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Bioengineering

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

増殖と分化に生体材料の剛性の影響を調査するため、オリゴペプチド、接木されたさまざまな剛性とポリビニル アルコール co イタコン酸ゲルを準備するためのプロトコルを表示します。幹細胞。ゲルの剛性は、架橋時間によって制御されました。

Abstract

幹細胞の分化増殖に対する生体材料の剛性などの物理的な手がかりの効果は、いくつかの研究が検討されています。ただし、これらの調査のほとんどは、彼らの研究の幹細胞文化のポリアクリルアミドのゲルを使用しています。したがって、これらの結果かもしれないと生体材料の物理的なキュー (剛性) ではなく、ポリアクリルアミドの特定の特性から発生するため、その結果、物議を醸す。ここでは、ポリアクリルアミド、様々 な幹があり、人間の萌芽期の茎 (ES) の細胞を含む細胞、ひと誘導多能性幹 (iPS) 細胞が培養することができますに基づいていないゲルの準備のプロトコルについて述べる。架橋時間を変更することによって架橋度によって制御剛性不活性ポリビニル アルコール co イタコン酸 (P IA) から可変剛性を有するゲルを調製されました。幹細胞培養と分化のため将来のプラットフォームとして移植細胞外マトリックス由来オリゴペプチドと P IA ヒドロゲルを調べた。文化および羊水幹細胞、脂肪由来幹細胞、ヒト ES 細胞、ヒト iPS 細胞の通路は、ここで詳細に記述されます。オリゴペプチド P IA ヒドロゲルの剛性特性によって誘導された優れた性能を示した。このプロトコルは、生体材料、剛性特性と最後に、xeno フリー培養条件を用いた幹細胞の運命への影響を制御すると共に、彼らの表面操作の合成を報告します。最近の研究に基づく、そのような変更された基板として使用できます将来のプラットフォームをサポートし、異なるリンケージ; さまざまな幹細胞ラインの運命を指示さらに、再生成し、失われた臓器や組織の機能を回復します。

Introduction

阻害剤、成長因子によって調節される細胞、幹細胞、特にひと誘導多能性 (iPS) 細胞と人間の萌芽期の茎 (ES) 細胞の長期的な増殖の特定の血統に幹細胞の分化の運命は知られていると/または文化メディアの生理活性分子が小さく。最近では、生体材料、特に細胞文化生体材料の剛性の物理的な手がかりは、幹細胞の増殖と分化1,の2、運命を導く重要な要素に認識されています。 3,4,5,6。したがって、いくつかの研究は、主にさまざまな剛性を有するポリアクリルアミド ゲルを使用して分化、ゲル上培養した幹細胞の運命を調査し始めています。

焦点接着斑、細胞の形態、細胞表現型、および幹細胞接着、二次元 (2 D) 栽培1,2,3,5で特に生体材料の剛性を制御できます。幹細胞による生体微粒子のメカノ センサーは、焦点接着インテグリン受容体を介したシグナル伝達によって一般に制御されます。NMMIIA、非ミオシンのアクチン細胞骨格の IIA 依存性収縮は 2 D セル栽培システム3,4,5,における幹細胞の力覚機構プロセスで重要な役割を果たしている7,8,9,10,11。

エングラーおよび彼の同僚は骨髄幹 (BMS) 細胞特定のティッシュのような剛性を有する細胞培養材料の栽培など、成人の幹細胞に由来する細胞に分化する傾向にある興味深い概念を開発しました。特定のティッシュの5。BMS セル拡張メディア (脳組織に匹敵する剛性) と私は自発的に BMS 細胞に対し初期の神経系統に分化誘導された型コラーゲンでコーティングされた 2 D ソフト ポリアクリルアミド ゲル上培養筋肉や骨の膠原線維組織のような剛性を有するゲルは、2 D ポリアクリルアミド ゲル3、5、それぞれの筋細胞と骨芽細胞の初期に分化を誘導するために発見されました。多くの研究者は、分化の幹細胞の運命を調査したポリアクリルアミドの培養コラーゲン固定化ヒドロゲル I 型12,13,14,,1516,17,18,19,20,21しますただし、これは1、、いくつかの矛盾を報告に言及する必要があります18,22,23,24エングラーによって提案されたよく知られているアイデアの存在。ら5これは、エングラーのアイデア5ポリアクリルアミド ゲル上だけ開発された、生体材料 (ポリアクリルアミド) の特定の特性との物理的なキュー (剛性) からだけではなく、その結果が由来しています。生体材料。したがって、ハイドロゲルが剛性、ゲルの架橋によって制御することができます別の種類を開発することが重要です。この目的のため不活性ヒドロゲルは開発された異なる硬度の変化する架橋時間25、架橋度によって制御されたポリビニル アルコール co イタコン酸 (P IA) からを作製26,27,28,29,30,31,32. nonmodified P IA ゲルだけでなく、細胞外マトリックス (Ecm) とオリゴペプチド接木 P IA ヒドロゲル幹細胞を栽培できます。以前の研究25ひと造血幹細胞 (hHSCs) 臍帯血からが P IA ゲル上 3 kPa からフィブロネクチンやオリゴペプチドが由来 30 kPa 貯蔵弾性率の異なる剛性値で栽培しました。フィブロネクチン (CS1, EILDVPST) は P IA ヒドロゲルへ移植されました。HHSCs の倍拡大高前のヴィヴォは CS1 と 30 kPa2512 kPa に至る中間剛性を表示, フィブロネクチン, 接ぎ木 P IA ヒドロゲルで観察されました。

ヒト ES および iPS 細胞はビトロネクチンなどラミニンの多能性を維持するために、Ecm に特定のバインディングを必要とするため、ヒト iPS や ES 細胞を従来の培養ポリスチレン (TCP) 料理33,34を栽培することが長期間培養します。したがって、最適な剛性特性を持つ P IA ヒドロゲルをオリゴペプチド接木のいくつかの構造が設計され、単一のチェーン、ジョイント部分を持つ単一のチェーン、共同セグメントと分岐型デュアル チェーンの形成の準備チェーン32。オリゴペプチドのシーケンスは、Ecm のインテグリンとグリコサミノグリカン結合ドメインから選ばれました。約 25 kPa で貯蔵弾性率を持ち、デュアル チェーンまたは共同セグメント ビトロネクチン由来のオリゴペプチドをグラフトした P IA ヒドロゲルは xeno 無料と化学の下以上 12 通路をヒト ES および iPS 細胞の長期培養をサポート定義された条件32。共同セグメントとデュアル チェーン、ゲル上の細胞接着分子で容易に増殖し、ヒト ES および iPS の多能性細胞32。ここでは、(空気中の湿潤条件下で測定した 30 kpa の空気に 10 kPa からストレージ係数) と P IA ゲルの準備のプロトコル移植オリゴペプチドとまたは Ecm の説明。文化および (羊水幹細胞、脂肪由来幹細胞、ヒト ES 細胞、ヒト iPS 細胞を含む) いくつかの幹細胞を通過する方法が表示されます。

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Protocol

本研究では実験は、台湾 Landseed 病院 (IRB-13-05)、国立中央大学の倫理委員会によって承認されました。すべての実験は、この研究ででき、関連する政府や機関ガイドラインおよび規制に従って行われました。

1. ソリューションとメディアの準備

  1. ポリマーの精製
    1. 浄化の加水分解の程度とカルボン酸基を持つ P IA > 96.5% P IA をエタノールで洗浄します。500 mL コニカル ビーカーに 200 mL のエタノールに P IA の 20 g を置き、扇動マグネチックスターラー 24 30 Exchange 新鮮なエタノールとエタノールのためにすべての 8-10 時間。
    2. ろ過を Büchner 漏斗の使用によってエタノールから P IA を削除します。
    3. 24 時間室温で減圧乾燥乾燥 P IA。
      注: お勧めトラップを頻繁に (エタノールの除去) で真空乾燥システムで最初の数時間、特に中にきれいにトラップが大量 P アイオワからのエタノールの除去した後に目詰まりになる傾向があるので
  2. P IA ソリューションの準備
    注: は、溶媒 (水) に非常にゆっくりとポリマーを追加します。溶媒に P IA を追加する、少なくとも 15 分を取ることをお勧めします。ポリマーに溶媒を追加すると、ポリマーが完全に溶解しないでしょう。P IA ソリューションの爆発的な沸騰を生成しないように注意してください。P IA ソリューションの準備の間、保護メガネを使用します。P IA ソリューションの加熱プロセスは P-アイオワの結晶を溶解する必要それは提案された (そして望ましい) 可能であれば比較的きれいな実験室、P IA ソリューションを準備します。
    1. 細胞培養実験の 0.050 重量 % 濃度や粘度測定用 0.50 重量 % 濃度に真水に P IA を溶解: たとえば、細胞培養のための純粋な水 100 mL と 100 ml ・ デ ・ P IA の 500 mg の P IA の 50 mg を解散レオメータ測定用イオン (DI) 水。
    2. ホット プレート上で 1 時間 P IA ソリューションを揺り動かしなさい。
      注: 爆発性の沸騰を避けるため、加熱しないソリューション以上 95 ° c.高温高分子溶液の爆発的沸騰の皮膚熱傷が生じる。そのため、非常に慎重に、P IA の暖房を実行し、暖房の間に P IA ソリューションの温度を監視します。
    3. 室温 48 h. 休暇ホット P IA ソリューション、暖房無しホット プレート上で P IA ソリューションを扇動し、空気の泡があることを確認する 20-24 時間室温で撹拌せずままに P IA ソリューションが周囲温度に冷却した後P IA ソリューションには存在しません。
  3. 架橋溶液の調製
    1. 25% 水溶液グルタルアルデヒド溶液から架橋ソリューション 1.0 重量 % グルタルアルデヒドを構成、20.0% ナ2だから重量4 99% を使用して > 純度と 1.0 重量 % H2、4。たとえば、1 つの 6 または 12 の細胞培養プレートをよく、10 mL の純水にグルタルアルデヒド溶液、硫酸ナトリウム 2 g、硫酸の 100 μ L の 100 μ L を追加します。
  4. 人間/PS の ES の細胞培養媒体
    注: 使用 DMEM/F12 メディア、不可欠な 6 メディア、および細胞培養のための重要な 8 メディア。
    1. 4 ° C の冷蔵庫で解凍してソリューションにゆっくり 50 X 必須 8 サプリメントは夜間に凍結を返します。
    2. 不可欠な 8 基底メディアの 1 つのボトルに 50 X 必須 8 サプリメントのボトル 1 本を追加します。小さい因数 (50 mL) 100 mL 遠心チューブ内に、メディアを分離し、-20 ° C でメディアを格納

2. P IA ハイドロゲル料理準備

  1. P IA 膜
    1. 35 mm TCP 皿に P IA ソリューションの 1 mL の約数を挿入してクリーン ベンチ内 P IA フィルムを製造する 2 日間の 45 ° C のオーブンでは、料理を乾燥します。
  2. P IA ハイドロゲル料理の架橋
    1. 0.5、1、2、4、6、12、24、および 48 h の水性架橋ソリューションに P IA 膜を浸漬します。
      注: 'P-IA-X' (例えばP-IA-12 h) X時間 (例えば、12 h) P IA ハイドロゲル架橋を指します。
    2. 架橋結合の後, 常温の純粋な水と P IA ヒドロゲルをリンスし、クリーン ベンチ内温度で純粋な水でゲルを維持します。
    3. 1 分 75.0 volume/volume% エタノール溶液浸漬によって P IA ヒドロゲルを滅菌、6 回純水で P IA ヒドロゲルをすすぎ、細胞の培養に使用されるまで純水で P IA ヒドロゲルを維持します。
  3. オリゴペプチドや ECM をグラフトした P IA ハイドロゲル料理の準備
    1. 10 mg/mL のN-(3-Dimethylaminopropyl)-を含む溶液の 1 mL に浸漬による P IA ヒドロゲルをアクティブにN'- ethylcarbodiimide 塩酸塩 (EDC) および 10 mg/mL のNヒドロキシスクシンイミド (NHS) を 37 ° C または 4 h で h 14 ° C で
    2. リンス リン酸 1 ml P IA ゲル緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) 3 回、4 ° C で 24 h のペプチド (100-1,500 μ g/mL) の ECM (10-100 μ g/mL) 1 mL を含む PBS 溶液中 P IA ゲルを浸す
      注: オリゴペプチド シーケンスおよび幹細胞培養用 Ecm を表 1にまとめます。
    3. オリゴペプチドや ECM を移植後 3 回 P IA ヒドロゲル、純粋な水を洗ってください。
      注: Y μ G/ml オリゴペプチドの ECM (Z) をグラフトした P IA ヒドロゲル以下と呼ばれます P-IA -Xh-ZやP-IA-Xh とZ Y、 Xは、架橋時間 (h)、Yを示しますオリゴペプチドや ECM の濃度、 Zは異なるペプチドまたは ECM を示します。

3. ヒト ES ・ iPS 細胞培養

  1. 通路と未分化のヒト ES および iPS 細胞のメンテナンスの方法
    1. 人間 ES (例えば、WA09 または H9) を維持細胞やヒト iPS (例えばHS0077) 6 cm 料理標準ヒト ES/iPS 必須 8 メディアのマトリゲルにセル細胞文化プロトコル28,32。
    2. 8-10 分の 37 ° C で DMEM/F-12 メディア 2.0 mg/mL 当期 II と合流の近く人間 ES/iPS 細胞をインキュベートして DMEM/F12 メディアで 2 回 ES/iPS 細胞をすすいでください。
    3. 人間の ES/iPS 細胞の培養皿に DMEM/F-12 メディア 2 mL の添加をデタッチ細胞スクレーパーを使用して弱く付着性コロニー後またはピペッティングします。
    4. 15 mL 遠心チューブにヒト ES/iPS 細胞を収集し、37 ° C で 5 分間 160 × g で人間 ES/iPS 細胞を遠心分離
    5. 遠心分離の後 DMEM/f12 キーを破棄し E8 メディアの 1 mL にヒト ES/iPS 細胞を中断し、細胞カウンターを用いた細胞密度をカウントします。
    6. 新しい培養皿 (オリゴペプチドや ECM をグラフトした P IA ヒドロゲル) に適切な密度調整 (1-5 cm2継またはとおりあたり 10 の4セル x) 後 ES/iPS 細胞を接種します。

4. ヒト ES/iPS 細胞特性のキャラクタリゼーション

  1. アルカリフォスファターゼ (AP) 活性の評価
    1. 標準アルカリホスファターゼ ライブ染色を用いた人間の ES/iPS 細胞のアルカリフォスファターゼ (AP) 活性を測定します。
  2. 免疫染色
    1. 次の従来のプロトコル28,32多能性を調査する hES と腰の細胞のトラ-1-81、SSEA 4、Sox2、Oct3/4 の免疫染色を実行します。
    2. ES/iPS 細胞が、培養し、セルを修正するための 4 ° C で 15 分間料理をインキュベート後、各 24 よく皿に 0.5 mL の量 (ボリューム) 4% パラホルムアルデヒドを追加します。
    3. 各ウェルからパラホルムアルデヒド ソリューションを吸い出しなさい。ウェルあたり 1 mL の PBS を追加し、セルを洗浄する PBS を吸引します。3 回洗浄のプロセスを実行します。
    4. 0.3% (ボリューム) 室温で 30 分間 PBS でトリトン X 100 ソリューションの 0.5 mL を追加することによって細胞膜を permeabilize します。
    5. トリトン X 100 ソリューションを吸引し各ウェルに PBS (バッファーのブロック) で 300 μ L 2% (重量/体積) ウシ血清アルブミン (BSA) を追加し、室温で 30 分間インキュベートします。
    6. ピペッティングでブロック バッファーを削除し、その後、必要な一次抗体を追加 (Oct3/4 (1: 200)、Sox2 (レバレッジ) SSEA-4 (レバレッジ) と、ピペット、Tra-1-81(1:200) は表 2を参照) 1: 200 と抗体が希釈された示されている、各ウェルにPBS の 200-fold と 4 ° C で 1 日孵化
    7. 一次抗体溶液を吸引し、0.05% の 300 μ L でセルを洗浄して PBS 溶液中室温で 3 回トゥイーン 20。
    8. 二次抗体の 300 μ L を追加 (1: 200、表 2を参照)、プライマリ IgG サブタイプに固有である、各 2% (重量/体積) BSA 溶液でよく、暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。
    9. 0.05% の 300 μ L でセルを洗浄して PBS 溶液中暗闇の中で部屋の温度で 3 回トゥイーン 20。
    10. 蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡による染色の細胞を分析します。
  3. 胚様体形成
    1. 10 と 20 の通路で胚様体 (EB) 形成によるヒト ES/iPS 細胞の多能性を調査します。
      注: 80% 近く 6 ウェル プレートでの合流は EB 形成の準備のため十分です。
    2. ヒト ES や iPS 細胞 DMEM/F-12 メディアの 2 ml を 2 回、リンスし、本質的な 6 メディアの 1.5 mL の細胞を浸します。
    3. 200 μ L のヒントを使用して約 32 個に 80% コンフルエント ヒト ES や iPS 細胞近くカットします。次に、セル スクレーパーを使用して皿からセルをデタッチします。
    4. 6 ウェル超添付皿にヒト ES/iPS 細胞と転送を収集します。
    5. 古いメディアをピペッティングし、2 日おきの新鮮なメディアの追加必須 6 メディアを交換します。
      注: 5% CO2と 37 ° C で 2 週間の懸濁液中の細胞を培養します。
    6. EBs がゆく重要な 6 メディアで中断され後、0.1% ゼラチン コーティング 24 ウェル TCP 料理文化に EBs を転送し、さらに 1 週間の必須 6 メディアで細胞の培養します。
    7. 3 つの胚性生殖細胞層由来細胞のマーカーに対する抗体で細胞を染色 [AFP (内胚葉)、延床面積 (外胚葉) β III-チューブリン (外胚葉) と SMA (中胚葉)] 上記免疫染色法による細胞を評価。
  4. 奇形腫形成
    1. 10 と 20 の通路で奇形腫形成によって人間 ES/iPS 細胞の多能性を調べる。
      注: 6 ウェル プレートで 80% の合流点近くの 5 皿、奇形腫形成のため十分な (少なくとも 3 x 10 の6セルは、奇形腫形成実験に必要な)。
    2. 2 mL DMEM/F-12 メディアでセルを 2 回、リンスし、細胞培養皿に 1.5 mL DMEM/F-12 メディアを追加します。
    3. 200 μ L のヒントを使用して約 32 枚にほぼ 80% コンフルエント ヒト ES 細胞も iPS 細胞をカットします。次に、セル スクレーパーを使用して皿からセルをデタッチします。
    4. 15 mL 遠心チューブにヒト ES/iPS 細胞を収集し、37 ° C で 5 分間 160 × g で細胞を遠心分離
    5. 100 μ L の細胞ペレットを中断、遠心分離後、DMEM/F12 と細胞ペレットに 100 μ L をミックス マトリゲル (1:1 の容積比)。
    6. -20 ° C の予冷注射器に細胞懸濁液を転送します。、少なくとも 3 × 10、合計で6セル皮下に注入男性うなずく SCID (うなずく。CB17 -Prkdascid/JNarl) マウス (5-8 週間)。
    7. 5-8 週間後に、奇形を解剖 4.0% (重量/体積) パラホルムアルデヒド溶液でを修正し、その後、4 ° C で保存
    8. パラフィンで、奇形を固定、パラフィン埋め込まれた奇形をスライス、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色標準プロトコル28,32を使用します。
      注意: 研究者はパラフィン、パラフィン埋め込まれたスライス奇形、奇形を修正し、H & E は、通常の病院で病理では使用でサンプルを染色会社に固定奇形腫組織を送信可能性があります。
  5. ひと脂肪由来幹細胞 (広告) 細胞培養
    1. 暖かい培 (1% 抗真菌抗生物質と 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む DMEM)、使用する水のお風呂前の 37 ° C にトリプシン-EDTA および PBS の 0.25%。
    2. 細胞を培養している各 6 cm 培養皿に分注 10 mL の PBS によって広告細胞を洗浄します。
    3. 6 cm の培養皿に 1 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.25%) を追加し、5 分の 37 ° C でソリューションを孵化させなさい。
    4. セルが切り離されることを確認する顕微鏡下 6 cm 培養皿の細胞を観察します。
    5. 15 mL 遠心チューブに細胞を収集し、文化メディアの等量を追加 (1% 抗真菌抗生物質および 10% を含む DMEM FBS) トリプシン-EDTA を中和するために遠心管に。
    6. 37 ° C で 5 分間 250 × g で細胞を遠心分離します。
    7. 遠心分離後、細胞ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを慎重に廃棄します。
    8. 培地で細胞を再懸濁しますで、新しい培養皿 (P IA ヒドロゲル接木そしてオリゴペプチドおよび ECM なし) に適切な密度 (5-10 cm2継またはとおりあたり 10 の3セル x) で細胞をシードします。
  6. 羊水幹 (AFS) 細胞培養
    1. 暖かい培 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 含む 20% 牛胎児血清 (FBS)、5 ng/mL bFGF と 1% 抗真菌抗生物質)、使用する水のお風呂前の 37 ° C にトリプシン-EDTA および PBS の 0.25%。
    2. ピペット 10 mL の細胞を培養している各 6 cm 培養皿で PBS によって人間の AFS セルを洗浄します。
    3. 6 cm の培養皿に 1 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.25%) を追加し、37 ° C、5 分で細胞を孵化させなさい。
    4. セルを確認する顕微鏡検査の下で 6 cm 培養皿の細胞は切り離されますを確認します。
    5. 15 mL 遠心チューブに細胞を収集し、トリプシン-EDTA を中和するために遠心チューブに培 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 含む 20% 牛胎児血清 (FBS)、5 ng/mL bFGF と 1% 抗真菌抗生物質) の等量を追加します。
    6. 37 ° C で 5 分間 250 × g で細胞を遠心分離します。
    7. 遠心分離の後に、ピペッティングにより細胞ペレットを乱すことがなく慎重に上澄みを廃棄します。
    8. 栽培メディアで細胞を再懸濁しますで、新しい培養皿 (P IA ヒドロゲル接木そしてオリゴペプチドおよび ECM なし) に適切な密度 (5-10 cm2継またはとおりあたり 10 の3セル x) で細胞をシードします。

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Representative Results

P IA ヒドロゲル グラフト ECM 由来ペプチド (oligoECM) または異なる弾力性と ECM で調製した反応スキームを以下図 1 aに見られるように oligoECM (図 1 b) の種類を使用しています。ゲルの弾力性は、応用架橋強度 (時間) (図 1) によって規制されました。25.3 kPa (24 h 架橋時間) の貯蔵弾性率を持つ、ビトロネクチン由来オリゴペプチドをグラフトした P IA ヒドロゲル サポート ヒト iPS と上の ES 細胞の長期培養 10 20 通路。特に、P IA ヒドロゲル グラフト共同セグメント (P-IA-24 h-VN1G) またはデュアル チェーン (P-IA-24 h-VN2G) サポート ヒト iPS と P IA VN1 より oligoECM (200-500 μ g/mL) の比較的低い濃度を調製する ES 細胞の多能性oligoECM の高濃度を使用する必要とゲル (> 1000 μ g/mL) 人間の多能性を維持するために iPS や ES 細胞28,32。

ヒト ES 細胞維持マウス胚性線維芽細胞 (MEFs) は他の合成被覆材料 (例えば、Synthemax II) をコーティング料理と P IA-24 h VN1 ハイドロゲル皿 (図 2)28文化に移った。料理がより簡単に区別するために、(図 2 aおよび2 c)、植民地の端に特にヒト ES 細胞は、P-IA-24 h-VN1 - 1000 の多能性を維持できるに対し発見された市販のコーティング上で培養したヒトの ES 細胞ハイドロゲルの料理 P IA 24 h VN1 1000 ハイドロゲル料理 (図 2 bおよび2 d)28ヒト ES 細胞の形態から分化した細胞を観察できなかったので。

従来の組換えビトロネクチン (、oligoECM (P IA 24 h VN1 1000、P-IA-24-VN1G-1000、P IA-24 h VN2C) をグラフトした (図 3 a) ヒト ES および P-IA-24 h ゲル上培養 (図 3 b) iPS 細胞の多能性rVitronectin)-料理をコーティング、多能性メーカー蛋白質 (Nanog、Sox2、Oct3/4) の式に基づいて評価した xeno 無料条件 10 通路32不可欠 8 メディアを使用して内の各料理に、細胞を培養後。これら多能性蛋白質申し分なくヒト iPS や ES 細胞の培養、oligoECM をグラフトした P IA ヒドロゲルに関する xeno 無料条件での料理の rVitronectin コーティングも示されました。

3 つの胚葉の in vitro (EB 形成) から派生した細胞に分化能力の評価と生体内で(奇形腫形成) 栽培が合成後のヒト ES および iPS 細胞の多能性を確認に不可欠です。生体材料。したがって、(図 4) ヒト ES 細胞やヒト iPS 細胞 (図 5) は P IA oligoECM ハイドロゲル料理で栽培された、10 の通路と続いて、細胞遺伝子組換えビトロネクチン コーティング料理フォームに懸濁液の培養EBs。EBs は、ゼラチン コーティング皿料理 (図 4 a及び図 5 a)32感染する細胞の能力を観察するために数週間のためにさらに栽培しました。差別化されたヒト ES (図 4 b) と ips (図 5 b) が 3 つの胚葉由来の蛋白質のための immunostained: グリア線維性酸性蛋白 (GFAP、平滑筋アクチン (SMA、中胚葉)、α-フェトプロテイン (afp 通信、内胚葉)、外胚葉)32。ヒト iPS や ES 細胞由来のヒト iPS や ES 細胞の多能性のもう一つの検証を示す、すべての 3 つの細菌層の細胞に区別するために発見された異種フリー oligoECM をグラフトした P IA ゲル上培養後も長期のための条件 (通路 > 10 通路)。

3 つの胚葉体内(奇形腫形成アッセイ) 由来細胞にヒト ES 細胞の分化能力を評価した.P-IA-VN1-1000 (図 6 a)、P-IA-VN2C-1000 (図 6 b) に 10 の通路の xeno フリー培養条件で栽培した、ヒトの ES 細胞は、32NOD SCID マウスに皮下注射しました。奇形は、マウスから分離した、奇形腫切片を固定され H & E (図 6Aおよび6B)32で染色します。奇形は、すべて 3 つの胚葉由来の細胞の存在を表示: (小腸上皮、図 6A(b) 及び6B(b)) は内胚葉、中胚葉 (軟骨、図 6A(c) および6B(c))、外胚葉 (神経上皮、図 6A(d);網膜色素上皮、図 6B(d))。P IA 24 h VN1 1000 と P-IA-24-VN2C-1000 10 通路の xeno 無料条件で培養したヒトの ES 細胞は分化細胞のを多能性が維持されることを示す 3 つの胚葉由来が示唆します。vivo。

人間の AFS セルもそのまま P IA ハイドロゲル、P IA oligoECM ハイドロゲル、増殖培地で TCP 皿で培養。図 7 P IA および P IA oligoECM 弾力性ハイドロゲル料理文化の 4 日後培われる人間の AFS 細胞の形態を示しています (E') 12.2 の (架橋時間 = 6 h)、18.3 (架橋時間 = 12 h)、25.3 (架橋時間 =24 h)、および 30.4 kPa (架橋時間 = 48 h) 剛性303-12 GPa と料理 oligoECM 濃度 μ g/mL として TCP の 0 または 50 を使用して。

P IA ヒドロゲルの剛性あった未満 11 kPa (PV-2 h、PV 2 h Y、太陽光発電-4 h、および太陽光発電 4 h Y)、oligoECM の有無、AFS 細胞が増殖するとき、P IA ハイドロゲル料理 oligoECM の有無に AFS 細胞が増殖しないときE'P-IA-6 h と PV IA-6 h COL1 ハイドロゲル料理を除いて、12 kPa よりも大きかった。P-IA-6 h と P IA-6 h COL1 ないよう人間の AFS 細胞の培養のために好ましいソフト ・ セル文化生体細胞周期進行30を停止するため。

上記が示唆された P IA ハイドロゲル料理が長い言葉の幹細胞の培養に最適な材料し、各種比剛性、oligoECM と oligoECM の最適反応濃度によって幹細胞の多能性を維持(oligoECM の表面密度)。

Figure 1
図 1: oligoECM または ECM をグラフトした P IA ハイドロゲルの調製します。(A) P IA ヒドロゲル ECM と ECM 由来ペプチド (oligoECM) 接ぎ木の反応法29。著作権の 2015 年。王立化学会からの許可を適応します。(B) 設計と P IA ヒドロゲルに接ぎ木したオリゴペプチドのシーケンス。単一のチェーン オリゴペプチド (P IA BSP、P-IA-VN1 と P IA HBP1) 単一の共同事業 (P IA VN1G) とチェーン オリゴペプチドとデュアル チェーン (P IA VN2C および P IA HBP2C) と ECM (P-IA-ECM) を P IA ヒドロゲル32に接木します。クリエイティブコモンズの帰属ライセンスの下で適応。(C) P 剛性 IA ゲル架橋29の異なる期間で準備します。著作権の 2015 年。王立化学会からの許可を適応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: ヒト ES 細胞の比較文化 P IA-24 h VN1 ヒドロゲル、市販コーティング料理を提供します。ヒト ES 細胞はマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) にで栽培から移ったときに市販コーティング料理 (a、b) と 1 の通路で P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) 料理で培われた人間の ES 細胞 (WA09) の形態栽培市販コーティング料理や PVA 24 h VN1 1000 料理。赤い矢印は、差別化されたヒト ES 細胞を示しています。スケール バーは、50 μ m (a、b) と (c, d) 100 μ m28を示します。クリエイティブコモンズの帰属ライセンスの下で適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 異なるオリゴペプチドの設計をグラフトした P IA ゲル上細胞人間の ES や iPS の多能性の特性。多能性蛋白質 Nanog (赤)、Sox2 の (A) 式、(緑) と Oct3/4 (緑) ヒト ES (H9) 細胞 (、) に培養後 (青) 核ラベル Hoechest33342 とデュアル染色と免疫染色による解析P-IA-24 h-VN1-1000、(b) P-IA-24-VN1G-1000 と P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲル (c) および (d) 組換えビトロネクチン (rVitronectin)-10 通路の xeno 無料条件の下で料理をコーティングします。多能性タンパク質 Nanog (赤) (緑)、Sox2、(、) に培養後 (青) 核ラベル Hoechest33342 とデュアル染色と免疫染色法を用いてヒト iPS 細胞、Oct3/4 (緑) P-IA-24 h-VN1-1000 (B) 式ハイドロゲル、(b) P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲルと (c) 遺伝子組換えビトロネクチン (rVitronectin)-10 通路32のゲルが xeno 無料条件の下で料理をコーティングします。スケール バーを示す 50 μ m クリエイティブ ・ コモンズの表示ライセンス下で適合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 異なるオリゴペプチドの設計をグラフトした P IA ゲル上細胞人間 ES の分化能力の特性。(A) ひと ES (H9) 細胞 (、) P-IA-24 h-VN1-1000、(b) の養殖 P-IA-24-VN1G-1000、および P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲル (c) と (d) と区別 EBs からの細胞の形態ビトロネクチン (rVitronectin)-10 通路の xeno 無料条件の下で料理をコーティングします。スケール バーを示す 100 μ m (B) 外胚葉蛋白 (GFAP、赤)、中胚葉蛋白質 (SMA、緑)、および内胚葉蛋白質 (afp 通信、緑) の Hoechest33342 二重染色と免疫染色を用いてヒト ES (H9) 細胞で発現核P IA 24 h VN1 1000、P-IA-24-VN1G-1000、および P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲルと組換えビトロネクチン (rVitronectin) を培養後 (青) ラベル-10 通路32の xeno 無料条件の下で料理をコーティングします。スケール バーを示す 50 μ m クリエイティブ ・ コモンズの表示ライセンス下で適合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 異なるオリゴペプチドの設計をグラフトした P IA ゲル上細胞 iPS の分化能力の特性。(C) 遺伝子組換えビトロネクチン (rVitronectin)、(b) P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲル (、) P IA 24 h VN1 1000 ハイドロゲル培養後 (HPS0077) ヒト iPS 細胞から分化した EBs からの細胞の形態を (A)-10 の通路の xeno 無料条件下でコーティングされた料理。スケール バーを示す 100 μ m (B) 外胚葉蛋白 (GFAP、赤)、中胚葉蛋白質 (SMA、緑)、および胚葉蛋白質 (afp 通信、緑) の Hoechest33342 二重染色と免疫染色による解析 (HPS0077)「iPS 細胞で発現核(c) 遺伝子組換えビトロネクチン (rVitronectin)、(b) P-IA-24-VN2C-1000 ハイドロゲル (、) P IA 24 h VN1 1000 ハイドロゲル培養後 (青) ラベル-10 通路32の xeno 無料条件の下で料理をコーティングします。スケール バーを示す 50 μ m クリエイティブ ・ コモンズの表示ライセンス下で適合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: P IA-24 h VN1 と P IA-24 h VN2C ゲル上培養後の生体内細胞ヒト ES (H9) の分化能力の特性。(A)10 継代後ゼノ無料培養条件下で P IA 24 h VN1 1000 ゲル上培養細胞 (、) ヒト ES で注入による奇形の写真。(B) 腸上皮 (内胚葉) を含む組織、(c) 軟骨 (中胚葉) と (d) 神経 (外胚葉) を観察できます。(B)10 継代後ゼノ無料培養条件下での P-IA-24-VN2C-1000 ゲル上培養細胞 (、) ヒト ES で注入による奇形の写真。(B) 腸上皮 (内胚葉) を含む組織、(c) 軟骨 (中胚葉)、および (d) 網膜色素上皮 (外胚葉)32が観察できます。スケール バーを示す 100 μ m クリエイティブ ・ コモンズの表示ライセンス下で適合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: TCP 料理に培われる人間の AFS 細胞と ECM 由来オリゴペプチドの有無を 4 日間培養後固定 P IA ハイドロゲル料理の形態。(A) TCP 料理に AFS 細胞の形態。P-IA-6 h と P-IA-6 h-Zの細胞 (B) 形態人間 AFS のハイドロゲル料理 (P-IA-6 h、P IA 6 h COL1 50、P IA 6 h FN1 50、P IA 6 h VN1 50、P-IA-6 h-HBP1-50、P-IA-6 h-cRGD-50)。(C) P-IA-12 h と P-IA-12 h -Zハイドロゲル料理 (P-IA-12 h、P IA 12 h COL1 50、P IA 12 h FN1 50、P IA 12 h VN1 50、P-IA-12 h-HBP1-50、P-IA-12 h-cRGD-50) の hAFCs の形態。(D) 人間の AFS の形態はハイドロゲル料理 (P-IA-24 h、P IA 24 h COL1 50、P IA 24 h FN1 50、P IA 24 h VN1 50、P-IA-24 h-HBP1-50、P-IA-24-cRGD-50) P-IA-24 h と P-IA-24 h-Zの細胞します。P-IA-48 h と P-IA-48 h-Zの細胞 (E) 形態人間 AFS のハイドロゲル料理 (P-IA-48 h、P IA 48 h COL1 50、P IA 48 h FN1 50、P IA 48 h VN1 50、P-IA-48 h-HBP1-50、P-IA-48 h-cRGD-50)。スケール バーは、100 μ m30を示します。2017 年著作権。王立化学会からの許可を適応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

素材の名前/機器 省略形
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA 環状 RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST DSV
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
ビトロネクチン rVN
フィブロネクチン FN

表 1: ECM 由来ペプチド シーケンスと本研究で使用されている ECM。

抗体 濃度 (希釈率)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
平滑筋アクチン 1: 200
(Α SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP 1: 200
Alexa Fluor 555-共役ヤギ抗マウス 1: 200

本研究では免疫染色用のテーブル 2: 抗体。

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Discussion

ヒト ES および iPS 細胞人間 AFS セル、広告細胞の培養のためだけでなく、無料の xeno の条件で 10 以上の通路を多能性を維持する長期的な拡大のため P IA oligoECM と可変剛性を有する P IA ECM ハイドロゲルを開発しました。そして造血幹細胞25,28,32。OligoECM で固定 P IA ヒドロゲルは分化の運命と様々 な種類の幹細胞として初代培養細胞の増殖に及ぼす細胞文化資料を調査する細胞培養材料の優秀な候補と癌細胞。

P IA ソリューションは、P IA ソリューションを料理にキャストした場合に、透明なはずです。架橋時間は、P IA ゲルの架橋結合強度を決定します。24 h P IA ゲルの架橋は、ヒト ES ・ iPS 細胞培養に最適なゲルを生成します。オリゴペプチドと Ecm は、オリゴペプチド、Ecm がある自由なアミノ グループ25,28,29,30,31,このプロトコルを使用して P IA ヒドロゲルに組み入れることができる32. XPS は、表面密度の絶対値を示すことができないが、オリゴペプチドや Ecm の存在を安全にすることができます、オリゴペプチドや Ecm の表面密度は x 線光電子分光法 (XPS) 測定で検出できます。分析しました。

架橋時間に応じて、3-30 kPa から貯蔵弾性率がある、P IA ヒドロゲルと接ぎ木オリゴペプチドや Ecm なしを用意できます。むしろ 3 kPa より少ない貯蔵弾性率と 30 kPa25,28,29,30,31,32より高い貯蔵弾性率を持つ P IA ヒドロゲルを準備することは困難です。これ P IA ヒドロゲルの化学架橋の存在のゲル調製法の制限です。しかし、この議定書は、初代培養細胞、がん細胞やヒト ES、iPS 細胞などの幹細胞の文化をサポートすることができますが、ポリアクリルアミド成っていない別の弾性を有するゲルの別のオプションを提供します。特に、ヒト ES および iPS 細胞ポリアクリルアミド ゲル上増殖できないが、P IA ヒドロゲルの図 2図 3図 4図 5図 6に示すように増殖することができます。確かに、P IA-24 h VN1 ヒドロゲル人間 ES の細胞培養よりも市販コーティング皿 (図 2) がサポートされています。したがって、P IA ハイドロゲルがヒト ES および iPS 細胞の培養に適しています。

ヒト ES および iPS 細胞が心筋細胞35、網膜色素上皮36、β 細胞6TH など細胞の特定の系統に区別される、ヒドロゲルの最適な弾力性を調べるは興味深いだろう+は細胞再生医療の将来の発展のための6です。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究は科学技術、台湾省で許可番号 106-2119-M-008-003、105-2119-M-008-006 と 104-2221-E-008-107-MY3 の下で部分的に支持されました。本研究は、台湾 Landseed 病院プロジェクト (NCU LSH 105 A-001-) によっても支えられました。費補助金科学研究 (番号 15 K 06591) 教育省、文化、スポーツ、科学および技術の日本からも認められています。樋口は、大学院教育と研究、キング サウド大学 11451、サウジアラビア王国リヤドの国際科学のパートナーシップ プログラム (ISPP-0062) 副牧師の地位の確認したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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バイオ エンジニア リング、問題 132 ハイドロゲル誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、弾力性、細胞培養、オリゴペプチド、表面改質、nanosegment
Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化
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