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Bioengineering

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Se presenta un protocolo para preparar polivinilos hidrogeles de ácido itacónico-co-alcohol con rigidez variable, que han sido injertadas con y sin oligopéptidos, para investigar el efecto de la rigidez de los biomateriales en la diferenciación y proliferación de células madre. La rigidez de los hidrogeles fue controlada por el tiempo de reticulación.

Abstract

El efecto de señales físicas, tales como la rigidez de los biomateriales en la proliferación y diferenciación de células madre, ha sido investigado por varios investigadores. Sin embargo, la mayoría de estos investigadores ha utilizado hidrogeles de poliacrilamida para el cultivo de células madre en sus estudios. Por lo tanto, sus resultados son controvertidos porque esos resultados pudieran originar de las características específicas de la poliacrilamida y no de la localización física (rigidez) de los biomateriales. Aquí, describimos un protocolo para la preparación de hidrogeles, que no se basan en poliacrilamida, donde varios vástago y las células incluyendo las células madre embrionarias humanas (ES) humanas pluripotentes inducidas (iPS) células, puede ser cultivado. Se prepararon hidrogeles con rigidez variable del bioinert el ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA), con rigidez controlada por grado de reticulación por cambiar tiempo de reticulación. Investigaron a los hidrogeles de P-IA injertados con y sin oligopéptidos derivados de matriz extracelular como una plataforma de futuro para la cultura de célula de vástago y diferenciación. La cultura y el paso de las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas se describe en detalle aquí. Los hidrogeles oligopeptide P-IA demostraron funcionamientos superiores, que fueron inducidas por sus propiedades de rigidez. Este protocolo informa la síntesis del biomaterial, su manipulación superficial, junto con el control de las propiedades de rigidez y, finalmente, su impacto en el destino de la célula de vástago usando las condiciones de cultivo libre de xeno. Basado en estudios recientes, tales sustratos modificados pueden actuar como futuras plataformas para apoyar y dirigir el destino de varias línea de células madre a diferentes vínculos; y además, regenerar y restaurar las funciones de la perdida órgano o tejido.

Introduction

El destino de la diferenciación de la célula de vástago en un linaje específico de células y la proliferación a largo plazo de células madre, células especialmente humanas pluripotentes inducidas (iPS) y las células madre embrionarias humanas (ES), se sabe para ser regulados por inhibidores de factores de crecimiento, y / o pequeñas moléculas bioactivas en medios de cultivo. Recientemente, han sido reconocidas las señales físicas de los biomateriales, particularmente la rigidez de biomateriales de la cultura de célula, a ser un factor importante que guía el destino de la célula de vástago proliferación y diferenciación1,2, 3,4,5,6. Por lo tanto, varios investigadores han comenzado a investigar el destino de las células madre, que se cultivan en hidrogeles, en diferenciación, principalmente utilizando hidrogeles de poliacrilamida con rigidez variable.

La rigidez de los biomateriales puede controlar adherencias focales, morfología celular, fenotipo de la célula y adherencia de la célula de vástago, sobre todo en dos dimensiones (2D) cultivo1,2,3,5. Mecano-detección de biomateriales las células madre generalmente es controlada por adherencia focal señalización vía receptores de integrina. NMMIIA, miosina UROLOGICAL contractilidad IIA dependen del citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en el proceso de mechanosensing de células madre en células de 2-D cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.

ENGLER y sus colegas desarrollaron un interesante concepto que las células madre adultas, como la médula ósea (BMS) células cultivadas en biomateriales de cultura de célula con una rigidez similar a la de tejidos específicos, tienden a diferenciarse en células que se originaron de tejidos específicos5. Se incubaron las células BMS en hidrogeles de poliacrilamida suave 2-D con colágeno de tipo I (con una rigidez comparable a la de tejidos de cerebro) en medios de expansión espontáneamente fueron inducidos a diferenciarse en linajes tempranos de neurona, mientras que las células BMS cultivan en hidrogeles con una rigidez similar a la del músculo o los tejidos de colágeno del hueso se encontraron para inducir la diferenciación en linajes tempranos de miocitos y osteoblastos, respectivamente, en los hidrogeles de poliacrilamida 2-D3,5. Muchos investigadores han investigado el destino de la célula de vástago de diferenciación cultivadas en poliacrilamida hidrogel inmovilizado con colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. sin embargo, debe mencionarse que algunos contradictorios informes1,18,22,23,24 existen para la bien conocida idea sugerida por Engler et al. 5 se trata ya idea5 de Engler fue desarrollado exclusivamente en hidrogeles de poliacrilamida y sus resultados han originado de características específicas del biomaterial (poliacrilamida) y no únicamente de la localización física (rigidez) de el biomaterial. Por lo tanto, es importante desarrollar otro tipo de hidrogel, de que la rigidez puede ser controlada por reticulación de los hidrogeles. Para ello, se desarrollaron bioinert hidrogeles, que fueron preparados de ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA) con una rigidez diferente, que estaba controlada por el grado de reticulación con un cambiante reticulación tiempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. las células madre puede ser cultivadas en hidrogeles P-IA nonmodified, como IA P hidrogeles injertados con matrices extracelulares (ECMs) y oligopéptidos. En un estudio anterior25, humanos las células madre hematopoyéticas (hHSCs) de cordón umbilical se cultivaron en P-IA hidrogeles con valores de rigidez diferentes que van desde un 3 kPa a 30 kPa módulo de almacenamiento donde fibronectina o un oligopéptido se deriva de fibronectina (CS1, EILDVPST) fue injertado en los hidrogeles de P-IA. Alto ex vivo doble expansión de hHSCs se observó en los hidrogeles de P-IA injertados con CS1 o fibronectina, que muestra una rigidez intermedia desde 12 kPa hasta 30 kPa25.

IPS humana y células madre embrionarias no pueden cultivarse en cultivo de tejidos convencionales poliestireno (TCP) platos33,34 porque ES humano y las células iPS requieren unión específica a ECMs, como vitronectina laminina mantener su pluripotencia durante el cultivo a largo plazo. Por lo tanto, varias estructuras de hidrogeles de P-IA oligopeptide-injertado con características de rigidez óptimo fueron diseñadas y preparadas en las formaciones de una sola cadena, una sola cadena con una serie de sesiones conjunta, una doble cadena con una serie de sesiones conjunta y un tipo ramificado cadena de32. Oligopeptide secuencias fueron seleccionadas de dominios de unión de la integrina y la glycosaminoglycan de ECMs. Los hidrogeles de P-IA injertados con oligopéptidos derivados de vitronectina con una doble cadena o serie de sesiones conjunta, que tienen un módulo de almacenamiento en aproximadamente 25 kPa, apoya la cultura a largo plazo ES humano y las células iPS para más de 12 pasajes gratis xeno y química condiciones definidas de32. La serie de sesiones conjunta y doble cadena con moléculas de adhesión celular en los hidrogeles facilitan la proliferación y células de pluripotencia de humano ES e iPS32. Aquí, un protocolo para la preparación de hidrogeles P-IA (con un módulo de almacenamiento de 10 kPa a 30 kPa, que se midió bajo condiciones de humedad en el aire) injertadas con y sin oligopéptidos o ECMs se describe. Se muestra cómo la cultura y paso varias células (incluyendo las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas).

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Protocol

Los experimentos en este estudio fueron aprobados por los comités éticos del Hospital de Landseed de Taiwán (IRB-13-05) y la Universidad Nacional del centro. Todos los experimentos fueron realizados según las directrices gubernamentales e institucionales pertinentes y aplicables y reglamentos durante este estudio.

1. solución y preparación de los medios de comunicación

  1. Purificación del polímero
    1. Purificar P-IA con el grupo de ácido carboxílico con un grado de hidrólisis de > 96,5% en P-IA se lava con etanol. 20 g de P-IA en 200 mL de etanol en un vaso cónico de 500 mL y agitar en un agitador magnético para 24-30 h. cambio el etanol con etanol fresco cada 8-10 h.
    2. Saque P-IA el etanol por filtración usando un embudo Büchner.
    3. Seco P-IA por secado al vacío a temperatura ambiente durante 24 h.
      Nota: Se recomienda limpiar la trampa en el sistema de secado al vacío (por la eliminación de etanol) con frecuencia, especialmente durante el primer par de horas, porque la trampa tiende a obstruirse después de la eliminación de una gran cantidad de etanol a partir de P-IA.
  2. Preparación de la solución de P-IA
    Nota: Agregue muy lentamente el polímero en el solvente (agua). Se recomienda tomar por lo menos 15 minutos para añadir el P-IA en el solvente. Si el solvente es añadido en el polímero, el polímero no se disolvería totalmente. Tenga cuidado de no generar ebullición explosiva de la solución de P-IA. Utilizar gafas de protección durante la preparación de la solución de P-IA. El proceso de calentamiento de la solución de P-IA es esencial disolver cristalina P-IA. Es sugerido (y preferible) para preparar la solución de P-IA en una sala experimental relativamente limpio, si es posible.
    1. Disolver el P-IA en agua pura a una concentración de peso 0.050% para el experimento de cultivo de células o una concentración de peso 0.50% para la medición de Reómetro: por ejemplo, disolver 50 mg de P-IA en 100 mL de agua pura para el cultivo celular y 500 mg de P-IA en 100 mL de agua ionizada (DI) para las mediciones de reómetro.
    2. Agite la solución de P-IA para 1 h en la placa.
      Nota: Para evitar una ebullición explosiva, no caliente la solución más a 95 ° C. Explosivo de ebullición de la solución de polímero a una temperatura alta puede generar quemaduras en la piel. Por lo tanto, realizar la calefacción de P-IA muy cuidadosamente y monitorear la temperatura de la solución de P-IA durante el calentamiento.
    3. Después de la solución de P-IA se enfrió a temperatura ambiente, agitar la solución de P-IA a temperatura ambiente durante 48 h. solución de P-IA caliente deja en el plato caliente sin calefacción y luego dejarlo sin agitación a temperatura ambiente durante 20-24 h para que las burbujas de aire sean no presentes en la solución de P-IA.
  3. Preparación de la solución de reticulación
    1. Hacer la composición de la reticulación solución 1.0 peso % glutaraldehído de solución de glutaraldehído acuoso al 25%, 20.0% Na2de peso tan4 uso 99% > pureza y 1.0 peso % H2hasta4. Por ejemplo, para 6 o 12 bien placa de cultivo celular, añada 100 μl de solución de glutaraldehído, 2 g de sulfato de sodio y 100 μl de ácido sulfúrico en 10 mL de agua pura.
  4. Medios de cultivo de células de humano ES/PS
    Nota: Uso DMEM/F12 medios, esenciales 6 medios de comunicación y medios 8 esenciales para el cultivo celular.
    1. Volver congelado 50 X 8 esencial suplemento lentamente la solución durante la noche por descongelación en un refrigerador de 4 ° C.
    2. Agregar una botella de 50 suplemento X 8 esenciales en una botella de media basal 8 esenciales. Separar los medios de comunicación en pequeñas alícuotas (50 mL) en tubos de centrifugación de 100 mL, luego almacenar los medios de comunicación a-20 ° C.

2. P-IA preparacion de hidrogel

  1. Preparación de la película de P-IA
    1. Inyectar una alícuota de 1 mL de la solución de P-IA en un plato TCP de 35 mm y el plato en un horno de 45 ° C durante 2 días para producir una película de P-IA en un banco de limpieza en seco.
  2. Reticulación de los platos del hidrogel P-IA
    1. Sumerja las películas P-IA en una solución acuosa de reticulación para 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 y 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (p. ej., h P-IA-12) se refiere a un P-IA hidrogel reticulado para X h (p. ej., 12 h).
    2. Después de reticulación, enjuague los hidrogeles P-IA con agua pura a temperatura ambiente y luego mantener los hidrogeles en agua pura a temperatura ambiente en un banco limpio.
    3. Esterilizar los hidrogeles P-IA por inmersión en una solución de etanol 75,0 volume/volume% durante 1 min, enjuagar el P-IA los hidrogeles en agua pura seis veces y entonces mantener el P-IA los hidrogeles en agua pura hasta para el cultivo de células.
  3. Preparación de platos típicos de hidrogel P-IA injertado con oligopéptidos o ECM
    1. Activar los P-IA los hidrogeles mediante inmersión en 1 mL de una solución acuosa que contiene 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- etilcarbodiimida clorhidrato (EDC) y 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) por 1 h a 37 ° C o 4 h a 4 ° C.
    2. Enjuague los hidrogeles P-IA con 1 mL de fosfato tampón salino (PBS, pH 7,2) 3 veces y sumerja los hidrogeles P-IA en una solución de PBS que contenga 1 mL de oligopéptido (100-1.500 μg/mL) o ECM (10-100 μg/mL) durante 24 h a 4 ° C.
      Nota: Las secuencias de oligopéptidos y ECMs utilizado para el cultivo de células madre se resumen en la tabla 1.
    3. Después de injertar el oligopéptido o ECM, lave los hidrogeles P-IA con agua pura 3 veces.
      Nota: Los hidrogeles P-IA injertados Y μg/ml de oligopéptidos o ECM (Z) son sucesivo P-IA -Xh -Z oP-IA-Xh -Z-Y, donde X se refiere al tiempo de reticulación (h), Y indica la concentración de los oligopéptidos o ECM, Z indica un diferentes oligopeptide o ECM.

3. humano ES/iPS Cell Culture

  1. Método de paso y mantenimiento de las células iPS y ES humano indiferenciado
    1. Mantener ES humano (p. ej., WA09 o H9) células o humano iPS (por ejemplo, HS0077) células en Matrigel en medios de comunicación esencial 8 platos 6 cm usando estándar ES/iPS humana de la célula cultura protocolos28,32.
    2. Incubar cerca de confluencia humana ES/iPS células con dispase 2.0 mg/mL II en medio DMEM/F-12 a 37 ° C durante 8-10 minutos y luego enjuague las células humanas del ES/iPS dos veces con medio DMEM/F12.
    3. Después de la adición de 2 mL de DMEM/F-12 medios humanos ES/iPS células cultura platos separar colonias adherentes débil con un raspador celular o mediante pipeteo.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS en tubos de centrifugación de 15 mL y centrifugar las células humanas del ES/iPS a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Después de la centrifugación, descartar el DMEM/F12 y suspender las células humanas del ES/iPS en 1 mL de medio de E8 y entonces contar la densidad celular usando un contador de células.
    6. Inocular las células ES/iPS después del ajuste de la densidad adecuada (1-5 x 104 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con el oligopéptido o ECM).

4. Caracterización de la caracterización de la célula humana ES/iPS

  1. Evaluación de la actividad de la fosfatasa alcalina (AP)
    1. Medir la actividad de la fosfatasa alcalina (AP) de células humanas del ES/iPS utilizando una tinción fosfatasa alcalina estándar vivo.
  2. Inmunotinción
    1. Realizar el immunostaining de Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 y Oct3/4 en las células del hES y caderas para investigar pluripotencia siguiendo el protocolo convencional28,32.
    2. Añadir un volumen de 0,5 mL de paraformaldehído al 4% (volumen/volumen) en cada plato bien 24 en el que las células humanas del ES/iPS fueron cultivadas y posteriormente, incuban los platos por 15 min a 4 ° C para fijar las células.
    3. Aspirar la solución de paraformaldehído de cada pozo. Luego, añadir 1 mL de PBS por pozo y aspirar PBS para enjuagar las células. Realizar el proceso de enjuague 3 veces.
    4. Permeabilizar las membranas celulares mediante la adición de 0,5 mL de 0,3% (volumen/volumen) de Triton-X 100 solución en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirar la solución Triton-X 100 y añadir 300 μL de 2% (peso/volumen) de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (tampón de bloqueo) en cada pozo, incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Retire el amortiguador de bloqueo mediante pipeteo y posteriormente, agregar los anticuerpos primarios deseados (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) y Tra-1-81(1:200) con una pipeta, ven tabla 2) en cada pocillo, donde 1: 200 indica que los anticuerpos se diluyeron con PBS 200-fold e incubados durante un día a 4 ° C.
    7. Aspirar la solución de anticuerpo primario y lavan las células con 300 μL de 0.05% Tween 20 en solución de PBS 3 veces a temperatura ambiente.
    8. Añadir 300 μL de anticuerpos secundarios (1: 200, ver tabla 2), que son el principal subtipo de IgG específicos, en la solución de BSA de 2% (peso/volumen) en cada uno así e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    9. Lavar las células con 300 μL de 0.05% Tween 20 en solución de PBS 3 veces a temperatura ambiente en la oscuridad.
    10. Analizar las células por microscopía de fluorescencia o la microscopia confocal.
  3. Formación del cuerpo de embryoid
    1. Investigar la pluripotencia de las células humanas del ES/iPS por formación de embryoid cuerpo (EB) en pasos de 10 y 20.
      Nota: Cerca de 80% es suficiente para la preparación de la formación de EB de confluencia en placas de 6 pocillos.
    2. Enjuague ES humana o células iPS con 2 mL de DMEM/F-12 medios dos veces y luego sumergir las células en 1,5 mL de medio fundamental 6.
    3. Cortar cerca de 80% confluente ES o iPS células humanas aproximadamente 32 piezas utilizando 200 μL puntas. A continuación, separar las células de los platos, con un raspador celular.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS y transferencia en un plato ultra bajo 6-bien accesorio.
    5. Medios de intercambio esencial 6 pipetear medios viejos y añadiendo medio fresco cada 2 días.
      Nota: La cultura las células en suspensión durante 2 semanas a 37 ° C con 5% CO2.
    6. Después de la EBs homogéneamente se suspendieron en 6 esencial los medios de comunicación, transferencia de EBs a la cultura en los platos TCP 24 pocillos recubiertos con 0.1 peso % de gelatina y las células en medios 6 esencial de la cultura para una semana adicional.
    7. Teñir las células con anticuerpos específicos contra los marcadores de las células derivadas de tres capas germinales embrionarias [AFP (endodermo), GFA (ectodermo), β III-tubulina (ectodermo) y SMA (mesodermo)] y evaluar las celdas por el método de immunostaining descrito anteriormente.
  4. Formación de teratoma
    1. Investigar la pluripotencia de las células humanas del ES/iPS por formación de teratoma en pasos de 10 y 20.
      Nota: 5 platos de cerca de 80% de confluencia en placas de 6 pocillos son suficientes para la formación del teratoma (por lo menos 3 x 106 células son necesarias para los experimentos de formación de teratoma).
    2. Lavar las células con 2 mL DMEM/F-12 medios dos veces y luego añadir 1,5 mL de medio DMEM/F-12 a los platos de cultivo celular.
    3. Cortada casi 80% confluente ES o iPS células humanas aproximadamente 32 por emplear 200 μL puntas. A continuación, separar las células de los platos, con un raspador celular.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS en un tubo de centrifugación de 15 mL y centrifugar las células a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Después de la centrifugación, suspender los pellets de células en 100 μl DMEM/F12 y luego mezcla bolitas de la célula con 100 μl Matrigel (cociente del volumen 1:1).
    6. Transferir la suspensión de células en una jeringa previamente enfriado de-20 ° C. Inyectar, en total, por lo menos 3 × 106 células por vía subcutánea en masculino NOD-SCID (cabeceo. CB17 -Prkdascid/JNarl) ratones (5-8 semanas).
    7. Después de 5 a 8 semanas, diseccionar los teratomas, fijar con solución de paraformaldehído al 4.0% (peso/volumen) y luego almacenar a 4 ° C.
    8. Fijar el teratoma con parafina, cortar los teratomas de parafina y tinción con hematoxilina y eosina (H & E) utilizando un protocolo estándar28,32.
      Nota: Los investigadores pueden enviar tejido fijo teratoma a la empresa para fijar los teratomas con parafina, rebanada la parafina-encajados los teratomas y mancha la muestra con H & E, que se utiliza normalmente en el Departamento de patología en los hospitales.
  5. Cultivo de células de vástago humano adiposo derivados (ADS)
    1. Medios de cultivo cálido (DMEM que contenía 1% antimicótico antibiótico y 10% suero bovino fetal (FBS)), 0,25% de tripsina-EDTA y PBS a 37 ° C en un antes de baño de agua a utilizar.
    2. Lavar las células humanas de anuncios Pipetear 10 ml de PBS en cada placa de cultivo de 6 cm donde se cultivan las células.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en los platos de cultura 6 cm e incubar la solución a 37 ° C durante 5 minutos.
    4. Observar las células en los platos de cultura 6 cm bajo microscopia para confirmar que las células son separadas.
    5. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y añadir un volumen igual de medio de cultivo (DMEM que contiene antibiótico antimicótico 1% y 10% FBS) en el tubo de la centrífuga para neutralizar el tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar las células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante cuidadosamente mediante pipeteo, sin perturbar el sedimento celulares.
    8. Resuspender las células en los medios de cultivo y luego sembrar las células a la densidad adecuada (5-10 x 103 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con y sin los oligopéptidos y ECM).
  6. El líquido amniótico humano tallo cultura de célula (AFS)
    1. Caliente de los medios de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) que contiene 20% suero bovino fetal (FBS), 5 ng/mL bFGF y antibiótico antimicótico 1%), 0,25% de tripsina-EDTA y PBS a 37 ° C en un antes de baño de agua a utilizar.
    2. Lavar las células AFS humanas Pipetear 10 ml de PBS en cada placa de cultivo de 6 cm donde se cultivan las células.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en platos de cultivo de 6 cm e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.
    4. Observar las células en los platos de la cultura 6 cm bajo microscopia para confirmar las células son separadas.
    5. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y añadir un volumen igual de medio de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) que contiene 20% suero bovino fetal (FBS), 5 ng/mL bFGF y antibiótico antimicótico 1%) en el tubo de la centrífuga para neutralizar el tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar las células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante con cuidado sin perturbar el pellet celular mediante pipeteo.
    8. Resuspender las células en los medios de cultivo y semillas luego las celdas de la densidad adecuada (5-10 x 103 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con y sin oligopeptide y ECM).

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Representative Results

P-IA hidrogeles injertan con oligopéptidos derivados de ECM (oligoECM) o ECM con diferentes elasticidades se prepararon siguiendo el esquema de la reacción, como se ve en la figura 1A, utilizando diferentes tipos de oligoECM (figura 1B). Las elasticidades de los hidrogeles fueron reguladas por la intensidad de crosslinking aplicada (tiempo) (figura 1). P-IA hidrogeles injertados con oligopéptidos derivados de vitronectina, que cuenta con un módulo de almacenamiento de 25,3 kPa (tiempo de reticulación de 24 h), apoya la cultura a largo plazo de iPS humana y células madre embrionarias para más de 10 a 20 pasos. Particularmente, P-IA hidrogeles injertan con una serie de sesiones conjunta (P-IA-24h-VN1G) o una cadena doble (P-IA-24h-VN2G) apoya la pluripotencia de iPS humana y células madre embrionarias, que fueron preparados con una concentración relativamente baja de oligoECM (200-500 μg/mL) que P-IA-VN1 hidrogeles, que hizo necesario usando una alta concentración de oligoECM (> 1000 μg/mL) para mantener la pluripotencialidad de humanos iPS y ES células de28,32.

Células madre embrionarias humanas mantienen en ratón embrionaria fibroblastos (MEFs) fueron cambiados de puesto a la cultura en otros platos sintetizado materiales (p. ej., Synthemax II) de la capa recubierta y P-IA-24 h-VN1 hidrogel platos (figura 2)28. Células madre embrionarias humanas cultivadas comercialmente disponible capa platos fueron encontrados distinguir más fácilmente, especialmente en el borde de las colonias (Figura 2a y 2C), mientras que células madre embrionarias humanas podrían mantener su pluripotencia en P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel platos porque no se podrían observar las células diferenciadas de la morfología de las células humanas del ES P-IA-24h-VN1-1000 hidrogel platos (figura 2b y 2d)28.

La pluripotencia ES humano (Figura 3A) y las células iPS (figura 3B) cultivadas en hidrogeles de P-IA - 24 h injertado con oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), así como (vitronectina recombinante convencional rVitronectin)-cubierta de platos, fue evaluado basado en la expresión de proteínas de fabricante pluripotentes (Nanog, Sox2 y Oct3/4) después de que las células fueron cultivadas en cada plato en condiciones libres de xeno medios esenciales 8 para 10 pasos32. Estas proteínas de pluripotencia satisfactoriamente se expresaron en iPS humana y células madre embrionarias cultivadas P-IA hidrogeles injertados con oligoECM, así como de platos recubiertos de rVitronectin en condiciones libres de xeno.

Evaluación de la capacidad de diferenciación en las células derivadas de tres capas germinales en vitro (EB formación) y en vivo (formación de teratoma) es esencial para verificar la pluripotencia de células iPS y ES humano después de la cultivación en sintético biomateriales. Por lo tanto, células ES humanas (figura 4) y las células iPS humanas (figura 5) se cultivaron en P-IA-oligoECM hidrogel platos y platos recubiertos de vitronectina recombinantes para 10 pasos y posteriormente, las células fueron cultivadas en suspensión para formar EBs. La EBs se cultivaron más de platos recubiertos de gelatina durante unas semanas observar la capacidad de las células para untar en los platos (Figura 4A y figura 5A)32. ES humano diferenciado (Figura 4B) y las células iPS (figura 5B) immunostained para proteínas derivadas de tres capas germinales: alfa-fetoproteína (AFP, endodermo), actinia del músculo liso (SMA, mesodermo) y la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP ectodermo)32. IPS humana y células madre embrionarias fueron encontrados para diferenciarse en las células derivadas de las tres capas del germen, indicando otra verificación de la pluripotencia de iPS humana y células madre embrionarias, incluso después de la cultivación en hidrogeles de P-IA injertados con oligoECM en xeno-libre condiciones a largo plazo (pasaje > 10 pasos).

También se evaluó la capacidad de diferenciación de células madre embrionarias humanas en las células que origina tres capas germinales en vivo (ensayo de formación de teratoma). Células madre embrionarias humanas, que se cultivaban en P-IA-VN1-1000 (figura 6A) y P-IA-VN2C-1000 (Figura 6B) en condiciones de cultivo libre de xeno para 10 pasos, se inyectan por vía subcutánea en ratones de SCID de NOD32. Los teratomas fueron aislados de los ratones, y teratoma tejido secciones fueron fijadas y teñidas con H & E (figura 6A y 6B)32. Los teratomas muestran la existencia de células procedentes de las tres capas del germen: endodermo (epitelio intestinal, figura 6A(b) y 6B(b)), mesodermo (cartílago, figura 6A(c) y 6B(c)) y ectodermo ( neuroepitelio, figura 6A(d); epitelio retiniano del pigmento, Figura 6B(d)). Estos resultados sugieren que células madre embrionarias humanas cultivadas en P-IA-24h-VN1-1000 y P-IA-24h-VN2C-1000 en condiciones libres de xeno para 10 pasos pueden diferencian en células procedentes de tres capas germinales, lo que indica que su pluripotencia se mantenga en vivo.

Las células AFS humanas también fueron cultivadas sin modificar IA P hidrogel, hidrogel P-IA-oligoECM y platos TCP en medios de expansión. La figura 7 muestra la morfología de las células AFS humanas cultivadas después de cuatro días de cultura en IA P y P-IA-oligoECM hidrogel con elasticidades (E') de 12.2 (época de reticulación = 6 h), 18.3 (época de reticulación = 12 h), 25.3 (época de reticulación = 24 h) y 30.4 kPa (época de reticulación = 48 h) utilizando una concentración de oligoECM de 0 o 50 μg/mL como TCP platos con 3-12 GPa de rigidez30.

Células humanas de AFS no podrían proliferar en los platos del hidrogel de IA P con o sin oligoECM cuando la rigidez de los hidrogeles P IA fue menos de 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h y PV-4h-Y), mientras que las células AFS humanas podrían proliferar con o sin oligoECM cuando E' fue más de 12 kPa, con excepción de los platos hidrogel P-IA - 6 h y PV-IA-h 6-COL1. P-IA - 6h y P-IA-h 6-COL1 parecen no ser favorables para el cultivo de células humanas de AFS porque los biomateriales de cultura de célula suave detener el ciclo celular avance30.

Los resultados anteriores sugieren que P-IA hidrogel es un material óptimo para largo cultivo de células madre de término y mantener la pluripotencialidad de las células madre por selección de rigidez específica y oligoECM, así como la concentración óptima de la reacción de oligoECM (densidad superficial oligoECM).

Figure 1
Figura 1: preparación de hidrogeles P-IA injertados con oligoECM o ECM. (A) esquema de la reacción de P-IA hidrogeles injertados con ECM y oligopéptidos derivados de ECM (oligoECM)29. Derechos reservados 2015. Adaptado con permiso de la Real Sociedad de química. (B) diseño y secuencia de oligopéptidos injertados sobre P-IA hidrogeles. Oligopéptidos de cadena única (P-IA-BSP, P-IA-VN1 y P-IA-HBP1) solo oligopéptidos de cadena con una serie de sesiones conjunta (P-IA-VN1G), y dos cadenas (P-IA-VN2C y P-IA-HBP2C) y ECM (P-IA-ECM) fueron injertadas sobre P-IA hidrogeles32. Adaptado bajo una licencia Atribución de Creative Commons. (C) rigidez de P-IA hidrogeles preparados por diferentes periodos de reticulación29. Derechos reservados 2015. Adaptado con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: comparación de células ES humanas culturas P-IA-24h-VN1 hidrogeles y platos de capa disponibles en el mercado. Morfología de células madre embrionarias humanas (WA09) cultivadas en platos de capa disponibles comercialmente (a, b) y P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) platos en el paso 1 cuando cambiaron de cultivo de células madre embrionarias humanas en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) en cultivo en platos de capa disponibles comercialmente o PVA-24h-VN1-1000 platos. Flechas rojas muestran las células ES humanas diferenciadas. Las barras de escala indican 50 μm (a, b) y 100 μm (c, d)28. Adaptado bajo una licencia Atribución de Creative Commons. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: caracterización de la pluripotencia de humano ES e iPS células en hidrogeles de P-IA injertados con diseños diferentes oligopeptide. (A) la expresión de proteínas de pluripotencia (rojo) Nanog, Sox2 (verde) y Oct3/4 (verde) en células humanas del ES (H9) analizados por inmunotinción con doble tinción con Hoechest33342 para el etiquetado nuclear (azul) después de cultivo de (un) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 y (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hidrogeles y (d) recombinante vitronectina (rVitronectin)-cubierto platos en condiciones libres de xeno para 10 pasajes. (B) expresión de las proteínas de la pluripotencia (rojo) Nanog, Sox2 (verde) y Oct3/4 (verde) en las células iPS humanas analizadas por inmunotinción con doble tinción con Hoechest33342 para el etiquetado nuclear (azul) después de cultivo de (un) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel, hidrogel (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 y (c) recombinante vitronectina (rVitronectin)-hidrogeles cubierto platos en condiciones libres de xeno para 10 pasos32. Indican las barras de escala 50 μm. adaptado bajo una Creative Commons Attribution License. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: caracterización de la capacidad de diferenciación de ES humano células en hidrogeles de P-IA injertados con diseños diferentes oligopeptide. (A) morfología de las células de EBs diferenciados de células humanas del ES (H9) después del cultivo en (un) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 y (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hidrogeles y (d) recombinante vitronectina (rVitronectin)-cubierto platos en condiciones libres de xeno para 10 pasajes. Las barras de escala indican 100 μm. (B) expresión de una proteína de ectodermo (GFAP, rojo), proteína de mesodermo (SMA, verde) y proteína de endodermo (AFP, verde) en células humanas del ES (H9) evaluado por inmunotinción con doble tinción con Hoechest33342 para nuclear etiquetado (azul) después de cultivo P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 y P-IA-24h-VN2C-1000 hidrogeles y vitronectina recombinante (rVitronectin)-cubierto platos en condiciones libres de xeno para 10 pasos32. Indican las barras de escala 50 μm. adaptado bajo una Creative Commons Attribution License. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterización de la capacidad de diferenciación de humano iPS células en hidrogeles de P-IA injertados con diseños diferentes oligopeptide. (A) morfología de las células de EBs diferenciados de células iPS humanas (HPS0077) después de cultivo (a) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogeles, hidrogeles (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 y (c) recombinante vitronectina (rVitronectin)- platos recubiertos en condiciones libres de xeno para 10 pasajes. Las barras de escala indican 100 μm. (B) expresión de una proteína de ectodermo (GFAP, rojo), proteína de mesodermo (SMA, verde) y proteína de endodermo (AFP, verde) en células iPS humanas (HPS0077) analizado por inmunotinción con doble tinción con Hoechest33342 para nuclear etiquetado (azul) después de cultivo (a) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogeles, hidrogeles (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 y (c) recombinante vitronectina (rVitronectin)-cubierto platos en condiciones libres de xeno para 10 pasos32. Indican las barras de escala 50 μm. adaptado bajo una Creative Commons Attribution License. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Caracterización de la capacidad de diferenciación de ES humanas (H9) las células in vivo después de cultivo en hidrogeles P-IA-24 h-VN1 y P-IA-24 h-VN2C. (A) (una) foto de un teratoma por inyección ES humano las células después de cultivo en hidrogeles de P-IA-24 h-VN1-1000 bajo condiciones de cultivo celular de xeno-libre después de 10 pasajes. Tejidos como el epitelio intestinal (b) (endodermo), puede observarse (c) cartílago (mesodermo) y (d) neuroepitelio (ectodermo). (B) (una) foto de un teratoma por inyección ES humano las células después de cultivo en hidrogeles de P-IA-24 h-VN2C-1000 bajo condiciones de cultivo celular de xeno-libre después de 10 pasajes. Tejidos como el epitelio intestinal (b) (endodermo), (c) cartílago (mesodermo) y (d) epitelio retiniano del pigmento (ectodermo) se observan32. Las barras de escala indican 100 μm. adaptado bajo una Creative Commons Attribution License. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: morfología de las células AFS humanas cultivadas en platos TCP y P-IA hidrogel platos inmovilizados con o sin oligopéptidos derivados de ECM después de 4 días de cultura. (A) morfología de las células humanas de AFS en los platos TCP. (B) morfología de AFS humano células P-IA - 6 h y P-IA-6 h -Z hidrogel platos (P-IA - 6 h, P-IA-h 6-COL1-50, P-IA-h 6-FN1-50, P-IA-h 6-VN1-50, P-IA-h 6-HBP1-50 y P-IA-h 6-cRGD-50). (C) morfología del hAFCs P-IA - 12 h y P-IA-12 h -Z hidrogel platos (P-IA - 12 h, P-IA-h 12-COL1-50, P-IA-h 12-FN1-50, P-IA-h 12-VN1-50, P-IA-h 12-HBP1-50 y P-IA-h 12-cRGD-50). (D) morfología de AFS humano células P-IA - 24 h y P-IA-24 h -Z hidrogel platos (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-COL1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 y P-IA-24 h-cRGD-50). (E) morfología de AFS humano células P-IA - 48 h y P-IA-48 h -Z hidrogel platos (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-COL1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 y P-IA-48 h-cRGD-50). Las barras de escala indican 100 μm30. 2017 copyright. Adaptado con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre del Material / equipo Abreviatura
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA RGD cíclica (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectina rVN
Fibronectina FN

Tabla 1: Secuencias de oligopéptidos derivados de ECM y ECM utilizados en este estudio.

Anticuerpos Concentración (tasa de dilución)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
SOX2 1: 200
Actina de músculo liso 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP 1: 200
Alexa Fluor 555 – cabra conjugado anti-ratón 1: 200

Tabla 2: Anticuerpos utilizados para la inmunotinción en este estudio.

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Discussion

P-IA-oligoECM y P-IA-ECM hidrogeles con rigidez variable fueron desarrollados para la expansión a largo plazo de ES humano y las células iPS mantienen su pluripotencialidad para más de diez pasos en condiciones libres de xeno, así como para el cultivo de células humanas de la AFS, células de anuncios, y las células madre hematopoyéticas25,28,32. P-IA hidrogeles inmovilizados con oligoECM son un excelente candidato para los materiales de cultivo celular para investigar el efecto de los materiales de cultivo celular en el destino de la diferenciación y la proliferación de varios tipos de células, como células primarias y células cancerosas.

P-IA solución debe ser transparente, cuando solución de P-IA en los platos. El tiempo de reticulación decide la intensidad de la reticulación de los hidrogeles P-IA. reticulación de 24 h de P-IA hidrogeles produce hidrogeles óptima para el cultivo de células de humano ES/iPS. Los oligopéptidos y ECMs puede ser injertado en hidrogeles de P-IA mediante este protocolo, donde los oligopéptidos y ECMs tienen grupos aminos libres25,28,29,30,31, 32. la densidad superficial de los oligopéptidos o ECMs puede detectarse mediante medidas de espectroscopia (XPS) de fotoelectrones de rayos-x, aunque XPS no puede presentar un valor absoluto de la densidad superficial, pero la existencia de los oligopéptidos o ECMs puede ser segura analizados.

P-IA hidrogeles con y sin injertos oligopéptidos o ECMs pueden estar preparados, que tienen módulo de almacenaje de 3-30 kPa, dependiendo del tiempo de reticulación. Es algo difícil de preparar hidrogeles P-IA tiene menor módulo de almacenamiento de 3 kPa y módulo de almacenamiento superior a 30 kPa25,28,29,30,31,32. Se trata de la limitación del método de preparación del hidrogel presente de reticulación química de hidrogeles P-IA. Sin embargo, el presente Protocolo ofrece otra opción de los hidrogeles con diferente elasticidad, que puede apoyar la cultura de células primarias, células cancerosas o células como las células iPS humanas ES, pero no se hace de poliacrilamida. Especialmente, ES humano y las células iPS no pueden proliferar en hidrogeles de poliacrilamida, pero pueden proliferar en hidrogeles de IA P como se muestra en la figura 2, figura 3, figura 4, figura 5y figura 6. De hecho, P-IA-24h-VN1 hidrogeles apoyaron cultura celular humana ES mejor que platos de capa disponibles comercialmente (figura 2). Por lo tanto, P-IA hidrogeles son preferibles para la cultura ES humana y las células iPS.

Sería interesante investigar la elasticidad óptima de los hidrogeles que ES humano y las células iPS se diferencian en linajes específicos de las células como cardiomiocitos35, de epitelio pigmentario de la retina36, de las células β6y TH + las células de6 para el desarrollo futuro de la medicina regenerativa.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue parcialmente financiada por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán bajo la beca número 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 y 104-2221-E-008-107-MY3. Esta investigación también fue apoyada por el proyecto de Hospital de Landseed de Taiwán (NCU-LSH-105-A-001). Subvenciones para la investigación científica (número 15K 06591) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón también es reconocido. A. Higuchi agradece a para el programa internacional de colaboración científica (ISPP-0062) Vicerrectorado de estudios de posgrado e investigación, Universidad Rey Saud, Riyadh 11451, Reino de Arabia Saudita.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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Bioingeniería número 132 hidrogel inducida por la célula de vástago pluripotent células de vástago embrionarias elasticidad cultivo celular oligopeptide modificación superficial nanosegment
Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno
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Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

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