Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.

Abstract

Biyomalzeme yayılması üzerine sertliği ve kök hücre, farklılaşma gibi fiziksel yardımlar etkisi çeşitli araştırmacılar tarafından araştırmış. Ancak, çoğu bu müfettişler çalışmalarına kök hücre kültüründe polyacrylamide hydrogels kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu sonuçlar polyacrylamide belirli özellikleri ve Biyomalzeme fiziksel işaret (sertlik) kaynaklı çünkü onların sonuçları tartışmalı. Burada, biz nerede çeşitli kök, insan embriyonik kök (ES) hücre de dahil olmak üzere hücreleri ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök (IPS) hücreler, kültürlü polyacrylamide üzerinde temel almayan hydrogels hazırlanması için bir protokol tanımlamak. Hydrogels değişen sertlik ile bioinert polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking zaman değiştirerek crosslinking derecesi tarafından kontrol edilen sertlik ile hazırlanmıştır. Ve hücre dışı matriks türetilmiş oligopeptides olmadan aşılı P-IA hydrogels kök hücre kültür ve farklılaşma için gelecek bir platform olarak araştırıldı. Kültür ve amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP'leri hücreleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Chowing P-IA hydrogels sertlik özelliklerini tarafından indüklenen üstün performans gösterdi. Bu iletişim kuralı biomaterial, sertlik özelliklerini ve son olarak, kök hücre kader xeno-Alerjik kültür koşul kullanma üzerindeki etkilerini kontrol ile birlikte onların yüzey işleme sentezi bildirir. Son çalışmalar üzerinde bağlı olarak, değiştirilmiş gibi yüzeylerde desteklemek ve farklı bağlantılar için farklı kök hücre satır kaderi yönlendirmek için gelecekteki platformlar olarak işlev görebilir; ve ayrıca, yeniden ve kayıp organ veya doku işlevlerini geri yüklemek.

Introduction

Kök hücre farklılaşması hücre ve kök hücreleri, özellikle İnsan İndüklenmiş pluripotent (IPS) hücreleri ve insan embriyonik kök (ES) hücreleri, uzun vadeli yayılması belirli bir soy içine kaderi inhibitörleri, büyüme faktörleri, düzenlenmiş olması bilinmektedir ve / ya da küçük biyoaktif moleküller kültür medya. Son zamanlarda, biyomalzemeler, özellikle hücre kültür Biyomalzeme, sertliği fiziksel ipuçları kök hücre çoğalması ve farklılaşma1,2kaderi rehberlik önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir, 3,4,5,6. Bu nedenle, çeşitli araştırmacılar kök hücre farklılaşması, üzerine hydrogels üzerinde kültürlü, kaderi araştırmak esas olarak polyacrylamide hydrogels ile değişen sertlik kullanmaya başlamıştır.

Biyomalzeme sertliği odak yapışıklıklar, hücre morfolojisi, hücre fenotip ve özellikle de iki boyutlu (2B) ekimi1,2,3,5kök hücre adezyon denetleyebilirsiniz. Mekanik algılamalı Biyomalzeme kök hücreleri tarafından genellikle odak yapışma integrin reseptörleri sinyal tarafından kontrol edilir. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-bağımlı contractility aktin sitoiskeleti, 2-B hücre işleme sistemleri3,4,5, kök hücrelerin mechanosensing sürecinde kritik bir rol oynar 7,8,9,10,11.

Engler ve meslektaşları gibi kemik iliği kök (BMS) hücre hücre kültür Biyomalzeme bu belirli dokuların için benzer bir sertlik ile ekili erişkin kök hücreleri kökenli hücrelerine ayırt etmek eğilimindedir ilginç bir fikir geliştirdi belirli doku5. 2-B yumuşak polyacrylamide hydrogels ben (ile beyin dokuları karşılaştırılabilir bir sertlik) genişleme medya kendiliğinden indüklenen erken nöron soy ayırt etmek için üzerinde BMS hücreler kültürlü ise kollajen türüyle kaplı üzerinde BMS hücreleri inkübe hydrogels kas veya kolajen kemik doku, benzer bir sertlik ile erken soy içine farklılaşma miyositler ve dokusunu, sırasıyla, 2-B polyacrylamide hydrogels3,5tarihinde ikna etmek için bulunamadı. Pek çok araştırmacı farklılaşma kök hücre kaderi araştırdık kültürlü polyacrylamide üzerinde kollajen ile immobilize hydrogels tip ı12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21.1,bazı çelişkili raporlar belirtilmelidir ancak,18,22,23,24 var Engler tarafından önerilen tanınmış fikir için vd. 5 bunun nedeni Engler'ın fikir5 sadece polyacrylamide hydrogels üzerinde geliştirilmiştir ve sonuçları belirli özelliklerini biomaterial (polyacrylamide) ve değil sadece fiziksel işaret (sertlik) ortaya çıkmış olmasıdır biomaterial. Bu nedenle, hangi-ebilmek var olmak güdümlü sertlik hydrogels polietilenin tarafından hidrojel, başka bir tür geliştirmek önemlidir. Bu amaçla, bioinert hydrogels, polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking derecesi ile bir değişen crosslinking saat25, tarafından kontrol farklı bir sertlik ile hazırlanmıştır geliştirilmiştir 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. kök hücreleri ekstrasellüler matrisler (ECMs) ve oligopeptides ile aşılı P-IA hydrogels yanı sıra nonmodified P-IA hydrogels ekili. Bir önceki çalışma25içinde insan hematopoetik kök hücreleri (hHSCs) göbek kordon kanı, P-IA hydrogels üzerinde nerede fibronektin veya bir chowing türetilen 30 kPa depolama modülü 3 kPa arasında değişen farklı sertlik değerleri ile ekili fibronektin (CS1, EILDVPST) P-IA hydrogels aşılı. Yüksek ex vivo hHSCs kat genişlemesi CS1 veya 12 kPa 30 kPa-25arasında değişen bir ara sertlik görüntülenen fibronektin ile aşılı P-IA hydrogels gözlendi.

İnsan ES ve IPS hücre ECMs, vitronectin veya onların pluripotency korumak için laminin gibi belirli bağlama gerektirdiği için insan IP ve ES hücreleri geleneksel doku kültürü polistiren (TCP) yemekleri33,34 üzerinde ekili olamaz uzun vadeli kültür sırasında. Bu nedenle, chowing aşılı P-IA hydrogels en iyi sertlik özelliklere sahip olan birkaç yapılar tasarlanmış ve oluşumları tek bir zinciri, tek bir zinciri ile ortak bir segment, bir çift zincir ortak bir kesimi ve dallı türü ile hazırlanan zincir32. Chowing dizileri ECMs integrin ve glikozaminoglikan bağlayıcı etki alanlarından seçildi. Yaklaşık 25 kPa depolama modülü olan vitronectin elde edilen oligopeptides ile bir çift zincir veya ortak segment, aşılı P-IA hydrogels insan ES ve IPS hücreleri uzun vadeli kültür xeno-Alerjik ve kimyasal altında 12 pasajlar için desteklenen tanımlanmış koşulları32. Ortak segment ve hücre adezyon molekülleri hydrogels üzerinde çift zincirle yayılması kolaylaştırdı ve pluripotency insan ES ve IPS32hücreleri. Burada, P-IA hydrogels (ile 10 kPa bir depolama modül için havada ıslak şartlar altında ölçülen 30 kPa) hazırlanması için bir protokol olan ve olmayan oligopeptides aşılı veya ECMs açıklanmıştır. Nasıl kültür ve birkaç kök hücreleri (amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP'leri hücreleri dahil) geçiş gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada deneylerde Tayvan Landseed hastane (IRB / 13 / 05) ve ulusal merkez Üniversitesi etik komiteleri tarafından kabul edildi. Tüm deneyler bu çalışma sırasında tüm alakalı ve uygun hükümet ve kurumsal kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapılmıştır.

1. çözüm ve medyası hazırlama

  1. Polimer arıtma
    1. P-IA karboksilik asit grubunun derecesi ile hidroliz ile arındırmak > %96,5 P-IA etanol ile yıkama tarafından. Bir 500 mL konik ölçek P-id 20 g 200 mL etanol içine yerleştirin ve her 8-10 h 24-30 h. Exchange ile taze etanol etanol için manyetik karıştırıcı üzerinde tahrik.
    2. P-id etanol tarafından filtrasyon Büchner huni kullanarak kaldırın.
    3. P-IA vakum kurutma için 24 saat oda sıcaklığında tarafından kuru.
      Not: tuzak etanol P-IA. üzerinden büyük miktarda çıkarıldıktan sonra tıkalı olma eğilimindedir çünkü bu tuzak vakum kurutma sistemi (etanol kaldırma tarafından) sık sık, özellikle ilk birkaç saat sırasında temizlemek için tavsiye edilir
  2. P-IA çözüm hazırlanması
    Not: polimer yavaşça çözücü (su) ekleyebilirsiniz. Bu P-IA çözücü eklemek için en az 15 dk almak için tavsiye edilir. Çözücü polimer eklediyseniz, polimer tamamen çözülmüş değil. Patlayıcı P-IA çözümü kaynama oluşturmamanız için dikkatli olun. P-IA çözüm hazırlanması sırasında koruyucu gözlük kullanın. P-IA çözüm Isıtma işlemi kristal P-IA. çözülmeye esastır Önerilen (ve tercih edilir) P-IA çözüm nispeten temiz deneysel bir odada, mümkünse hazırlamak için.
    1. P-IA 0,050 ağırlığı % konsantrasyon hücre ekimi deneme için veya bir 0,50 ağırlığı % konsantrasyon rheometer ölçüm için saf suda çözülür: Örneğin, P-IA 50 mg 100 mL saf su için hücre kültürü ve P-IA 500 mg 100 ml de dağıtılması iyonize (DI) su rheometer ölçümler için.
    2. Sıcak plaka üzerinde 1 h için P-IA çözüm tahrik.
      Not: patlayıcı kaynar önlemek için çözüm üzerinde 95 ° c ısı değil Patlayıcı polimer çözüm yüksek bir ısıda kaynama cilt yanıkları oluşturabilir. Bu nedenle, P-IA Isıtma çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve P-IA çözüm sıcaklığını Isıtma sırasında izleyebilirsiniz.
    3. P-IA çözüm ortam sıcaklığında soğutmalı sonra P-IA çözüm 48 h. bırak sıcak P-IA çözüm Isıtma olmadan sıcak tabakta için oda sıcaklığında kışkırtmak ve sonra olmadan ajitasyon, oda sıcaklığında 20-24 h hava kabarcıkları olduğundan emin olmak için bırakın P-IA çözümde mevcut değil.
  3. Crosslinking çözüm hazırlanması
    1. Crosslinking çözüm 1.0 ağırlık % oxazolidin %25 sulu oxazolidin çözüm oluşturmak olsun, %20.0 Na2kilo kadar%4 99 kullanımı > saflık ve 1.0 ağırlık % H2kadar4. Örneğin, bir 6 veya 12 için hücre kültür tabak iyi, oxazolidin çözüm, 2 g sodyum sülfat ve sülfürik asit 100 µL 100 µL 10 mL saf su ekleyin.
  4. İnsan ES/PS hücre kültür medya
    Not: Kullanım DMEM/F12 medya, temel 6 medya ve hücre kültürü için temel 8 medya.
    1. 50 X temel 8 özel sayı: çözüm için yavaş yavaş gecede 4 ° C buzdolabında çözdürme tarafından dondurulmuş dönün.
    2. 50 X temel 8 özel sayı: temel 8 Bazal medya bir şişe içine bir şişe ekleyin. Küçük aliquots (50 mL her) 100 mL aralıklarla tüpler içine medya ayrı sonra medya-20 ° C'de depolayın

2. P-IA hidrojel yemek hazırlama

  1. P-IA film hazırlık
    1. 1 mL aliquot P-IA çözümün bir 35 mm TCP tabak içine enjekte ve temiz bir Bank bir P-IA film için 2 gün 45 ° C fırında Bulaşık Makinası.
  2. P-IA hidrojel yemekleri polietilenin
    1. P-IA filmleri 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 ve 48 saat için bir sulu crosslinking çözüm içine bırakın.
      Not: ' P-IA -X' P-IA hidrojel çapraz X h (örneğin, 12 h) için (örneğin, P-IA-12 h) başvurur.
    2. Crosslinking sonra ortam sıcaklığında P-IA hydrogels saf su ile durulayın ve daha sonra temiz bir Bank ortam sıcaklığında saf suda hydrogels tutmak.
    3. P-IA hydrogels 1 dk bir 75,0 volume/volume% etanol çözümde daldırma tarafından sterilize etmek, altı kez P-IA hydrogels saf suda yıkayın ve sonra P-IA hydrogels hücre tarım için kullanılan kadar saf su bulundurun.
  3. P-IA hidrojel yemekleri chowing veya ECM ile aşılı hazırlanması
    1. P-IA hydrogels 1 mL daldırma 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) - içeren sulu bir çözüm üzerinden etkinleştirinN'- ethylcarbodiimide hidroklorid (EDC) ve 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) 1 37 ° C veya 4 h s 4 ° C'de
    2. Durulama fosfat 1 mL ile P-IA hydrogels tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) 3 kez ve P-IA hydrogels 4 ° C'de 24 h için chowing (100-1.500 µg/mL) veya ECM (10-100 µg/mL) 1 mL içeren bir PBS çözümde bırakın
      Not: Chowing dizileri ve kök hücre kültürü için kullanılan ECMs Tablo 1' de özetlenmiştir.
    3. Chowing veya ECM aşılama sonra 3 kez P-IA hydrogels saf su ile yıkayın.
      Not: Y µg/mL ile chowing veya ECM (Z) aşılı P-IA hydrogels bundan sonra P olarak adlandırılır-IA -Xh -Z veyaBurada X crosslinking saat (h) gösterir, P-IA-Xh -Z-Y, Y gösterir chowing veya ECM, konsantrasyon ve Z farklı chowing veya ECM gösterir.

3. insan ES/IPS hücre kültürü

  1. Geçit ve farklılaşmamış insan ES ve IPS hücreleri bakım yöntemi
    1. İnsan ES (örneğin, WA09 veya H9) korumak hücreleri veya insan IP'leri (örneğin, HS0077) temel 8 medya standart insan ES/IPS kullanarak 6 cm yemekler Matrigel üzerinde hücreleri hücre kültür protokolleri28,32.
    2. Kuluçkaya birleşmesi yakınındaki insan ES/IPS hücrelerle 2.0 mg/mL dispase II DMEM/F-12 medya için 8-10 dk. 37 ° C'de ve insan ES/IPS hücreleri iki kez DMEM/F12 medya ile durulayın.
    3. DMEM/F-12 medya insan ES/IPS hücre kültür yemekleri, 2 mL ilavesi ayırdıktan sonra hücre kazıyıcı kullanarak zayıf yapisan kolonileri ya da pipetting tarafından.
    4. 15 mL aralıklarla tüpler içine insan ES/IPS hücreleri toplamak ve 37 ° C'de 5 min için 160 × g de insan ES/IPS hücreleri santrifüj kapasitesi
    5. Santrifüjü sonra DMEM/F12 atmak ve 1 mL E8 medya insan ES/IPS hücrelerinde askıya alma ve sonra hücre yoğunluğu saymak için bir hücre karşı kullanma.
    6. ES/IPS hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels chowing veya ECM ile aşılı) uygun yoğunluk ayarı (x 104 hücreleri cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 1-5) sonra aşılamak.

4. insan ES/IPS hücre karakterizasyonu karakterizasyonu

  1. Alkalen fosfataz (AP) etkinliği değerlendirilmesi
    1. Standart alkalin fosfataz Canlı Boyama kullanarak insan ES/IPS hücreleri alkalen fosfataz (AP) etkinliğini ölçmek.
  2. Immunostaining
    1. Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 ve Oct3/4 immunostaining hES ve kalça hücreleri üzerinde geleneksel iletişim kuralı28,32takip pluripotency araştırmak için gerçekleştirin.
    2. Hangi insan ES/IPS hücreler kültürlü ve daha sonra yemekler 4 ° C'de hücreler düzeltmek için 15 dakika kuluçkaya 24 her iyi çanak içine %4 (birim/birim) paraformaldehyde 0.5 mL hacmi ekleyin.
    3. Her şey paraformaldehyde çözümden Aspire edin. Daha sonra PBS 1 mL de başına ekleyin ve hücreleri durulama için PBS Aspire edin. Yıkama işlemi 3 kez uygulayın.
    4. Hücre zarlarında % 0,3 (birim/birim) PBS Triton-X 100 çözümde, oda sıcaklığında 30 dk için 0.5 mL ekleyerek permeabilize.
    5. Triton-X 100 çözüm Aspire edin ve %2 (ağırlık/hacim) sığır serum albumin (BSA) 300 µL PBS (arabellek kütük parçası) her kuyunun içine ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    6. Pipetting tarafından engelleme arabellek kaldırın ve daha sonra istediğiniz birincil antikorlar ekleyin (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) ve Tra-1-81(1:200) tarafından pipet, bkz: Tablo 2) burada 1: 200 gösterir antikorlar seyreltilmiş her kuyuya PBS ile 200-fold ve bir gün 4 ° C'de inkübe
    7. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve %0,05 300 µL hücrelerle yıkayın ara 20 PBS çözüm 3 kat, oda sıcaklığında.
    8. İkincil antikorların 300 µL ekleyin (1: 200, Tablo 2' ye bakın), birincil IgG alt türü için belirli olan, %2 (ağırlık/hacim) BSA çözümünde her şey ve karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    9. %0,05 300 µL hücrelerle yıkama ara 20 3 kat, oda sıcaklığında karanlık PBS çözümde.
    10. Lekeli hücreleri floresan mikroskopi veya confocal mikroskobu tarafından analiz.
  3. Embryoid vücut oluşumu
    1. Embryoid vücut (EB) oluşumu, pasajlar 10 ve 20 tarafından insan ES/IPS hücreler Pluripotent araştırmak.
      Not: % 80'i 6-şey tabak içinde EB oluşumu hazırlanması için yeterli görkemlidir.
    2. İnsan ES veya IP'leri hücreleri 2 mL DMEM/F-12 medya ile iki kez durulama ve temel 6 medya 1,5 mL hücrelerde bırakın.
    3. % 80 Konfluent insan ES veya IP'leri hücreleri 200 µL ipuçlarını kullanarak yaklaşık 32 parçalar halinde kesin. Daha sonra bulaşıkları hücrelerinden hücre kazıyıcı kullanarak bağlantısını kesin.
    4. İnsan ES/IPS hücreleri ve transfer bir 6-şey ultralow eki tabak içine toplamak.
    5. Temel 6 medya eski medya pipetting ve 2 günde taze medya ekleme değişimi.
      Not: süspansiyon hücrelerde % 5 CO237 ° C'de 2 hafta kültür.
    6. EBs rastlanılmaması askıya sonra temel 6 medyada, EBs 24-şey TCP yemekleri 0.1 ağırlığı % jelatin ile kaplı kültür aktarmak ve hücrelerin temel 6 medya için ek bir hafta kültür.
    7. İşaretçileri üç embriyonik germline katmanlardan elde edilen hücre karşı antikor hücrelerle leke [AFP (endoderm), GFA (ektoderm), β III-tübülin (ektoderm) ve SMA (mesoderm)] ve yukarıda açıklanan immunostaining yöntemi tarafından hücreleri değerlendirmek.
  4. Teratoma oluşumu
    1. İnsan ES/IPS hücreler Pluripotent teratoma oluşumu, pasajlar 10 ve 20 tarafından araştırmak.
      Not: % 80 izdiham içinde 6-şey plakaları yakınındaki 5 yemekleri teratoma oluşumu için yeterli (en az 3 x 106 hücre teratoma oluşumu deneyler için gerekli).
    2. 2 mL DMEM/F-12 medya hücrelerle iki kez durulayın ve 1.5 mL DMEM/F-12 medya hücre kültür yemekleri için ekleyin.
    3. Yaklaşık % 80'i Konfluent insan ES veya IP'leri hücreleri 200 µL ipuçlarını kullanarak yaklaşık 32 parçalar halinde kesin. Daha sonra bulaşıkları hücrelerinden hücre kazıyıcı kullanarak bağlantısını kesin.
    4. 15 mL aralıklarla tüp içine insan ES/IPS hücreleri toplamak ve 37 ° C'de 5 min için 160 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    5. Santrifüjü sonra hücre topakları içinde 100 µL askıya DMEM/F12 ve sonra karışımı hücre yemi ile 100 µL Matrigel (1:1 hacim oranı).
    6. Hücre süspansiyon-20 ° C önceden soğutulmuş enjektör aktarın. Enjekte, toplam, en az 3 × 106 hücre subkutan erkek NOD-SCID (başını SALLAMAK. CB17 -Prkdascid/JNarl) fareler (5-8 hafta).
    7. 5-8 hafta sonra teratomas incelemek, %4.0 (ağırlık/hacim) paraformaldehyde çözüm fix ve 4 ° C'de depolayın
    8. Parafin ile teratoma düzeltmek, parafin gömülü teratomas dilim ve leke Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile bir standart iletişim kuralı28,32kullanarak.
      Not: Araştırmacılar teratomas dilim parafin gömülü teratomas, parafin ile düzeltmek ve örnek ile H & E, genellikle patoloji Bölümü hastanelerde kullanılan leke için şirket sabit teratoma doku gönderebilir.
  5. İnsan yağ kaynaklı kök (ADS) hücre kültürü
    1. Sıcak kültür medya (DMEM) % 1 antimycotic antibiyotik ve % 10 fetal sığır serum (FBS) içeren, tripsin-EDTA ve PBS %0.25 37 ° c kullanmadan su banyosu önce.
    2. İnsan reklamlar hücreleri tarafından PBS pipetting 10 mL nerede hücreler kültürlü her 6 cm kültür çanak içine yıkayın.
    3. 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0,25) 6-cm kültür yemekleri ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de çözüm kuluçkaya.
    4. 6 cm kültür yemekleri hücreler ayrılır onaylamak için mikroskobu altında hücrelerde gözlemlemek.
    5. 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri toplamak ve kültür ortamının eşit bir birim eklemek (DMEM % 1 antimycotic antibiyotik ve % 10 içeren FBS) santrifüj tüpü tripsin-EDTA nötralize içine.
    6. 37 ° C'de 5 min için 250 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    7. Santrifüjü sonra süpernatant dikkatle pipetting tarafından hücre Pelet bozmadan atmak.
    8. Kültür medya hücrelerde resuspend ve sonra hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels ve oligopeptides ve ECM olmadan aşılı) uygun yoğunluğu (5-10 cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 103 hücre x), temel olarak belirler.
  6. İnsan amniyotik sıvı kök (AFS) hücre kültürü
    1. Sıcak yetiştirme ortamı (DMEM/MCDB 201 (2:3) içeren %20 fetal sığır serum (FBS), 5 ng/mL bFGF ve % 1 antimycotic antibiyotik), tripsin-EDTA ve PBS %0.25 37 ° c kullanmadan su banyosu önce.
    2. İnsan AFS hücresi tarafından PBS nerede hücreler kültürlü her 6 cm kültür tabağına pipetting 10 mL yıkayın.
    3. 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0,25) 6-cm kültür yemekleri ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    4. 6-cm kültür yemekleri hücreleri onaylamak için mikroskobu altında hücreler ayrılır gözlemlemek.
    5. 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri toplamak ve tripsin-EDTA nötralize etmek için santrifüj tüpüne kültür ortamının (DMEM/MCDB 201 (2:3) içeren % 20 fetal sığır serum (FBS), 5 ng/mL bFGF ve % 1 antimycotic antibiyotik) eşit bir birimi ekleyin.
    6. 37 ° C'de 5 min için 250 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    7. Santrifüjü sonra süpernatant dikkatle pipetting tarafından hücre Pelet bozmadan atmak.
    8. Yetiştirme ortamı hücrelerde resuspend ve sonra hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels ile ve ezelî chowing ve ECM aşılı) uygun yoğunluğu (5-10 cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 103 hücre x), temel olarak belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P-IA hydrogels ECM kaynaklı chowing (oligoECM) ile aşılı veya ECM farklı elasticities ile hazırlanan tepki düzeni takip ederek şekil 1A', görüldüğü gibi oligoECM (şekil 1B) farklı türleri kullanarak. Hydrogels elasticities uygulanan crosslinking yoğunluğu (zaman) (şekil 1 c) tarafından düzenlenmiş. P-IA hydrogels 25,3 kPa (24 h crosslinking saat) bir depolama modülü olan vitronectin elde edilen oligopeptides ile aşılı desteklenen insan IP'leri ve ES hücreler için üzerinde uzun vadeli kültür 10-20 pasajlar. Özellikle, ortak bir kesimi (P-IA-24 h-VN1G) ile P-IA hydrogels aşılı veya çift zincir (P-IA-24h-VN2G) insan IP'leri ve oligoECM (200-500 μg/mL) nispeten daha düşük bir konsantrasyon daha P-IA-VN1 ile hazırlanmıştır ES hücreler Pluripotent desteklenen hydrogels, oligoECM yüksek konsantrasyon kullanarak gerektirdiği (> 1000 μg/mL) insan pluripotency korumak için28,32IP'leri ve ES hücreleri.

İnsan ES hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) kültürü için diğer sentezlenmiş kaplanmış malzeme (örneğin, Synthemax II) kaplama yemekleri ve P-IA-24 h-VN1 hidrojel yemekleri (Şekil 2)28kaymıştır yapılmaktadır. Piyasada bulunan kaplama yemekler ise onların pluripotency P-IA-24 h-VN1-1000 üzerinde insan ES hücreleri korumak olabilir daha kolay, özellikle koloniler (şekil 2a ve 2 c) arasındaki sınırda ayırt etmek için bulunamadı üzerinde kültürlü insan ES hücreleri Farklılaşmış hücre morfolojisi insan ES hücre P-IA-24 h-VN1-1000 hidrojel yemekleri (2b şekil ve 2d)28üzerinden gözlenen değil çünkü hidrojel yemekleri.

İnsan ES (3A rakam) ve P-IA - 24 h hydrogels kültürlü IP'leri (3B rakam) hücreler Pluripotent (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), oligoECM ile aşılı geleneksel rekombinant vitronectin () yanı sıra rVitronectin)-boyalı yemekleri, pluripotent maker proteinleri (MicroRNAs, Sox2 ve Oct3/4) ifade üzerinde göre değerlendirildiğinde hücreleri üzerinde 1032geçişleri için temel 8 medya kullanarak xeno-Alerjik koşullarında her yemeğin kültürlü sonra. Bu Pluripotent proteinler tatmin edici insan IP'leri ve ES hücreleri rVitronectin kaplı yemekleri xeno-Alerjik durumlarda yanı sıra, P-IA hydrogels oligoECM ile aşılı kültürlü ifade edildi.

Hücrelere farklılaşma yetenek değerlendirilmesi üç germ katmanları vitro (EB oluşumu) türetilmiş ve in vivo (teratoma oluşumu) ekimi sentetik üzerinde sonra insan ES ve IPS hücreler Pluripotent doğrulamak için gereklidir Biyomalzeme. Bu nedenle, insan ES hücreleri (şekil 4) ve insan IP'leri hücreleri (şekil 5) P-IA-oligoECM hidrojel yemekleri üzerinde ekili ve rekombinant vitronectin kaplı yemekleri 10 geçişleri ve daha sonra hücreleri için süspansiyon forma kültürlü EBs. EBs daha fazla jelatin kaplı yemekleri yemekleri (şekil 4A ve şekil 5A)32üzerinde yaymak için yetenek hücrelerin gözlemlemek bir kaç hafta ekili. Farklılaştırılmış insan ES (şekil 4B) ve IP'leri (şekil 5B) hücreleri vardı üç germ katmanlardan elde edilen proteinler için immunostained: alpha-fetoprotein (AFP, endoderm), düz kas aktin (SMA, mesoderm) ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin ektoderm)32. İnsan IP ve ES hücreleri bulundu tüm üç germ pluripotency insan IP'leri ve ES hücre, başka bir doğrulama gösteren katmanlardan, türetilmiş hücre içine ayırt etmek için düz-den sonra yetiştirme xeno ücretsiz olarak oligoECM ile aşılı P-IA hydrogels üzerinde uzun vadede koşulları (geçit > 10 pasajlar).

İnsan ES hücreleri ayırt etme yeteneği üç germ Katmanlar içinde vivo (teratoma oluşumu tahlil) kaynaklı hücrelere de değerlendirilmiştir. P-IA-VN1-1000 (şekil 6A) ve P-IA-VN2C-1000 (şekil 6B) 10 pasajlar için xeno-Alerjik kültür koşullarında ekili, insan ES hücreleri subkutan başını SALLAMAK-SCID fareler32enjekte edildi. Teratomas fareler izole edildi ve teratoma doku bölümler sabit ve H & E (şekil 6A ve 6B)32ile lekeli. Teratomas tüm üç germ katmanlardan kaynaklanan hücreleri varlığını görüntülenen: endoderm (bağırsak epiteli, şekil 6A(b) ve 6B(b)), mesoderm (kıkırdak, şekil 6A(c) ve 6B(c)) ve ektoderm () neuroepithelium, şekil 6A(d); Retina pigment epiteli, şekil 6B(d)). Bu sonuçlar insan ES hücreleri P-IA-24 h-VN1-1000 ve P-IA-24 h-VN2C-1000 üzerinde 10 pasajlar olabilir için xeno-Alerjik koşullarında kültürlü onların pluripotency korunur gösteren üç germ katmanlardan menşeli hücrelerine ayırt etmek tavsiye ederim vivo.

İnsan AFS hücresi de değiştirilmemiş P-IA hidrojel, P-IA-oligoECM hidrojel ve TCP yemekleri genişleme medya kültürlü. Şekil 7 gösterir kültür elasticities ile P-IA ve P-IA-oligoECM hidrojel yemekler dört gün sonra ekili insan AFS hücre türleri Morfoloji (E') 12,2, (çapraz zaman 6 h =), 18.3 (crosslinking saat 12 h =), 25,3 (çapraz zaman = 24 s) ve 30,4 kPa (crosslinking saat 48 h =) bir oligoECM konsantrasyon 0-50 μg/mL olarak TCP kullanarak yemekleri sertliği303-12 not ortalaması ile.

İnsan AFS hücresi değil çoğalırlar P-IA hidrojel yemekleri veya oligoECM olmadan insan AFS hücresi veya oligoECM olmadan prolifere, ancak P-IA hydrogels sertliği daha az 11 kPa (PV - 2 h, PV-2 h-Y, PV - 4 h ve PV-4 h-Y), zaman zaman E' P-IA - 6 h ve PV-IA-6 h-COL1 hidrojel yemekleri dışında 12 kPa daha fazlaydı. P-IA - 6h ve P-IA-6h-COL1 yumuşak hücre kültür Biyomalzeme hücre döngüsü ilerleme30durdurmak çünkü insan AFS hücre kültür için uygun değil gibi görünmektedir.

Yukarıdaki sonuç P-IA hidrojel yemekler uzun vadeli kök hücre ekimi için uygun bir malzeme ve Pluripotent kök hücre seçimi belirli sertlik ve oligoECM, hem de oligoECM en uygun tepki konsantrasyon tarafından korumak öneririz (oligoECM yüzey yoğunluğu).

Figure 1
Şekil 1: P-IA hydrogels oligoECM veya ECM ile aşılı hazırlanması. (A)düzeni tepki ECM ve ECM kaynaklı chowing (oligoECM) ile aşılı P-IA hydrogels için29. Telif hakkı 2015. Kimya Royal Society izniyle uyarlanmıştır. (B) tasarım ve P-IA hydrogels aşılı oligopeptides dizisi. Tek zincir oligopeptides (P-IA-BSP, P-IA-VN1 ve P-IA-HBP1) zincir oligopeptides ortak bir kesimi (P-IA-VN1G) ile tek ve çift zincirleri (P-IA-VN2C ve P-IA-HBP2C) ve ECM (P-IA-ECM) P-IA hydrogels32aşılı. Bir Creative Commons Attribution lisansı uyarlanmış. (C) crosslinking29farklı dönemlere göre hazırlanan sertlik P-IA hydrogels. Telif hakkı 2015. Kimya Royal Society izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: insan ES hücre karşılaştırılması kültürlerin P-IA-24 h-VN1 hydrogels ve ticari olarak mevcut kaplama yemekleri. Morfoloji insan ES hücreleri ekimi fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) üzerinde kaymıştır piyasada bulunan kaplama yemekleri (a, b) ve geçiş 1 P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) yemeklerinin üzerinde ekili insan ES hücre (WA09) ekimi piyasada bulunan kaplama yemekleri veya PVA-24h-VN1-1000 yemekleri. Kırmızı oklar farklılaştırılmış insan ES hücreleri gösterir. Ölçek Çubuklarõn 50 µm (a, b) ve 100 µm (c, d)28. Bir Creative Commons Attribution lisansı uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: insan ES ve IPS pluripotency karakterizasyonu hücreleri üzerinde farklı chowing tasarımları ile aşılı P-IA hydrogels. (A)ifade (yeşil) MicroRNAs (kırmızı), Sox2 pluripotency proteinlerin ve Oct3/immunostaining çift Hoechest33342 ile nükleer (bir) kültür sonra (mavi) etiketleme için boyama ile analiz 4 (yeşil) insan ES (H9) hücreleri üzerinde P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 ve (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels ve (d) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-kaplı yemekleri 10 pasajlar için xeno-Alerjik koşullarda. (B) ifade pluripotency proteinlerin MicroRNAs (kırmızı), Sox2 (yeşil) ve Oct3/4 (yeşil) çift Hoechest33342 ile nükleer (bir) kültür sonra (mavi) etiketleme için boyama ile immunostaining tarafından analiz insan IP'leri hücreleri üzerinde P-IA-24 h-VN1-1000 hidrojel, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hidrojel ve (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-hydrogels kaplı yemekleri xeno-Alerjik koşullar altında 1032geçişleri için. Ölçek çubuklar 50 µm. uyarlama bir Creative Commons Attribution License altında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: insan ES ayırt etme yeteneği karakterizasyonu hücreleri üzerinde farklı chowing tasarımları ile aşılı P-IA hydrogels. (A)Morfoloji EBs insan ES (H9) hücreleri üzerinde (bir) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) kodlamayla P-IA-24 h-VN1G-1000 ve (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels sonra ve (d) rekombinant farklılaşmış hücre vitronectin (rVitronectin)-kaplı yemekleri 10 pasajlar için xeno-Alerjik koşullarda. Ölçek çubuklar 100 µm. (B) gösterir ifade ektoderm protein (GFAP'nin, kırmızı), mesoderm protein (SMA, yeşil) ve endoderm protein (AFP, yeşil) ile Hoechest33342 için çift boyama ile immunostaining tarafından değerlendirilen insan ES (H9) hücrelerinde nükleer P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000 ve P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels ve rekombinant vitronectin (rVitronectin) kültürü sonra (mavi) etiketleme-kaplı yemekleri xeno-Alerjik koşullar altında 1032geçişleri için. Ölçek çubuklar 50 µm. uyarlama bir Creative Commons Attribution License altında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: insan IP'leri ayırt etme yeteneği karakterizasyonu hücreleri üzerinde farklı chowing tasarımları ile aşılı P-IA hydrogels. (A)Morfoloji EBs hücre ayrıştırılan insan IP'leri (HPS0077) hücrelerden (bir) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels ve (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin) kültürü sonra- kaplamalı yemekleri 10 pasajlar için xeno-Alerjik koşullarda. Ölçek çubuklar 100 µm. (B) gösterir ifade ektoderm protein (GFAP'nin, kırmızı), mesoderm protein (SMA, yeşil) ve endoderm protein (AFP, yeşil) ile Hoechest33342 için çift boyama ile immunostaining tarafından analiz insan IP'leri (HPS0077) hücrelerdeki nükleer (bir) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels ve (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin) kültürü sonra (mavi) etiketleme-kaplı yemekleri xeno-Alerjik koşullar altında 1032geçişleri için. Ölçek çubuklar 50 µm. uyarlama bir Creative Commons Attribution License altında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: İnsan ES (H9) ayırt etme yeteneği karakterizasyonu içinde vivo P-IA-24 h-VN1 ve P-IA-24 h-VN2C hydrogels kültür sonra hücreler. (A) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels xeno-Alerjik hücre kültür koşullar altında üzerinde sonra 10 pasajlar kültür sonra (bir) enjeksiyonla teratoma resmi insan ES ile hücreleri. Dokular (b) bağırsak epitel (endoderm) dahil olmak üzere, (c) kıkırdak (mesoderm) ve (d) neuroepithelium (ektoderm) görülebilir. (B) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels xeno-Alerjik hücre kültür koşullar altında üzerinde sonra 10 pasajlar kültür sonra (bir) enjeksiyonla teratoma resmi insan ES ile hücreleri. Dokular (b) bağırsak epitel (endoderm) dahil olmak üzere, (c) kıkırdak (mesoderm) ve (d) retina pigment epiteli (ektoderm)32görülebilmektedir. Ölçek çubuklar 100 µm. uyarlama bir Creative Commons Attribution License altında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: TCP yemekleri üzerinde ekili insan AFS hücresi ve P-IA hidrojel yemekleri veya ECM kaynaklı oligopeptides olmadan kültür 4 gün sonra immobilize morfolojisi. (A)Morfoloji insan AFS hücre TCP yemekleri. (B) Morfoloji insan AFS'nin P-IA - 6 h ve P-IA-6 h -Z (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-COL1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 ve P-IA-6 h-cRGD-50) hidrojel yemekleri hücreleri. (C) Morfoloji hAFCs P-IA - 12 h ve P-IA-12 h -Z hidrojel yemekleri (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-COL1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 ve P-IA-12 h-cRGD-50). (D) Morfoloji insan AFS'nin P-IA - 24 h ve P-IA-24 h -Z (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-COL1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 ve P-IA-24 h-cRGD-50) hidrojel yemekleri hücreleri. (E) Morfoloji insan AFS'nin P-IA - 48 h ve P-IA-48 h -Z (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-COL1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 ve P-IA-48 h-cRGD-50) hidrojel yemekleri hücreleri. 100 μm kalınlığında30ölçek Çubuklarõn. Telif hakkı 2017. Kimya Royal Society izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Malzemenin adı / ekipman Kısaltma
GTPGPQGIAGQRGVV SÜTUN1
GACRGDCLGA Döngüsel RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Fibronektin FN

Tablo 1: ECM kaynaklı chowing dizileri ve bu çalışmada kullanılan ECM.

Antikorlar Konsantrasyonu (seyreltme oranı)
MicroRNAs 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Düz kas aktin 1: 200
(α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP'NİN 1: 200
Alexa Fluor 555-konjüge keçi Anti-fare 1: 200

Tablo 2: immunostaining bu çalışmada kullanılan antikor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P-IA-oligoECM ve P-IA-ECM hydrogels değişen sertlik ile uzun vadeli genişlemesi insan ES ve IPS hücreleri onların pluripotency xeno-Alerjik koşullar üzerinden pasajlar, yanı sıra insan AFS hücresi, reklamlar hücre kültürünü korumak için geliştirilmiştir, ve hematopoetik kök hücre25,28,32. P-IA hydrogels oligoECM ile immobilize hücre kültür malzeme türleri kök hücreler gibi Primer hücre çoğalması ve farklılaşma kaderi üzerinde etkisi araştırmak için hücre ekimi malzemeleri için mükemmel bir aday olan ve kanser hücreleri.

P-IA çözüm üzerinde yemekler artığını P-IA çözüm şeffaf olmalıdır. Crosslinking zaman P-IA hydrogels crosslinking yoğunluğunu karar verir. P-IA hydrogels 24 h polietilenin insan ES/IPS hücre kültürü için en uygun hydrogels üretir. Herhangi bir oligopeptides ve ECMs P-IA hydrogels nerede ücretsiz amino grupları25,28,29,30,31, oligopeptides ve ECMs var bu iletişim kuralını kullanan aşılı 32. oligopeptides veya ECMs yüzey yoğunluğu x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) ölçümleri tarafından ne kadar XPS yüzey yoğunluğu bir mutlak değeri mevcut değil, ancak oligopeptides veya ECMs-ebilmek var olmak güvenli bir şekilde tespit edilebilir analiz.

Hangi depolama modülü itibaren crosslinking süreye bağlı olarak 3-30 kPa var P-IA hydrogels ve aşılı oligopeptides veya ECMs olmadan hazırlanabilir. Daha az depolama modülü 3 kPa daha ve daha yüksek depolama modülü daha 30 kPa25,28,29,30,31,32P-IA hydrogels hazırlamak oldukça zordur. Bu P-IA hydrogels kimyasal polietilenin mevcut hidrojel hazırlama yöntemi kısıtlamasıdır. Ancak, mevcut iletişim kuralı olan Primer hücre, kanser hücrelerini veya kök insan ES ve IPS hücreleri de dahil olmak üzere hücre kültürünü destekleyebilir, ancak polyacrylamide ile yapılan değil farklı esneklik, sahip hydrogels, başka bir seçenek sağlar. Özellikle, insan ES ve IPS hücreleri üzerinde polyacrylamide hydrogels çoğalırlar olamaz ama Şekil 2, şekil 3, şekil 4, şekil 5ve şekil 6gösterildiği gibi P-IA hydrogels prolifere. Gerçekten de, P-IA-24h-VN1 hydrogels insan ES hücre kültürü piyasada bulunan kaplama yemekleri (Şekil 2) iyi desteklenen. Bu nedenle, P-IA hydrogels insan ES ve IPS hücre kültürü için tercih edilir.

Nerede insan ES ve IPS hücreleri belirli soy cardiomyocytes35, retina pigment epiteli36, β hücrelerinin6ve TH gibi hücrelerin içine farklılaşmış hydrogels en iyi esnekliğini araştırmak için ilginç olabilir + 6 rejeneratif tıp gelecekteki gelişimi için hücreler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma kısmen grant numaraları'nın altında 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 ve 104-2221-E-008-107-MY3 Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da Tayvan Landseed hastane Projesi (NCU-LSH-105-A-001) tarafından desteklenmiştir. Bilimsel araştırma (sayı 15K 06591) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya için bir Grant-in-Aid da kabul edilmektedir. A. Higuchi lisansüstü çalışmalar ve araştırmalar, Kral Suud Üniversitesi, Riyad 11451, Suudi Arabistan için uluslararası bilimsel ortaklık programı (ISPP-0062) Yardımcısı Rektörlüğü için kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Biyomühendislik sayı 132 hidrojel indüklenen pluripotent kök hücre embriyonik kök hücre elastikiyet hücre kültürü chowing yüzey değiştirme nanosegment
İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter