Bu yordam damlacıkları pupa olarak aynı aralığı elde etmenizi sağlar. - Coverslip ters çevirin ve pupa el ya da pupa yanında yer açıcı coverslips üzerinde coverslip bir tarafı istirahat ederken forseps (standart #5) kullanarak üzerinde konumlandırın. Sonra yavaşça coverslip pupa üzerine bırakın. Pupa büyük açıklıklar ile % 50 gliserol iyi görüntü kalitesi için ve pupa kurumasını önlemek için düzgün kaplıdır emin olun.
- Yapışkan bant parçası üzerinde bir ucunu katlayın ve forseps (standart #5) o sonunda ile yakala. Öyle ki en iyi coverslip, pul coverslip(s) ve bir tarafta plastik slayt bir kenarına kapsar yavaşça kaset yerleştirin. Teyp henüz bastırmayın. İlk olarak, slayt arkanı dön ve diğer taraf için tekrarlayın.
- Her iki işaret parmakları bant aynı anda her iki tarafta basın için kullanın. Bu yordam pupa değil yerlerinden sağlar.
- Pupa coverslip de temas halinde olup olmadığını kontrol edin. En iyi görüntü kalitesi için pupa yavaşça coverslip altında sıkışmış. Çıta coverslips sayısını ayarlayın.
- Yapışkan bant üzerindeki yazarak Slayt etiket.
- Islak bir fırça ile bir oluk (özel olarak oluşturulmuş, yeniden kullanılabilir, bkz: tartışma ve malzeme listesi) plastik bir slayt için en çok beş pupa aktarmak için kullanın. Her tarafı oluk derinliği ve pupa kalınlığına bağlı olarak bir veya iki boşluk ekleyici coverslips ekleyin. Küçük bir damla su altında slayt için sopa ve oluk ve spacer coverslips arasında her iki tarafta biraz boşluk bırakın yapmak her yer açıcı coverslip koymak.
3. canlı pupa görüntüleme
- Montaj yöntemi pupa görüntüleme ters mikroskoplar (1I rakam) ve dik mikroskoplar (şekil 1J) sağlar. Özellikle çoğu canlı görüntüleme tarama için confocal mikroskoplar, İki fotonlu mikroskoplar ve ne olursa olsun ister onlar ters dönen disk confocal mikroskoplar uygundur veya dik. Uzun vadeli filmler için bir ısı kontrollü sahne varsa kullanır.
- Göz ve bir UV lamba veya iletim ışık kullanarak bir pupa ve odak içinde pupa bulun.
- Kamera kullanarak, istenen yapı bulmak ve yakınlaştırma düzeyini ayarlayın.
- Uzun vadeli Filmler, faiz de (örneğin, dolaylı uçuş kasları, onların ek siteler, tendon hücreleri veya bir arada söz konusu) yapısını kapsayan bir z-yığın tanımlamak ve bir zaman aralığı seçin. Daha iyi görüntü kalitesi için ortalama yaptığını düşünün. Yüksek hızlı, kısa vadeli filmler için yüksek kare hızı elde etmek için tek bir z uçağı seçin.
- Lazer güç vermek en iyi olası sinyal ama küçük doygunluk ayarlayın. Ancak, çok yüksek lazer gücü zaman içinde pupa zarar verebilir.
- Görüntüleme başlatın ve zaman zaman filmin denetlemek ve gerekirse z-yığın konumlandırma yeniden düzenlemek için dönün.
Şekil 1: iş akışı Drosophila pupa kas-tendon morfogenez, canlı görüntüleme için. Ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı bkz:. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Representative Results
Çeşitli dokularda sinek pupa, yapım onları morfogenez yetişkin organlarının çalışma için bir ideal modeli sistem geliştirme görüntülü vivo içinde olabilir. Bunlar arasında dolaylı uçuş kas, tendon hücreleri de dahil olmak üzere göğüs epitel, kanat epitel, karın kasları ve kalp22,23,24,25,26 . , 27. biz kas ve tendon morfogenez canlı görüntüleme üzerinde odaklanabilir. Dolaylı uçuş kas ve karın kas morfogenez, Drosophilakas biyoloji okuyan için ek yöntemler ayrıntılı açıklaması için okuyucu Weitkunat ve Schnorrer 201422' ye bakın.
Dolaylı uçuş kaslarının Imaging yaşamak
Eğitim için uzun vadeli kalkınma dorsolongitudinal kas (DLMs) ve dorsoventral kas (DVMs), küresel Moesin aktin-bağlayıcı etki öğesini GFP (UAS -GFP-Gma) ile oluşan dolaylı uçuş kaslarının toplamda ifade edildi Myocyte artırıcı faktör 2 (Mef2)kullanılarak kas-GAL4 sürücü (şekil 2A-D, Film S1). Görüntüleme önce şekil 1Fiçinde gösterildiği gibi Toraks pupa durumda bir pencerede açıldı. İki fotonlu mikroskop, z-yığınlar her 20 dk ≈11 s puparium oluşumu (11 h APF) sonra başlayan 21 h için satın alınan. Bu süre içinde DLMs (yeşil şekil 2Abindirmeleri'-D') ilk eki tendon hücrelere (şekil 2A) başlatmak ve kas ekleri (şekil 2B) olgun süre sonra böl. Ardından, son olarak 30 h APF (şekil 2B) sonuna kadar sıkıştırılmış aşamada ulaşana kadar myotubes (şekil 2C) kısaltın. Birlikte ele alındığında, bu film saat zaman ölçeği üzerinde oluşan kas Morfoloji dramatik değişiklikleri vurgular.
Şekil 2: dolaylı uçuş kas ve tendon morfogenez görüntüleme yaşamak. (A-D) Zaman Mef2kullanarak iki fotonlu Film (film S1) puan-GAL4, UAS- GFP-Gma aktin dorsolongitudinal kasları oluşan dolaylı uçuş kasları için bir işaretleyici olarak (a yeşil vurgulanan DLMs,'-D') ve dorsoventral kasları ( DVMs, mavi a vurgulanmış '-D'). Ölçek çubukları 100 µm. (E-H) zaman nokta Dufkullanarak iki fotonlu Film (film S2) vardır-GAL4UAS-CD8-GFP dolaylı uçuş kas ve tendon hücreleri de dahil olmak üzere göğüs epitel avans olarak. Panelleri E'-H' uzun hücresel uzantıları vurgulayarak kasları (yeşil) ile temas tendon epitel (macenta) tarafından kurulan her zaman noktada bir bindirme bir kas-tendon sistemi modeli ile göstermek. Ölçek barlar 100 µm (Görüntülü yapıları boyutundan tahmini) vardır. (I-L) Puan zaman kas-tendon ek başlatma üzerinde odaklanan bir filmden iki renkli, iplik disk confocal (film S3). Tendon hücreleri srile etiketlenir-GAL4UAS-palm-mCherry (macenta) ve dolaylı dorsolongitudinal uçuş kasları Mhc -Tau-GFP (yeşil) ile. Ölçek çubukları nelerdir 10 µm. zaman belirtilir SS: DD puparium oluşumu (APF) sonra. Tüm filmler ısı kontrollü bir sahnede satın alınan, bu nedenle, gelişimsel zamanlama sapmak dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tendon ve kas morfogenez aynı anda çalışmak için membran bağlı GFP (UAS -CD8-GFP) kullanarak ifade edildi Dumbfounded (Duf)-GAL4 tendon hücreleri ve dolaylı uçuş kasları (şekil 2E hem de ifade edilir bir sürücü olarak -S, film S2). Bir z-yığın üzerinde iki fotonlu mikroskop her 20 dk 16 h APF 20 h için başlayan çekildi. Myotubes kompakt iken ( şekil 2Eyeşil kaplaması'-H'), tendon zamanla uzamış formu uzun hücresel uzantıları hücreleri ( şekil 2Emacenta kaplaması'-H'). Birlikte ele alındığında, bu film tendon ve kas hücreleri içinde vivoarasında yakın Interplay vurgulamaktadır.
Kas-tendon etkileşim daha ayrıntılı araştırmak için iki renkli, yüksek büyütme görüntüleme gerçekleştirildi. Pupa myosin ağır zincir (Mhc)ile-Tau-GFP DLMs ve UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) tarafından tahrik Şerit (sr)-GAL4 tendonlar içinde her 5 dk 12 h APF bir iplik disk üzerinde 4.5 h için başlayan görüntüsü confocal mikroskop (şekil 2I-L, film S3). APF 12 h myotubes karşı onların tendon hedef hücreleri uzun filopodia onların İpuçları (şekil 2I) şekillendirme sırasında geçirilir. Daha sonra kas ve tendon dokuları interdigitate (istikrarlı bir eki oluşturmak içinşekil 2J, K). Eki geliştikçe daha az filopodia formu ve kas-tendon arabirimi (Şekil 2 L) smoothens. Böylece, iki renkli, yüksek büyütme görüntüleme ayrıntılı canlı organizma olarak hücre dinamiği ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Karın kaslarının Imaging yaşamak
(Şekil 3film S4), karın kaslarının canlı görüntüleme için Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP bir işareti olarak kullanıldı ve karın içinde pupa durum ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde 1Golarak yukarıda bir pencere açılmıştır. Benzer şekilde şekil 2A-Dtemsil dolaylı uçuş kas film, oluşumu ve gelişmesi karın kasları geliştirme (55 h film S4) birçok saat içinde izlenebilir. Bu süre boyunca, myoblasts myotubes (şekil 3A) büyüyen forma sigorta. Myotube ipuçları tendon hedeflerine geçirin ve tendon hücrelere ekledikten sonra kas, sarcomeres, contractile birimleri oluşur (şekil 3B-D).
Şekil 3: karın kas morfogenez görüntüleme yaşamak. (A-D) Zaman Mef2kullanarak Film (film S4) puan-GAL4UAS-CD8-GFP bir işaretleyici olarak karın kas morfogenez izleyin. Panelleri A'-E' bindirmeleri de novo pupa aşamasında oluşturur bir karın kas set (yeşil) modelleri ile göstermek. Ölçek çubukları vardır 100 µm. zaman APF SS: DD belirtilen. Film oda sıcaklığında satın alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Kas seğirmesi görüntüleme yaşamak
Şekil 2 ve şekil 3aksine, şekil 4 saniye zaman ölçeği üzerinde meydana gelen kas dynamics gösterir: canlı kayıt kas kasılma. βps-Integrin-GFP endojen kontrol altında ifade pupa 0.65, saat çözünürlüklü görüntüsü tek z-uçağa confocal mikroskop (Film S5) s. Şekil 4' te gösterilen örnekte, üç DVMs (şekil 4A) ek sitelerin 10 dk 42 h APF başlangıç görüntüsü. Bu sırada, beş seğirme olaylar (şekil 4B-F), tespit edildi sarcomeres zaten yeterince iyi koordine kasılmalar bu zamanda noktada içinde gelişimini desteklemek için monte edilir olduğunu gösteren. Bu nedenle, kas seğirmesi, görüntüleme işlevsel bir okuma sarcomerogenesis için zaten sırasında dolaylı uçuş kas geliştirme28, örneğin yalnızca eclosion sonra gerçekleştirilebilir uçuş testleri yerine kullanılabilir.
Şekil 4: kas seğirmesi, görüntüleme yaşamak. (A) ilk kez-noktasından 42 h APF kullanarak dorsoventral dolaylı uçuş kaslarının seğirmesi βPS-Integrin-bir işareti olarak GFP gösteren bir film (film S5). Görüş alanı içinde kas DVM II 2, DVM III 1 ve DVM III 2 eki sitelerdir. (B-F) Bindirmeleri beş bireysel seğirme olayların her biri seğirme (macenta) önce belgili tanımlık çerçevelemek ve seğirme olay (yeşil) ilk karesini gösteren renk. Bireysel kas lifleri birbirinden bağımsız olarak seğirme unutmayın. Oklar tik hareket vurgulayın. Film zaman çözünürlüğü 0.65 s. ölçek çubukları 25 µm. olmasıdır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Endogenously tagged proteinlerin Imaging yaşamak
βps benzer-Integrin-GFP, geniş bir koleksiyon füzyon proteinlerin Drosophila içinde endojen kontrol altında oluşturulan2,3,4olmuştur. Bu sinek satırları örneğin hücre altı yerelleştirme ya da ilgi proteinlerin ifade profilleri eğitim için kullanılabilir. Koleksiyon belirli antikor kullanılabilir değil veya protein dynamics incelenen vivo içinde fiksasyon olmadan olmak gerekirse özellikle yararlıdır. Şekil 5 gösterir endogenously ifade füzyon protein üç örnek sinek TransgeneOme (fTRG) kütüphaneden Hu li tai shao (Hts)-GFP (şekil 5A, B), Talin-GFP (şekil 5C, D) ve βTubulin60D-GFP ( Rakam 5E, F). Bu proteinler ifade onları doğal olarak ifade tüm dokularda okudu olabilir. İşte, toraks epitel (şekil 5AC, E) ve dolaylı uçuş kasları veya eki sitelerinde (şekil 5BD, F) örnek olarak göstermektedir.
Şekil 5: canlı, endogenously Imaging öğesini proteinler. (a, B) Z-yığınlar Hts-GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. (C, D) Z-yığınlar Talin GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. (E, F) Z-yığınları βTubulin60D-GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. Paneller A, C ve E sırasıyla 18, 24 ve 18 h APF, toraks epitel gösterir ve B, D ve F dolaylı uçuş kasları veya kendi eki sitelerinde de 30 h APF göstermek panelleri. Ölçek barlar vardır 25 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Sunulan Protokolü kas-tendon morfogenez yaşayan görüntü açıklar Drosophila pupa fluorescently tagged proteinler çeşitli kullanarak. Bu strateji Imaging vivo içinde gelişimsel süreçleri tüm organizmanın doğal ortamda eğitim için kullanılabilir.
Bu analiz etmek için doğru gelişim süresi noktası bulmak başarılı bir deneme için çok önemlidir. Örneğin, karın kasları daha sonra geliştirirken ve sadece 30 ve 40 h APF26arasında her iki ucundaki eklemek dorsolongitudinal dolaylı uçuş kasları tendon hedeflerine ≈16 h APF23 eki başlatın. Sonuç olarak, önceden yayınlanmış edebiyat geliştirme analiz etmek için doğru zaman noktaları bulmak için kullanılması gereken veya doku veya faiz yapısını ayrıntılı önce araştırılmamıştır, genel geliştirme ilk karakterize edilebilir vardır.
Özel olarak oluşturulmuş plastik slaytlarda başarıyla montaj pupa için bu oluklar uygun boyutlara sahip önemlidir: 1.0-1.5 mm geniş ve 0.3 - oluklar gerek 0.4 mm derin. Bu derinliği ile gerektiği gibi yer açıcı coverslips üst coverslip kesin Uzaklik ayarlama sağlar. Ancak, en az bir boşluk ekleyici coverslip % 50 gliserol örnek uzak boşaltma önlemek için kılcal kuvvetler tarafından kullanılmalıdır. Oluk içinde pupa doğru konumlandırma bazı deneyim ve faiz yapısı coverslip için mümkün olduğu kadar yakın olacak optimize edilmelidir gerektirir.
Pupa, çok sayıda bir mikroskop oturumda yansıması gerekiyordu eğer onlar tüm önceden monte edilebilir ve daha sonra bir kuluçka makinesine uygun gelişim zamanlaması sağlamak için Imaging kadar saklı. Pupa yordamın tamamını hayatta kalmak ve ayrıca en az eclose için slayt üzerinde görüntüleme sonra devam deneyin. Sağkalım oranı bir okuma görüntüleme koşulları pupa zarar olup olmadığını kontrol etmek için kullanılabilir.
Görüntüleme ayarları dikkatle deneysel gereksinimlerine göre seçilmelidir. Kısa süreli filmler için yüksek kare hızı yüksek sinyal gürültü oranı karşı dengeli olabilir nispeten yüksek lazer güç-ebilmek var olmak kullanılmış pupa çok fazla zarar vermeden süre gerekiyor. Ancak, uzun vadeli Filmler, lazer gücü makul ses seviyelerinde tutulmalıdır ve pupa sürekli ziyade belli zaman noktalarda, örneğin, her 20 dk yansıması değil. Faiz yapısını görüş alanı dışında hareket etmez emin olmak için z-yığın zaman puan arasında konumlandırılması yeniden düzenlemek gerekli olabilir. Bilgimizi, Pupa dava açılması gelişimsel zamanlama başına etkilemez. Ancak, ısı kontrollü bir sahne uzun vadeli filmler için uygun gelişim zamanlaması sağlamak için kullanılmalıdır. Bu noktalar göz önünde tutulduğunda, son derece bilgilendirici Filmler elde edilebilir.
Sunulan protokolü hem de diğer gelişmekte olan dokular, örneğin, kanat epitel29kas-tendon morfogenez görselleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü yalnızca üç değişiklikler gereklidir: (1) yerine göğüs veya karın kanat yukarıda pupa davanın açılması, (2) pupa en iyi coverslip ve (3) doğru kanat ile farklı floresan marker proteinler kullanımı konumlandırma. Drosophila30,31 yılında endojen loci hedeflemek daha basit hale gelmiştir çünkü CRISPR/Cas9-teknoloji ilerlemesi ile daha fazla endogenously tagged floresan proteinler, kullanılabilir , 32. gelecekte, bu çok sayıda proteinler, hücre ve fizyolojik çevreleri ayrıntılı olarak tüm dokularda dinamikleri elucidating izin verir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Manuela Weitkunat film S3 edinimi için teşekkür ederiz. Cömert desteği Reinhard Fässler için sana şükrediyoruz. Bu eser tarafından EMBO Young araştırmacı programı (F.S.), Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında desteklenen / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck toplum (S.B.L., F.S.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), mükemmellik girişimi Aix-Marseille Üniversitesi AMIDEX (F.S.) LabEX BİLGİLENDİRMEK (F.S.) ve Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
