Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Humane pluripotente stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhed på Xeno-fri betingelser

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

En protokol, der er forelagt for at forberede polyvinyl alkohol-co-itaconic syre hydrogels med varierende stivhed, som blev podet med og uden oligopeptides, for at undersøge effekten af stivhed af biomaterialer på differentiering og spredning af stamceller. Stivhed af hydrogels blev kontrolleret af crosslinking tid.

Abstract

Effekten af fysisk stikord, som stivhed af biomaterialer om spredning og differentiering af stamceller, er blevet undersøgt af flere forskere. Men de fleste af disse efterforskere har brugt polyacrylamid hydrogels for stamceller kultur i deres studier. Derfor, deres resultater er kontroversiel, fordi disse resultater muligvis stammer fra de særlige karakteristika ved polyacrylamid og ikke fra den fysiske cue (stivhed) af biomaterialerne. Her, beskriver vi en protokol for at forberede hydrogels, som ikke er baseret på polyacrylamid, hvor forskellige stilk, celler, herunder menneskelige embryonale stamceller (ES) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler, kan være kulturperler. Hydrogels med varierende stivhed blev udarbejdet fra bioinert polyvinyl alkohol-co-itaconic syre (P-IA), med stivhed kontrolleret af crosslinking grad ved at ændre crosslinking tid. P-IA hydrogels podet med og uden oligopeptides afledt af ekstracellulære matrix blev undersøgt som fremtidige platform for stamcelleforskning kultur og differentiering. Kultur og passage af fostervand væske stamceller, fedtholdigt-afledte stamceller, humane ES-celler og menneskelige iPS-celler er beskrevet i detaljer her. Oligopeptide P-IA hydrogels viste superior forestillinger, der blev induceret af deres stivhed egenskaber. Denne protokol rapporter syntesen af biomateriale, deres overflade manipulation, sammen med kontrollere egenskaberne stivhed og endelig deres indvirkning på stamcelle skæbne ved hjælp af xeno-fri kultur betingelser. Baseret på de seneste undersøgelser, kan sådan modificerede substrater fungere som fremtidige platforme til at støtte og direkte skæbne af forskellige stamceller linje til forskellige forbindelser; og yderligere, regenerere og genoprette tabt organ eller væv.

Introduction

Skæbne af stamceller differentiering i en bestemt slægt af celler og langsigtede spredning af stamceller, især menneskelig inducerede pluripotente (iPS) celler og humane embryonale stamceller (ES) celler, er kendt for at være reguleret af hæmmere, vækstfaktorer, og / eller små bioaktive molekyler i dyrkningsmedier. For nylig, de fysiske signaler af biomaterialer, især stivhed af celle kultur biomaterialer, blevet anerkendt at være en vigtig faktor, vejlede skæbnen af stamceller spredning og differentiering1,2, 3,4,5,6. Derfor er flere forskere begyndt at undersøge skæbnen af stamceller, som er kulturperler på hydrogels, på differentiering, hovedsageligt ved hjælp af polyacrylamid hydrogels med varierende stivhed.

Stivhed af biomaterialer kan styre fokale sammenvoksninger, celle morfologi, celle fænotype og stamceller vedhæftning, især i todimensionale (2D) dyrkning1,2,3,5. Mekanisk-sensing af biomaterialer af stamceller styres generelt af fokale vedhæftning signalering via integrin receptorer. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-afhængige kontraktilitet af cytoskeleton af actin spiller en afgørende rolle i Epitelcellers respons proces af stamceller i 2D-celle dyrkning systemer3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler og hans kolleger udviklet et interessant begreb, at voksne stamceller, såsom knoglemarv stamceller (BMS) celler dyrkes på celle kultur biomaterialer med en lignende stivhed til, at specifikke væv, tendens til at differentiere i cellerne stammer fra specifikke væv5. BMS cellerne inkuberes på 2-D blød polyacrylamid hydrogels belagt med kollagen type jeg (med en stivhed sammenlignes med hjernen væv) i ekspansion medier var spontant tilskyndet til at differentiere i tidlige neuron lineages, mens BMS celler dyrkes på hydrogels med en stivhed svarer til muskel eller kollagen knogle væv fandtes for at inducere differentiering af tidlige lineages af myocytes og osteoblaster, henholdsvis på 2D-polyacrylamid hydrogels3,5. Mange forskere har undersøgt stamcelle skæbne differentiering kulturperler på polyacrylamid hydrogels immobiliseret med kollagen type I-12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. dog det bør nævnes, at nogle modstridende rapporter1,18,22,23,24 findes for den velkendte idé foreslået af Engler et al. 5 dette er fordi Englers idé5 blev udviklet udelukkende på polyacrylamid hydrogels og deres resultater har stammede fra særlige karakteristika ved biomateriale (polyacrylamid), og ikke udelukkende fra den fysiske cue (stivhed) af biomateriale. Det er derfor vigtigt at udvikle en anden type af hydrogel, hvoraf stivhed kan styres af crosslinking af hydrogels. Til dette formål, blev bioinert hydrogels udviklet, som var fremstillet af polyvinyl alkohol-co-itaconic syre (P-IA) med en anden stivhed, som blev kontrolleret af crosslinking grad med en skiftende crosslinking tid25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. stamcellerne kan dyrkes på nonmodified P-IA hydrogels, samt P-IA hydrogels podet med ekstracellulære matricer (ECMs) og oligopeptides. I en tidligere undersøgelse25, blev menneskelige hæmatopoietisk stamceller (hHSCs) fra navlestrengsblod dyrket på P-IA hydrogels med forskellige stivhed værdier spænder fra en 3 kPa til 30 kPa opbevaring modulus hvor fibronektin eller en oligopeptide stammer fra fibronektin (CS1, EILDVPST) blev podet på P-IA hydrogels. Høj ex vivo fold udvidelse af hHSCs blev observeret i P-IA hydrogels podet med CS1 eller fibronektin, som vises en mellemliggende stivhed spænder fra 12 kPa til 30 kPa25.

Menneskelige iPS og ES-celler ikke kan dyrkes på konventionelle vævskultur polystyren (TCP) retter33,34 , fordi menneskelige ES og iPS-celler kræver specifik binding til ECMs, såsom vitronectin eller laminin at opretholde deres pluripotency under langvarige kultur. Derfor er flere strukturer af oligopeptide-podet P-IA hydrogels med optimal stivhed karakteristika designet og udarbejdet i formationer af en enkelt kæde, en enkelt kæde med et fælles segment, en dobbelt kæde med et fælles segment, og en forgrenet-type kæde32. Oligopeptide sekvenser blev udvalgt fra integrin - og glykosaminoglykan-bindende domæner af ECMs. P-IA hydrogels podes med vitronectin-afledte oligopeptides med en dobbelt kæde eller fælles segment, som har en opbevaring modulus på ca. 25 kPa, støttet langtidskulturer menneskelige ES og iPS-celler for over 12 passager under xeno-fri og kemiske definerede betingelser32. Fælles segment og dobbelt kæde med celle adhæsionsmolekyler på hydrogels lettes spredning og pluripotency menneskelige ES og iPS-celler32. Her, en protokol for at forberede P-IA hydrogels (med en opbevaring modulus fra 10 kPa til 30 kPa, som blev målt under våde forhold i luften) podes med og uden oligopeptides eller ECMs er beskrevet. Sådan kultur og passage flere stamceller (herunder fostervand væske stamceller, fedtholdigt-afledte stamceller, humane ES-celler og menneskelige iPS-celler) er vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter i denne undersøgelse blev godkendt af de etiske komitéer i Taiwan Landseed Hospital (IRB-13-05) og National Central University. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med alle relevante og gældende statslige og institutionelle retningslinjer og forordninger i løbet af denne undersøgelse.

1. løsning og medier forberedelse

  1. Polymer rensning
    1. Rense P-IA med carboxylsyre gruppe med en grad af hydrolyse af > 96,5% ved at vaske P-IA med ethanol. 20 g af P-IA i 200 mL ethanol anbringes i en 500 mL konisk bæger og agitere på en magnetomrører for 24-30 h. Exchange ethanol med friske ethanol hver 8-10 h.
    2. Fjern P-IA fra ethanol ved filtrering ved hjælp af en Büchner tragt.
    3. Tør P-IA af vakuum tørrer ved rumtemperatur i 24 timer.
      Bemærk: Det anbefales at rengøre fælden i vakuum tørring system (ved fjernelse af ethanol) ofte, især i første par timer, fordi fælden tendens til at blive tilstoppet efter fjernelse af en stor mængde af ethanol fra P-IA.
  2. Fremstilling af P-IA
    Bemærk: Tilføje polymeren meget langsomt i opløsningsmiddel (vand). Det anbefales at tage mindst 15 min til at tilføje P-IA i opløsningsmidlet. Hvis opløsningsmiddel er tilføjet i polymeren, opløst polymeren ville ikke helt. Vær omhyggelig med ikke at generere eksplosive kogning af P-IA løsning. Brug beskyttelsesbriller under forberedelse af P-IA løsning. Opvarmning proces af P-IA løsning er væsentlige at opløse krystallinsk P-IA. Det er foreslået (og bedre) at forberede P-IA løsning i en forholdsvis ren eksperimentelle rum, hvis muligt.
    1. Opløse P-IA i rent vand til en 0,050 vægt % koncentration for celle dyrkning eksperiment eller en 0,50 vægt % koncentration til rheometer måling: for eksempel, opløses 50 mg P-IA i 100 mL rent vand for cellekultur og 500 mg P-IA i 100 mL af de ioniseret (DI) vand til rheometer målinger.
    2. Agitere P-IA løsning i 1 time på varmepladen.
      Bemærk: For at undgå eksplosive kogende, ikke varme løsning over 95 ° C. Eksplosive kogning af polymer løsning ved en høj temperatur kan generere forbrændinger af huden. Derfor udfører opvarmning af P-IA meget omhyggeligt, og overvåge temperaturen i P-IA løsningen under opvarmningen.
    3. Efter P-IA løsning var afkølet ved omgivelsestemperatur, agitere P-IA løsning ved stuetemperatur i 48 h. orlov hot P-IA løsning på varmeplade uden varme, og derefter lade det uden agitation ved stuetemperatur til 20-24 h at sikre, at luftbobler ikke til stede i P-IA løsning.
  3. Forberedelse af crosslinking løsning
    1. Gøre sammensætningen af crosslinking løsning 1,0 vægt % glutaraldehyd fra 25% vandig glutaraldehyd løsning, 20,0 vægt % Na2så4 bruger 99% > renhed og 1,0 vægt % H2så4. For eksempel, for en 6 eller 12 godt celle kultur plade, Tilsæt 100 µL af glutaraldehyd løsning, 2 g natriumsulfat, og 100 µL af svovlsyre i 10 mL rent vand.
  4. Menneskelige ES/PS celle Kulturmedier
    Bemærk: Brug DMEM/F12 medier, essential 6 medier, og essential 8 medier for cellekultur.
    1. Returnere frosne 50 X væsentlige 8 tillæg langsomt til løsningen natten over ved optøning i 4 ° C køleskab.
    2. Tilføje en flaske af 50 X væsentlige 8 supplement i en flaske af væsentlige 8 basal medier. Adskille medierne i små prøver (50 mL) i 100 mL centrifugering rør og derefter gemme medier på-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel parabol forberedelse

  1. P-IA film forberedelse
    1. Indsprøjte 1 mL alikvot af P-IA løsning i en 35 mm TCP parabol, og tør skålen i en 45 ° C ovnen i 2 dage til at producere en P-IA film i en ren bænk.
  2. Crosslinking af P-IA hydrogel retter
    1. Fordybe P-IA film i en vandig crosslinking løsning til 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 og 48 timer.
      Bemærk: ' P-IA -X' (f.eks.P-IA-12 h) henviser til en P-IA hydrogel crosslinked for X h (f.eks., 12 h).
    2. Efter crosslinking, skyl P-IA hydrogels med rent vand ved stuetemperatur, og derefter holde hydrogels i rent vand ved stuetemperatur i en ren bænk.
    3. Sterilisere P-IA hydrogels ved nedsænkning i en 75,0 volume/volume% ethanol opløsning i 1 min., skyl P-IA hydrogels i rent vand seks gange, og derefter holde P-IA hydrogels i ren vand indtil anvendes til celle dyrkning.
  3. Forberedelse af P-IA hydrogel retter podet med oligopeptide eller ECM
    1. Aktivere P-IA hydrogels via nedsænkning i 1 mL af en vandig opløsning indeholdende 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC) og 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) for 1 h ved 37 ° C eller 4 h ved 4 ° C.
    2. Skyl P-IA hydrogels med 1 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 7,2) 3 gange og fordybe P-IA hydrogels i en PBS løsning indeholdende 1 mL af oligopeptide (100-1500 µg/mL) eller ECM (10-100 µg/mL) i 24 timer ved 4 ° C.
      Bemærk: Oligopeptide sekvenser og ECMs bruges til stamceller kultur er opsummeret i tabel 1.
    3. Efter podning oligopeptide eller ECM, vask P-IA hydrogels med rent vand 3 gange.
      Bemærk: P-IA hydrogels podet med Y µg/mL af oligopeptide eller ECM (Z) er benævnt P-IA -Xh -Z ellerP-IA-Xh -Z-Y, hvor X henviser til crosslinking tid (h), Y angiver en koncentration af oligopeptide eller ECM, og Z angiver en anden oligopeptide eller ECM.

3. menneskelige ES/iPS cellekultur

  1. Metode til passage og vedligeholdelse af udifferentierede menneskelige ES og iPS-celler
    1. Vedligeholde menneskelige ES (f.eks.WA09 eller H9) celler eller menneskelige iPS (f.eks.HS0077) celler i Matrigel i væsentlige 8 medier i 6 cm retter ved hjælp af standard menneskelige ES/iPS celle kultur protokoller28,32.
    2. Inkuber nær sammenflydende menneskelige ES/iPS-celler med 2,0 mg/mL dispase II i DMEM/F-12 medier ved 37 ° C i 8-10 min. og skyl derefter ES/iPS menneskeceller to gange med DMEM/F12 medier.
    3. Efter tilsætning af 2 mL af DMEM/F-12 medier til menneskelige ES/iPS celle kultur retter, frigøre svagt vedhængende kolonier ved hjælp af en celle skraber eller af pipettering.
    4. Indsamle de menneskelige ES/iPS-celler i 15 mL centrifugering rør og centrifugeres menneskelige ES/iPS-celler ved 160 × g i 5 min. ved 37 ° C.
    5. Efter centrifugering, kassere DMEM/F12 og suspendere de menneskelige ES/iPS-celler i 1 mL E8 medier og derefter tælle celle tæthed ved hjælp af en celle counter.
    6. Podes ES/iPS-celler efter passende tæthed justering (1-5 x 104 celler pr. cm2 for passaging eller som angivet) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med oligopeptide eller ECM).

4. Karakteristik af menneskelige ES/iPS celle karakterisering

  1. Evaluering af alkalisk fosfataseaktivitet (AP)
    1. Måle alkalisk fosfatase (AP) aktiviteten af menneskelige ES/iPS-celler ved hjælp af en standard alkalisk fosfatase live farvning.
  2. Immunfarvning
    1. Udføre immunfarvning af Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 og Oct3/4 på hES og hofter celler at undersøge pluripotency efter konventionelle protokol28,32.
    2. Tilføje en 0,5 mL volumen af 4% (volumen/bind) PARAFORMALDEHYD i hver 24 godt skål, hvor de menneskelige ES/iPS-celler var kulturperler, og efterfølgende inkuberes retter i 15 min. ved 4 ° C til at fastsætte cellerne.
    3. Opsug PARAFORMALDEHYD løsningen fra hver brønd. Derefter tilsættes 1 mL PBS pr. brønd og Opsug PBS for at skylle cellerne. Udføre den føres proces 3 gange.
    4. Permeabilize cellemembraner ved tilsætning af 0,5 mL 0,3% (volumen/bind) Triton-X 100 løsning i PBS i 30 min. ved stuetemperatur.
    5. Aspirér Triton-X 100 løsning og tilsæt 300 µL af 2% (vægt/volumen) bovint serumalbumin (BSA) i PBS (blokerende buffer) i hver brønd og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
    6. Fjerne den blokerende buffer af pipettering, og derefter tilføje de ønskede primære antistoffer (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200), og Tra-1-81(1:200) med pipette, se tabel 2) i hver brønd, hvor 1:200 angiver antistofferne blev fortyndet med PBS 200-fold og rugede for én dag ved 4 ° C.
    7. Opsug den primære antistof løsning, og cellerne vaskes med 300 µL af 0,05% Tween 20 i PBS løsning 3 gange ved stuetemperatur.
    8. Tilsæt 300 µL af sekundære antistoffer (1:200, se tabel 2), der er specifikke for den primære IgG type, i 2% (vægt/volumen) BSA løsning i hver godt og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
    9. Cellerne vaskes med 300 µL af 0,05% Tween 20 i PBS løsning 3 gange ved stuetemperatur i mørke.
    10. Analysere de farvede celler af Fluorescens mikroskopi eller Konfokal mikroskopi.
  3. Embryoid krop dannelse
    1. Undersøge pluripotency af menneskelige ES/iPS-celler af embryoid organ (EB) dannelse på passager 10 og 20.
      Bemærk: Nær 80% sammenløbet i 6-godt plader er tilstrækkelig for udarbejdelsen af EB dannelse.
    2. Skyl menneskelige ES eller iPS-celler med 2 mL af DMEM/F-12 medier to gange, og derefter nedsænke celler i 1,5 mL af væsentlige 6 medier.
    3. Skær nær 80% sammenflydende humane ES eller iPS celler i ca 32 stykker med 200 µL tips. Næste, frigøre celler fra retterne ved hjælp af en celle skraber.
    4. Indsamle menneskelige ES/iPS-celler og overførsel til en 6-godt ultralow vedhæftet skål.
    5. Udveksle Essential 6 medier ved pipettering gamle medier og tilføje frisk media hver 2 dage.
      Bemærk: Kultur celler i suspension i 2 uger ved 37 ° C med 5% CO2.
    6. Efter EBs var homogen måde suspenderet i væsentlige 6 medier, overføre EBs til kultur på 24-godt TCP retter belagt med 0,1 vægt % gelatine, og kultur celler i væsentlige 6 medier for en ekstra uge.
    7. Pletten celler med antistoffer mod markører for de celler, der stammer fra tre embryonale kønscelleoverførsel lag [AFP (endoderm), GFA (ectoderm), β III-Tubulin (ectoderm) og SMA (mesoderm)] og evaluere cellerne ved immunfarvning metode beskrevet ovenfor.
  4. Teratom dannelse
    1. Undersøge pluripotency af menneskelige ES/iPS-celler af teratom dannelse på passager 10 og 20.
      Bemærk: 5 retter af nær 80% sammenløbet i 6-godt plader er tilstrækkelig for teratom dannelse (mindst 3 x 106 celler er nødvendige for teratom dannelse eksperimenter).
    2. Skyl celler med 2 mL DMEM/F-12 medier to gange, og derefter tilføje 1,5 mL DMEM/F-12 medier til celle kultur retter.
    3. Skåret næsten 80% sammenflydende ES eller iPS menneskeceller i ca 32 stykker ved hjælp af 200 µL tips. Næste, frigøre celler fra retterne ved hjælp af en celle skraber.
    4. Indsamle menneskelige ES/iPS-celler ind i en 15 mL centrifugering rør og centrifugeres celler på 160 × g i 5 min ved 37 ° C.
    5. Efter centrifugering, suspendere celle pellets i 100 µL DMEM/F12, og derefter blandes cellen pellets med 100 µL Matrigel (1:1 volumen ratio).
    6. Overføre cellesuspension til en-20 ° C pre afkølede sprøjte. I alt, i det mindste 3 × 10 subkutant at injicere6 celler i mandlige NOD-SCID (Nik. CB17 -Prkdascid/JNarl) mus (5-8 uger).
    7. Efter 5-8 uger, dissekere Teratomer, fix med 4,0% (vægt/volumen) PARAFORMALDEHYD løsning og derefter opbevares ved 4 ° C.
    8. Fix teratom med paraffin, skær de paraffin-embedded Teratomer og pletten med hæmatoxylin og eosin (H & E) ved hjælp af en standardprotokol28,32.
      Bemærk: Forskere kan sende faste teratom væv til selskabet til at fastsætte Teratomer med paraffin, paraffin-indkapslet skive Teratomer, og plette prøve med H & E, som typisk anvendes i afdeling af patologi på hospitaler.
  5. Menneskelige fedtholdigt-afledte stamceller (ADS) cellekultur
    1. Varm kultur medier (DMEM indeholdende 1% antimykotikum antibiotika og 10% føtal bovint serum (FBS)), 0,25% af trypsin-EDTA og PBS til 37 ° C i et vand bad før brug.
    2. Vask menneskeceller annoncer af pipettering 10 mL PBS i hvert 6-cm kultur parabol hvor cellerne er kulturperler.
    3. Tilsæt 1 mL trypsin-EDTA-oploesning (0,25%) i 6-cm kultur retter, og der inkuberes løsning ved 37 ° C i 5 min.
    4. Iagttage cellerne i 6 cm kultur retter under mikroskopi til at bekræfte, at cellerne er frakoblet.
    5. Indsamle cellerne i en 15 mL centrifugeglas, og tilføje et lige saa stort volumen af kultur medier (DMEM indeholdende 1% antimykotikum antibiotikum og 10% FBS) i centrifugeglasset at neutralisere trypsin-EDTA.
    6. Centrifugeres celler ved 250 × g i 5 min. ved 37 ° C.
    7. Efter centrifugering, supernatanten omhyggeligt af pipettering, uden at forstyrre den celle pellet.
    8. Resuspend celler i kultur medier, og derefter frø cellerne i den passende tæthed (5-10 x 103 celler pr. cm2 for passaging eller som angivet) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med og uden oligopeptides og ECM).
  6. Menneskelige fostervand stammer (AFS) cellekultur
    1. Varm dyrkning media (DMEM/MCDB 201 (2:3) indeholdende 20% føtal bovint serum (FBS), 5 ng/mL bFGF og 1% antimykotikum antibiotikum), 0,25% af trypsin-EDTA og PBS til 37 ° C i et vand bad før brug.
    2. Vask AFS menneskeceller af pipettering 10 mL PBS i hvert 6-cm kultur parabol hvor cellerne er kulturperler.
    3. Tilsæt 1 mL trypsin-EDTA-oploesning (0,25%) i 6-cm kultur retter, og der inkuberes celler ved 37 ° C i 5 min.
    4. Observere celler på 6 cm kultur retter under mikroskopi til at bekræfte cellerne er frakoblet.
    5. Indsamle cellerne i en 15 mL centrifugeglas, og tilsæt en tilsvarende mængde af kultur medier (DMEM/MCDB 201 (2:3) indeholdende 20% føtal bovint serum (FBS), 5 ng/mL bFGF og 1% antimykotikum antibiotikum) i centrifugeglasset at neutralisere trypsin-EDTA.
    6. Centrifugeres celler ved 250 × g i 5 min. ved 37 ° C.
    7. Efter centrifugering, supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre den celle pellet af pipettering.
    8. Resuspend celler i dyrkning medier og derefter frø cellerne i den passende tæthed (5-10 x 103 celler pr. cm2 for passaging eller som angivet) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med og uden oligopeptide og ECM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P-IA hydrogels podet med ECM-afledte oligopeptide (oligoECM) eller ECM med forskellige elasticiteter blev udarbejdet ved at følge reaktion ordningen, som det ses i figur 1A, ved hjælp af forskellige typer af oligoECM (figur 1B). Elasticiteter af hydrogels blev reguleret af anvendt crosslinking intensitet (tid) (figur 1 c). P-IA hydrogels podes med vitronectin-afledte oligopeptides, som har en opbevaring modulus 25.3 kPa (24 h crosslinking tid), støttet langtidskulturer menneskelige iPS og ES-celler for over 10-20 passager. Især, P-IA hydrogels podet med et fælles segment (P-IA-24h-VN1G) eller en dobbelt kæde (P-IA-24h-VN2G) understøttet pluripotency menneskelige iPS og ES-celler, der tilberedes med et relativt lavere koncentration af oligoECM (200-500 μg/mL) end P-IA-VN1 hydrogels, som nødvendiggjorde ved hjælp af en høj koncentration af oligoECM (> 1000 μg/mL) for at opretholde pluripotency af menneskelige celler iPS og ES28,32.

ES menneskeceller vedligeholdes på musen embryonale fibroblaster (MEFs) blev flyttet til kultur på andre syntetiserede belægning materialer (f.eks.Synthemax II) belagt retter og P-IA-24 h-VN1 hydrogel retter (figur 2)28. ES menneskeceller kulturperler på kommercielt tilgængelige belægning retter blev konstateret at mere let skelne, især på kanten af kolonier (figur 2a og 2 c), hvorimod humane ES-celler kunne opretholde deres pluripotency på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel retter fordi de differentierede celler ikke kunne ses fra morfologi af humane ES-celler på P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel retter (figur 2b og 2d)28.

Pluripotency menneskelige ES (figur 3A) og iPS (figur 3B) celler dyrkes på P-IA - 24 h hydrogels podet med oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), såvel som konventionelle rekombinante vitronectin ( rVitronectin)-belagt retter, blev evalueret baseret på udtryk for pluripotente maker proteiner (Nanog, Sox2 og Oct3/4) efter at cellerne blev kulturperler på hver tallerken i xeno-fri betingelser ved hjælp af væsentlige 8 medier for 10 passager32. Disse pluripotency proteiner var tilfredsstillende udtrykt på menneskelige iPS og ES-celler kulturperler på P-IA hydrogels podet med oligoECM og rVitronectin-belagt retter i xeno-fri betingelser.

Vurdering af muligheden for differentiering i cellerne stammer fra tre Kim lag i vitro (EB dannelse) og i vivo (teratom dannelse) er afgørende for at kontrollere pluripotency menneskelige ES og iPS-celler efter dyrkning på syntetisk biomaterialer. Derfor, humane ES-celler (figur 4) og menneskelige iPS-celler (figur 5) blev dyrket på P-IA-oligoECM hydrogel retter og rekombinante vitronectin-belagt retter for 10 passager, og efterfølgende cellerne var kulturperler i suspension til form EBs. EBs blev yderligere dyrket på gelatine-belagt retter for et par uger at iagttage cellerne evne til at spredes på retter (figur 4A og figur 5A)32. Differentierede menneskelige ES (figur 4B) og iPS (figur 5B) celler blev immunostained for protein fra tre Kim lag: alfa-fetoprotein (AFP, endoderm), glat muskel aktin (SMA, mesoderm) og glial fibrillære sure protein (GFAP ectoderm)32. Både menneskelige iPS og ES-celler blev fundet til at differentiere i de celler, der stammer fra alle tre Kim lag, der angiver en anden kontrol af pluripotency menneskelige iPS og ES-celler, selv efter dyrkning på P-IA hydrogels podet med oligoECM i xeno-fri betingelser for på lang sigt (passage > 10 passager).

Differentiering evne til ES menneskeceller ind i cellerne stammer fra tre Kim lag i vivo (teratom dannelse assay) blev også vurderet. Humane ES-celler, der blev dyrket på P-IA-VN1-1000 (figur 6A) og P-IA-VN2C-1000 (fig. 6B) i xeno-fri kultur betingelser for 10 passager, blev injiceret subkutant i NOD-SCID mus32. Teratomer blev isoleret fra mus, og teratom væv sektioner var fast og plettet med H & E (figur 6A og 6B)32. Teratomer vises eksistens af celler fra alle tre Kim lag: endoderm (intestinale epitel, figur 6A(b) og 6B(b)), mesoderm (brusk, figur 6A(c) og 6B(c)) og ectoderm ( neuroepithelium, figur 6A(d); retinale pigment epitel, fig. 6B(d)). Disse resultater tyder på, at ES menneskeceller kulturperler på P-IA-24h-VN1-1000 og P-IA-24h-VN2C-1000 i xeno-fri betingelser for 10 passager kan differentiere sig til celler med oprindelse fra tre Kim lag, der angiver, at deres pluripotency bevares i vivo.

AFS menneskeceller var også kulturperler i umodificeret P-IA hydrogel, P-IA-oligoECM hydrogel og TCP retter i ekspansion medier. Figur 7 viser morfologier af menneskelige AFS celler dyrkes efter fire dage af kultur i P-IA og P-IA-oligoECM hydrogel retter med elasticiteter (E') af 12.2 (crosslinking tid = 6 h), 18,3 (crosslinking tid = 12 h), 25.3 (crosslinking tid = 24 timer), og 30.4 kPa (crosslinking tid = 48t) ved hjælp af en oligoECM koncentration på 0 eller 50 μg/mL samt TCP retter med 3-12 GPa stivhed30.

AFS menneskeceller kan ikke formere sig på P-IA hydrogel retter med eller uden oligoECM når stivhed af P-IA hydrogels var mindre end 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h og PV-4h-Y), der henviser til, at AFS menneskeceller kunne formere sig med eller uden oligoECM da E' var større end 12 kPa, med undtagelse af P-IA - 6 h og PV-IA-6 h-Kol1 hydrogel retterne. P-IA - 6h og P-IA-6h-Kol1 synes ikke at være gunstige for kulturen af humane celler, AFS fordi bløde celle kultur biomaterialer standse cellecyklus progression30.

De ovenstående resultater tyder på, at P-IA hydrogel retter er en optimal materiale til lang sigt stem cell dyrkning og opretholde pluripotency af stamceller ved udvælgelse af specifikke stivhed og oligoECM, samt optimal reaktion koncentrationen af oligoECM (overflade tæthed af oligoECM).

Figure 1
Figur 1: forberedelse af P-IA hydrogels podet med oligoECM eller ECM. (A) ordningen af reaktion for P-IA hydrogels podet med ECM og ECM-afledte oligopeptide (oligoECM)29. Copyright 2015. Tilpasset med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry. (B) Design og rækkefølgen af oligopeptides podet på P-IA hydrogels. Enkelt kæde oligopeptides (P-IA-BSP, P-IA-VN1 og P-IA-HBP1), enkelt kæde oligopeptides med et fælles segment (P-IA-VN1G), og dobbelt kæder (P-IA-VN2C og P-IA-HBP2C) og ECM (P-IA-ECM) blev podet på P-IA hydrogels32. Tilpasset under en Creative Commons Attribution License. (C) stivhed af P-IA hydrogels udarbejdet af forskellige perioder af crosslinking29. Copyright 2015. Tilpasset med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sammenligning af humane ES celle kulturer på P-IA-24h-VN1 hydrogels og kommercielt tilgængelige belægning retter. Morfologi af humane ES-celler (WA09) dyrkes kommercielt tilgængelige belægning retter (a, b) og P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) retter på passage 1 når humane ES-celler blev flyttet fra dyrkning på musen embryonale fibroblaster (MEFs) ind i dyrkning på kommercielt tilgængelige belægning retter eller PVA-24h-VN1-1000 retter. Røde pile viser de differentierede humane ES-celler. De skala angiver 50 µm (a, b) og 100 µm (c, d)28. Tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: karakterisering af pluripotency menneskelige ES og iPS-celler på P-IA hydrogels podet med forskellige oligopeptide designs. (A) udtryk pluripotency proteiner Nanog (rød), Sox2 (grøn), og Oct3/4 (grøn) på menneskeceller ES (H9) analyseres ved immunfarvning med dobbelt farvning med Hoechest33342 for nukleare mærkning (blå) efter dyrkning på (en) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, og (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og på (d) rekombinante vitronectin (rVitronectin)-belagt retter på xeno-fri betingelser for 10 passager. (B) udtryk pluripotency proteiner Nanog (rød), Sox2 (grøn) og Oct3/4 (grøn) på menneskelige iPS-celler analyseret ved immunfarvning med dobbelt farvning med Hoechest33342 for nukleare mærkning (blå) efter dyrkning på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogel, og (c) rekombinante vitronectin (rVitronectin)-hydrogels belagt retter på xeno-fri betingelser for 10 passager32. Skala barer angiver 50 µm. Adapted under en Creative Commons Attribution License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: karakterisering af muligheden for differentiering af humane ES-celler på P-IA hydrogels podet med forskellige oligopeptide designs. (A) morfologi af celler fra EBs differentieret fra humane ES (H9) celler efter dyrkningsbaserede på (en) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, og (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og (d) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-belagt retter på xeno-fri betingelser for 10 passager. Skala barer angive 100 µm. (B) udtryk for en ectoderm protein (GFAP, red), mesoderm protein (SMA, grønne) og endoderm protein (AFP, grøn) i humane ES (H9) celler evalueret ved immunfarvning med dobbelt farvning med Hoechest33342 for nukleart mærkning (blå) efter dyrkning på P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 og P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels, og på rekombinante vitronectin (rVitronectin)-belagt retter på xeno-fri betingelser for 10 passager32. Skala barer angiver 50 µm. Adapted under en Creative Commons Attribution License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: karakterisering af muligheden for differentiering af menneskelige iPS-celler på P-IA hydrogels podet med forskellige oligopeptide designs. (A) morfologi af celler fra EBs differentieret fra menneskelige iPS (HPS0077) celler efter dyrkning på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og (c) rekombinante vitronectin (rVitronectin)- coatede retter på xeno-fri betingelser for 10 passager. Skala barer angive 100 µm. (B) udtryk for en ectoderm protein (GFAP, red), mesoderm protein (SMA, grønne) og endoderm protein (AFP, grøn) i menneskelige iPS (HPS0077) celler analyseret ved immunfarvning med dobbelt farvning med Hoechest33342 for nukleart mærkning (blå) efter dyrkning på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og (c) rekombinante vitronectin (rVitronectin)-belagt retter på xeno-fri betingelser for 10 passager32. Skala barer angiver 50 µm. Adapted under en Creative Commons Attribution License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering af muligheden for differentiering af humane ES (H9) celler in vivo efter dyrkning på P-IA-24 h-VN1 og P-IA-24 h-VN2C hydrogels. (A) (en) billede af en teratom ved indsprøjtning med humant ES celler efter dyrkning på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels xeno-gratis celle kultur betingelser efter 10 passager. Væv, herunder (b) intestinale epitel (endoderm), kan (c) brusk (mesoderm) og (d) neuroepithelium (ectoderm) observeres. (B) (en) billede af en teratom ved indsprøjtning med humant ES celler efter dyrkning på P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels xeno-gratis celle kultur betingelser efter 10 passager. Væv, herunder (b) intestinale epitel (endoderm), kan (c) brusk (mesoderm) og (d) retinale pigment epitel (ectoderm) observeres32. Skala barer angive 100 µm. Adapted under en Creative Commons Attribution License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: morfologi af menneskelige AFS celler dyrkes på TCP retter og P-IA hydrogel retter immobiliseret med eller uden ECM-afledte oligopeptides efter 4 dages kultur. (A) morfologi af AFS menneskeceller på TCP retter. (B) morfologi af menneskelige AFS celler P-IA - 6 h-og P-IA-6 h -Z hydrogel retter (P-IA - 6 h, Pedersen-IA-6 h-Kol1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 og P-IA-6 h-cRGD-50). (C) morfologi af hAFCs på P-IA - 12 h og P-IA-12 h -Z hydrogel retter (P-IA - 12 h, Pedersen-IA-12t-Kol1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 og P-IA-12 h-cRGD-50). (D) morfologi af menneskelige AFS celler P-IA - 24 h-og P-IA-24 h -Z hydrogel retter (P-IA - 24 h, Pedersen-IA-24 h-Kol1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 og P-IA-24 h-cRGD-50). (E) morfologi af menneskelige AFS celler P-IA - 48 h-og P-IA-48 h -Z hydrogel retter (P-IA - 48 h, Pedersen-IA-48 h-Kol1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 og P-IA-48 h-cRGD-50). De skala angiver 100 μm30. Copyright 2017. Tilpasset med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navnet på materiale / udstyr Forkortelse
GTPGPQGIAGQRGVV KOL1
GACRGDCLGA Cyklisk M.H.T. (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Fibronektin FN

Tabel 1: ECM-afledte oligopeptide sekvenser og ECM anvendes i denne undersøgelse.

Antistoffer Koncentration (fortynding sats)
Nanog 1:200
SSEA4 1:200
OCT3/4 1:200
Sox2 1:200
Glat muskel aktin 1:200
(Α-SMA) 1:200
AFP 1:200
GFAP 1:200
Alexa Fluor 555-konjugeret gede anti-mus 1:200

Tabel 2: Antistoffer bruges for immunfarvning i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P-IA-oligoECM og P-IA-ECM hydrogels med varierende stivhed blev udviklet for den langsigtede udbygning af menneskelige ES og iPS-celler opretholde deres pluripotency for over ti passager i xeno-fri betingelser og for kulturen i AFS menneskeceller, annoncer celler, og hæmatopoietisk stamceller25,28,32. P-IA hydrogels immobiliseret med oligoECM er en fremragende kandidat til celle dyrkning materialer til at undersøge effekten af celle kultur materialer på differentiering skæbne og spredning af forskellige typer af stamceller samt primærelementer og kræftceller.

P-IA løsning bør være gennemsigtig, når P-IA løsning er støbt på retterne. Crosslinking tid beslutter crosslinking intensiteten af P-IA hydrogels. 24 h crosslinking af P-IA hydrogels producerer optimale hydrogels for menneskelige ES/iPS cellekultur. Enhver oligopeptides og ECMs kan blive podet på P-IA hydrogels ved hjælp af denne protokol, hvor oligopeptides og ECMs har gratis amino grupper25,28,29,30,31, 32. overflade tætheden af oligopeptides eller ECMs kan blive opdaget af X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) målinger, selv om XPS kan ikke præsentere absolut værdi af den overflade tæthed, men eksistensen af oligopeptides eller ECMs kan være sikkert analyseret.

P-IA hydrogels med og uden podede oligopeptides eller ECMs kan være forberedt, som har opbevaring modulus fra 3-30 kPa, afhængigt af crosslinking tid. Det er temmelig svært at forberede sig P-IA hydrogels at have mindre opbevaring modulus end 3 kPa og højere opbevaring modulus end 30 kPa25,28,29,30,31,32. Dette er en begrænsning af den nuværende hydrogel forberedelse metode til kemisk crosslinking af P-IA hydrogels. Denne protokol giver imidlertid en anden indstilling af hydrogels at have forskellige elasticitet, som kan støtte kulturen af primærelementer, kræftceller, eller stamceller, herunder menneskelige ES og iPS-celler, men er ikke lavet af polyacrylamid. Især menneskelige ES og iPS-celler ikke kan formere sig på polyacrylamid hydrogels, men kan formere sig på P-IA hydrogels som vist i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5og figur 6. Ja, P-IA-24h-VN1 hydrogels støttede menneskelige ES cellekultur bedre end kommercielt tilgængelige belægning retter (figur 2). P-IA hydrogels er derfor at foretrække for kulturen af human ES og iPS-celler.

Det ville være interessant at undersøge optimal elasticitet af hydrogels, hvor menneskelige ES og iPS-celler er differentieret i specifikke lineages af celler som cardiomyocytes35, retinale pigment epitel36, β celler6og TH + celler6 for den fremtidige udvikling af regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev delvist støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan under grant numre 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006, og 104-2221-E-008-107-MY3. Denne forskning blev også støttet af Taiwan Landseed Hospital projekt (Netkontrolenheden-LSH-105-A-001). En licensbetaling for videnskabelig forskning (nummer 15K 06591) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan er også anerkendt. A. Higuchi vil gerne anerkende for internationale videnskabelige Partnership Program (ISPP-0062) Vice repræsentantskabet for studier og forskning, King Saud University, Riyadh 11451, Kongeriget Saudi-Arabien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Bioteknologi sag 132 Hydrogel induceret pluripotente stamceller embryonale stamceller elasticitet cellekultur oligopeptide overflade ændring nanosegment
Humane pluripotente stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhed på Xeno-fri betingelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter