Summary
젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.
Abstract
능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 불행히도, 게놈 생성 또는 transcriptomic 라이브러리에 대 한 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 그리고 연구원은 특정 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 젤-seq 연구원은 DNA와 RNA 100-1000 셀 하이드로 겔 간단한 장치를 사용 하 여 시작에 대 한 라이브러리를 동시에 준비 하 여이 문제를 해결 합니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 우리 설계 젤-seq; 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있도록 많은 유전학 실험실 이미 젤-seq 장치 제작을 재현 하는 필요한 장비. 우리의 프로토콜 사용 하 여 두 전체 사본 증폭 (WTA)에 대 한 키트 일반적으로 사용 되 고 라이브러리 준비는 연구원에 게 이미 익숙할 것 또한 라이브러리 생성 하 게놈 그리고 transcriptomic에 정통한. 우리의 접근 연구원을 무시할 수 추가 비용와 분할 하지 않고 단일 샘플에 DNA와 RNA 시퀀싱의 힘을가지고 있습니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 (NGS) 유전학 연구는 실시 방법에 깊은 영향을 했다. 연구원은 한 번 전체 종의 게놈 시퀀싱에 초점을 맞춘, 단일 종양 또는 심지어 한 실험에 있는 단일 셀의 게놈을 시퀀싱 수 지금이. 1 NGS는 또한 했다 비용 효율적인 셀 데이터는 transcriptome로 알려진 컬렉션 내 RNA 사본 시퀀싱 하. 능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 2 , 3 , 4 는 불행 하 게도, 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 하 고 연구원은 주어진된 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 시작 샘플 충분히 큰 경우 반으로 나눌 수 있습니다. 그러나 작은 스케일에서, 샘플 분할로 인해 재료의 손실 라이브러리 품질에 영향을 하 고 셀 사이의 재미 있는 변화 밖으로 평균 수 샘플 풀링. 5 또한, 연구팀은 단일 세포 또는 작은 다른 유형의 종양 생 검 등 분할 수 없는 샘플 검사에 점점 관심이 있습니다. 6
이 문제를 해결 하려면 세 가지 프로토콜 최근 개발 된 동일한 시작 샘플에서 DNA와 RNA 시퀀싱 하: 젤-seq7,8G & T-seq 및 박사-seq9. 이 문서는 젤-seq, 동시에 몇 가지 사소한 추가 비용 100 셀으로에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 독점적으로 저가 히드로 매트릭스를 사용 하 여 크기에 따라 분리 하는 기능입니다. 젤-Seq 프로토콜의 핵심 혁신은 RNA에서 DNA의 물리적 분리 이다. 이 분리 electrophoretically polyacrylamide 막이이 분자의 크기 차이 활용 하는의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 맥락에서 이러한 크기 차이 넣어, DNA와 RNA의 이미지로 어떻게 하는 것을 고려: DNA 미크론 단위에 존재 하는 동안 전통적인 현미경을 사용 하 여 볼 수 있습니다, RNA 나노미터 규모로 존재 하 고 cryo 전자 등 복잡 한 기술을 사용 하 여 촬영 해야 합니다 현미경 검사 법입니다. 10
이 프로토콜에서 DNA와 RNA를 분리 하는 접근 방식은 그림 1에 표시 됩니다. 왼쪽된 패널 DNA와 RNA 무료 솔루션 막 근처에 떠 있는 것을 보여줍니다. 전기 분야 적용, 오른쪽 패널에 표시 된 것 처럼, DNA와 RNA는 세포 막을 통해 마이그레이션 유도 전기 이동 힘 경험. 막 속성을 조정 하 여 우리는 RNA에서 DNA를 분리 하는 반 투과성 막을 만들었습니다. DNA 분자는 멤브레인에 대 한 적용 됩니다 하지만 그들의 큰 크기 때문에 가장자리에 얽히게 된다. 작은 RNA 분자, 다른 한편으로, 재구성 고 막 통해 그들의 방법을 짜 다 수 있습니다. Reptation로 알려진이 프로세스는 잔디를 통해 뱀 이동 방법와 비슷합니다. 결국 이러한 RNA 분자는 너무 어려운 작은 고분자에 대 한 두 번째, 고밀도 막 중단 되었습니다 (> 200 기본적인 쌍)을 통해 몸부림. 일단 물리적으로 분리, DNA와 RNA 복구 고 게놈 및 transcriptome에 대 한 정보를 생성 하는 처리. 우리는 DNA와 RNA를 분리할 수 있습니다, 하는 동안 우리는 RNA는 역방향 분리 전에 cDNA를 복사할 경우 더 나은 결과 얻을 수 있습니다 나타났습니다. CDNA/RNA 하이브리드 RNA 혼자 보다 더 안정 되며 저밀도 멤브레인 통해 전달할 수 있습니다.
그림 1 . 젤-seq 운영 원칙. 육체적으로 DNA와 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 기본 원리. 적용 된 전기 분야에서 작은 RNA 분자는 저밀도 막 통해 마이그레이션할 하지만 큰 DNA 분자 표면에 갇혀 있다. 이 그림은 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 종이 젤-seq 장치 제조 자세히 설명 하 고 생성 하는 생물 학적 프로토콜 결합 DNA와 RNA 라이브러리. 둘 다에 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다. 장치는 레이어 링 3 개의 서로 다른 밀도 polyacrylamide 젤 서로 표준 스태킹 젤을 만드는 유사한 과정에 의해 조작 됩니다. 11 생물 학적 프로토콜 100-1000 셀 PBS에 정지로 시작 합니다. 셀 lysed 고 RNA cDNA/RNA 하이브리드에서 게놈 DNA를 분리 하는 장치를 사용 하기 전에 cDNA로 변환 됩니다. 분리 및 복구, 게놈 및 transcriptomic 후 라이브러리 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 다음과 밀접 하 게 하는 프로세스를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 칩 게시 에 실험실에서 개발 및 젤-seq의 유효성 검사에 대 한 추가 세부 정보를 읽을 수 있습니다 "젤-seq: 전체 게놈 및 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 사용 하 여 반 투과성 히드로 장벽을 transcriptome 시퀀싱 ." 7
그림 2 . 젤-seq 프로토콜. 젤-seq 장치 및 생성 된 쌍을 이루는 DNA와 RNA 라이브러리에 프로토콜을 조작 하는 단계의 개요입니다. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
단일 세포에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하기 위해 연구원은 G & T-seq 또는 박사가 G & T-Seq, 젤-seq 같은 사용 하 여 고려해 야, genomic DNA에서 RNA의 물리적 분리에 의존. 메신저 RNA (mRNA)에 의존 하는이 방법은 3 ' polyadenylated 꼬리 풀 다운 대상으로. mRNA에 자석 구슬을 biotinylated 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 캡처됩니다. 일단는 mRNA를 캡처한 구슬 자석와 장소에서 개최 되 고 게놈 DNA를 포함 하는 상쾌한 수 있습니다 제거 하 고 다른 튜브로 전송. 이 물리적 분리 완료 되 면 DNA와 mRNA에서 별도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 그러나 8 이 이렇게 잘 관심의 RNA는 polyadenylated, 그것은 사용할 수 없습니다 ribosomal RNA, tRNA, 또는 RNA 원핵생물에서 같은 비-polyadenylated 증명서를 공부 하 작동 합니다.
박사-seq 같은 튜브에 DNA와 RNA에서 파생 하는 cDNA 증폭 됩니다 사전 증폭 단계에 의존 합니다. 샘플은 다음 둘 하 고 DNA와 RNA seq 라이브러리를 준비 하는 동시에 처리. 게놈 DNA와 RNA에서 파생 된 cDNA 사이 구별, 박사-seq 전산 접근을 걸립니다. 그 중 DNA 또는 RNA에서 유래 수로 exons는 현재 시퀀스 계산 genomic DNA 데이터에 억제 됩니다. 9 는이 방법의 장점은 그 DNA 및 cDNA/RNA 필요 하지 물리적으로 분리 될 젤-seq와 G & T이 이루어집니다. 그러나, 단점은 박사-seq 게놈 및 (즉, introns 대 exons), transcriptome 선험적 지식이 필요 하 고 이상적인 시퀀싱의 핵, 없는 많은 증명서는 아직 완벽 하 게 되지 않을 수도 있습니다. 접합 하 고 여전히 introns를 포함. 12
젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 크기에 독점적으로 기반으로 셀의 수백에서 분리 하는 기능입니다. 이 메서드는 선험적 지식이 게놈 또는 transcriptome, 불완전 한 접합에 대 한 강력한 이며 폴 리 adenylated 증명서에 국한 되지 않습니다 필요 합니다. 애플리케이션에 연구원 적어도 100 셀 시작할 수 젤-seq 저렴 하 고 널리 사용 가능한 재료를 사용 하 여 간단한 접근을 제공 합니다.
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Protocol
1. 화학 솔루션 준비
참고: 다음 단계는 이후 단계에서 필요한 화학 솔루션을 준비. 이러한 대량에서 만든 고 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다.
- 시작 하려면, 어떤 오염 DNA 중화 15 분 (15 mJ/cm2 총 노출) 254 nm 자외선 가교 오븐에 살 균 하 여 정화, 이온 물 50 mL를 준비 합니다. 다음 단계에 사용 하기 위해 37 ° C에가 열.
- 총 40% (T) 및 3.3 %crosslinker (C) (29: 1) 10 mL를 만들기 polyacrylamide 전조가 솔루션. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.133 g 3.867 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 최대 10 mL 따뜻한 물 정화와 소용돌이 녹아 때까지. 스토어 실 온에서 빛 으로부터 보호입니다.
참고: Premixed 40 %T, 3.3 %C (29: 1) polyacrylamide 솔루션 구입하실 수 있습니다 상업적으로. - 50 %T, 5 %C 젤 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.250 g 4.750 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 따뜻한 물 정화 및 해산 때까지 소용돌이 사용 하 여 최대 10 mL. 스토어 실 온에서 빛 으로부터 보호입니다.
- 50% (w/v) 자당 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. 5 g 자당 졸업된 실린더를 추가 하 고 10 ml 전체 볼륨까지 따뜻한 물 정화를 추가. 해산 때까지 소용돌이 고 실내 온도에 상점.
- 10%의 10 mL 확인 APS (w/v). 졸업된 실린더를 암모늄 persulfate (AP)의 1 g을 추가 합니다. 감기 (~ 4 ° C) 정화 추가 물 10 mL 및 해산 때까지 소용돌이의 총 볼륨까지. 즉시 200 µ L의 aliquots에 고정 합니다.
2. 젤-seq 카세트 제작
참고: 젤-seq 똑바로 카세트 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조); 원래 개발 되었다 그러나,이 프로토콜은 모든 표준 젤 전기 이동 법 카세트와 함께 작동 하도록 적용할 수 있습니다.
- 표 1에서에서 아래와 같이 시 약을 추가 하 여 3 개의 별도 플라스틱 튜브에 젤 선구자를 준비 합니다. 하지 않습니다 AP 또는 Tetramethylethylenediamine (TEMED) 다음 단계에서 지시 될 때까지 추가. 소용돌이 철저 하 게 혼합 재료.
| 필러 젤 전조 | 고밀도 젤 전조 | 낮은 밀도 젤 전조 | |||
| 40 %T, 3.3%C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션 | 1.6 mL | 50 %T, 5 %C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션 | 2.4 mL | 40 %T, 3.3%C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션 | 0.6 mL |
| 이온된 수 | 10.2 mL | 이온된 수 | 1.0 mL | 이온된 수 | 4.8 mL |
| 자당 솔루션 (50 %w / v) | 2.6 mL | 자당 솔루션 (50 %w / v) | 0.6 mL | ||
| 10 X 트리 스-Borate-EDTA | 1.6 mL | 10 X 트리 스-Borate-EDTA | 0.6 mL | ||
| 암모늄 persulfate (10 %w / v) | 104.0 Μ L | 암모늄 persulfate (10 %w / v) | 50.0 Μ L | 암모늄 persulfate (10 %w / v) | 39.0 Μ L |
| TEMED | 6.0 Μ L | TEMED | 1.0 Μ L | TEMED | 2.2 Μ L |
| 총 볼륨 | 16.1 mL | 총 볼륨 | 4.1 mL | 총 볼륨 | 6.0 mL |
표 1입니다. 합성 시 약 젤. Polyacrylamide 젤 선구자 약 2 카세트의 제작에 대 한 충분 한
- 튜브의 모자를 통해 바늘을 삽입 하 고이 바늘 집 진공 라인에 연결 하 여 탈 가스 젤 단위체 솔루션. 높은 초음파 목욕 세트에이 어셈블리를 잠수함과 거품 액체에서 다음 단계로 이동 하기 전에 신흥 중지 될 때까지 기다립니다 (~ 60 초 / 튜브).
참고: 진공의 질 및 초음파 목욕의 아니다 중요 한 너무 오랫동안 솔루션에서 신흥 거품을 볼 수 있다. - 추가 APS와 TEMED 필러 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 솔루션 카세트의 상단에 pipetting 여 각 젤 카세트 필러 젤 전조의 6 mL를 추가 합니다. 사용 하 여 1 mL micropipette 흘리 고 피하기 위해 6 단위로 전조를 추가. 이 단계에 대 한 총 시간 3 분 미만 이어야 한다.
- 액체는 카세트를 레벨 테이블에 똑바로 배치 하 여 수준 인지 확인 합니다. 이온, degassed 물으로 카세트의 나머지를 채우십시오. 다시 사용 하 여 1 mL 씩, 천천히 혼합을 최소화 하기 위해 카세트의 센터에 물, 플라스틱 폴리머 하룻밤에 최대 1 시간 이상에 대 한 치료를 하실 수 있습니다.
- 폴리머는 치료 후 물 층을 제거 하는 위에 젤 카세트를 반전. 부드럽게 인터페이스 6 인치의 거리에서 카세트의 상단 개방을 통해 공기를 불어 건조 압축 공기 총을 사용할 수 있습니다.
- 추가 APS와 TEMED 고밀도 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 다시 1 mL 피 펫을 사용 하 여 카세트를 고밀도 전조의 320 µ L를 추가 합니다. 액체는 균등 하 게 락 카세트와 약 3 시간 여 필러 젤 레이어 코트 확인 합니다. 이 단계는 3 분 미만 소요 됩니다.
- 이온, degassed 물으로 카세트의 나머지를 채우십시오. 천천히 혼합을 최소화 하기 위해 카세트의 중앙에 1 mL 피 펫과 플라스틱. 폴리머 적어도 15 분, 가급적 이면 한 시간에 대 한 치료를 하실 수 있습니다.
- 다시, 반전 물 오버레이 제거 하 젤 카세트. 압축 공기는 부드럽게 건조 인터페이스를 사용할 수 있습니다. 추가 APS와 TEMED 저밀도 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 저밀도 젤 전조와 카세트 (~1.65 mL)의 나머지를 작성 하 고 젤 빗을 삽입.
- 플라스틱 빗의 상단에서 보유 전조의 과잉으로 중 합 하는 동안 흡수 될 것 이다. 폴리머 적어도 4 시간, 가급적 이면 밤새 껏 치료를 하실 수 있습니다. 젤 트리 스-붕 산 염-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (TBE 버퍼) 버퍼에 1 주일 이상 저장할 수 있습니다.
3. 샘플 준비 및 전사 역
- 관심, 셀의 서 스 펜 션으로 시작 하 고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 층 류 두건에서 셀 농도 계산 하는 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) µ L 당 100 ~ 1000 셀의 농도에 세포를 희석.
참고:이 프로토콜 PC3, 헬러, 그리고 마우스 간 세포를 포함 하 여 셀의 범위에서 검증 되었습니다. - WTA는에서 제공 하는 시 약을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조), 혼합 세포의 용 해 버퍼의 19 µ L 그리고 10 배 준비 RNase 억제제의 1 µ L 주식 반응 버퍼의 솔루션. 반응 버퍼의 0.5 µ L 각 샘플에 대 한 무료 물 nuclease 2.75 µ L을 포함 하는 충분 한 양의 세포 마스터 믹스를 만듭니다.
- 다시 정착된 셀을 일시 중단 하 고 다음 200 µ L nuclease 무료 스트립 튜브 자외선에 의해 소독으로 샘플의 1 µ L를 플라스틱을 5 번 위아래로 세포 현 탁 액 플라스틱 샘플의 번호에 따라 필요한 만큼 반복 합니다. 하나의 반응에 대 한 셀 대신 nuclease 무료 물 pipetting 1 µ L에 의해 부정적인 제어를 포함 해야 합니다. 다음, 각 샘플에 세포 마스터 믹스의 3.25 µ L을 추가 하 고 부드럽게 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 72 ° c (온수 뚜껑)와 열 cycler 예 열 각 샘플에 WTA 어댑터 (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3) RT 뇌관의 1 µ L와 20 µ M 임의의 hexamer의 1 µ L를 추가 합니다. GDNA 라이브러리 준비에 대 한 긍정적인 제어로 적어도 1 개의 관을 보유 하 고 뇌관 대신 물 2 µ L를 추가 합니다.
참고: WTA 어댑터와 무작위 hexamer 선택적 이며 시퀀싱 결과에 미치는 영향을 최소화 했다. - 세포를 lyse에 3 분 데워 열 cycler에 72 ° C에서 샘플을 품 어. 2 분 동안 얼음에 장소와 열 cycler에서 셀을 제거 합니다. 5 단계까지 4 ° C에서 긍정적인 컨트롤을 저장 합니다.
- 셀 lysing는 하는 동안 다음 시 비율을 포함 하는 모든 RNA 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 충분 한 볼륨 작성: 첫 번째 가닥 버퍼의 2 µ L, 0.5 µ L 서식 파일 스위치 oligonucleotide (TSO), 0.25 µ L의 RNase 억제제, 및의 1 µ L의 역전사 (100 U / µ L)
- 42 ° c 열 cycler 예 열 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 3.75 µ L 10 µ L. 총 샘플 볼륨을 데리고 나머지 샘플에 추가 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 반전 녹음 방송 즉시 데워 열 cycler에서 샘플을 배치 하 여 수행 합니다. 다음 프로그램 실행: 90 분, 10 분, 4 ° C 영원히 70 ° C에 대 한 42 ° C. 이것은 안전 정지 지점 이다.
4. 젤 분리 하 고 복구
- 신중 하 게 DNA 제거 제품을 사용 하는 젤 전기 이동 법 실 청소. 챔버의 모든 표면에 걸쳐 일회용 보풀 무료 지우기 및 지우기 액체 세정제의 몇 mL를 적용 하 고 다음 깨끗 한 0.5와 챔버를 입력 x TBE. 최적의 결과 얻으려면 전체 기구 254 nm 자외선 가교 오븐에 놓고 15 분 (15 mJ/cm2)에 대 한 소독 합니다.
- 젤 전기 이동 법 챔버로 젤-seq 카세트를 삽입 하 고 제자리에 고정. 천천히 위로 젤 빗을 제거 합니다. 천천히 찢 어 젤 또는 팔의 리핑 방지 하려면 이동 합니다.
- 얼음에 3 단계에서 샘플을 유지, cDNA 라이브러리 생성을 위한 긍정적인 컨트롤 하나 이상의 샘플을 보유 합니다. 6 단계까지 4 ° C에서이 컨트롤을 저장 합니다. 나머지 샘플 염료 로드 X 6의 2 µ L을 추가, 5 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 섞어 데 총 볼륨 ~ 12 µ L. 철저 하 게.
- DNA 사다리의 1 µ L 2 µ L 로드 염료 및 물 7 µ L x 6의 결합. 전기 이동 법 컨트롤로 젤-seq 카세트의 1 차선으로이 혼합물을 플라스틱. 젤-seq 카세트의 별도 차선에 이전 단계에서 샘플 플라스틱 피펫으로 각 잘 완전히 삽입만 수직 모션을 사용 하 여 그것을 제거 하 여 우물 사이 오염을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 젤-seq 카세트에서 cDNA/RNA 하이브리드는 gDNA를 분리 하는 30 분 동안에 걸쳐 250 V의 전기 분야를 적용 표준 젤 전기 이동 법 전원 공급 장치를 사용 하 여. 분리 된, 일단 젤 전기 이동 법 상공에서 젤 seq 카세트를 제거 하 고 근 근이 살아가고 도구 가장자리를 캐 고 하 여 카세트의 두 반쪽을 엽니다.
- 메스를 사용 하 여 고밀도 레이어 바로 아래 절반에 젤을 잘라. 반 장갑 낀 손으로 그것을 선택 하 여 필러 젤 포함 된을 삭제 합니다. 부드럽게 페인트 스 크레이 퍼 또는 기타 유사한 도구와 된다고 하 여 카세트의 나머지 젤 껍질. 0.5 ~ 30 mL를 포함 하는 접시에 젤의이 섹션을 배치 젤 얼룩의 3 µ L 함께 x TBE.
- Photobleaching를 최소화 하 고 부드럽게 5 분에 대 한 컨테이너를 떨고 있는 동안 젤 담가를 컨테이너 커버. 플라스틱 포장에 젤을 놓고 (추가 세부 사항 참고. 13 참조)에 대 한 젤 문서 시스템을 사용 하 여 자외선 이미지. 30 초 노출은 일반적으로 투명 한 이미지를 생성합니다. 분리 되었음을 확인 합니다.
- 핵 산의 시각화를 촉진 하기 위하여 UV transilluminator 젤을 이동 합니다. 적절 한 자외선 안경 착용, 젤 설명서 시스템에서 결과 확인 합니다. gDNA 저밀도 젤과 저밀도 및 고밀도 지역의 인터페이스에서 cDNA의 시작에 위치 해야 합니다.
- 메스를 사용 하 여, 포함 하는 cDNA 및 gDNA 젤의 영역 밖으로 잘라. 샘플 10 m m 젤;의 직사각형 섹션 4 m m 절단 하 여 최고의 복구 그러나, 정확한 형상 사용 젤 전기 이동 법 체계에 따라 달라 집니다. 도 부정적인 컨트롤 로드 레인을 기억 하십시오.
- 각 장소는 무뚝뚝한 끝 핀셋의 쌍을 사용 하 여 스트립 튜브로 젤의 섹션 excised. 너무 많은 힘을 적용 하지 않도록 주의 하십시오 또는 젤 여러 조각으로 분할 합니다. 해야이 일이, 단순히 각 조각을 데리 고 튜브에 추가.
- 튜브의 하단에 원형 패션에 피 펫 팁을 이동 하 여 피 펫 (200 µ L 피 펫 팁 잘 작동)의 팁을 사용 하 여 각 튜브에 젤을 갈기. 샘플 손실을 최소화 하기 위해 젤을 사용 하는 피 펫 팁을 제거 하기 전에 각 튜브를 nuclease 무료 물 (gDNA 샘플에 40 µ L 및 cDNA 샘플으로 80 µ L)를 추가 합니다.
- 37 ° C 배양 기 안에 소용돌이 믹서를 스트립 튜브를 놓고 8-12 시간 동안 흔들어. 이 젤 확산 핵 산을 허용 하 고는 자연 정지점이 멀티 하루 프로토콜에 대 한.
- 샘플 8 µ m 메쉬 필터 플레이트에 플라스틱 하 고 젤 조각 밖으로 스트레인에 5 분 동안 2600 x g에서 접시를 회전. 메쉬 필터 플레이트 주택 플레이트에서 들어올린 새로운 200 µ L 스트립 관으로 물이 젤 무료 샘플을 플라스틱.
- 프로 테아 제 (0.9 AU/mL)의 1 µ L gDNA를 위아래로 pipetting으로 잘 혼합을 포함 하는 각 샘플을 추가 하 고 15 분 뒤에 15 분 동안 70 ° C에서 열 비활성화 50 ° C에서 품 어. 이 단계 nucleosomes를 없애고 중요 고는 gDNA를 후속 반응 단계에 액세스할 수 있습니다.
- 18 게이지 바늘을 사용 하 여, 모든 샘플 튜브의 뚜껑에 구멍 구멍. 액체 볼륨을 줄이기 위해 vacufuge에서 샘플을 놓습니다. gDNA 샘플 5 µ L 및 cDNA 샘플 10 µ L로 감소 감소 되어야 한다.
- Vacufuge 샘플 수에 따라, 총 증발 시간 30 분에서 60 분 사이의 달라질 수 있습니다. 샘플 볼륨 대상 볼륨 미만으로 떨어지면, nuclease 무료 물 샘플 볼륨을 추가 하면 됩니다.
5입니다. gDNA 라이브러리 준비
- Using fluorometer 또는 유사 기술, 각 gDNA 샘플 4 단계에서 3 단계에서 긍정적인 통제에 DNA 농도 계량. 자세한 프로토콜에 대 한 fluorometer 참조 설명서를 참조 하십시오. 14
- DNA의 0.2 ng / µ L의 샘플을 희석. 시작 셀 형식을 요구 하는 결과의 품질에 따라, 낮은 농도 아직도 가능한 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 일부 실험 해야 합니다; 그러나, 저자 낮은 0.1 ng / µ L로 라이브러리와 함께 성공을 했다.
- 7 단계에서에서 라이브러리 준비 절반 반응 볼륨 프로토콜 따라 gDNA 라이브러리 준비를 완료 합니다.
6입니다. cDNA 라이브러리 준비
- 10 µ L cDNA 샘플 및 4 단계에서 긍정적인 통제를 시작으로, 2 X qPCR 믹스, 0.5 µ L cDNA PCR 뇌관, 및 2 µ L nuclease 무료 물 12.5 µ L를 추가 합니다.
- 다음 프로토콜을 사용 하 여 실시간 thermocycler PCR 수행: 10 98 ° C의 20-30 사이클 뒤 3 분 동안 95 ° C에서 핫 스타트 s, 65 ° C 30 s, 및 72 ° C에 대 일 분 총 샘플 볼륨은 25 µ L. 반응 곡선을 모니터링 그리고 일 전에 증폭을 중지 e 반응 PCR 유물 때문에 overamplification 피하기 위하여 지 수 단계 (주기 수 대 선형 신호 증가)를 둡니다. 에 대 한 자세한 overamplification를 피하고,이 종이 뿐만 아니라 참고 15의 토론 섹션 참조.
- 증폭 후 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 구슬 다음 8 단계에서 프로토콜을 사용 하 여 제품을 청소. 일단 마무리 되 면 다음 단계를 진행 합니다.
- Using fluorometer 또는 유사 기술, 각 cDNA 샘플 4 단계에서 긍정적인 통제에 DNA 농도 계량. DNA의 약 0.2 ng / µ L을 포함 하는 데 필요한 경우 샘플을 희석. 약간 낮은 농도 여전히 가능한 라이브러리를 생성합니다. 그러나 일부 실험 저자 라이브러리 0.1 ng / µ L로 낮은 성공 했다, 있을 것입니다.
- 선택적 단계: 각 라이브러리 생성 반응의 유효성을 검사 하는 정량 제품 일의 1-2 µ L에 표준 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 별거를 수행. 성공적인 결과의 샘플 이미지는 그림 4에 표시 됩니다. Polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 수행 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 참고 16 참조.
- 7 단계에서에서 라이브러리 준비 키트 절반 볼륨 반응 프로토콜을 따라 cDNA 라이브러리 준비를 완료 합니다.
7. 라이브러리 준비 절반 볼륨 반응
- 라이브러리 준비 절반 볼륨 반응을 사용 하 여 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 따릅니다. 17 프로토콜의이 섹션에서 참조 하는 모든 시 약은 라이브러리 준비에서 키트 ( 재료의 표참조). UV 스트립 튜브 샘플 수에 대 한 충분 한 수를 살 균 처리 하 여 시작 합니다.
- Transposase 반응 분석 결과에서 사용 될 각 스트립 튜브를 5 µ L transposase 버퍼를 추가 하 여 수행 합니다. 뒤에 2.5 µ L transposase 0.2 ng / µ L (0.5 ng 총)에서 2.5 µ L 입력 DNA를 추가 합니다. 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 55 ° C에서 5 분 동안 품 어 다음 10 ° c.에서 개최 샘플에는 10 ° C에 도달 하면는 thermocycler에서 그것을 제거 하 고 즉시 각 샘플을 2.5 µ L transposase 정지 버퍼를 추가 합니다. 5 분 동안 실 온에서 샘플을 유지.
- 7.5 µ L 도서관 준비 PCR 혼합, 인덱스 1 뇌관의 2.5 µ L 및 인덱스 2 뇌관의 2.5 µ L을 추가 하 여 전치 처리 샘플 증폭 PCR 반응 준비. 이 뇌관 독점 하 고 라이브러리 준비 키트의 제조 업체에 의해 제공 됩니다. 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
참고: 각 샘플에 대 한 독특한 뇌관 조합 사용 됩니다 확인 하십시오. 12 다른 인덱스 1 뇌관 및 8 다른 인덱스 2 뇌관, 96 다른 샘플까지 레이블을 고유 하 게 수 있다. 각 샘플에 대 한 프라이 머의 독특한 조합을 선택 합니다. - PCR는 thermocycler에 다음 프로그램을 사용 하 여 수행 합니다. 샘플 볼륨 25 µ L입니다.
3 분 동안 72 ° C
30 초 동안 95 ° C
12 주기:
10 초 동안 95 ° C
30 초 동안 72 ° C
30 초 동안 55 ° C
5 분 동안 72 ° C
10 ° C에 - SPRI 구슬 다음 8 단계에서 프로토콜을 사용 하 여 준비 된 라이브러리를 청소. 젤 전기 이동 법 또는 유사한 분석 결과 사용 하 여 라이브러리를 확인 합니다. 라이브러리를 확인 하는 방법에 대 한 내용은 라이브러리 준비 키트 설명서를 참조 하십시오. 17
8. 단단한 단계의 가역 Immobilization 비드 도서관 청소
- 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 구슬과 1.5 mL aliquots에 저장 되어야 합니다 각 사용 하기 전에 실내 온도에 가져. 그것은 또한 각 실험에 대 한 신선한 80% 에탄올을 준비 하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 기반으로 WTA 키트 설명서에서 SPRI 비드 프로토콜. 18
- 각 PCR 제품에는 WTA 키트 세포의 용 해 버퍼의 1 µ l를 추가 합니다. SPRI 구슬까지 균일 하 게 혼합, 소용돌이 각 샘플에 SPRI 구슬의 50 µ l를 추가 합니다. 10 번 위아래로 샘플 pipetting으로 혼합 하 고 8 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
- 짧게 샘플 튜브의 측면에서 액체를 수집을 회전 합니다. ~ 5 분까지 액체 나타납니다 완전히 취소에 대 한 샘플 자기 분리 장치에 놓습니다.
- 샘플 자석 분리 장치에 있는 동안, 천천히 상쾌한 및 폐기 플라스틱-튜브에 구슬의 반지를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 다음 비즈를 방해 하지 않고 각 샘플을 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 초 동안 기다려야 하 고 신중 하 게는 상쾌한에서 플라스틱. 이 단계 (에탄올 세척)를 반복 한 번.
- 샘플 30에 대 한 건조 허용 s-1 분. 할-건조 하지 샘플 큰 조각 구슬에 영구적으로 바운드 될 것입니다.
참고: 짧은 건조 시간은 에탄올의 모든 흔적을 제거 되도록 것이 좋습니다. 에탄올의 상당량 뒤에 있어야 그들은 약간 다운스트림 반응 억제 수 있습니다. - 자기 분리 장치에서 샘플을 제거 하 고 추가 물 15 µ L elute 구슬에서 DNA를 각 샘플. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 고 구슬 튜브의 측면에서 제거 됩니다 확인 합니다. 2 분 동안 실 온에서 품 어. 간단히 샘플을 회전 하 고 ~ 1 분 솔루션 분명 나타날 때까지 자기 분리 장치에 그들을 배치.
- 샘플 자석 분리 장치에 있는 동안, 천천히는 상쾌한을 플라스틱 하 고 깨끗 한 관에 그것을 전송. 수 관에 구슬의 반지를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 구슬 튜브를 삭제 합니다.
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Representative Results
젤-seq 장치에서 gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 물리적 분리 형광 젤 영상; 통해 구상 될 수 있다 대표 결과 그림 3에 표시 됩니다. 패널 A 표시 조작된 젤-seq 장치; 거짓 색상 구별 다른 젤 지역에 추가 되었습니다. B 패널의 유효성 검사에 사용 하는 4 개의 다른 분판을 가까이 나타난다. 3 레인, 부정적인 컨트롤 배경 나타내고 인터페이스에서 젤의 아무 autoflourescence는 보여줍니다. 우리는 DNA 사다리와 함께 첫 번째 및 두 번째 차선을 로드. 이 차선 표시 낮은 및 고밀도 세포 막, 작은 조각 저밀도 젤을 통해 전달할 수 있습니다 공개 간의 인터페이스에만 어두운 밴드. 4 레인의 생물 학적 샘플의 동작을 보여 줍니다: 500 PC3 셀. 우리는 프로토콜의 3 단계에서 설명한 대로 레인 4 로드. 이미지는 genomic DNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 분리를 보여줍니다. 저밀도 막의 상단에 어두운 밴드는 megabase 규모 genomic DNA cDNA/RNA 하이브리드 낮은 고밀도 지역의 인터페이스에 정렬 됩니다. 사다리와 로드 레인 달리 여러 밴드 젤의 고밀도 지역 내에서 현재 또한 있다. 이 조각, 100 보다 작은 혈압, 오프 대상 제품은 뇌관 oligonucleotides에서 반전 녹음 방송 동안 생성 된. 패널 C 성공적인 실험에서 전체 젤-seq 장치의 대표 이미지를 보여줍니다. RNA/cDNA를 표시 하는 차선 차선 RNA를 표시 보여 그냥 gDNA와 RNA 분리 젤-seq 프로토콜 처리 되었습니다. 패널 D 저밀도 막의 각 레인의 상단에 검은 밴드와 함께 실패 한 실험을 보여줍니다. 이 전기 이동 법 버퍼 조각난된 DNA와 오염에 의해 발생 했다. 이 단계에서 연구원은 깨끗 한 네거티브 컨트롤 및 두 개의 뚜렷한 검은 밴드 분리 gDNA와 RNA/cDNA 하이브리드의 존재를 나타내는 찾고 있을 해야 합니다.
그림 3 . 젤-Seq 분리 결과. 젤-seq 장치 (A)와 DNA와 RNA/cDNA 하이브리드 (B)의 분리는 형광 이미지. 거짓 색상 보다 쉽게 젤 내의 밀도의 다른 지역 사이의 구별에 추가 되었습니다. (C, D) 성공 (C), 실패 (D) 실험에서 전체 젤-seq 장치의 대표적인 형광 이미지. NTC 템플릿 컨트롤을 =. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
일단 DNA 및 RNA/cDNA 하이브리드가 분리 되며 완료 젤-seq 프로토콜의 나머지 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 준비 된 라이브러리의 유효성을 검사 하는 bioanalyzer 또는 표준 젤 전기 이동 법 실험 (그림 4)을 실행 합니다. 그림 4에서 결과 500 PC3 전지와 750 HeLa 세포에서 생성 하는 라이브러리를 보여 줍니다. 그림 젤-seq ('젤' 표시) 표준 프로토콜 ('튜브' 라는) 생성 하는 뛰어난된 샘플 비교에서 생성 된 라이브러리에 대 한 조각 배포판입니다. 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 키트를 사용 하 여 라이브러리를 준비할 때 예상 대로 젤-seq의 조각 크기는 200, 800 basepairs 사이 나타납니다. 도서관 파편이이 단계에서 정확한 크기 범위에 표시 되지 않습니다, 도서관 준비 실패 했습니다.
그림 4 . 도서관 조각 크기 비교. 형광 젤 전기 이동 법 이미지 라이브러리 크기 분포 젤-seq (젤)과 표준 컨트롤 (튜브) 사이 비교. 왼쪽된 레인 조각 크기 100, 200, 400, 800, 1200, 및 2000 basepairs와 낮은 대량 DNA 사다리를 포함합니다. 이 키트와 함께 준비 하는 라이브러리에 대 한 예상 대로 모든 라이브러리에 대 한 조각 크기는 200, 800 basepairs 사이을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
젤-seq 프로토콜의 궁극적인 유효성 검사 시퀀싱 결과의 분석을 기반으로 합니다. 이 세포는 균질 성 식 프로필 샘플 될 수 있도록 우리 우리의 검증 실험에 대 한 PC3 셀 선택 분할 하 고 젤-seq와 전통적인 방법;를 사용 하 여 처리 그림 5를 참조 하십시오. 그림 5A 에 5BPC3 셀에 대 한 게놈 DNA 비교 표시 됩니다. 그림 5 A 표시의 게놈 넓은 사본 수 변이 (CNV) 프로필 PC3에서 생성 된 비교 젤-seq 또는 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 반응 (튜브 제어)를 사용 하 여. 각 포인트는 비 정규화 된 빈 수; 쓰레기통은 정의 참조 게놈 데이터에서 같은 각 빈은 건강 한 2 중 셀, 즉, 모든 상 염색체의 각 지역에 대 한 동일한 복사본을 나타내는 플랫 라인에 동일한 예상된 수 (제외 X 및 Y) 염색체. PC3은 스파이크 2의 배경 복사 수 위 표시는 같은 영역의 여러 복사본을 포함 합니다. 젤-seq 표준 튜브 반응으로 질적으로 유사한 CNV 프로 파일을 생성합니다. 두 개의 플롯 사이 계약 평가할 수 있습니다 양적 선형 회귀, 패널 b.와 같이 피어슨 상관 r = 0.90 게놈 데이터 수집 방법 중 하나에서 기능적 임을 나타냅니다.
그림 5 . 유효성 검사 라이브러리. 젤-seq는 게놈에 대 한 유효성 검사 (A 및 B) 및 PC3 및 Hela 세포에서 생성 된 transcriptomic (C, D 및 E) 데이터. 패널 A 비교 표시의 게놈 넓은 CNV 프로필 PC3에서 생성 된 젤-seq (젤-seq) 또는 표준 반응 (튜브) 사용 하 여. MAPD 중간 절대 없음을 차이 =. 패널 B는 선형 회귀 패널 A에에서 두 샘플 사이 R = 0.90 나타내는 게놈 데이터는 기능적으로 동일. 축은 log2 정규화 된 빈 계산을 표시 합니다. 패널 C와 D 각 포인트 당 kilobase 당 성적표에 수를 보여주는 transcriptomic PC3 셀에서 데이터를 비교 하 여 백만 (TPM). 축 표시 log2 정규화 사본 수로 두 샘플 사이 비교. 패널 C 젤-seq를 사용 하 여 생성 하는 기술 복제의 비교를 보여준다 고 패널 D 젤-seq와 전통적인 RNA-이 패널을 비교 표시 젤-seq 셀 형식을 기반으로 RNA 식 주성분 분석을 사용 하 여 해결할 수 있습니다 보여줍니다. X 축 y 축 분산의 6.5%에 대 한 두 번째 주성분 계정을 보여줍니다 하는 동안 샘플 사이 변이의 91.6%에 대 한 첫 번째 주성분 계정을 보여줍니다. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
마찬가지로, 우리 표준 튜브에 스마트 Seq 프로토콜을 우리의 젤-seq 프로토콜에서 transcriptomic 데이터 비교. 그림 5 및 젤-seq와 표준 방법 (그림 5D) 두 젤-seq 기술 복제 (그림 5C) 사이의 상관 관계를 보여 줍니다. 각 점은 당 kilobase 당 성적표에 수 백만 (TPM) TPM에서 각 유전자에 대 한 두 데이터 집합에서 > 5. 선형 회귀는 빨간색 선으로 표시 됩니다 하 고 피어슨 상관 계수는 왼쪽된 상단에 표시 됩니다. 젤-seq에서 기술 복제 (R ∼ 0.8), 동의 하지만 표준 방법 덜 잘 연관 (R < 0.7). 이 젤-seq 유전자 수에 바이어스 소개 나왔다. 다행히도,이 바이어스 체계적 이며, 그림 5E주성분 분석에 의해 볼 수 있는 의미 있는 결론 그려질 수 있습니다 여전히 다른 생물학 견본 사이.
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Discussion
젤-seq 장치 제조 뿐만 아니라 프로토콜 자체와 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제조, 중 젤의 다양 한 지역에 대 한 소정의 레이어 두께 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 우리는 다른 제조 옵션을 테스트 하는 중요 한 시간을 보냈다 고 여기에 설명 된 프로토콜 카세트에 테이블의 재료 및 시 약에대 한 가장 좋은 장치를 생성 합니다. 연구자는 다른 카세트 시스템을 사용 하는 경우 그들은 장치를 만들 때 사용 하는 볼륨을 조정 하는 데 필요한 찾을 수 있습니다. 제조의 주요 과제는 고밀도 젤 영역이 카세트의 가장자리에서 delaminate 하 고 전기 중단 됩니다 카세트의 내부에 공기 주머니를 만들 수 너무 큰 경우. 여러 다른 레이어 볼륨 여러 카세트를 캐스팅 하 여 연구원 신속 하 게 그들의 특정 하드웨어에 대 한 최적의 구성을 확인할 수 있어야 합니다.
젤-seq 프로토콜 또한 프로토콜 완료 되기 전에 유효성을 검사할 수 있는 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 한 잠재적인 오류 지점 gDNA와 RNA/cDNA 하이브리드의 분리 이다. 이 분리 후 젤-seq 장치 이미징 유효성을 검사 될 수 있습니다 ( 그림 3B참조). 실험의 한 세트, 우리는 발견 우리의 실험실 공급 버퍼의 DNA로 오염 될 했다 우리의 장치에 상당한 autoflourescence 원인이 되었다 ( 그림 3D참조). 이 분리 했다 자리를 차지 하는 경우를 결정 하기 어려운 했다. 형광 이미징 도움이 식별 되 고 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 어떤 비용이 많이 드는 시 약을 사용 하기 전에이 문제를 해결.
또 다른 중요 한 요점은 단계 6.2, 분리 후 cDNA의 정량 Pcr 증폭입니다. 연구원은 주의 하지 그것은 RNA-seq 데이터의 품질을 줄일 것입니다이 단계에서 overamplify를 기울여야 합니다. 이 젤-seq에 고유 하지 않습니다 하지만 낮은 입력 RNA-seq 라이브러리 준비의 일반적인 측면. 라이브러리 준비를 시퀀싱 하는 동안 PCR 확대는 경우가 많습니다, 하지만 그것은 시퀀스 오류와 편견을 소개할 수 있다. PCR 위한 사이클의 필요한 수 샘플 양 및 복잡성에 따라 달라 집니다. 그것은 일반적으로 충분 한 클러스터링 라이브러리 시퀀스 될 때 생성 하는 데 필요한 최소한 PCR 주기 수를 제한 하는 것이 좋습니다. 이론에서는, 과도 한 유물을 소개 하지 않고 충분 한 복사본 수를 생성 하는 정확한 주기 수를 결정 하는 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 그러나 실제로,, 샘플 품질에서 불일치 로드, 또는 프로토콜에 일찍 처리 수 극적으로 영향을 분자 템플릿 라이브러리 준비에 최적의 PCR 주기 수에 영향을 미치는 PCR에 사용할 수 있는 배포. 실시간 PCR thermocycler 반응을 실행 가장 일반적인 솔루션 우리가 찾은 형광 염료를 사용 하 여 증폭 반응의 진행 상황을 모니터링 하 고 중지 (주기 수 대 선형) 지 수에서 반응 단계. 우리의 경험에서 실시간 모니터링 개발, 적응, 또는 새로운 프로토콜을 채택 하는 경우에 특히 관련 된입니다.
마지막 중요 한 단계는 게놈 생성 및 transcriptomic 라이브러리. 이 단계에 열쇠는 가능한 DNA 도서관 준비 반응에 대 한 시작 샘플 농도 0.2 ng / µ L (0.5 ng 총)에 가까운 설정. 이것은 일반적으로 cDNA, 초과 하지만 gDNA 샘플에 대 한 더 많은 도전 수 정량 Pcr 증폭 cDNA에 대 한 상대적으로 간단 합니다. 우리는 주의 샘플 집중 되 고 있었다 하는 동안 vacufuge 단계에 주의 필요로 했다 발견. 1000 세포 실험에서 예상 대로 vacufuge 단계 수 중지 많은 100 실험 보다 빨리 세포. vacufuge에서 샘플의 수는 또한 우리의 실험에서 증발 속도 영향을. 우리가 발견 DNA의 유효성을 검사 하는 flourometer를 사용 하 여 콘텐츠 중간 농도 단계 익숙하지 않은 샘플 프로토콜을 수행할 때 도움이 될 수 있습니다. 다행히도, 만약 샘플, 무료 nuclease 한 집중을 통해 연구원 물 수 샘플을 희석에 추가 됩니다. 이론적으로, 그것은을 사용 하는 vacufuge DNA를 건조 하 고 다음 원하는 볼륨; resuspend 그러나, 완전 한 증발을 방지 하는 것이 좋습니다.
우리는 동시 DNA와 RNA 라이브러리, 젤-seq7, G 및 T-seq8및 박사-seq9, 무료으로 생성 하기 위한 세 가지 현재 방법 보기 젤-seq 샘플 100-1000 셀 범위에 대 하 이상적 이며 풀 다운 대상 또는 게놈의 선험적 지식을 요구 한다. 다른 두 메서드는 단일 셀 애플리케이션을 위한 적합 잘. 젤-seq 개발에 우리의 목표 중 하나는 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있는 프로토콜을 만드는 것 이었다. 우리는 따라서 polyacrylamide 젤 카세트의 표준 폼 팩터 내에서 장치를 제작 하기로 결정 했습니다. 우리가 우리의 서로 다른 막을 정의 하는 데 사용 하는 기술은 소설 동안에, 대부분의 유전학 실험실 젤-seq 장치 조작에 필요한 모든 장비를 이미 있다. 또한, 장치 비용은 사소한-단지 $5.25 12 샘플을 처리할 수 있는 장치에 대 한. 즉, 상업용 시 약을 사용 하 여 모든 라이브러리 준비 프로토콜, 라이브러리를 생성 하기 위한 전체 비용 높은 유지. 샘플 당 시 약 비용 50 달러의 전체 사본 증폭 되었고 DNA와 RNA에 대 한 라이브러리 준비에 대 한 $28. 다행히도, 젤-seq 장치 자체 프로토콜 불가 지론 이다. 예를 들어 개발 하는 동안 성공적으로 테스트 문화와는 이전 RNA 라이브러리 증폭 프로토콜19, 셀을 사용 하 여 장치 비록 우리가 발견 하는 쥐에서 조직 샘플에 적합 했다. 라이브러리 준비에 대 한 저렴 한 대안 개발 되는 미래를 향해 찾고, 우리의 프로토콜 이러한 새로운 기술을 사용 하도록 적용할 수 있습니다. 우리 연구원은 그들의 자신의 실험실에 젤-seq를 구현 하는 간단 찾을 것입니다 믿습니다. 우리는이 기술의 신속한 도입을 촉진할 것 이다 바랍니다.
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Disclosures
KZ는 공동 설립자 및 Singlera 유전체학 inc의 과학 고문
Acknowledgments
이 작품에 대 한 자금 제공에 의해 대학의 샌디에고, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램, NIH R01-HG007836, 부여 하 고 한국 정부 과학, 정보 통신 및 미래 계획에 의해 했다.
여러 인물의 이전 버전 "Hoople, G. D. 외 에 처음 출판 되었다 젤-seq: 전체 게놈 그리고 transcriptome 시퀀싱 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 반 투과성 히드로 장벽을 사용 하 여. 실험실에 칩 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " 칩에 실험실이이 발행물에서 그림의 재사용을 허가 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acrylamide Monomer | Sigma Aldrich | A8887-100G | |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678-25G | |
| Ampure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | ThermoFisher Scientific | R0611 | Referred to in the text as 6X loading dye |
| Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits | Kapa BioSystems | 7959613001 | Referred to in the text as 2X qPCR mix |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma Aldrich | 146072-100G | Also known as bis-acrylamide |
| NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit) | Illumina | FC-131-1024 | Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix) |
| Nuclease Free Water | Millipore | 3098 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit) | Takara/Clontech | 634888 | Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer) |
| Random hexamer with WTA adapter | IDT | n/a | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′ |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| DNA AWAY Surface Decontaminant | ThermoFisher Scientific | 7010PK | Referred to in the text as DNA removal product |
| Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration) | Sigma Aldrich | T4415-1L | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher Scientific | S11494 | Referred to in the text as gel stain |
| Equipment | |||
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 18 | Sigma Aldrich | Z192554 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769363 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm | ThermoFisher Scientific | NC2010 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size | Sigma Aldrich | CLS3374 | Referred to in the text as 8 um mesh filter plate |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33216 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Vacufuge Concentrator | Eppendorf | 22822993 | Any equivalent hardware is acceptable |
| XCell SureLock Mini-Cell system | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker | GE Healthcare Life Sciences | UVC500-115V | Discontinued, any equivalent hardware is acceptable |
| Gel Doc XR+ Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | Referred to in the text as gel imager |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR89 | Referred to in the text as UV transilluminator |
| Ultrasonic Bath | Bransonic | 1207K35 | Any equivalent ultrasonic bath is acceptable. |
References
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