Summary
本协议描述 caspase 分子荧光互补 (BiFC);一种基于图像的方法, 可用于可视化引发器半胱氨酸蛋白酶的诱导接近度, 这是它们激活的第一步。
Abstract
蛋白酶 caspase 家族在细胞凋亡和先天免疫中起着至关重要的作用。其中, 一个称为发起方半胱氨酸蛋白酶的子群是第一个在这些路径中激活的分组。该组包括 caspase-2,-8, 和-9, 以及炎症半胱氨酸蛋白酶, caspase-1,-4, 和-5。发起人半胱氨酸蛋白酶都是由二聚化激活后, 招募到特定的复合复合体称为活化平台。Caspase 分子荧光互补 (BiFC) 是一种以成像为基础的方法, 将分离的荧光蛋白融合到引发剂半胱氨酸蛋白酶用于可视化引发剂半胱氨酸蛋白酶到它们的活化平台, 由此产生的诱导接近。此荧光提供了启动器 caspase 激活所需的最早步骤之一的读数。利用多种不同的显微手术方法, 该技术可以提供定量的数据, caspase 活化的效率, 人口水平以及 caspase 活化的动力学和大小和数量的 caspase 活化在每个细胞基础上的配合物。
Introduction
caspase 蛋白酶家族以其在细胞凋亡和先天免疫中的重要作用而闻名1。由于它们的重要性, 确定何时、在何处以及如何有效地激活特定的半胱氨酸蛋白酶, 可以为 caspase 激活通路的机制提供重要的洞察力。此处描述的基于映像的协议启用了 caspase 激活级联中最早步骤的可视化。这种技术利用动态蛋白质: 推动 caspase 活化的蛋白质相互作用。
半胱氨酸蛋白酶可分为两组: 启动器半胱氨酸蛋白酶 (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9, 10, 和-12) 和刽子手半胱氨酸蛋白酶 (caspase-3,-6, 和-7)。刽子手半胱氨酸蛋白酶是存在于细胞作为预制的脂肪酸并且由分裂激活在大和小亚基2 之间。当激活时, 它们会切割许多结构和调节蛋白, 导致细胞凋亡3。启动器半胱氨酸蛋白酶是第一个在通路中激活的半胱氨酸蛋白酶, 通常触发刽子手半胱氨酸蛋白酶的活化。与刽子手半胱氨酸蛋白酶相反, 启动器半胱氨酸蛋白酶由二聚化4、5激活。这种二聚化是通过招募不活跃的单体到特定的大型分子量复合物称为活化平台来促进的。活化平台的组装受一系列特定蛋白质的控制: 蛋白质相互作用。这些都是由在启动器 caspase 的 proform 中存在的保守蛋白交互图案介导的, 包括死亡域 (DD)、死亡效应域 () 和 caspase 招聘域 (卡) 6 (图 1A)。激活平台通常包括受体蛋白和适配器蛋白。受体通常被激活后, 结合的配体, 诱导构象变化, 使许多分子齐聚。然后, 受体要么直接招募 caspase 或适配器分子, 然后将 caspase 带到复合体。因此, 许多 caspase 分子进入接近的接近度允许二聚化。这称为诱导接近模型7。一旦二聚, caspase 经历 autoprocessing, 这有助于稳定活性酶 4, 8. 例如, Apaf1 apoptosome 的组装是由细胞色素 c 在线粒体外膜通透 (MOMP) 的过程中释放出来后触发的。Apaf1 反过来通过一个由两种蛋白质9中存在的卡介导的交互来招募 caspase-9。相似的蛋白质相互作用导致 CD95 死亡诱导信号复合体 (椎间盘) 的组装导致 caspase-8 活化;PIDDosome, 可以激活 caspase-2;和各种 inflammasome 复合体, 启动 caspase-1 激活10,11,12。因此, 启动器半胱氨酸蛋白酶通过一个共同的机制被招募到特定的激活平台上, 导致了诱导接近和二聚化, 没有它的激活就不会发生。
Caspase 分子荧光互补 (BiFC) 是一种基于成像的检测方法, 用于测量启动器半胱氨酸蛋白酶激活的第一步, 允许在激活平台后直接可视化 Caspase 诱导的接近度。大会.该方法利用了分裂荧光蛋白金星的性质。金星是一个更明亮和更 photostable 的黄色荧光蛋白 (YFP) 的版本, 可分为两个非荧光和略微重叠的片段: 金星 n 终点 (金星 n 或钒氮) 和金星的 c 终点 (金星 c 或 VC)。这些片段保留在接近接近13时再折叠餐巾和变为荧光的能力。每个金星碎片被融合到 caspase 的 prodomain, 这是绑定到激活平台的 caspase 的最小部分。这确保了半胱氨酸蛋白酶不保留酶活性, 因此可以同时分析与内源事件相关的下游事件。当 caspase prodomains 被招募到活化平台并经过诱导接近时, 金星碎片再折叠餐巾。(图 1B)。由此产生的金星荧光可用于准确和具体地监测 caspase 激活平台在单细胞中的亚细胞定位、动力学和组装效率。成像数据可以通过共聚焦显微镜或标准荧光显微镜获得, 并可适应多种不同的显微方法, 包括: 时间推移成像实时跟踪 caspase 激活;高分辨率成像对亚细胞定位的精确测定和末端点量化的活化效率。
首先开发了此技术来调查 caspase-214的激活。虽然 caspase-2 的活化平台被认为是 PIDDosome, 包括受体 PIDD (p53-induced 蛋白与死亡域) 和适配器 RAIDD (RIP 相关 ICH-1/CAD-3 同源蛋白与死亡域),PIDDosome 独立的 caspase-2 激活已被报道。这表明 caspase-2 的其他激活平台存在15,16。尽管不知道 caspase-2 激活平台的全部组件, caspase BiFC 技术还是允许在分子级14、17上成功地审问 caspase-2 信号通路。我们还成功地修改了该协议的炎症半胱氨酸蛋白酶 (caspase-1,-4,-5 和-12 ) 18, 原则上, 同样的方法应该足以同样分析每一个其余的发起人半胱氨酸蛋白酶。该协议也可以类似地被修改, 以调查其他途径是二聚化是一个主要的激活信号。例如, 通过二聚化激酶 (JAK )19 磷酸化后, 统计蛋白被激活。因此, BiFC 系统可以用于可视化的统计活化以及许多其他途径调控的动态蛋白质相互作用。下面的协议提供分步说明, 介绍如何将记者引入细胞, 以及图像获取和分析方法。
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Protocol
1. 细胞和培养皿的制备
注意: 在组织培养层流罩中执行步骤1-3。戴上手套。
- 如果使用玻璃底菜, 涂玻璃纤维连接器。如果使用塑料盘子, 请跳到步骤1.2。
- 用0.1 毫克/毫升的纤维连接蛋白溶液: 稀释1毫升1毫克/毫升纤维连接蛋白溶液在9毫升 1 X PBS。
- 用 0.5-1 毫升的纤连蛋白覆盖每个井的玻璃底部, 室温下孵育1-5 分钟。
- 使用吸管, 收集纤维连接蛋白溶液和存储在4摄氏度。
注: 纤维连接蛋白溶液可多次重复使用。 - 用1-2 毫升 1 X pbs 清洗玻璃, 然后从 pbs 中抽出。
- 板 1 x 105单元每井的6井板在2毫升适当的细胞培养媒介 (参见表 1为用于不同大小的井的细胞数字)。如果使用稳定表达 caspase BiFC 组件的单元格线 (参见讨论), 则板 2 x 105单元格, 然后继续处理步骤 (步骤 3)。
- 允许细胞在37摄氏度的组织培养孵化器中一夜之间坚持盘子。
2. 转染细胞以引入 caspase BiFC 成分
- 染细胞与适当的转染试剂。
注意: 本协议概述了脂质体2000的说明, 该指令已被优化为最小毒性。该协议已成功地用于 Hela 细胞、MCF7 细胞和 LN18 细胞。如果使用其他转染试剂遵循制造商的指示, 并根据需要进行优化。- 在无菌管中添加12µL 的转染试剂到750µL 的减少血清培养基中。
- 室温孵育5分钟。
- 添加 10 ng 的报告质粒 (一种荧光蛋白编码的质粒,例如红色荧光蛋白 [RFP], 它将标记被转染的细胞) 到不育的1.5 毫升管为每个井被转染。
- 将每个 caspase BiFC 质粒 (例如, 20 吴 caspase-2 prodomain [C2 pro] VC 和 20 ng C2 亲氮) 添加到每个管 (表 2) 中20。
- 通过添加减少的血清培养基, 使每根管子的总容积达到100µL。
- 使用 p200 吸管, 添加100µL 转染试剂溶液从步骤2.1.2 到质粒混合物滴状方式。
- 室温下孵育质粒转染试剂混合物20分钟。
- 用吸管或吸力从细胞中吸出培养基, 然后用 p1000 吸管将800µL 的血清游离培养基轻轻地放在井侧。
- 使用 p200 吸管, 添加200µL 的 DNA 脂复合体滴向每个井。
- 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化出3小时的细胞。
- 注意不要破坏单层, 取出含有 DNA 脂复合物的血清游离培养基, 吸入或用吸管抽吸。
- 吸管2毫升预热 (37 °c) 完全生长介质轻轻地向下的每一个井的一侧。
- 在组织培养孵化器中孵育37摄氏度的细胞, 以达到最佳蛋白质表达的24-48 小时。
3. 诱导 caspase 活化
- 治疗的药物或刺激, 诱导 caspase 激活约24小时后转染。
- 添加所需的药物浓度的预热 (37 °c) 成像介质 (完全生长介质补充与 Hepes [20 毫米, pH 值 7.2-7.5] 和 2-巯基乙醇 [55 µM]), 并轻轻混合(表 3)。
- 用吸管或吸力从细胞中吸出培养基, 然后用吸管将溶液中的2毫升吸管从3.1.1 的一侧轻轻地移到井边。
- 将没有药物的成像介质添加到一个井中作为未经处理的控制。
- 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化细胞, 或进行4.3 步的时间推移实验。
4.Caspase BiFC 数据采集
-
Caspase BiFC 单时间点采集
- 按照制造商的说明打开显微镜和荧光灯光源。
- 在 RFP 过滤器下找到细胞, 聚焦于报告基因荧光。
- 使用手动计数计数器, 计算可视字段中所有的 RFP 阳性单元格。记录数字。
- 在保持相同的视觉场的同时, 切换到 GFP 过滤器 (或 YFP 过滤器 (如果可用), 并使用手计数计数器, 计算红细胞的数量也是绿色 (金星阳性)。在两个过滤器之间来回切换, 以确保只有红细胞被评估为金星阳性。记录数字 (图 3)。
- 从板块的三个单独区域中计算出至少100个 RFP 阳性细胞。
- 在每个区域, 计算金星阳性转染细胞的百分比 (即红细胞也是绿色的)。平均产生的百分比以获得标准偏差。
-
caspase BiFC 的三维成像
- 根据制造商的指示打开显微镜并启动采集软件。
- 选择60x 或63x 油目标, 并在目标上放置一滴油
- 使用正确的板架将培养皿放在显微镜台上。
- 使用荧光光源和显微镜眼片或共焦激光器和计算机屏幕, 导航到感兴趣的领域。
- 关注记者荧光使用 RFP 激光或过滤器。
- 如果荧光已经用到这一点, 将光源切换到共焦激光器, 并可视化相机获取的单元格的实时图像, 并在计算机屏幕上显示采集软件。
- 使用操纵杆控制和焦点轮, 微调单元格的焦点和位置, 使单元格位于视图查找器的中心。选择彼此分离且不重叠的单元格。
- 输入的百分比激光功率为50% 和曝光时间在100毫秒的金星和 RFP 作为一个出发点, 以确定最佳设置, 用于实验。
- 打开实时捕获并检查生成的图像以及两个通道的随附显示直方图。
- 如果信号很低, 图像很难制作出来, 增加激光功率和/或曝光时间的增量, 直到图像中的信号看起来很好。
- 确保信号不达到饱和。检查显示直方图, 确保每个流体都能看到明显的峰值。如果峰值包含整个直方图显示, 则输入较低的激光功率和曝光设置 (图 2)。
- 在相同的条件下可视化控制 (未经处理或未转染) 细胞, 以确保信号是特定的。
注意: 单色 transfectants 也可以用来控制交叉, 但如果信号在空间上是不同的 (例如线粒体与胞浆), 这是不必要的。 - 在显微镜软件中选择或打开 Z 堆栈模块。
- 使用焦点旋钮, 近似与单元格中心相对应的焦点位置。
- 将焦点调整为一个方向, 直到单元格不再可见时, 选择此项作为顶部位置。
- 将焦点调整到相反方向, 直到单元格不再可见, 然后选择此作为底部位置。
- 选择最佳步长 (通常约为20µm), 并开始获取, 以指示相机自动在每个通道中的20个µm 步骤之间的顶部和底部位置的单个图像。
- 使用3D 渲染软件重建3D 映像 (图 4, 电影 1)。
-
caspase BiFC 的时间推移成像
- 实验前至少1小时, 打开显微镜, 将温度设置为37摄氏度。
- 选择40x、60x 或63x 油目标, 并在目标上放置一滴油。
- 使用正确的板架将培养皿放在显微镜台上。
- 如果 co2源可用, 请将 co2传递设备 (通常是连接到提供 co2的管道的有机玻璃盖子) 放在板架上。将 co2级别设置为 5%, 并从软件内部打开 co2控制器。如果 CO2源不可用, 则包括 20 mM Hepes 以缓冲介质。
- 导航到转染细胞的领域, 并可视化相机获取的单元格的实时图像, 并使用 RFP 激光器在计算机屏幕上显示采集软件。
- 按照步骤 4.2. 8-4. 2.12, 输入对 RFP 激光器的激光功率和曝光时间百分比的设置。保持这些值尽可能低, 同时仍然能够检测到荧光信号。
- 使用正则控件示例 (请参见表 3中的示例), 按照步骤 4.2. 8-4. 2.12 输入 YFP 激光光功率和曝光时间百分比的设置。保持这些值尽可能低, 同时仍能探测到金星信号。
- 对于每个板块的井, 选择多个不同的位置, 其中包含一个或多个表达记者的单元格。
- 输入时间间隔的每个帧和要采取的帧总数之间的时间段。确保有时间获得所有选定的职位之前, 将采取的下一个框架。
- 重新访问每个位置, 并根据需要更正和更新焦点。
- 为了纠正可能因温度或外部振动变化而引起的焦漂移, 请打开焦点漂移校正系统 (如果可用)。
- 开始时间推移并保存数据。
- 使用可用的成像软件分析数据 (图 5, 电影 2)。
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Representative Results
在图 3中显示了 DNA 损伤引起的 caspase-2 BiFC 的例子。喜树碱, 一种拓扑异构酶抑制剂, 被用来诱导 DNA 损伤和 caspase-2 活化。红色荧光蛋白 mCherry 作为一个记者, 以表明细胞表达的 BiFC 探针和帮助可视化的总数量的细胞。金星荧光显示在绿色和大 puncta 代表 caspase-2 诱导接近度。这些细胞可以计数, 以确定金星阳性细胞的百分比。结论也可以从这些图像中进行亚细胞定位。在所示的例子中, caspase-2 诱导接近度检测在核仁以及细胞质17中。为了提供 caspase 活化复合物亚细胞定位的高分辨率可视化, 单细胞可以在三维上进行成像。图 4显示了两种表示此类3D 图像的方法。第一种是生成细胞的3D 重建。该例表明喜树碱诱导的 caspase-2 BiFC 在绿色和核的红色。3D 重建显示了两个显影在整个细胞中的相对定位。此类型的结果显示在放映为影片时特别有效, 旋转单个坐标轴 (影片 1) 周围的单元格。第二个面板是同一个单元格的正交视图。这提供了单元格中特定点的单元格的xy、 xz和yz可视化。以这种方式对结果的描述可以更适合于纸面演示文稿, 如在期刊文章中, 因为它更容易解释以2D 格式显示的3D 数据。图 5显示了用蛋白酶体抑制剂佐米处理的胶质瘤细胞系中 caspase-2 BiFC 的时间推移成像示例 (请参见电影 2)。该图显示了在多个单元格 (适应于20) 的每个单元格的平均金星强度的增加。这种类型的数据也可以显示为一个图表上的多个单个单元格跟踪。在所示的例子中, caspase 诱导的接近度的开始是大约 2 h 以下治疗。
图 1: caspase 结构示意图和分子荧光互补 (BiFC) 方法.(A)启动器 caspase 的一般结构。prodomain, 大和小亚基, 和保守的 QACRG 主题, 包含活动的网站半胱氨酸被描述。(B) BiFC 使用的分裂荧光蛋白, 单独不是荧光的, 但可以联想到改革的荧光分子, 当融合到相互作用的蛋白质。对于 caspase BiFC, prodomain (Pro) 或全长 caspase 被熔化到 N 末端半 (金星 n) 和到 C 末端半 (金星 c) 金星。在他们的单体状态 caspase 融合蛋白质不是荧光的。在招募到一个激活平台, 如 PIDDosome, 如图所示, 金星的两个半部分的协会被强制代表 caspase 诱导接近度被测量作为金星荧光的增量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用显示直方图识别饱和度的代表性图像.显示最佳 (上部面板) 和饱和信号 (下面板) 的示例。显示金星 (黄色峰值) 和 RFP (红色峰值) 信号。x 轴表示强度, y 轴为像素数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: DNA 损伤后 Caspase-2 分子荧光互补 (BiFC).在 qVD OPH (20 µM) 的存在下, 表达 caspase-2 BiFC 成分的 Hela 细胞未经处理的(A)或用喜树碱 (100 µM) (B)治疗。mCherry 是一个荧光记者。具有代表性的图像以 caspase-2 BiFC (绿色) 在喜树碱处理过的细胞中显示细胞 (红色), 治疗后16小时。刻度条代表20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: caspase-2 分子荧光互补 (BiFC) 的定位.在 qVD OPH (20 µM) 的存在下, 用喜树碱 (20 µM) 对表达 caspase-2 BiFC 成分和荧光核记者的 Hela 细胞进行治疗。3D 由0.1 微米串行共焦图像组成, 通过细胞的z平面在24小时后进行重建, 并以绿色的红色和 caspase-2 BiFC 显示细胞核。左面板显示3D 最大强度投影渲染重建 (参见电影 1)。右面板显示同一单元格的正交切片视图。中间框 (blue) 是xy平面, 右侧框 (黄色) 是yz平面, 顶部框 (白色) 是xz平面。yz和xz平面根据交叉毛发相交。刻度条代表10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: caspase 分子荧光互补 (BiFC) 的时间推移(A)在佐米 (20 qVD) 的存在下, 用 OPH (15 nM) 对转染了 caspase-2 BiFC 成分和红色荧光线粒体标记 (DsRed-图 LN18) 的胶质瘤细胞进行了治疗. 细胞被放置在共聚焦显微镜在37°c 和图片被采取每2分钟为 8 h. 具有代表性细胞的图像从时间推移表明, 诱导接近的两个 caspase-2 BiFC 成分导致金星荧光增加 (绿色) 随着时间的推移。(B)测量每个时间点每个细胞中金星的平均强度。佐米治疗后, 金星荧光量随时间增加。在未经处理的控制中的分裂表明, 激光光的毒性条件很低或微不足道 (从20改编的数字)。刻度条代表20µm. 误差线表示 8 (控制) 和 14 (佐米) 单个单元格的平均值 (SEM) 的标准误差 (请参见影片 2)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 板材尺寸 | 单元格数 | 媒体量 |
| 6井板 | 1 x 105单元格/好 | 2毫升 |
| 12井板 | 5x 104单元格/好 | 1毫升 |
| 24井板 | 2.5 x 104单元格/好 | 0.5 毫升 |
| 4室菜 | 2.5 x 104单元格/分室 | 1毫升 |
| 8室菜 | 1.25 x 104单元格/分室 | 0.5 毫升 |
表 1: 要板的单元格数的准则.如果使用细胞稳定地表达 caspase 分子荧光互补 (BiFC) 成分, 板材加倍的数量这里显示。
| 板材尺寸 | 转染试剂 | 减少血清介质 | 报告质粒 | Caspase 型 VC 质粒 | Caspase-亲钒质粒 | 减少血清培养基添加到质粒混合物中 | 添加到质粒混合物中的转染试剂溶液 | 血清游离培养基添加到细胞中 |
| 6井板 | 12µL/盘 | 750µL | 10吴 | 20吴 | 20吴 | 总计100µL | 100µL | 800µL |
| 12井板 | 12µL/盘 | 750µL | 5吴 | 10吴 | 10吴 | 总计50µL | 50µL | 400µL |
| 24井板 | 12µL/盘 | 750µL | 2.5 吴 | 5吴 | 5吴 | 总计25µL | 25µL | 200µL |
| 4室菜 | 4µL/盘 | 250µL | 2.5 吴 | 5吴 | 5吴 | 总计25µL | 25µL | 200µL |
| 8室菜 | 4µL/盘 | 250µL | 1.25 吴 | 2.5 吴 | 2.5 吴 | 总计12.5 µL | 12.5 µL | 100µL |
表 2: 用于瞬变转染的试剂推荐量.注: 建议的质粒量只是一个起点。如果没有检测到信号, 建议将该质粒从6井板的每井 20-200 ng 滴定。
| caspase | 治疗 | 浓度 | 时间 | 预期结果 |
| Caspase-1 | 过度表达的 ASC | 6井板250井 | 48小时 | 50% BiFC 阳性 |
| Caspase-2 | 过度表达的 RAIDD | 6井板500井 | 24小时 | 90% BiFC 阳性 |
| 喜树碱 | 100µM | 16小时 | 30-60% BiFC 阳性 | |
| 热休克 | 1 h 在45°c | 16小时 | 80% BiFC 阳性 | |
| Caspase-4 | 抗原 NALP1 | 6井板250井 | 48小时 | 30% BiFC 阳性 |
| Caspase-5 | 抗原 IPAF | 6井板250井 | 48小时 | 15% BiFC 阳性 |
表 3: caspase 分子荧光互补 (BiFC) 的阳性对照例.条件和预期结果基于已发布的数据, 使用 Pro 构造14,17,18。共同表达的质粒应与 BiFC 质粒 (步骤 2.1.4) 一起转染
影片 1: 3D caspase-2 分子荧光互补 (BiFC) 的本地化.3D 重建, 绕着共焦图像的y轴旋转, 通过在表达 caspase-2-BiFC 成分的 Hela 细胞的z平面, 并以喜树碱 (20 µM) 治疗16小时。影片显示 caspase-2 BiFC (绿色) 和原子核 (红色)。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
影片 2: caspase-2 分子荧光互补 (BiFC) 的时间推移.LN18 胶质瘤细胞转染的 caspase-2 BiFC 成分和治疗佐米 (15 nm) 被成像每2分钟8小时。影片显示 caspase-2 BiFC (绿色) 和线粒体 (红色)。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
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Discussion
该协议讨论了使用分裂荧光蛋白测量 caspase 诱导接近度。因为它非常明亮, 高度 photostable, 而且复用速度快13, 所以选择了分离金星。因此, 对 caspase 诱导接近度的金星复性分析可以提供接近 caspase 蛋白相互作用动力学的实时估计。金星被分成两个稍微重叠的片段, 金星的 n 终点 (金星 n 或钒氮), 包括氨基酸1-173 和 C 末端片段 (金星 c 或 VC), 包括残留物155-239。其他分裂荧光蛋白存在, 但一些, 如分裂 mCherry, 要求孵化4°c 高达2小时的复用21。额外的分裂荧光蛋白, 包括分裂蔚蓝 (一个版本的青色荧光蛋白) 和远红色分裂 mLumin 还有待在这个上下文中测试13,22。最终, 如果这些荧光蛋白证明适合测量 caspase 诱导接近度, 这将允许同时评价多半胱氨酸蛋白酶。
通常, caspase 的 prodomain (Pro) 区域被融合到分裂的荧光片段。该区域包含绑定到激活平台所需的 caspase 的最小部分, 并包括卡或基交互主题。使用 prodomain 的优点是它不向细胞引入任何酶活性。这允许同时监测下游事件由于内源性 caspase。迄今的研究表明, prodomain 与全长 caspase 14之间的 caspase BiFC 的动力学和定位差异不大。然而, 全长结构往往以较低的效率表达, 这就有必要对增加的质粒 DNA 进行转染。此外, 建议将催化半胱氨酸突变为丝氨酸, 以防止 caspase 诱导的凋亡。尽管存在这些缺点, 但某些调查可能需要对全长 BiFC 对进行同时分析, 以确定在催化领域存在或不存在时, caspase 引起的接近度是否存在上下文相关的差异。
本协议专门针对 HeLa 细胞进行了调整。同一协议适用于附加黏附细胞线, 包括乳腺癌细胞系, MCF-7, 胶质瘤细胞系, LN18, 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)。建议用户在将此协议调整为新的单元格类型时, 优化电镀和转染条件。该协议描述了两种主要的显微方法, 可用于评估细胞: 荧光和共焦显微镜。在使用共焦显微镜时, 必须将细胞镀在玻璃盖玻片上, 因为大多数高数值孔径目标与共焦显微术一起使用不会穿透塑料盘子或玻璃滑梯的厚度。因此, 建议使用嵌入 no 1.5 玻璃盖玻片, 具有最佳盖玻片厚度0.17 毫米的菜肴。许多不同类型的这些菜肴可从个别的3厘米菜肴, 到会议厅幻灯片, 到标准尺寸的多井板。表 1和2概述了如何根据不同的井大小调整电镀和转染指令。对于这里描述的荧光成像 (4.1), 只要显微镜配备了长时间的目标, 标准的塑料组织培养板就足够了。
由于这种方法实际上是一种 "灯 on" 方法来测量 caspase 激活, 因此包含荧光报告器对于允许在 caspase 记者未激活之前或在没有活化的情况下对细胞进行可视化是至关重要的, 并确定转染的细胞, 当使用瞬变染。许多不同的记者可以使用, 唯一的标准, 当选择一个是: 1) 荧光是足够明亮的, 以便它可以很容易地检测到成像协议;2) 其荧光光谱与 YFP 不重合。例如, 绿色荧光蛋白 (GFP) 不应该被用作记者, 因为它将被检测的 YFP 过滤器或激光用于探测金星。这是由于两个显影的光谱重叠。选择一个荧光, 本地化到特定的细胞器可以提供额外的质量信息。例如, 使用靶向线粒体的蛋白质, 如红色荧光蛋白 DsRed, 可以提供关于细胞整体生存能力的补充信息。线粒体倾向于发生分裂 (裂变) 在细胞死亡的早期阶段23 , 这可以可视化的记者像 DsRed。作为一名记者, 使用细胞器标记也可以得出关于 caspase BiFC 亚细胞定位的结论。
有许多方法可以获取和分析 caspase BiFC 数据。决定使用哪种方法将取决于要探索的参数 (端点种群分析与单细胞位置或动力学信息) 以及仪器和成像软件的可用性。该协议概述了一些基于显微镜的方法来收集 caspase BiFC 实验的结果, 以获取单个时间点和时间推移数据。然而, 应该指出的是, 这些方法的一些变化和组合被用来创造性地审问 caspase 激活通路。
单时间点数据采集 (4.1) 用于确定单个时间点 caspase 诱导接近度的细胞百分比。对于这个协议, 你只需要计算金星阳性的转染细胞的数量。因此, 不需要高度专业化的设备, 只有最基本的荧光显微镜与 GFP (或 YFP) 和 RFP 过滤器和手计数计数器是必要的。一些成像系统可以自动化, 以自动采取一组的图像每井的一个板块。如果此类仪器可用, 则获取图像中的单元格可以通过目视检查或量化使用成像软件进行相似的计数。三维成像 (4.2) 提供了 caspase BiFC 在整个细胞的焦平面上的高分辨率图像。一个共焦显微镜与激光器, 激发金星和 RFP (或选择转染记者) 和 Z 堆栈能力是必需的。许多3D 渲染软件模块可用来提供不同的可视化数据的方法。对于这两种类型的分析, 都有可能修复单元格和图像, 或者在以后的某个时间对它们进行评估。然而, 固定的过程确实减少了金星信号, 这可能会增加工件的分析, 因此不建议采用这种方法。时间推移成像 (4.3) 可用于提供 caspase BiFC 的同时动力学和位置分析。一个装有机动化阶段的显微镜可以设置为拍摄多个位置的图像, 甚至在同一实验中比较不同的治疗组。
对于时间推移, 应考虑到一些额外的考虑因素。激光可能导致工件由于毒性或漂白和两者都需要被控制。一般而言, 这两种方法都可以避免使用尽可能少的光 (输入低百分比激光功率和短曝光时间在步骤 4.3. 6-4. 3.7)。毒性结果, 当激光光诱发细胞死亡, 并可以控制在相同条件下的影像未经处理的细胞, 并确认细胞分裂的正常进行。当同一单元格中的多个图像减少荧光时, 漂白发生。金星荧光蛋白是相当 photostable 的, 所以这是很少在实践中的问题。漂白的影响可以通过拍摄金星阳性细胞的大量序列图像来确定, 并确保荧光保持稳定。这只需要做一次, 只要相同的激光功率和曝光设置用于每个实验。由于毒性或漂白的影响, 也可以通过减少捕获的图像总数来减轻。这可以通过延长或缩短捕获之间的时间间隔 (步骤 4.3.9) 来实现。使用5-10 分钟间隔超过16小时的时间-失效是一个好地方开始。如果没有观察到 photoxicity, 或者需要更短的持续时间的实验, 则可以减少帧间的间隔。如果 caspase 活化快速, 可以使用较短的时间间隔短的实验。例如, 对于16小时的实验, 每隔10分钟, 总共将拍摄192张图像 (每荧光96个)。2小时的1.5 米间隔实验将产生160张图像。因此, 长期和短期的实验将每个细胞暴露在类似的总数量的激光光。在短时间实验中, caspase 激活刺激可以直接添加到介质中, 在启动延时捕获之前 (步骤4.3.11 而不是步骤 3)。要做到这一点, 从板上取下盖子, 并轻轻地下降的解决方案包含刺激使用吸管。注意不要挤在盘子上, 快速检查细胞是否仍然处于焦点, 然后再继续。
在进行时间推移实验时, 确保细胞的直接环境与组织培养孵化器的紧密相似也是至关重要的。许多环境控制是可利用的在不同的显微镜设置 ups。这些包括较小的舞台顶部孵化器以及封装整个显微镜的环境室。这两个设备通常提供热量, CO2, 和湿度的房间, 可以精确控制的方式。co2和温度的精确控制对于实验的成功至关重要, 因为意外的温度波动会导致焦漂移, co2的缺失会导致介质的 pH 升高, 从而对细胞产生毒性。如果 CO2源不可用, 则可以通过添加 Hepes 来缓冲媒体 (请参见步骤 3.1.1)。即使 CO2源可用, 建议将 Hepes 作为一种额外的措施, 以保持细胞健康。然而, 即使在 Hepes 存在的情况下, 长时间的 CO2的缺席也会导致细胞死亡。因此, 重要的是检查未经处理的细胞, 在相同的条件下成像, 以及在实验结束时媒体的颜色, 以确保 pH 保持稳定。请注意, 由于自体荧光对金星信号的贡献极小, 因此不需要从该协议中使用的任何介质中省略苯酚红色。
有许多可用的方法来分析由时间推移实验产生的成像数据。测量每转染细胞的金星像素平均强度是分析 caspase 诱导接近时间的最直接的方法。如图 3、 图 4、 图 5所示, caspase-2 BiFC 通常显示为位于不同亚细胞室中的一个或多个 puncta。测量病灶数目、物体大小或其他类似因素的成像分析方法可以产生有关这些结构的信息性定量数据。并非所有 caspase BiFC 都以 puncta 的形式出现。例如, 炎症半胱氨酸蛋白酶显示了不同的 BiFC 模式, 包括漫射荧光、丝状结构和每个单元格18 的单个或多个 puncta。这些模式依赖于 caspase 激活和上游激活信号。因此, 最适合于时间失效结果的分析类型在很大程度上取决于所观察到的荧光模式的类型。
在使用本协议时评估的许多治疗刺激将通过参与不同的细胞死亡途径直接通过 caspase 分析或间接诱导细胞凋亡。这导致细胞收缩和分离的板块, 这使得很难想象的细胞, 几乎不可能确定任何特定的定位 caspase-BiFC。加入一个泛 caspase 抑制剂将防止这种细胞死亡。招募半胱氨酸蛋白酶到他们的活化平台和相关的 caspase BiFC 不依赖于 caspase 的催化活性。因此, caspase 抑制对这一步骤没有影响, 但会抑制细胞凋亡的下游物理特征, 包括起泡、分离和最终损失的细胞膜完整性。因此, 如果进行端点分析 (步骤 4.1) 或 Z 栈 (步骤 4.2), caspase 抑制剂的加入是必不可少的。相对于时间推移实验, 如果 MOMP、蛋白 V 结合 (检测磷脂丝氨酸暴露) 或碘碘吸收 (检测血浆膜通透) 的凋亡相关事件将与 caspase BiFC 一起分析, 则caspase 抑制剂应省略, 以防止这些事件的抑制。caspase 抑制剂, 如 qVD-OPh (10-20 µM) 应添加到包含凋亡诱导刺激 (步骤 3.1.1) 的媒体中。如果与 caspase BiFC 成分共同表达亲凋亡蛋白, 则应在步骤2.1.12 中添加 caspase 抑制剂。
虽然 caspase BiFC 是少数可用的方法之一, 可用于可视化活动细胞 caspase 活化通路的事件, 在设计这些实验时必须考虑到一些因素。因为这种方法是基于过度表达的, 所以对特异性的控制是很重要的。这可以通过以下两种方式之一实现。首先, 引入单点突变入卡或 caspase prodomain, 使其破坏 caspase 及其活化平台之间的结合, 应减少 caspase BiFC 的强度和金星阳性率细胞.例如, caspase-1 prodomain 中的残留 D59 对 E 的突变会扰乱与适配器蛋白 ASC (包含卡的凋亡相关的斑点状蛋白) 的绑定, 并同样扰乱 ASC 诱导的 caspase-1 BiFC 18,24.其次, 在将 caspase 到活化平台的适配器蛋白中, 使用不足的细胞会减少特定的 BiFC 信号。这可以通过使用挖空单元 (如果可用) 或使用 siRNA 或 CRISPR/Cas9-based 方法耗尽适配器的单元格来实现。因此, caspase-2 适配器蛋白 RAIDD 的耗尽完全阻断了由热休克或 DNA 损伤引起的 caspase-2 BiFC 14,17。对于这些实验, 应将挖空或击倒细胞与匹配的控制细胞 (即凋落物匹配的野生型 MEF 或控制下落细胞) 进行比较, 如果使用新的细胞线, 应评估最佳转染条件, 以确保同等BiFC 记者跨单元格线的表达式。
这种方法的第二个局限性是, 当使用瞬变转染时, 很难确保每个细胞都表达等量的每种蛋白质。如果表达式是不等的, 一个金星片断可以被吸收到平台在更高的频率。这可能掩盖完整的荧光信号, 并导致错误的负面结果。为了克服这一问题, 最近报告了一个新版本的 caspase BiFC 的稳定单元格线生成器17。这个新版本包括一个构造, 表达 C2 亲 BiFC 组件在一个开放的阅读框架分离的病毒2A 自裂解肽25。因此, BiFC 成分被转录为一个单一的 mRNA 从同一启动子, 但转化为生产 stoichiometrically 同等数量的 VC 和钒氮融合蛋白。生成稳定表达这一结构的细胞系显示了类似的活化趋势, 瞬态表达的记者, 但两者都更敏感, 并显示较低的背景荧光。因此, 如果使用与稳定地表达 caspase BiFC 组件的记者单元格线结合, 上述协议可以大大简化。
迄今为止的数据表明, caspase BiFC 组分与内源蛋白之间的干扰极小。例如, 已知 caspase-2 在 MOMP 上游激活, 但 caspase-2 BiFC 未阻止 MOMP 14的进程。因此, 这些记者似乎并没有以一种主导的消极方式行事。但是, 如果同时评估下游事件, 则应在每组实验中对此进行调查。在实验中包括不转染好的控制是解决这一情况的最好方法。如果细胞死亡的动力学是不变的与或没有 caspase 传感器的表达, 这将表明, caspase-BiFC 成分不干预内源性功能。反之, 内源 caspase 可能会影响 BiFC 读数, 无论是在效率或大小或形状的结构。表达记者在细胞缺乏为 caspase 将控制这一点。
尽管有这些限制, caspase BiFC 技术是一个有用的方法来审问 caspase 激活通路, 可以补充甚至改进现有的方法来衡量发起 caspase 激活。通过测量诱导接近度, 激活的第一步, 这项技术克服了与测量后的步骤相关的问题, 如 caspase 自动处理与激活相关。例如, 在使用西方印迹监视刽子手半胱氨酸蛋白酶、caspase-3 和 caspase-7 的解切时, 为激活2 提供了一个精确的测量方法, 使用相同的启动器半胱氨酸蛋白酶可能有缺陷。这是因为启动器半胱氨酸蛋白酶的解切不足以激活4, 26, 27.事实上, 许多引发剂半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡过程中被 caspase-3, 而不产生活性酶28。同样, 基于使用作为特定半胱氨酸蛋白酶目标的肽基板的技术需要考虑到这些序列在半胱氨酸蛋白酶29中的重叠特性。这并不意味着这些方法不能用于测量 caspase 激活, 但在解释结果时应该承认缺点。Caspase BiFC 提供了一种替代方法, 可以帮助使用更常规的方法来确认结果。此外, 能够实时跟踪 caspase 活化配合物的装配, 并清楚地确定复合体的大小、形状和定位, 这是一种无法用其他方法评估的技术的显著优势。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
我们想感谢 Bouchier-海斯实验室的所有成员, 他们为这一技术的发展做出了贡献。这项工作部分是由德州儿童医院儿科试验奖给 LBH 提供的。我们感谢 Joya 钱德拉 (马里兰州休斯顿, 得克萨斯州) 允许包括与她的团队合作发布的数据。所描述的试剂的开发得到了贝勒医学院的细胞分选核心和 NIH (NIAID P30AI036211, P30CA125123 和 NCRR S10RR024574) 的资助, 以及乔尔 m. Sederstrom 的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
