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Bioengineering

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Un protocollo è presentato per preparare polivinil alcool-co-itaconico acido idrogel con rigidità variabile, che sono stati innestati con e senza oligopeptidi, per studiare l'effetto della rigidità dei biomateriali sulla differenziazione e proliferazione delle cellule staminali. La rigidità nel caso degli idrogeli fu controllata dal tempo di reticolazione.

Abstract

L'effetto di segnali fisici, ad esempio la rigidità dei biomateriali sulla proliferazione e differenziazione delle cellule staminali, è stato studiato da diversi ricercatori. Tuttavia, la maggior parte di questi investigatori hanno utilizzato idrogel di poliacrilamide per coltura della cellula formativa nei loro studi. Pertanto, i loro risultati sono discutibili perché tali risultati potrebbero provenire dalle caratteristiche specifiche del poliacrilammide e non dallo spunto fisico (rigidità) dei biomateriali. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di idrogeli, che non si basano su poliacrilammide, dove vari staminali, cellule compreso le cellule staminali embrionali umane (ES) e umane pluripotenti indotte (iPS) staminali, può essere coltivato. Idrogel con rigidità variabile sono stati preparati da bioinerte polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA), con rigidità controllata dal grado di reticolazione cambiando tempo di reticolazione. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con e senza oligopeptidi derivato dalla matrice extracellulare sono stati studiati come una futura piattaforma per la coltura delle cellule staminali e differenziazione. La cultura e il passaggio di cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS è descritto in dettaglio qui. Nel caso degli idrogeli oligopeptide P-IA ha mostrato prestazioni superiori, che sono state indotte dalle loro proprietà di rigidità. Questo protocollo riporta la sintesi del biomateriale, loro manipolazione superficiale, insieme a controllare le proprietà di rigidezza e infine, il loro impatto sul destino delle cellule staminali utilizzando condizioni di coltura privo di xeno. Basato su studi recenti, tali substrati modificate possono fungere da piattaforme future per sostenere e dirigere il destino di varie cellule staminali linea per diversi collegamenti; e inoltre, rigenerare e ripristinare le funzioni dell'organo perso o tessuto.

Introduction

Il destino del differenziamento di cellule staminali in un lignaggio specifico delle cellule e la proliferazione delle cellule staminali, soprattutto umane pluripotenti indotte (iPS) e cellule staminali embrionali umane (ES), a lungo termine è noto per essere regolata da inibitori, fattori di crescita, e / o piccole molecole bioattive in terreni di coltura. Recentemente, i segnali fisici dei biomateriali, in particolare la rigidità dei biomateriali di coltura delle cellule, sono stati riconosciuti per essere un fattore importante che guida il destino delle cellule staminali proliferazione e differenziazione1,2, 3,4,5,6. Di conseguenza, diversi ricercatori hanno iniziato a investigare sul destino delle cellule staminali, che sono coltivati su idrogeli, sulla differenziazione, principalmente utilizzando idrogel di poliacrilamide con rigidità diverse.

La rigidità dei biomateriali possa controllare adesioni focali, morfologia delle cellule, fenotipo delle cellule e adesione delle cellule staminali, soprattutto in bidimensionale (2D) coltivazione1,2,3,5. Meccano-rilevamento di biomateriali di cellule staminali è generalmente controllata di segnalazione tramite recettori integrinici focale di adesione. NMMIIA, miosina non muscolare contrattilità IIA-dipendente del citoscheletro di actina svolge un ruolo critico nel processo di mechanosensing delle cellule staminali in 2-D cell coltivazione sistemi3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler e i suoi colleghi ha sviluppato un concetto interessante che cellule staminali adulte, quali midollo osseo le cellule staminali (BMS) coltivate sui biomateriali di cultura delle cellule con una rigidità simile a quella di tessuti specifici, tendono a differenziarsi in cellule ha provenute da tessuti specifici5. BMS cellule incubate su idrogel di poliacrilamide morbido 2-D rivestito con collagene di tipo I (con una rigidità paragonabile a quella dei tessuti cerebrali) nei media espansione fossi spontaneamente indotte a differenziarsi in linee cellulari di neurone iniziale, considerando che BMS cellule coltivate su idrogel con una rigidità simile a quella del muscolo o tessuti collagena dell'osso sono stati trovati per indurre la differenziazione in primi lignaggi di miociti e osteoblasti, rispettivamente, il 2-D poliacrilammide idrogeli3,5. Molti ricercatori hanno studiato il destino delle cellule staminali di differenziazione coltivate su poliacrilammide idrogeli immobilizzati con collagene tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Tuttavia, va ricordato che alcune contraddittorie segnala1,18,22,23,24 esiste per il ben noto idea suggerita da Engler et al. 5 questo è perché idea5 di Engler è stato sviluppato esclusivamente su idrogel di poliacrilamide e i loro risultati hanno avuto origine da caratteristiche specifiche di biomateriale (poliacrilammide) e non solamente dalla stecca fisica (rigidità) di il biomateriale. Pertanto, è importante sviluppare un altro tipo di idrogel, di cui la rigidità può essere controllata da reticolazione nel caso degli idrogeli. Per questo scopo, bioinerte idrogeli sono stati sviluppati, che sono stati preparati da polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA) con una diversa rigidezza, che era controllata dal grado di reticolazione con un cambiamento reticolazione tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. le cellule staminali possono essere coltivate su nonmodified P-IA idrogeli, come pure P-IA idrogeli innestati con matrici extracellulari (ECMs) e oligopeptidi. In un precedente studio25, cellule staminali ematopoietiche umane (hHSCs) da sangue del cordone ombelicale sono state coltivate su P-IA idrogel con valori di rigidità differenti che vanno da un 3 kPa a 30 kPa modulo elastico dove fibronectina o un oligopeptide derivato da fibronectina (CS1, EILDVPST) è stata innestata nel caso degli idrogeli P-IA. Alta ex vivo piega espansione di hHSCs è stata osservata nel caso degli idrogeli P-IA innestato con CS1 o fibronectina, che visualizzata una rigidità intermedia che vanno da 12 kPa a 30 kPa25.

IPS umano e cellule ES non possono essere coltivate coltura convenzionale polistirolo (TCP) piatti33,34 ES umano e cellule iPS richiedono legame specifico con ECMs, come vitronectina o laminina per mantenere la loro pluripotenza durante la coltura a lungo termine. Di conseguenza, diverse strutture di idrogeli di P-IA oligopeptide-innestati con caratteristiche di rigidità ottimale sono stati progettati e preparati nelle formazioni di una singola catena, una catena singola con un segmento comune, una doppia catena con un segmento comune e un tipo di ramificata catena32. Oligopeptide sequenze sono stati selezionati da domini di integrina e glicosaminoglicani-associazione di ECMs. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con oligopeptidi vitronectin-derivati con una doppia catena o un segmento comune, che hanno un modulo di deposito a circa 25 kPa, supportata la coltura a lungo termine di ES umano e cellule iPS per oltre 12 passaggi sotto privo di xeno e chimica condizioni definite32. Il segmento comune e doppia catena con molecole di adesione cellulare nel caso degli idrogeli facilitato la proliferazione e pluripotenza delle umane ES e iPS celle32. Qui, un protocollo per la preparazione di idrogeli di P-IA (con un modulo di deposito da 10 kPa a 30 kPa, che è stata misurata in condizioni di umide nell'aria) innestato con e senza oligopeptidi o ECMs è descritto. Viene mostrato come cultura e passaggio parecchie cellule staminali (tra cui le cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS).

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Protocol

Gli esperimenti in questo studio sono stati approvati dai comitati di etica dell'ospedale di Landseed (05-13-IRB) di Taiwan e National Central University. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con tutte le linee guida istituzionali e governative pertinenti ed applicabili e regolamenti durante questo studio.

1. soluzione e preparazione di terreni

  1. Purificazione di polimero
    1. Purificare il P-IA con gruppo dell'acido carbossilico con un grado di idrolisi di > 96,5% di P-IA di lavaggio con etanolo. Mettere 20 g di P-IA in 200 mL di etanolo in un becher da 500 mL conico e agitare su un agitatore magnetico per 24-30 h. cambio l'etanolo con etanolo ogni 8-10 h.
    2. Rimuovere P-IA da etanolo mediante filtrazione utilizzando un filtro Büchner.
    3. P-IA asciutto di essiccazione sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 h.
      Nota: Si raccomanda di pulire la trappola del sistema di essiccazione a vuoto (tramite la rimozione di etanolo) frequentemente, soprattutto durante le prime poche ore, perché la trappola tende ad occludersi dopo la rimozione di una grande quantità di etanolo da P-Ia.
  2. Preparazione della soluzione P-IA
    Nota: Aggiungere il polimero molto lentamente in solvente (acqua). Si consiglia di prendere almeno 15 min per aggiungere il P-IA in solvente. Se il solvente è aggiunto nel polimero, il polimero non sarebbe dissolto completamente. Fare attenzione a non generare esplosiva di ebollizione della soluzione P-IA. Uso di occhiali protettivi durante la preparazione della soluzione P-IA. Il processo di riscaldamento della soluzione P-IA è essenziale per sciogliere il cristallino P-Ia. È suggerito (e preferibile) per preparare la soluzione di P-IA in una camera sperimentale relativamente pulita, se possibile.
    1. Sciogliere il P-IA in acqua pura a una concentrazione di peso 0.050% per l'esperimento di coltivazione delle cellule o una concentrazione di peso 0.50% per la misurazione del reometro: ad esempio, sciogliere 50 mg di P-IA in 100 mL di acqua pura per la coltura cellulare e 500 mg di P-IA in 100 mL di de acqua ionizzata (DI) per le misurazioni di reometro.
    2. Agitare la soluzione di P-IA per 1h sulla piastra calda.
      Nota: Per evitare l'ebollizione esplosiva, non riscaldare la soluzione oltre a 95 ° C. Ebollizione esplosiva della soluzione polimerica ad alta temperatura può generare ustioni della pelle. Pertanto, eseguire il riscaldamento del P-IA molto con attenzione e monitorare la temperatura della soluzione P-IA durante il riscaldamento.
    3. Dopo la soluzione di P-IA è stata raffreddata a temperatura ambiente, agitare la soluzione di P-IA a temperatura ambiente per 48 h. soluzione di P-IA calda lascia sulla piastra calda senza riscaldamento e poi lasciarlo senza agitazione a temperatura ambiente per 20-24 h garantire che siano bolle d'aria non presenti nella soluzione P-IA.
  3. Preparazione della soluzione di reticolazione
    1. Effettuare la composizione della % di glutaraldeide reticolazione soluzione 1.0 peso da soluzione di glutaraldeide acquosa 25%, 20,0% Na2di peso così4 utilizzo 99% > purezza e 1.0 peso % H2così4. Ad esempio, per un 6 o 12 Beh piastra di coltura cellulare, aggiungere 100 µ l di soluzione di glutaraldeide, 2 g di solfato di sodio e 100 µ l di acido solforico in 10 mL di acqua pura.
  4. Terreni di coltura umana delle cellule ES/PS
    Nota: Uso DMEM/F12 media, media 6 essenziale ed essenziale 8 media per la coltura delle cellule.
    1. Ritorno congelato 50 X essenziale 8 supplemento lentamente alla soluzione durante la notte da scongelare in frigorifero a 4 ° C.
    2. Aggiungere una bottiglia di 50 supplemento x8 essenziali in una bottiglia di media basale 8 essenziali. Separare il media in piccole aliquote (50 mL CAD.) in tubi di centrifugazione 100ml, quindi conservare i supporti a-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel piatto preparazione

  1. Preparazione dei film P-IA
    1. Iniettare un'aliquota di 1 mL della soluzione P-IA in un piatto TCP di 35 mm ed asciugare il piatto in forno a 45 ° C per 2 giorni per produrre un film P-IA in un banco di lavoro pulito.
  2. Reticolazione dei piatti idrogel P-IA
    1. Immergere i film P-IA in una soluzione acquosa di reticolazione per 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (per esempio, P-IA-12 h) si riferisce a un reticolato di idrogel P-IA per X h (ad es., 12 h).
    2. Dopo reticolazione, sciacquare l'idrogel di P-IA con acqua pura a temperatura ambiente e quindi mantenere idrogeli in acqua pura a temperatura ambiente in un banco di lavoro pulito.
    3. Sterilizzare i P-IA idrogeli mediante immersione in una soluzione di etanolo 75.0 volume/volume% per 1 min, sciacquare l'idrogel di P-IA in acqua pura sei volte e quindi mantenere l'idrogel di P-IA in acqua pura fino a quando non utilizzati per colture cellulari.
  3. Preparazione di piatti di idrogel P-IA innestato con oligopeptide o ECM
    1. Attivare l'idrogel di P-IA tramite immersione in 1 mL di soluzione acquosa contenente 10 mg/mL N.-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide cloridrato (EDC) e 10 mg/mL N- Idrossisuccinimide (NHS) per 1 h a 37 ° C o a 4 h a 4 ° C.
    2. Sciacquare l'idrogel di P-IA con 1 mL di fosfato tampone salino (PBS, pH 7,2) 3 volte e immergere l'idrogel di P-IA in una soluzione di PBS contenente 1 mL di oligopeptide (100-1.500 µ g/mL) o ECM (10-100 µ g/mL) per 24 h a 4 ° C.
      Nota: Le sequenze di oligopeptide ed ECMs usato per coltura della cellula formativa sono riassunti nella tabella 1.
    3. Dopo l'innesto l'oligopeptide o ECM, lavare l'idrogel di P-IA con acqua pura 3 volte.
      Nota: Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con Y µ g/mL di oligopeptide o ECM (Z) è appresso P-IA -Xh -Z oP-IA-Xcon la h -Z-Y, dove X indica il tempo di reticolazione (h), Y indica la concentrazione del oligopeptide o ECM, e Z indica un oligopeptide differenti o ECM.

3. coltura cellulare umano ES/iPS

  1. Metodo di passaggio e di manutenzione dell'indifferenziato ES umano e cellule iPS
    1. Mantenere umano ES (ad es., WA09 o H9) cellule o umano iPS (ad esempio, HS0077) cellule su Matrigel in media 8 essenziali in piatti 6 cm utilizzando standard umano ES/iPS delle cellule di cultura protocolli28,32.
    2. Incubare le cellule umane di vicino-confluenti ES/iPS con dispase 2,0 mg/mL II in DMEM/F-12 media a 37 ° C per 8-10 minuti e poi risciacquare cellule umane ES/iPS due volte con DMEM/F12 media.
    3. Dopo l'aggiunta di 2 mL di DMEM/F-12 media per piastre di coltura delle cellule ES/iPS umani, scollegare debolmente colonie aderenti con un raschietto di cella o di pipettaggio.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS in provette da centrifuga 15 mL e centrifugare le cellule umane ES/iPS a 160 × g per 5 min a 37 ° C.
    5. Dopo la centrifugazione, scartare il DMEM/F12 e sospendere le cellule umane ES/iPS in 1 mL di E8 media e poi contare la densità delle cellule utilizzando un contatore di cellule.
    6. Inoculare le cellule ES/iPS dopo la regolazione adeguata densità (1-5 x 104 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con l'oligopeptide o ECM).

4. caratterizzazione della caratterizzazione delle cellule umane ES/iPS

  1. Valutazione dell'attività della fosfatasi alcalina (AP)
    1. Misurare l'attività della fosfatasi alcalina (AP) di cellule umane ES/iPS utilizzando una colorazione diretta di fosfatasi alcalina standard.
  2. Immunostaining
    1. Eseguire immunostaining del Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 e Oct3/4 sulle cellule hES e fianchi per indagare la pluripotenza seguendo il protocollo convenzionale28,32.
    2. Aggiungere un volume di 0,5 mL di paraformaldeide al 4% (volume/volume) in ogni piatto ben 24 in cui sono state coltivate le cellule umane ES/iPS e successivamente, incubare i piatti per 15 min a 4 ° C per fissare le cellule.
    3. Aspirare la soluzione di paraformaldeide da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di PBS per bene, quindi aspirare PBS per sciacquare le cellule. Eseguire il processo di risciacquo 3 volte.
    4. Permeabilize le membrane cellulari aggiungendo 0,5 mL dello 0,3% (volume/volume) soluzione di Triton-X100 in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirare la soluzione di Triton-X100, aggiungere 300 µ l di 2% (peso/volume) albumina di siero bovino (BSA) in PBS (tampone di arresto) in ogni pozzetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il tampone bloccante pipettando e successivamente, aggiungere gli anticorpi primari desiderati (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) e Tra-1-81(1:200) di pipetta, cfr. tabella 2) in ciascun pozzetto, dove 1: 200 indica gli anticorpi sono stati diluiti con PBS 200 volte e incubate per un giorno a 4 ° C.
    7. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare le cellule con 300 µ l di 0.05% Tween 20 in soluzione PBS 3 volte a temperatura ambiente.
    8. Aggiungere 300 µ l di anticorpi secondari (1: 200, cfr. tabella 2), che sono specifici per il sottotipo di IgG primario, in soluzione al 2% (peso/volume) BSA in ogni bene e incubare per 1 h a temperatura ambiente al buio.
    9. Lavare le cellule con 300 µ l di 0.05% Tween 20 in soluzione PBS 3 volte a temperatura ambiente al buio.
    10. Analizzare le cellule marcate da microscopia di fluorescenza o microscopia confocale.
  3. Formazione embryoid body
    1. Indagare la pluripotenza delle cellule umane ES/iPS da formazione embryoid body (EB) a passaggi 10 e 20.
      Nota: Vicino a 80% confluenza in piastre da 6 pozzetti è sufficiente per la preparazione della formazione di EB.
    2. Sciacquare ES umana o cellule iPS con 2 mL di terreno DMEM/F-12 due volte e poi immergere le cellule in 1,5 mL di Essential 6 media.
    3. Tagliate a circa 32 pezzi utilizzando 200 µ l consigli vicino a 80% confluenti umane cellule ES o iPS. Successivamente, scollegare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto di cella.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS e trasferimento in un piatto di allegato 6 pozzetti ultrabasso.
    5. Supporti cambio Essential 6 pipettaggio vecchi media e aggiungendo media freschi ogni 2 giorni.
      Nota: Coltura le cellule in sospensione per 2 settimane a 37 ° C con 5% CO2.
    6. Dopo l'EBs omogeneamente sono stati sospesi nei media Essential 6, trasferire EBs alla cultura su piatti TCP 24 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina peso e cultura le cellule nei media di 6 essenziale per una settimana supplementare.
    7. Macchia le celle con gli anticorpi contro i marcatori delle cellule derivate da tre strati germinali embrionali [AFP (endoderma), GFA (ectoderma), β III-tubulina (ectoderma) e SMA (mesoderma)] e valutare le cellule con il metodo di immunostaining descritto sopra.
  4. Formazione di teratoma
    1. Indagare la pluripotenza delle cellule umane ES/iPS da formazione di teratoma a passaggi 10 e 20.
      Nota: 5 piatti della confluenza di 80% in piastre da 6 pozzetti sono sufficienti per la formazione di teratoma (almeno 3 x 106 cellule sono necessarie per gli esperimenti di formazione di teratoma).
    2. Sciacquare le cellule con 2 mL DMEM/F-12 media due volte e quindi aggiungere 1,5 mL DMEM/F-12 supporti per le piastre di coltura delle cellule.
    3. Tagliate quasi 80% confluenti ES o iPS cellule umane a circa 32 pezzi utilizzando 200 µ l consigli. Successivamente, scollegare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto di cella.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS in una provetta da centrifuga 15 mL e centrifugare le cellule a 160 × g per 5 min a 37 ° C.
    5. Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet cellulare in 100 µ l DMEM/F12 e poi mix la cella pellet con 100 µ l Matrigel (rapporto 1:1 in volume).
    6. Trasferire la sospensione cellulare in una siringa pre-raffreddata a-20 ° C. Iniettare, in totale, almeno 3 × 106 cellule per via sottocutanea nel maschio NOD-SCID (cenno del capo. CB17 -Prkdascid/JNarl) topi (5-8 settimane).
    7. Dopo 5-8 settimane, sezionare i teratomas, difficoltà con soluzione di paraformaldeide 4,0% (peso/volume) e quindi conservare a 4 ° C.
    8. Difficoltà il teratoma con paraffina, affettare i teratomas paraffina e macchia con ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando un protocollo standard28,32.
      Nota: I ricercatori possono inviare tessuto fisso teratoma all'azienda di difficoltà i teratomas con paraffina, teratomi fetta della paraffina e macchia il campione con H & E, che viene in genere utilizzato nel reparto di patologia negli ospedali.
  5. Coltura delle cellule staminali adiposo-derivate umane (annunci)
    1. Terreni di coltura caldo (DMEM contenente 1% antimicotico Antibiotico e 10% siero bovino fetale (FBS)), 0,25% di tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C in un prima vasca acqua di usarla.
    2. Lavare le cellule umane annunci di pipettaggio 10 mL di PBS in ogni piatto-6cm cultura dove le cellule sono coltivate.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) i piatti di cultura di 6 cm e incubare la soluzione a 37 ° C per 5 min.
    4. Osservare le cellule in piastre di coltura di 6 cm sotto microscopia per confermare che le cellule sono staccate.
    5. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere un volume equivalente di terreni di coltura (DMEM contenente antibiotico antimicotico 1% e 10% FBS) nella provetta da centrifuga per neutralizzare la tripsina-EDTA.
    6. Centrifugare le cellule a 250 × g per 5 min a 37 ° C.
    7. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante con attenzione di pipettaggio, senza disturbare il pellet cellulare.
    8. Risospendere le cellule in coltura e quindi seme le cellule alla densità appropriata (5-10 x 103 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con e senza oligopeptidi ed ECM).
  6. Staminali del liquido amniotico umano coltura cellulare (AFS)
    1. Caldo media coltivazione (DMEM/MCDB 201 (2:3) contenente 20% siero bovino fetale (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% antibiotico antimicotico), 0,25% di tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C in un prima vasca acqua di usarla.
    2. Lavare le cellule umane di AFS di pipettaggio 10 mL di PBS in ogni piatto-6cm cultura dove le cellule sono coltivate.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in piastre di coltura di 6 cm e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
    4. Osservare le cellule su piastre di coltura di 6 cm sotto microscopia per confermare le cellule sono staccate.
    5. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere un volume uguale di terreni di coltura (DMEM/MCDB 201 (2:3) contenente 20% siero bovino fetale (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% antibiotico antimicotico) nella provetta da centrifuga per neutralizzare la tripsina-EDTA.
    6. Centrifugare le cellule a 250 × g per 5 min a 37 ° C.
    7. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante con attenzione senza disturbare il pellet cellulare pipettando.
    8. Risospendere le cellule in media coltivazione e quindi seme le cellule alla densità appropriata (5-10 x 103 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con e senza oligopeptide ed ECM).

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Representative Results

P-IA idrogeli innestano con ECM-derivato oligopeptide (oligoECM) o ECM con elasticità differenti sono stati preparati seguendo lo schema di reazione, come si vede in Figura 1A, utilizzando diversi tipi di oligoECM (Figura 1B). Le elasticità nel caso degli idrogeli sono state regolate dall'intensità applicata reticolazione (tempo) (Figura 1). P-IA idrogeli innestati con oligopeptidi vitronectin-derivato, che ha un modulo di deposito di 25,3 kPa (tempo di reticolazione di 24h), supportato la coltura a lungo termine di iPS umano e cellule ES per oltre 10-20 passaggi. In particolare, P-IA idrogeli innestano con un segmento comune (P-IA-24h-VN1G) o una doppia catena (P-IA-24h-VN2G) supportato la pluripotenza delle iPS umano e cellule ES, che sono state preparate con una concentrazione relativamente bassa di oligoECM (200-500 μg/mL) rispetto a P-IA-VN1 idrogel, che ha reso necessario utilizzando un'alta concentrazione di oligoECM (> 1000 μg/mL) per mantenere la pluripotenza delle umane iPS ed ES celle28,32.

Cellule umane ES mantenuto sul mouse embrionali fibroblasti (MEFs) sono stati spostati alla cultura su altri piatti di rivestimento di materiali (ad es., Synthemax II) rivestito sintetizzati e P-IA-24h-VN1 idrogel piatti (Figura 2)28. Cellule ES umane coltivate sul rivestimento commercialmente disponibile piatti sono stati trovati per differenziare più facilmente, specialmente al bordo delle colonie (Figura 2a e 2C), considerando che le cellule umane ES ha potuto effettuare la loro pluripotenza su P-IA-24h-VN1-1000 idrogel piatti perché le cellule differenziate non ha potevano essere osservate dalla morfologia delle cellule umane ES su P-IA-24h-VN1-1000 idrogel piatti (Figura 2b e 2d)28.

La pluripotenza di ES umano (Figura 3A) e iPS (Figura 3B) cellule coltivate su P-IA - 24h idrogeli innestato con oligoECM (P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000, P-IA-24h-VN2C), così come convenzionale vitronectina ricombinante ( rVitronectin)-rivestito piatti, è stata valutata in base all'espressione delle proteine di bollitore pluripotenti (Oct3/4, Sox2 e Nanog) dopo che le cellule sono state coltivate su ogni piatto in condizioni prive di xeno utilizzando supporti essenziali 8 per 10 passaggi32. Queste proteine di pluripotenza sono stati espressi in modo soddisfacente su iPS umano e cellule ES coltivate sul P-IA idrogeli innestati con oligoECM, così come sui piatti rVitronectin-rivestito in condizioni prive di xeno.

Valutazione della capacità di differenziazione nelle cellule derivate da tre strati germinativi in vitro (formazione di EB) e in vivo (formazione di teratoma) è indispensabile verificare la pluripotenza delle ES umane e cellule iPS dopo coltura sintetici biomateriali. Pertanto, cellule umane ES (Figura 4) e le cellule umane iPS (Figura 5) erano coltivate su P-IA-oligoECM idrogel piatti e piatti rivestite con vitronectina ricombinante per 10 passaggi e, successivamente, le cellule sono state coltivate in sospensione a forma EBs. L'EBs erano ulteriormente coltivato su piatti rivestite con gelatina per un paio di settimane osservare la capacità delle cellule di diffondere sui piatti (Figura 4A e 5A figura)32. ES umano differenziato (Figura 4B) e le cellule iPS (figura 5B) immunostained per proteine derivate da tre strati di germe: alfa-fetoproteina (AFP, endoderma), actina del muscolo liscio (SMA, mesoderma) e la proteina silicea fibrillare glial (GFAP ectoderma)32. Sia umano iPS e cellule ES sono state trovate a differenziarsi in cellule derivate da tutti i tre strati di germe, che indica un'altra verifica di pluripotenza di iPS umano e cellule ES, anche dopo la coltivazione su P-IA idrogeli innestati con oligoECM xeno-Free condizioni per il lungo termine (passaggio > 10 passaggi).

Inoltre è stata valutata la capacità di differenziazione delle cellule umane ES nelle cellule ha provenuto da tre strati germinativi in vivo (teratoma analisi di formazione). Le cellule ES umane, che sono state coltivate su P-IA-VN1-1000 (Figura 6A) e P-IA-VN2C-1000 (Figura 6B) in condizioni di coltura privo di xeno per 10 passaggi, sono state iniettate per via sottocutanea nella di topi NOD-SCID32. I teratomas sono stati isolati dai topi, e sezioni di tessuto di teratoma erano fissi e macchiate con H & E (Figura 6A e 6B)32. I teratomas visualizzato l'esistenza di cellule provenienti da tutti i tre strati di germe: endoderma (epitelio intestinale, Figura 6A(b) e 6B(b)), mesoderma (cartilagine, Figura 6A(c) e 6B(c)) e (ectoderma neuroepithelium, Figura 6A(d); epitelio pigmentato retinico, Figura 6B(d)). Questi risultati indicano che le cellule ES umane coltivate su P-IA-24h-VN1-1000 e P-IA-24h-VN2C-1000 in condizioni prive di xeno per 10 passaggi possono differenziano in cellule originarie da tre strati di germe, che indica che la loro pluripotenza è mantenuto vivo.

Cellule umane AFS sono state coltivate anche in idrogel P-IA non modificato, P-IA-oligoECM idrogel e TCP piatti nei media espansione. La figura 7 Mostra le morfologie delle cellule AFS umane coltivate dopo quattro giorni di cultura in P-IA e P-IA-oligoECM piatti di idrogel con elasticità (E') di 12,2 (tempo di reticolazione = 6 h), 18,3 (tempo di reticolazione = 12 h), 25,3 (tempo di reticolazione = 24 h) e 30,4 kPa (tempo di reticolazione = 48h) usando una concentrazione di oligoECM di 0 o 50 μg/mL, nonché TCP piatti con 3-12 GPa di rigidità30.

Cellule umane AFS non potrebbero proliferare su piatti di idrogel P-IA con o senza oligoECM quando la rigidità degli idrogeli P-IA era meno di 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h e PV-4h-Y), mentre le cellule umane di AFS potrebbero proliferare con o senza oligoECM quando E' era maggiore di 12 kPa, fatta eccezione per i piatti di idrogel P-IA - 6h e PV-IA-6h-COL1. P-IA - 6h e P-IA-6h-COL1 non sembrano essere favorevoli per la coltura di cellule umane di AFS perché i biomateriali di cultura cellulare morbido arrestare il ciclo cellulare progressione30.

I risultati di cui sopra suggeriscono che P-IA idrogel piatti sono un materiale ottimo per la coltivazione di cellule staminali a lungo termine e mantengono la pluripotenza delle cellule staminali di selezione di rigidità specifica e oligoECM, come pure la concentrazione ottimale di reazione di oligoECM (densità di superficie di oligoECM).

Figure 1
Figura 1: preparazione di idrogeli di P-IA innestati con oligoECM o ECM. (A) schema della reazione per P-IA idrogeli innestati con ECM ed ECM-derivato oligopeptide (oligoECM)29. Copyright 2015. Adattato con permesso da The Royal Society of Chemistry. (B) progettazione e sequenza di oligopeptidi innestata su P-IA idrogeli. Singola catena oligopeptidi (P-IA-BSP, P-IA-VN1 e P-IA-HBP1), singola catena oligopeptidi con un segmento comune (P-IA-VN1G), e catene doppio (P-IA-VN2C e P-IA-HBP2C) ed ECM (P-IA-ECM) sono stati innestati su P-IA idrogeli32. Adattato sotto una licenza Creative Commons. (C) rigidità di P-IA idrogel preparati da diversi periodi di reticolazione29. Copyright 2015. Adattato con permesso da The Royal Society of Chemistry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: confronto delle cellule umane ES culture su P-IA-24h-VN1 idrogeli e rivestimento disponibile in commercio piatti. Morfologia delle cellule umane ES (WA09) coltivato su piatti di rivestimento disponibili in commercio (a, b) e P-IA-24h-VN1-1000 (c, d) al passaggio 1 quando le cellule ES umane sono state spostate dalla coltivazione su fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) in coltivazione su piatti di rivestimento disponibili in commercio o PVA-24h-VN1-1000. Le frecce rosse mostrano le cellule differenziate umane ES. Le barre di scala indicano 50 µm (a, b) e 100 µm (c, d)28. Adattato sotto una licenza Creative Commons. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: caratterizzazione della pluripotenza delle umane ES e iPS cellule su P-IA idrogeli innestati con disegni diversi oligopeptide. (A) espressione delle proteine di pluripotenza Nanog (rosso), Sox2 (verde) e Oct3/4 (verde) sulle cellule umane ES (H9) analizzati immunostaining con doppia colorazione con Hoechest33342 per l'etichettatura nucleare (blu) dopo la coltura su (un) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24h-VN1G-1000 e (c), idrogeli P-IA-24h-VN2C-1000 e il vitronectin ricombinante (d) (rVitronectin)-rivestito piatti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi. (B) espressione delle proteine di pluripotenza Nanog (rosso), Sox2 (verde) e Oct3/4 (verde) sulle cellule umane iPS analizzati immunostaining con doppia colorazione con Hoechest33342 per l'etichettatura nucleare (blu) dopo la coltura su (a) P-IA-24h-VN1-1000 idrogel, idrogel (b) P-IA-24h-VN2C-1000 e (c) ricombinante vitronectina (rVitronectin)-idrogeli rivestiti piatti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi32. Le barre di scala indicano 50 µm. adattato sotto una Creative Commons Attribution License. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: caratterizzazione della capacità di differenziazione di ES umano cellule su P-IA idrogeli innestati con disegni diversi oligopeptide. (A) morfologia delle cellule da EBs differenziati da cellule umane ES (H9) dopo coltura su (a) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24h-VN1G-1000 e (c) P-IA-24h-VN2C-1000 idrogeli e (d) ricombinante vitronectina (rVitronectin)-rivestito piatti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi. Le barre di scala indicano 100 µm. (B) espressione di una proteina ectoderma (GFAP, rosso), proteina di mesoderma (SMA, verde) ed endoderma proteina (AFP, verde) in cellule umane di ES (H9) valutati immunostaining con doppia colorazione con Hoechest33342 per nucleare etichettatura (blu) dopo la coltura su P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 e P-IA-24h-VN2C-1000 idrogeli e il vitronectin ricombinante (rVitronectin)-rivestiti piatti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi32. Le barre di scala indicano 50 µm. adattato sotto una Creative Commons Attribution License. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: caratterizzazione della capacità di differenziazione di iPS umano cellule su P-IA idrogeli innestati con disegni diversi oligopeptide. (A) morfologia delle cellule da EBs differenziati da cellule umane iPS (HPS0077) dopo la coltura su (a) P-IA-24h-VN1-1000 idrogeli, idrogeli (b) P-IA-24h-VN2C-1000 e (c) ricombinante vitronectina (rVitronectin)- piatti rivestiti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi. Le barre di scala indicano 100 µm. (B) espressione di una proteina ectoderma (GFAP, rosso), proteina mesoderma (SMA, verde) ed endoderma proteina (AFP, verde) in cellule umane iPS (HPS0077) analizzati immunostaining con doppia colorazione con Hoechest33342 per nucleare etichettatura (blu) dopo la coltura su (a) P-IA-24h-VN1-1000 idrogeli, idrogeli (b) P-IA-24h-VN2C-1000 e (c) ricombinante vitronectina (rVitronectin)-rivestiti piatti nelle circostanze senza xeno per 10 passaggi32. Le barre di scala indicano 50 µm. adattato sotto una Creative Commons Attribution License. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Caratterizzazione della capacità umana ES (H9) differenziazione cellule in vivo dopo la coltura su idrogeli P-IA-24h-VN1 e P-IA-24h-VN2C. (A) (una) foto di un teratoma di iniezione con ES umano cellule dopo la coltura su P-IA-24h-VN1-1000 idrogeli in condizioni di coltura cellulare privo di xeno dopo 10 passaggi. Tessuti compresi epitelio intestinale (b) (endoderma), (c) cartilagine (mesoderma) e (d) neuroepithelium (ectoderma) può essere osservato. (B) (una) foto di un teratoma di iniezione con ES umano cellule dopo la coltura su P-IA-24h-VN2C-1000 idrogeli in condizioni di coltura cellulare privo di xeno dopo 10 passaggi. Tessuti compresi epitelio intestinale (b) (endoderma), (c) cartilagine (mesoderma) e (d) dell'epitelio retinico del pigmento (ectoderma) può essere osservato32. Le barre di scala indicano 100 µm. adattato sotto una Creative Commons Attribution License. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: morfologia delle cellule umane di AFS coltivate su piatti TCP e piatti di idrogel P-IA immobilizzati con o senza oligopeptidi ECM-derivato dopo 4 giorni di cultura. (A) morfologia delle cellule umane di AFS su piatti TCP. (B) morfologia di AFS umano cellule su P-IA - 6 h e P-IA-6 h -Z piatti idrogel (P-IA - 6h, P-IA-6h-COL1-50, P-IA-6h-FN1-50, P-IA-6h-VN1-50, P-IA-6h-HBP1-50 e P-IA-6h-cRGD-50). (C) morfologia del hAFCs su P-IA - 12 h e P-IA-12 h -Z idrogel piatti (P-IA - 12 h, P-IA-12h-COL1-50, P-IA-12h-FN1-50, P-IA-12h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 e P-IA-12h-cRGD-50). (D) morfologia di AFS umano cellule su P-IA - 24 h e P-IA-24 h -Z piatti idrogel (P-IA - 24 h, P-IA-24h-COL1-50, P-IA-24h-FN1-50, P-IA-24h-VN1-50, P-IA-24h-HBP1-50 e P-IA-24h-cRGD-50). (E) morfologia di AFS umano cellule su P-IA - 48 h e P-IA-48 h -Z piatti idrogel (P-IA - 48h, P-IA-48h-COL1-50, P-IA-48h-FN1-50, P-IA-48h-VN1-50, P-IA-48h-HBP1-50 e P-IA-48h-cRGD-50). Le barre di scala indicano 100 μm30. Copyright 2017. Adattato con permesso da The Royal Society of Chemistry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome di materiale / attrezzatura Abbreviazione
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA Ciclico RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectina rVN
Fibronectina FN

Tabella 1: Sequenze di oligopeptide ECM-derivato ed ECM utilizzati in questo studio.

Anticorpi Concentrazione (tasso di diluizione)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Actina del muscolo liscio 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP 1: 200
Alexa Fluor 555 – coniugato anti-topo di capra 1: 200

Tabella 2: Gli anticorpi usati per immunostaining in questo studio.

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Discussion

P-IA-oligoECM e P-IA-ECM idrogel con rigidità variabile sono stati sviluppati per l'espansione a lungo termine di ES umano e cellule iPS mantenendo la loro pluripotenza per oltre dieci passaggi in condizioni prive di xeno, così come per la coltura di cellule umane di AFS, cellule di annunci, e le cellule staminali emopoietiche25,28,32. P-IA idrogeli immobilizzati con oligoECM sono un candidato eccellente per materiali di coltivazione delle cellule per studiare l'effetto dei materiali di cultura cellulare sul destino di differenziazione e la proliferazione di vari tipi di cellule staminali, come pure le cellule primarie e cellule tumorali.

P-IA soluzione dovrebbe essere trasparente, quando viene eseguito il cast di soluzione P-IA sui piatti. Il tempo di reticolazione decide l'intensità di reticolazione di idrogeli di P-IA. reticolazione di 24 h di P-IA idrogeli produce idrogeli ottimali per la coltura di cellule umana ES/iPS. Qualsiasi oligopeptidi ed ECMs possa essere innestato su P-IA idrogeli usando questo protocollo, in cui gli oligopeptidi ed ECMs hanno gruppi amminici liberi25,28,29,30,31, 32. la densità di superficie di oligopeptidi o ECMs possa essere rilevata mediante misure di spettroscopia (XPS) fotoelettronica a raggi x, sebbene XPS non può presentare un valore assoluto di densità superficiale, ma l'esistenza di oligopeptidi o ECMs può essere tranquillamente analizzati.

P-IA idrogel con e senza oligopeptidi innestate o ECMs possono essere preparati, che hanno modulo elastico da 3-30 kPa, a seconda del tempo di reticolazione. È piuttosto difficile per la preparazione di idrogeli di P-IA avendo meno modulo di deposito a 3 kPa e maggiore modulo di deposito oltre 30 kPa25,28,29,30,31,32. Si tratta di limitazione dell'attuale metodo di preparazione di idrogel di reticolazione chimica di idrogeli di P-IA. Tuttavia, il presente protocollo fornisce un'altra opzione di idrogeli avendo diverse elasticità, che può sostenere la cultura di cellule primarie, le cellule tumorali o cellule staminali tra cui ES umano e cellule iPS, ma non sono fatti di poliacrilammide. Soprattutto, ES umano e cellule iPS non possono proliferare su idrogel di poliacrilamide, ma possono proliferare su P-IA idrogeli come mostrato in Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5e Figura 6. Infatti, P-IA-24h-VN1 idrogeli sostegno cultura umana delle cellule di ES meglio di piatti di rivestimento disponibili in commercio (Figura 2). Pertanto, P-IA idrogeli sono preferibili per le impostazioni cultura di ES umano e cellule iPS.

Sarebbe interessante studiare ottimale elasticità nel caso degli idrogeli dove ES umano e cellule iPS sono differenziate in specifiche linee cellulari delle cellule come cardiomiociti35, del pigmento retinico epitelio36, β cellule6e TH + cellule6 per lo sviluppo futuro della medicina rigenerativa.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan sotto grant numeri 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Taiwan Landseed ospedale progetto (NCU-LSH-105-A-001). Una sovvenzione per la ricerca scientifica (numero 15K 06591) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone è anche riconosciuto. R. Higuchi desidera ringraziare per il programma di partenariato scientifico internazionale (ISPP-0062) Vice Rettorato per gli studi universitari e di ricerca, King Saud University, Riyadh 11451, Regno dell'Arabia Saudita.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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Bioingegneria problema 132 idrogel indotta da cellule staminali pluripotenti cellule staminali embrionali elasticità coltura cellulare oligopeptide modificazione superficiale nanosegment
Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno
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Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

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