Summary
提出了一种不同刚度的聚乙烯醇-共衣酸凝胶的制备方法, 并与无肽接枝, 研究了生物材料的硬度对其分化和增殖的影响。干细胞。水凝胶的刚度受交联时间的控制。
Abstract
一些研究人员研究了物理线索, 如生物材料的硬度对干细胞增殖和分化的影响。然而, 这些研究人员大多用聚丙烯酰胺水凝胶进行干细胞培养。因此, 它们的结果是有争议的, 因为这些结果可能来源于聚丙烯酰胺的具体特性, 而不是生物材料的物理提示 (刚度)。在这里, 我们描述了一个用于制备水凝胶的协议, 它不是以聚丙烯酰胺为基础的, 它可以培养各种干细胞, 包括人类胚胎干细胞和人类诱导的多能干细胞 (iPS) 细胞。从 bioinert 聚乙烯醇-共衣酸 (P IA) 制备了不同刚度的水凝胶, 通过改变交联时间来控制交联度的刚度。以细胞外基质为基础, 研究了肽的 P IA 水凝胶作为干细胞培养和分化的未来平台。本文详细介绍了羊水干细胞、脂肪源性干细胞、人 ES 细胞和人类 iPS 细胞的培养和传代。肽的 P IA 水凝胶表现出优异的性能, 这是由它们的刚度特性引起的。该协议报告了生物材料的合成, 他们的表面操作, 以及控制的刚度性质, 最后, 它们对干细胞的命运的影响, 利用异的自由文化条件。根据最近的研究, 这种改良的基板可以作为未来的平台, 支持和指导各种干细胞线的命运, 以不同的联系;进一步, 再生和恢复失去的器官或组织的功能。
Introduction
干细胞分化为特定细胞谱系的命运和干细胞的长期增殖, 特别是人类诱导的多能 (iPS) 细胞和人类胚胎干细胞, 已知受抑制剂、生长因子和/或培养培养基中的小生物活性分子。最近, 生物材料的物理线索, 特别是细胞培养生物材料的硬度, 已被认为是一个重要的因素, 引导干细胞增殖和分化的命运1,2, 3、4、5、6。因此, 一些研究人员已经开始研究干细胞的命运, 它们在水凝胶上培养, 分化, 主要是采用不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶。
生物材料的硬度可以控制局灶粘连, 细胞形态学, 细胞表型和干细胞黏附, 特别是在二维 (2 维) 培养1,2,3,5。干细胞对生物材料的机械传感通常是通过整合素受体的黏着性信号来控制的。NMMIIA, nonmuscle 肌球蛋白 IIA 与肌动蛋白细胞骨架的依赖性收缩作用在2维细胞培养系统中的干细胞 mechanosensing 过程中起着至关重要的角色3,4,5, 7,8,9,10,11。
恩和他的同事们提出了一个有趣的观点, 即成体干细胞, 如骨髓干细胞培养的细胞培养生物材料具有类似的刚性与特定组织, 往往分化成细胞起源于特定的组织5。在膨胀介质中, 培养的2维软质聚丙烯酰胺水凝胶 (与脑组织的硬度可比) 被自发诱导分化为早期神经元谱系, 而 bms 细胞在在2维聚丙烯酰胺水凝胶3,5中, 与肌肉或胶原骨组织相似的水凝胶分别被发现诱导分化为心肌细胞和成骨细胞的早期谱系。许多研究者研究了胶原蛋白固定化培养的聚丙烯酰胺水凝胶的干细胞命运. i12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 但是, 应该提到一些相互矛盾的报告1,18,22,23,24为恩建议的知名的想法存在et al.5这是因为恩的想法5仅是在聚丙烯酰胺水凝胶上开发的, 其结果来源于生物材料 (聚丙烯酰胺) 的特定特性, 而不仅仅是物理提示 (刚度)生物材料因此, 开发另一种类型的水凝胶是很重要的, 其中的刚性可以通过交联凝胶来控制。为此, 研制了 bioinert 水凝胶, 由聚乙烯醇-共衣康酸 (P IA) 与不同的刚度, 这是由交联度控制与改变交联时间25,26,27,28,29,30,31,32. 干细胞可以在 nonmodified 的 p-ia 水凝胶上培养, 以及与胞外基质 (ECMs) 和肽接枝的 p ia 水凝胶。在先前的研究25中, 从脐带血中培养出的人造血干细胞 (hHSCs) 在不同刚度值的 P IA 水凝胶中进行, 从3帕斯卡到30帕斯卡的储存模数, 其中纤维连接蛋白或肽来自纤维连接蛋白 (CS1, EILDVPST) 被嫁接到 P IA 水凝胶。在 CS1 或纤维连接蛋白接枝的 P IA 水凝胶中观察到 hHSCs 的高体外折叠扩张, 显示了从12帕斯卡到30帕的中间刚度不等的 25。
人类 ips 和 ES 细胞不能在传统的组织培养聚苯乙烯 (TCP) 菜肴上培养33,34 , 因为人类 es 和 ips 细胞需要对 ECMs (如受精或层粘连蛋白) 进行特定的绑定, 以保持其多在长期文化。因此, 设计并制备了具有最佳刚度特性的肽接枝型 P IA 水凝胶结构, 并在单链、单链、联合段、双链、节段、分支式链32。从 ECMs 的整合素和多糖结合域中选择了肽序列。受精肽与双链或关节段连接的 P IA 水凝胶, 其储存模量在大约25人民军, 支持人类 ES 和 iPS 细胞的长期培养, 超过12个通道在无异和化学定义的条件32。在水凝胶上的关节段和双链细胞黏附分子促进了人类 ES 和 iPS 细胞的增殖和多32。这里, 一个关于制备 P IA 水凝胶的协议 (以储存模数从10人民军到30帕, 这是测量在空气湿条件下) 接枝和没有肽或 ECMs 描述。如何培养和通过几个干细胞 (包括羊水干细胞, 脂肪来源干细胞, 人 ES 细胞, 人类 iPS 细胞) 显示。
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Protocol
本研究的实验得到了台湾 Landseed 医院 (IRB-13-05) 和国立中央大学伦理委员会的批准。在本研究中, 所有的实验都是按照所有相关的和适用的政府和机构的指导方针和规定进行的。
1. 解决方案和媒体准备
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高分子提纯
- 用乙醇洗涤 p ia 水解 > 96.5% 的羧酸基团净化 p ia。在500毫升的圆锥烧杯中将20克的 P IA 放入200毫升的乙醇中, 在磁力搅拌器上搅拌 24-30 h. 每8-10 小时用新鲜乙醇交换乙醇。
- 用 chner 漏斗滤除乙醇中的 P IA。
- 室温下真空干燥24小时干燥 P IA。
注: 建议在真空干燥系统 (通过去除乙醇) 经常清洗陷阱, 特别是在最初的几个小时内, 因为在从 P IA 去除大量乙醇后, 陷阱往往会堵塞。
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p-IA 溶液的制备
注: 将聚合物慢慢加入溶剂 (水)。建议在溶剂中加入 P IA 至少15分钟。如果在聚合物中加入溶剂, 聚合物就不会完全溶解。小心不要产生爆炸性沸腾的 P IA 解决方案。在制备 P IA 溶液时使用防护眼镜。p ia 溶液的加热过程是溶解结晶 p-ia 的关键。建议 (最好) 在一个相对干净的实验室中, 如果可能的话, 准备 P IA 溶液。- 溶解在纯净水中的 p ia 0.050 weight% 浓度为细胞培养实验或 0.50 weight% 浓度的流变仪测量: 例如, 溶解50毫克的 p ia 在100毫升的纯净水细胞培养和500毫克 p ia 在100毫升的 de电离 (DI) 水的流变仪测量。
- 在热板上搅动 1 h 的 P IA 溶液。
注意: 为避免爆沸, 不要加热溶液超过95° c。在高温下, 聚合物溶液的爆炸性沸腾可能会产生皮肤灼伤。因此, 在加热过程中, 要非常仔细地进行 p ia 的加热, 并监测 p ia 溶液的温度。 - 在室温下对 p ia 溶液进行冷却后, 在室温下激发 p ia 溶液为 48 h. 将热的 p ia 溶液留在热板上不加热, 然后在室温下不搅动20-24 小时, 以确保气泡在 P IA 解决方案中不存在。
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交联溶液的制备
- 使交联溶液的成分 1.0 weight% 戊二醛从25% 水戊二醛溶液, 20.0 weight% Na2, 使4使用 99% > 纯度, 和 1.0 weight% H2所以4。例如, 对于一个6或12良好细胞培养板, 增加100µL 戊二醛溶液, 2 克硫酸钠, 和100µL 的硫酸成10毫升的纯净水。
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人类 ES/PS 细胞培养培养基
注意: 使用 DMEM/F12 媒体, 必要的6媒体, 和必要的8媒体的细胞文化。- 返回冷冻50X 必要8缓慢补充到解决方案过夜通过解冻在一个4° c 冰箱。
- 添加一瓶50X 必要的8补充到一瓶基本的8基础媒体。在100毫升离心管中将介质分离成小等分 (每50毫升), 然后将介质存储在-20 ° c。
2. P IA 水凝胶盘的制备
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P IA 薄膜制备
- 在一个35毫米的 TCP 盘中注入一个1毫升的 p ia 溶液的分, 并在一个45° c 的烤箱中烘干2天, 在干净的长凳上产生 p ia 膜。
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P IA 水凝胶菜肴的交联
- 将 P IA 薄膜浸入0.5、1、2、4、6、12、24和 48 h 的水交联溶液中。
注: "p ia-X" (例如, P-IA-12 h) 是指对 p ia 水凝胶交联为X h (如, 12 h)。 - 交联后, 在常温下用纯水冲洗 P IA 水凝胶, 在常温下将水凝胶保持在纯净的清水中, 在干净的长凳上。
- 在75.0 体积/volume% 乙醇溶液中浸泡1分钟, 对 p ia 水凝胶进行消毒, 在纯水中清洗六次, 然后将 p ia 水凝胶保存在纯水中, 直至用于细胞培养。
- 将 P IA 薄膜浸入0.5、1、2、4、6、12、24和 48 h 的水交联溶液中。
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肽或 ECM 接枝的 P IA 水凝胶菜肴的制备
- 通过浸入含10毫克/毫升n的水溶液中的1毫升活化 P IA 凝胶-(3-Dimethylaminopropyl)-n "-ethylcarbodiimide 盐酸盐和10毫克/毫升N-琥珀酰亚胺 (NHS) 在37° c 或 4 h 处为1小时在4° c。
- 用1毫升磷酸缓冲盐水冲洗 p ia 水凝胶 (pbs, pH 7.2) 3 次, 并将 p ia 凝胶浸入含有1毫升肽 (100-1, 500 µg/毫升) 或 ECM (10-100 µg/毫升) 的 PBS 溶液中, 24 ° c 时为4小时。
注意: 在表 1中总结了用于干细胞培养的肽序列和 ECMs。 - 在接肽或 ECM 后, 用清水洗涤3次的 P IA 水凝胶。
注: 与Y µg/毫升的肽或 ECM (Z) 接枝的 p ia 水凝胶以后被称为 p ia-xh-z或p ia xh-z-y, 其中, X指的是交联时间 (h),Y指示肽或 ecm 的浓度, 而Z表示不同的肽或 ecm。
3. 人类 ES/iPS 细胞培养
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未分化人 ES 和 iPS 细胞的通道和维持方法
- 使用标准的人类 es/ips 细胞培养协议28,32, 在 6 cm 菜肴中, 维护人类的 es (如、WA09 或 H9) 细胞或人类 iPS (如如、HS0077) 细胞基质的8介质。
- 孵育近汇合的人类 es/ips 细胞与2.0 毫克/毫升中性 II 在 DMEM/F-12 介质在37° c 为8-10 分钟, 然后冲洗人类 es/ips 细胞两次 DMEM/F12 媒体。
- 在2毫升的 DMEM/F-12 培养基加入人类 ES/iPS 细胞培养皿后, 用细胞刮刀或移分离弱附着的菌落。
- 将人类 es/ips 细胞收集到15毫升离心管中, 并将人类 es/ips 细胞在 160 x g 上离心, 在37° c 5 分钟。
- 离心后, 丢弃 DMEM/F12, 在1毫升的 E8 介质中暂停人类的 ES/iPS 细胞, 然后使用细胞计数器计算细胞密度。
- 在适当的密度调整后接种 ES/iPS 细胞 (1-5 x 104细胞, 每 cm2用于传代或指示) 进入新的培养皿 (肽或 ECM 接枝的 P IA 水凝胶)。
4. 人体 ES/iPS 细胞特性表征
- 碱性磷酸酶 (AP) 活性的评价
- 用标准碱性磷酸酶活染色法测定人 ES/iPS 细胞的碱性磷酸酶 (AP) 活性。
- 免疫
- 执行免疫的 Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 和 Oct3/4 在他和臀部细胞, 以调查多遵循常规的协议28,32。
- 将0.5 毫升体积的 4% (体积/体积) 甲醛到每24井道, 其中人类 ES/iPS 细胞的培养, 然后, 孵化皿15分钟在4° c 固定细胞。
- 从每个井中吸取甲醛溶液。然后, 增加1毫升的 pbs 每井和吸气 pbs 冲洗细胞。执行冲洗过程3次。
- Permeabilize 细胞膜通过在 PBS 中加入0.5 毫升 0.3% (体积/体积) 海卫一 x 100 溶液, 室温下为30分钟。
- 吸入海卫一 x 100 溶液, 并在 PBS (µL) 中加入300个 2% (重量/体积) 牛血清白蛋白 (BSA), 并在室温下孵育30分钟。
- 通过移移除阻塞缓冲区, 然后添加所需的主抗体 (Oct3/4 (1:200)、Sox2 (1:200)、SSEA-4 (1:200) 和 1-81 (1:200) 吸管, 请参见表 2) 到每个井中, 其中1:200 表示抗体被稀释与 PBS 200 倍和孵化一天在4° c。
- 在 PBS 溶液中, 用300µL 0.05% 吐温20的细胞在室温下, 以3倍的方式将原抗体溶液抽吸。
- 添加300µL 的二次抗体 (1:200, 见表 2), 这是特定的主要 IgG 亚型, 在 2% (重量/体积) BSA 溶液入每井和孵化为 1 h 在室温下在黑暗中。
- 在 PBS 溶液中, 用300µL 0.05% 吐温20的电池在室温下洗涤3次。
- 用荧光显微镜或共聚焦显微镜对染色细胞进行分析。
- 胚体形成
- 通过10和20段的胚体 (EB) 形成研究人类 ES/iPS 细胞的多。
注: 近80% 汇合在 6-井板是充足的为电子束形成的准备。 - 用2毫升 DMEM/F-12 介质冲洗人类 ES 或 iPS 细胞两次, 然后将细胞浸泡在1.5 毫升的基本6介质中。
- 用200µL 的技巧将近80% 汇合的人类 ES 或 iPS 细胞切割成大约32块。接下来, 用刮板机将细胞与盘子分离。
- 收集人类的 ES/iPS 细胞和转移到一个6井超低的附件盘。
- 交换必要的6媒介由移老媒介和增加新鲜的媒介每2天。
注: 培养细胞悬浮2周在37° c 与 5% CO2。 - 在 ebs 被 homogenously 悬浮在必要的6媒介之后, 转移 ebs 到文化在24个井 TCP 盘子涂上与 0.1 weight% 明胶, 并且培养细胞在必要的6媒介为另外的星期。
- 用抗体对细胞进行染色, 对来自三胚胎系层的细胞标记物 (AFP (内胚层)、建筑面积 (外胚层)、β III-蛋白 (外胚层) 和 SMA (胚层)) 进行检测, 并通过上述免疫方法对细胞进行评价。
- 通过10和20段的胚体 (EB) 形成研究人类 ES/iPS 细胞的多。
- 畸胎瘤形成
- 通过10和20段的畸胎瘤形成研究人类 ES/iPS 细胞的多。
注: 5 盘近80% 汇合在 6-井板是足够为畸胎瘤形成 (至少 3 x 106细胞为畸胎瘤形成实验是必要的)。 - 用2毫升 DMEM/F-12 介质冲洗两次细胞, 然后在细胞培养皿中加入1.5 毫升 DMEM/F-12 介质。
- 用200µL 的技巧将近80% 汇合的人类 ES 或 iPS 细胞切成大约32块。接下来, 用刮板机将细胞与盘子分离。
- 将人类 ES/iPS 细胞收集到15毫升的离心管中, 并在 160 x g 离心分离细胞, 在37° c 5 分钟。
- 离心后, 悬浮在100µL DMEM/F12 细胞小球, 然后混合细胞小球与100µL 基质 (1:1 体积比)。
- 将细胞悬浮液转化为-20 ° c 前冷却的注射器。注射, 总共至少 3 x 106细胞皮下注射到男性 nod 免疫缺陷 (点头。CB17-Prkda无缺陷/JNarl) 小鼠 (5-8 周).
- 5-8 周后, 解剖畸胎瘤, 修复 4.0% (重量/体积) 甲醛溶液, 然后存储在4° c。
- 用石蜡修复畸胎瘤, 切片石蜡嵌入畸胎瘤, 用苏木精和曙红 (H & E) 染色, 使用标准的协议28,32。
注意: 研究人员可以向公司发送固定的畸胎瘤组织, 用石蜡修复畸胎瘤, 切片石蜡包埋的畸胎瘤, 并用 H & E 染色样品, 这通常在医院病理科使用。
- 通过10和20段的畸胎瘤形成研究人类 ES/iPS 细胞的多。
- 人脂肪源性干细胞 (ADS) 细胞培养
- 温培养基 (DMEM 含有1% 抗抗生素和10% 胎牛血清 (FBS)), 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA, PBS 到37° c 在水浴前使用。
- 通过移10毫升的 PBS, 将人体广告细胞洗净到每 6 cm 培养皿中的细胞。
- 将1毫升的胰蛋白酶-EDTA 溶液 (0.25%) 加入到 6 cm 培养皿中, 在37° c 下孵育溶液5分钟。
- 显微镜下观察 6 cm 培养皿中的细胞, 确认细胞分离。
- 将细胞收集到15毫升的离心管中, 并在离心管中加入等量的培养基 (DMEM 含有1% 抗抗生素和 10% FBS), 以中和胰蛋白酶-EDTA。
- 离心细胞在 250 x g 为5分钟在37° c。
- 离心后, 移小心丢弃上清液, 不干扰细胞颗粒。
- 重在培养基中的细胞, 然后在适当的密度 (5-10 x 103细胞每 cm2的传代或如所示) 进入新的培养皿 (P IA 水凝胶接枝和没有肽和 ECM)。
- 人羊膜液干 (AFS) 细胞培养
- 暖培养培养基 (DMEM/MCDB 201 (2:3), 含有20% 胎牛血清 (FBS), 5 ng/毫升 bFGF 和1% 抗抗生素), 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA, PBS 到37° c 在水浴前使用。
- 在每 6 cm 培养皿中, 用移10毫升的 PBS 洗涤人类 AFS 细胞。
- 将1毫升的胰蛋白酶-EDTA 溶液 (0.25%) 放入6厘米培养皿中, 并在37° c 下孵育5分钟的细胞。
- 显微镜下观察 6 cm 培养皿中的细胞, 确认细胞分离。
- 将细胞收集到一个15毫升的离心管中, 并加入等量的培养基 (DMEM/MCDB 201 (2:3), 含有20% 胎牛血清 (FBS)、5 ng/mL bFGF 和1% 抗抗生素) 进入离心管中, 以中和胰蛋白酶-EDTA。
- 离心细胞在 250 x g 为5分钟在37° c。
- 离心后, 在不干扰细胞颗粒的情况下, 小心丢弃上清移。
- 重培养培养基中的细胞, 然后在适当的密度下种子细胞 (5-10x103细胞每 cm2为传代或被表明) 入新的文化菜 (P IA 水凝胶嫁接与和没有肽和 ECM)。
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Representative Results
采用肽 (oligoECM) 或不同弹性的 ecm 接枝的 P IA 水凝胶是通过以下的反应方案来制备的, 如图 1A所示, 使用不同类型的 oligoECM (图 1B)。水凝胶的弹性由应用的交联强度 (时间) (图 1C) 调节。采用受精衍生肽接枝的 P IA 水凝胶, 具有25.3 帕 (24 h 交联时间) 的贮存模量, 支持人类 iPS 和 ES 细胞长期培养超过10-20 通道。特别是, 与关节段 (P-IA-24h-VN1G) 或双链 (P-IA-24h-VN2G) 接枝的 p-IA 水凝胶支持人类 iPS 和 ES 细胞的多, 它们的 oligoECM 浓度相对较低 (200-500 微克/毫升) 比 P-IA-VN1。水凝胶, 需要使用高浓度的 oligoECM (> 1000 微克/毫升), 以维护人类 iPS 和 ES 细胞的多28,32。
在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 上保存的人类 ES 细胞被转移到其他合成涂层材料 (如, Synthemax II) 涂层的菜肴和 P-IA-24h-VN1 水凝胶菜肴 (图 2)28。人们发现, 在商用的涂层盘子上培养的人类 es 细胞更容易区分, 特别是在菌落的边缘 (图 2a和2c), 而人类 es 细胞可以在 P-IA-24h-VN1-1000 上维持它们的多。水凝胶菜肴, 因为在 P-IA-24h-VN1-1000 水凝胶盘子 (图 2b和2d)28中, 人类 ES 细胞的形态学无法观察到分化细胞。
人类 ES 的多 (图 3A) 和 iPS (图 3B) 细胞培养的 P-IA-24h 水凝胶嫁接与 oligoECM (P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000, P-IA-24h-VN2C), 以及常规重组受精 (rVitronectin)-涂层的菜肴, 是基于多能制造商的蛋白质 (Nanog, Sox2, 和 Oct3/4) 的表达, 在每道菜的细胞被培养后, 在无异条件下使用基本的8媒体为10通道32。这些多蛋白的表达令人满意的人 iPS 和 ES 细胞培养的 P IA 水凝胶接枝 oligoECM, 以及 rVitronectin 涂层的菜肴在异自由的条件。
分化能力的评价从三种胚层中提取的细胞在体外(EB 形成) 和体内(畸胎瘤形成) 对人工合成的人 ES 和 iPS 细胞多的验证是必不可少的。材料.因此, 人类 ES 细胞 (图 4) 和人类 iPS 细胞 (图 5) 是在 P IA-oligoECM 水凝胶菜肴和重组受精的10通道上培养的, 随后, 细胞被培养成悬浮形成ebs.EBs 在明胶涂层的盘子里进一步培养了几周, 观察细胞在盘子上传播的能力 (图 4A和图 5A)32。区分人类 ES (图 4B) 和 iPS (图 5B) 细胞是从三种细菌层获得的蛋白质 immunostained: 甲胎蛋白 (AFP、内胚层)、平滑肌肌动蛋白 (SMA、胚层) 和胶质纤维酸性蛋白 (胶质, 外胚层)32。人类 ips 和 es 细胞都被发现分化为来自所有三种细菌层的细胞, 表明人类 ips 和 es 细胞多的另一种验证, 即使是在 oligoECM 异移植的 P IA 水凝胶培养后。条件为长期 (段落 > 10 段落)。
人类 ES 细胞的分化能力从三种细菌层在体内(畸胎瘤形成试验) 也进行了评估。人类 ES 细胞, 这是培养在 P-IA-VN1-1000 (图 6A) 和 P-IA-VN2C-1000 (图 6B) 在异10通道的自由培养条件下, 被注射皮下注射到 NOD 小鼠32。畸胎瘤是孤立的小鼠, 和畸胎瘤组织切片固定和染色的 H & E (图 6A和6B)32。畸胎瘤显示来自所有三种细菌层的细胞的存在: 内胚层 (肠上皮,图 6A(b) 和6 b (b)), 胚层 (软骨,图 6A(c) 和6 b (c)), 和外胚层 (神经细胞,图 6A(d);视网膜色素上皮,图 6B(d))。这些结果表明, 人类 ES 细胞培养的 P-IA-24h-VN1-1000 和 P-IA-24h-VN2C-1000 在异10通道的自由条件下可以区分成细胞起源于三种细菌层, 表明他们的多保持在体内。
在未修改的 p ia 水凝胶、p-ia oligoECM 水凝胶以及膨胀介质中的 TCP 天线中也培养了人类 AFS 细胞。图 7显示了在 p ia 和 p ia-oligoECM 水凝胶菜肴中培养的四天的人体 AFS 细胞的形态, 具有弹性 (E ") 的 12.2 (交联时间 = 6 h), 18.3 (交联时间 = 12 h), 25.3 (交联时间 =24 h) 和30.4 帕斯卡 (交联时间 = 48 h) 使用 oligoECM 浓度0或50微克/毫升, 以及 TCP 菜肴与 3-12 GPa 的刚度30。
当 p ia 水凝胶的硬度低于11帕 (PV-2h、PV-2h-Y、PV-4h 和 PV-4h-Y) 时, 人类 afs 细胞不能在 p ia 凝胶 oligoECM 上增殖, 而当E "超过12人民军, 除了 P-IA-6h 和 PV-IA-6h-COL1 水凝胶菜肴。P-IA-6h 和 P-IA-6h-COL1 似乎不利于人类 AFS 细胞的培养, 因为软细胞培养生物材料停止了细胞周期进展30。
上述结果表明, P IA 水凝胶是一种最佳的材料, 长期干细胞培养和保持多的干细胞, 通过选择特定的刚度和 oligoECM, 以及最佳反应浓度 oligoECM(oligoECM 的表面密度)。
图 1: oligoECM 或 ECM 接枝的 P IA 水凝胶的制备.(A) 与 ecm 和 ecm 衍生的肽 (oligoECM)29接枝的 P IA 水凝胶反应方案。版权所有2015。根据皇家化学学会的许可改编(B) 在 P IA 水凝胶上接枝肽的设计和序列。单链肽 (p ia BSP, P-IA-VN1, 和 P-IA-HBP1), 单链肽与联合段 (P-IA-VN1G), 和双链 (P-IA-VN2C 和 P-IA-HBP2C) 和 ecm (p ia ecm) 嫁接在 P ia 水凝胶32。根据创造性的共同性归属执照适应。(C) 不同交联期的 P IA 水凝胶的刚度29。版权所有2015。根据皇家化学学会的许可改编请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 人类 ES 细胞培养物对 P-IA-24h-VN1 水凝胶和市面上可用的涂层菜肴的比较.人 es 细胞 (WA09) 的形态学培养在商业上可用的涂层菜肴 (a, b) 和 P-IA-24h-VN1-1000 (c, d) 的菜肴在通道 1, 当人类 es 细胞从培养小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 转变成在商业上提供的涂层菜肴或 PVA-24h-VN1-1000 菜肴的种植。红色箭头显示分化的人类 ES 细胞。刻度线指示50µm (a、b) 和100µm (c、d)28。根据创造性的共同性归属执照适应。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对不同肽设计的 P IA 水凝胶中的人 ES 和 iPS 细胞多的表征.(a) 多蛋白 Nanog (红色)、Sox2 (绿色) 和 Oct3/4 (绿色) 在人类 ES (H9) 细胞中的表达 (免疫) 用 Hoechest33342 对核标记 (蓝色) 进行双重染色分析 (A)P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24h-VN1G-1000, 和 (c) P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶, 并在 (d) 重组受精 (rVitronectin) 涂层的菜肴在异-自由条件下10通道。(B) 多蛋白 Nanog (红色)、Sox2 (绿色) 和 Oct3/4 (绿色) 在人类 iPS 细胞上的表达, 用免疫与 Hoechest33342 进行双重染色, 在 (a) P-IA-24h-VN1-1000 上培养后核标记 (蓝色)水凝胶, (b) P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶, 和 (c) 重组受精 (rVitronectin)-凝胶涂层的菜肴在异-自由条件下10通道32。刻度条表示50µm. 根据创造性的共用归属许可证改编。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 不同肽设计的 P IA 水凝胶对人 ES 细胞分化能力的表征.(a) 在 (A) P-IA-24h-VN1-1000、(b) P-IA-24h-VN1G-1000 和 (c) P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶和 (d) 重组后, 从 EBs 与人类 ES (H9) 细胞分化的细胞形态学受精 (rVitronectin)-在异10通道的自由条件下的涂层菜肴。刻度线表示100µm. (B) 表达的外胚层蛋白 (胶质, 红色), 胚层蛋白 (SMA, 绿色), 和内胚层蛋白 (AFP, 绿色) 在人类 ES (H9) 细胞中的免疫与 Hoechest33342 双染色评价核标记 (蓝色) 在 P-IA-24h-VN1-1000、P-IA-24h-VN1G-1000 和 P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶的培养之后, 和在重组受精 (rVitronectin) 涂层的菜在异-自由的条件下为10段落32。刻度条表示50µm. 根据创造性的共用归属许可证改编。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 不同肽设计的 P IA 水凝胶对人 iPS 细胞分化能力的表征.(a) 从 EBs 与人类 iPS (HPS0077) 细胞分化后的细胞形态学 (A) P-IA-24h-VN1-1000 水凝胶, (b) P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶, 和 (c) 重组受精 (rVitronectin)-在异10通道的免费条件下涂覆的菜肴。刻度线表示100µm. (B) 表达的外胚层蛋白 (胶质, 红色), 胚层蛋白 (SMA, 绿色), 和内胚层蛋白 (AFP, 绿色) 在人类 iPS (HPS0077) 细胞分析免疫双染色与 Hoechest33342 核标记 (蓝色) 在培养以后 (a) P-IA-24h-VN1-1000 水凝胶, (b) P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶, 并且 (c) 重组受精 (rVitronectin) 被涂的菜在异无条件下为10段落32。刻度条表示50µm. 根据创造性的共用归属许可证改编。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: P-IA-24h-VN1 和 P-IA-24h-VN2C 水凝胶培养后的人 ES (H9) 细胞分化能力的特征.(A)(a) 在异细胞培养条件下, 在 P-IA-24h-VN1-1000 水凝胶培养后, 经10通道注射后的畸胎瘤的图片。可观察组织包括 (b) 肠上皮 (内胚层)、(c) 软骨 (胚层) 和 (d) 神经细胞 (外胚层)。(B)(a) 在异细胞培养条件下, 在 P-IA-24h-VN2C-1000 水凝胶培养后, 经10通道注射后的畸胎瘤的图片。组织包括 (b) 肠上皮 (内胚层), (c) 软骨 (胚层), 和 (d) 视网膜色素上皮 (外胚层) 可以观察32。刻度条表示100µm. 根据创造性的共用归属许可证改编。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 在经过4天的培养后, 在 TCP 菜肴和 P IA 水凝胶中培养的人 AFS 细胞的形态, 在肽中固定或无 ECM 衍生的食物.(A) 在 TCP 天线上的人体 AFS 细胞形态。(B) P-IA-6h 和 P-IA-6h-Z水凝胶菜肴 (P-IA-6h、P-IA-6h-COL1-50、P-IA-6h-FN1-50、P-IA-6h-VN1-50、P-IA-6h-HBP1-50 和 P-IA-6h-cRGD-50) 的人类 AFS 细胞形态。(C) hAFCs 在 P-IA-12h 和 P-IA-12h-Z水凝胶菜肴 (P-IA-12h、P-IA-12h-COL1-50、P-IA-12h-FN1-50、P-IA-12h-VN1-50、P-IA-12h-HBP1-50 和 P-IA-12h-cRGD-50) 的形态学。(D) P-IA-24h 和 P-IA-24h-Z水凝胶菜肴 (P-IA-24h、P-IA-24h-COL1-50、P-IA-24h-FN1-50、P-IA-24h-VN1-50、P-IA-24h-HBP1-50 和 P-IA-24h-cRGD-50) 的人类 AFS 细胞形态。(E) P-IA-48h 和 P-IA-48h-Z水凝胶菜肴 (P-IA-48h、P-IA-48h-COL1-50、P-IA-48h-FN1-50、P-IA-48h-VN1-50、P-IA-48h-HBP1-50 和 P-IA-48h-cRGD-50) 的人类 AFS 细胞形态。刻度线指示100μ m30。版权所有2017。根据皇家化学学会的许可改编请单击此处查看此图的较大版本.
| 材料/设备名称 | 缩写 |
| GTPGPQGIAGQRGVV | COL1 |
| GACRGDCLGA | 循环 RGD (cRGD) |
| KGGAVTGRGDSPASS | FN1 |
| EILDVPST | CS1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | VN1 |
| GKKQRFRHRNRKG | HBP1 |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | HBP2C |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | VN1G |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | VN2C |
| 受精 | 范尼 |
| 蛋白 | fn |
表 1: 本研究中使用的 ecm 衍生的肽序列和 ecm。
| 抗体 | 浓度 (稀释率) |
| nanog | 1:200 |
| SSEA4 | 1:200 |
| OCT3/4 | 1:200 |
| Sox2 | 1:200 |
| 平滑肌肌动蛋白 | 1:200 |
| (α-SMA) | 1:200 |
| 法新社 | 1:200 |
| gfap | 1:200 |
| Alexa 氟 555-共轭山羊抗鼠 | 1:200 |
表 2: 本研究中用于免疫的抗体。
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Discussion
为了长期扩展人类 ES 和 iPS 细胞, 在异自由条件下维持其多超过十通道, 以及对人类 AFS 细胞、广告细胞的培养, 建立了具有不同刚度的 p-ia-oligoECM 和 p-ia 型 ECM 水凝胶,和造血干细胞25,28,32。oligoECM 固定化的 p-IA 水凝胶是细胞培养材料研究细胞培养材料对不同类型的干细胞分化和增殖的命运以及原代细胞的影响的绝佳候选物。癌细胞。
p ia 解决方案应该是透明的, 当 p ia 的解决方案是在盘子上投。交联时间决定了 P IA 水凝胶的交联强度。24 h 交联的 P IA 水凝胶生产的最佳水凝胶的人 ES/iPS 细胞培养。任何肽和 ECMs 可以移植到 P IA 水凝胶使用该协议, 其中肽和 ECMs 有免费氨基酸组25,28,29,30,31, 32. x 射线光电子能谱 (xps) 测量可以检测肽或 ECMs 的表面密度, 虽然 xps 不能显示表面密度的绝对值, 但肽或 ECMs 的存在可以安全地分析.
根据交联时间的不同, 可制备具有和不接枝肽或 ECMs 的 P IA 水凝胶, 其储存量为3-30 帕斯卡。制备的 P IA 型水凝胶比3帕斯卡和更高的存储模数要比 30帕斯卡25、28、29、3031 是相当困难。这是目前水凝胶制备对 P IA 凝胶的化学交联方法的局限性。然而, 本议定书提供了另一个选择的水凝胶具有不同的弹性, 它可以支持原细胞, 癌细胞, 或干细胞, 包括人类 ES 和 iPS 细胞, 但不是由聚丙烯酰胺。特别是, 人 ES 和 iPS 细胞不能增殖聚丙烯酰胺水凝胶, 但可以增殖对 P IA 水凝胶, 如图 2,图 3,图 4,图 5, 和图 6。事实上, P-IA-24h-VN1 水凝胶支持人类 ES 细胞培养优于商业可用的涂层菜肴 (图 2)。因此, p-IA 水凝胶是人类 ES 和 iPS 细胞培养的首选。
这将是有趣的研究水凝胶的最佳弹性的人 ES 和 iPS 细胞分化成特定的细胞谱系, 如心肌素35, 视网膜色素上皮细胞36, β细胞6, 和 TH+单元格6用于再生医学的未来发展。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了部分支持的科技部, 台湾根据赠款编号 106-2119-m-008-003, 105-2119-m-008-006, 和 104-2221-e--008-107-MY3。这项研究也得到了台湾 Landseed 医院项目 (NCU-LSH-105-A-001) 的支持。还承认日本教育、文化、体育、科学和技术部的科研资助 (数字 15K06591)。a. 口想感谢沙特阿拉伯王国利雅得11451沙特国王大学国际科学伙伴计划 (ISPP-0062) 的研究生研究和研究副校长。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
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