Summary
A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.
Abstract
Maturação dos mRNAs eucarióticos envolve 3' formação de ponta, que envolve a adição de uma cauda poli (a). A fim de mapear a extremidade 3' de um gene, o tradicional método de escolha é 3' amplificação rápida das extremidades do cDNA (3' corrida). Protocolos para 3' corrida requerem o design cuidadoso e seleção de primers aninhadas dentro da região 3' untranslated (3' UTR) do gene alvo de interesse. No entanto, com algumas modificações, o protocolo pode ser usado para incluir o inteiro 3' UTR e sequências dentro do quadro de leitura aberta (ORF), fornecendo uma imagem mais abrangente da relação entre a ORF e a 3' UTR. Isto está além da identificação do sinal de poliadenilação (PAS), assim como o decote e poliadenilação site fornecido pelo convencional 3' corrida. Expandida de 3' corrida pode detectar incomum 3' UTRs, incluindo fusões gene dentro a 3' UTR, e as informações de sequência podem ser usadas para prever potenciais locais obrigatórios de miRNA, bem como AU rico desestabilizando a elementos que possam afectar a estabilidade da transcrição.
Introduction
A formação da extremidade 3' é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução1.
As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3' extremidades3. Assim, é importante identificar onde a cauda poli (a) atribui ao resto do 3' UTR, bem como identificar o PAS usado por qualquer transcrição determinada. O advento da próxima geração de sequenciamento resultou na identificação simultânea de 3' UTRs e a passagem de milhares de genes. Este aumento na capacidade de sequenciamento exigiu o desenvolvimento de algoritmos de bioinformatic para analisar os dados envolvendo poliadenilação alternativa da extremidade 3'. Para a detecção de novo ou validação do PAS e, portanto, mapeamento da extremidade 3' de genes individuais de dados de sequenciamento em larga escala, 3' corrida continua a ser o método de escolha4,5. As sequências incluídas em produtos de cDNA de 3' corrida normalmente incluem apenas uma parte do 3' UTR que contém a cauda poli (a), o local de clivagem, o PAS, sequências e o montante do PAS. Ao contrário do PCR, que requer a concepção e utilização do gene específico para diante e reverso primeiras demão, 3' corrida requer apenas duas gene específico aninhado frente primeiras demão. Daí, a PCR requer um conhecimento mais detalhado da sequência de nucleotídeos de uma grande região do gene sendo amplificado4,6. Desde 3' corrida usa o mesmo inverter a primeira demão que metas a poli (a) cauda para todos polyadenylated RNA transcritos, somente os primers para a frente devem ser gene específico, assim, exigindo apenas conhecimento de uma região significativamente menor do mRNA. Isso permite que a amplificação das regiões cujas sequências não são inteiramente caracterizado4,7. Isto permitiu 3' corrida para ser usado não somente para determinar a extremidade 3' de um gene, mas para também determinar e caracterizar regiões grandes montante do PAS que formam uma parcela significativa de 3' UTR. Combinando 5' corrida com o modificado 3' corrida que inclui porções maiores de 3' UTR e flanqueiam regiões, é possível totalmente sequenciar ou clonar uma transcrição de mRNA inteira da extremidade 5' para seus 3' final8.
Um exemplo desta aplicação de modificado 3' corrida é a identificação recente de um romance CCND1-MRCK transcrição de gene de fusão de linhas de células do linfoma de células do manto e pacientes com câncer. O 3' UTR consistia de sequências de genes de ambos os CCND1 e MRCK e foi recalcitrantes a miRNA Regulamento9. Os dois aninhados CCND1 específicos frente primers foram complementares à região imediatamente adjacente e a jusante do CCND1 códon de parada. Embora toda transcriptoma sequenciamento juntamente com ferramentas de bioinformatic específico pode ser usado para detectar fusões gene dentro do 3' UTR10, muitos laboratórios podem não ter os recursos financeiros ou bioinformatic perícia para fazer uso desta tecnologia. Portanto, 3' corrida é uma alternativa para novo de identificação e validação de genes de fusão novela envolvendo a 3' UTR. Considerando o drástico aumento no número de genes de fusão relatados, bem como ler as transcrições, 3' corrida tornou-se uma poderosa ferramenta na caracterização de gene sequências11,12. Além disso, estudos recentes demonstraram que diferentes sequências dentro a 3' UTR, bem como o comprimento de 3' UTR pode afetar a estabilidade de transcrição do mRNA, localização, Traduzibilidade próprios e função13. Devido em parte ao crescente interesse no mapeamento da transcriptoma, tem havido um aumento no número de diferentes polimerases de DNA, sendo desenvolvido para uso em laboratório. É importante determinar que tipos de modificações podem ser feitos para o 3' protocolo de corrida em a fim de utilizar o repertório disponível de polimerases de DNA.
Este trabalho de adaptação 3' corrida para mapear o inteiro 3' UTR de relatórios, o PAS e 3' final local de clivagem da transcrição de ANKHD1 usando aninhados cartilhas dentro da seção de ANKHD1 de transcrição e dois diferentes polimerases de DNA.
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Protocol
Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança em todos os momentos durante a execução de todos os procedimentos no presente protocolo. Certifique-se que recipientes/tubos contendo o reagente de isotiocianato de fenol e guanidina só são abertos em um capuz certificada e descarte de resíduos de fenol em um recipiente designado. Use os reagentes, dicas e tubos estéreis DNAse/RNAse-livre.
1. cultura de pilha
- Crescer a linhagem de células HeLa e dois suspensão manto linfoma célula linhas celulares, Granta-519 e Jeko-1, em DMEM contendo 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C. Diluir as células 01:10... e contar usando um contador de partículas14.
- Para a extração de RNA, placa 500.000 células/poço em um prato bem 6 (mídia de 2 mL por alvéolo). Após incubação de 24h, colete o RNA das células.
2. extração do RNA
- Colheita de células
Nota: Com exceção da etapa de centrifugação, execute todas as etapas listadas em um capuz de cultura de tecidos para manter a esterilidade.- Para células de suspensão (Jeko-1 e Granta-519):
- Transfira as células (juntamente com 2 mL de mídia) para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.725 x g, durante 5 min. Aspire a mídia e deixar o centrifugado no fundo do tubo.
- Ressuspender as células em 50 µ l de 1 x salino de tampão fosfato (PBS). Adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada amostra no tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Misture bem e deixe em temperatura ambiente (RT) por 5 min enquanto inversão do tubo microcentrifuga cada 1 min.
- Para células aderentes (HeLa):
- Aspire o meio de cultura celular de cada poço. Adicione 1 mL de PBS a cada poço para lavar fora os detritos.
- Remova a PBS e adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada poço.
- Incube a RT por 5 min com balanço suave. Transfira para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Para células de suspensão (Jeko-1 e Granta-519):
- Lise celular
- Congele a mistura de célula isotiocianato fenol e guanidina a-20 º C por 1h.
Nota: A mistura pode ser deixada a-20 ° C durante a noite ou até que seja necessário. - Descongele o fenol e guanidina isotiocianato mistura de células no gelo. Adicione 100 µ l de clorofórmio para o tubo de microcentrifugadora em uma capa PCR. Vórtice a amostra para 10-15 s até que a mistura é opaco e cor de rosa. Incube a amostra no gelo (a 4 ° C) por 15 min.
- Centrifugar a amostra por 15 min a 20.800 x g e 4 ° C. Remova cuidadosamente a fase aquosa incolor superior (~ 200 µ l) e a transferência para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Congele a mistura de célula isotiocianato fenol e guanidina a-20 º C por 1h.
- Precipitação do RNA
- Adicione um volume igual de isopropanol para cada amostra. Adicione 1 µ l de coprecipitant (consulte a Tabela de materiais) para cada amostra para agir como um portador para o RNA e ajudar a visualizar o RNA em etapas subsequentes. Incube a amostra a-80 ° C durante pelo menos 4 h. Para melhores resultados, incubar durante uma noite a-80 ° C.
- Transferi a amostra para uma centrífuga de refrigeração. Centrífuga para 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; o RNA aparecerá como uma mancha azul na parte inferior do tubo. Remova cuidadosamente o isopropanol da amostra. Adicionar 500 µ l de etanol 80% e resuspenda o pellet vortexing brevemente por 3 s.
- Centrifugue a amostra a 20.800 x g em RT 5 min. Retire todo o etanol da amostra. Deixe a amostra secar ao ar por cerca de 10 min. Ressuspender a amostra em 35 µ l de água livre de RNAse. Coloque em um bloco de calor (65 ° C) por 5 min garantir que o RNA é totalmente em solução e imediatamente colocar o tubo no gelo.
- Determine a concentração de RNA total usando um spectrophotometer conforme descrito anteriormente, exceto o uso de 1,5 µ l da amostra do RNA em vez de 1 µ l15. Opcionalmente, execute 1 µ g de RNA total em um gel de agarose a 1% para determinar a integridade do RNA.
3. DNase tratamento
- Após a quantificação do RNA, realizar o tratamento de DNAse sobre o RNA total de degradar qualquer DNA genômico. Para cada amostra, adicione os seguintes reagentes do kit de DNAse RNAse-livre para fazer uma reação de total de 20 µ l misture em um tubo de microcentrifugadora separada:
- Misture 2 µ l de DNase 10 X amortecedor da reação com 4,4 µ g de RNA total. Trazer para um total de 14 µ l com água.
- Adicione 2 µ l de RNase-livres DNAse. Incube a 37 ° C por 30 min na presença de 2 µ l de inibidor de RNase (do Kit de transcrição reversa).
- Adicione 2 µ l da solução de paragem e calor em um bloco de calor por 10 min a 70 ° C para inativar a enzima DNAse.
Nota: O tratamento de DNAse é opcional.
4. síntese de cDNA
Para um volume final de reação de 50 µ l:
- Para um volume final de reação de 50 µ l: transferência 22 µ l do DNase tratados RNA para um novo tubo ou transferência 4 µ g de RNA total com água adicionada a um volume total de 22 µ l para um novo tubo. Adicione 2 µ l da T7 oligo dT25 primeira demão da solução de primer 10 µM. A sequência para o primer de25 T7 oligo dT é 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- O kit de transcrição reversa adicione 2 µ l do inibidor de RNase (20 U / µ l), 8 µ l de tampão de reação a 5x, 4 µ l de dNTPs 10 mM e 2 µ l da transcriptase reversa (200 U / µ l).
Nota: Configure uma reação sem transcriptase reversa para atuar como um controle negativo. - Incube a 42 ° C por 1 h. transferência diretamente para o gelo. Aqueça o tubo a 75 ° C por 5 min e colocar o tubo no gelo.
5. primer busca de transcrição do Gene de fusão
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Projeto da primeira demão
- Baixar a sequência do cDNA do navegador genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar uma região dentro a ORF da transcrição alvo (ANKHD1) montante do códon de parada. Copie e cole a toda a região (até 700 nucleotídeos) que contêm sequências montante do códon de parada para a região de entrada de sequência de software do projeto da primeira demão (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- Selecione a opção de design personalizado exibir e selecionar 10 para o número de primers que o sistema deve gerar (resultados retorno) e deixar todos os outros parâmetros definidos como padrão.
- Escolha cinco primers para a frente e duas primeiras demão reversos que não se sobreponham. Ordenar as primeiras demão e reconstituir com água RNAse/DNAse-livre para uma concentração final de 10 µM. Mais detalhes sobre o projeto da primeira demão geral para PCR são cobertos em outro lugar16.
-
PCR para identificar potenciais primers para uso em subsequentes 3' corrida
Nota: Para determinar os finais frente primers para usar na reação, teste os primers projetados pela criação de combinações diferentes de primers para diante e reversos para o PCR regular em uma capa PCR.- Transferi o cDNA (2 µ l) para um tubo PCR de 0,5 mL. Adicione 1 µ l do primer para a frente e 1 µ l do primer reverso (a partir de uma solução de primeira demão de 10 mM). Fazer até 12,5 µ l adicionando 8,5 µ l de água livre de nuclease. Adicione 12,5 µ l do 2 x Gel-para-PCR Master Mix.
- Use as seguintes condições ciclagem térmicas de PCR: 95 ° C por 2 min, seguido por 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min. definir o ciclo final a 68 ° C por 7 min.
- Após a PCR, execute os produtos em um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Detalhes de eletroforese são como descritos anteriormente com algumas modificações17.
- Dissolva 1 g de agarose em 100 mL de tampão Tris-Acetato (TAE) em um balão de 250 mL. Ferver no microondas.
- Deixar arrefecer durante 1 min e adicionar 7,5 µ l de solução de brometo de etídio (estoque de 10 mg/mL) em uma coifa. Misturar bem, agitando o frasco e despeje em um aparelho de gel horizontal. Deixe às RT a coifa pelo menos 30 min permitir que o gel solidificar.
- Cubra o gel com 1 x TAE de buffer e carregar 10 µ l do produto do PCR para o gel de agarose juntamente com 3 a 5 µ l de escada do peso molecular de ADN. Em 175 V por 10 min. Visualizar os produtos usando um gerador de imagens ou se ainda mais a separação de produtos for necessária, execute o gel para um adicional 5-10 min.
-
Seleção de primers aninhados para 3' corrida
- Analise os resultados do gel do agarose PCR para selecionar primários que têm uma banda única, distinta e forte do PCR. Usar o primer mais 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') juntamente com a primeira demão25 oligodT T7 em PCR primeiro executar.
- Selecione o primer aninhado que está localizado a jusante do primeiro primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e usá-lo com o primer T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') no segundo conjunto de reações de PCR.
6. otimização 3' corrida para mapear o 3' UTR usando duas enzimas diferentes
Nota: Tem havido um aumento na diversidade de polimerases de DNA usado para PCR; Portanto, nós queríamos determinar condições padrão que podem ser aplicadas mesmo quando usando enzimas diferentes para reações de PCR de corrida de 3'. Primers para qualquer transcrição reversos são mantidos constantes; as únicas mudanças são nos primers frente aninhados que são específicos para a transcrição do alvo.
-
Protocolo 1:3 ' corrida usando uma polimerase de DNA modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu)
- Primeiro PCR
- Transferir 1 μL de cDNA para um tubo PCR e adicionar 5 µ l de buffer de reação 10 x Pfu . Adicione 1 µ l da primeira cartilha frente aninhada, 1 µ l do primer T7 oligodT25 e 1 µ l de dNTPs (a partir de uma solução de 10 mM).
- Fazer o volume total de até 49 µ l adicionando 40 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase e misture bem. Execute o PCR usando o perfil PCR na tabela 1.
- Segundo PCR
- Transferir 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo PCR e misturar com 5 µ l de buffer de reação Ultra II de Pfu10 x. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado, 1 µ l do T7 primer e 1 µ l de dNTPs (solução de 10 mM).
- Fazer até 49 µ l total reaccional adicionando 39 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 1).
- Primeiro PCR
-
Protocolo 2:3 ' corrida usando uma DNA polimerase quimérico, consistindo de um domínio de ligação do DNA fundido a um Pyrococcus-como revisão mistura de mestre polimerase PCR
- Primeiro PCR
- Transferi 1 μL de cDNA para um tubo PCR. Adicione 1 µ l do primeiro primer aninhado para a frente e 1 µ l do primer T7 oligodT25 . Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água.
- Adicione 25 µ l de 2 x PCR Master Mix e misture bem. Use as condições PCR ciclismo descritas na tabela 2.
- Segundo PCR
- Transferi 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo de PCR. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado junto com 1 µ l do T7 primer reverso.
- Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água. Adicione 25 µ l de 2 X PCR Master Mix. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 2).
- Primeiro PCR
7. Verifique se o segundo produto PCR de 3' corrida.
- Tome 5 a 10 µ l do segundo produto da PCR (bem como produto da primeira rodada de PCRs se a transcrição é abundantemente expressa) e executar em um gel de agarose. Configurar o gel e executar a eletroforese como descrito anteriormente (passos 5.2.3.1 para 5.2.3.3). Visualize resultados em uma imagem.
8. sequenciamento e purificação do produto
- Purifica os produtos PCR gel de segunda PCR usando o Gel e sistema de Clean-Up do PCR fragmento de DNA, conforme o protocolo do fabricante.
- Executar Sanger sequenciamento (em alternativa, enviar o gel purificada primers de sequenciamento adequado para um laboratório de sequenciamento e amostras de produtos PCR). Analisar os dados de sequenciamento Sanger após o sequenciamento.
- Download de software de análise de sequência (ver Tabela de materiais) e importar os arquivos de rastreamento para o software. Uso o individual pura Base QVs (qualidade valores) para obter a Base chamar informações18. Baixe o cromatograma com traços de alta qualidade para visualização.
Opcional: O produto purificado de gel pode ser clonado usando um kit de clonagem apropriado e os clones isolados enviados para Sanger sequenciamento.
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Representative Results
Pesquisa de Primer frente aninhados:
O gel de agarose de A Figura 1 mostra dois produtos distintos de gel PCR (faixas 1 e 2) que uso o mesmo encaminhar a cartilha mas diferentes cartilhas reversos. 3 Lane tem um produto PCR distinto e tem uma distinta cartilha frente e verso. Os primers ideais para usar para a reação de PCR com base são aqueles que dão um produto PCR distinto (faixa 3). O primer para a frente, usado nas faixas 1 e 2 dá a banda mais forte e dá os maiores produtos PCR (esperados) e é usado como a primeira cartilha para a frente. A segunda cartilha aninhada para o segundo conjunto de reações de PCR em 3' corrida é o primer para a frente da pista 3.
As polimerases de DNA diferente usado em 3' corrida produzem resultados semelhantes:
Dois diferentes polimerases de DNA produziram os mesmos produtos PCR porte apesar de ter diferentes condições de ciclagem do PCR para a 3' corrida (Figura 2). Há somente uma faixa distinta para o esperado produto da PCR. Tudo menos transcriptase reversa controles negativo (-) não têm uma banda, não mostrando nenhuma contaminação genoma do RNA usado na síntese de cDNA, bem como em reações a jusante subsequentes.
Sequenciamento Sanger resulta:
Os produtos PCR foram gel purificada e enviado para Sanger sequenciamento. Os resultados mostrados na Figura 3A mostram uma porção de um cromatógrafo sequência de Sanger sequenciamento. Uma representante sequência identifica a localização do codão stop, sinal de poliadenilação putativo e o local de clivagem, bem como o poli (A) cauda no 3' corrida produto (Figura 3B).
Figura 1: identificação de dois primers de frente específico gene aninhados para usar em 3' corrida. Mostrado é um exemplo de produtos PCR de diferentes combinações de genes específicos para a frente e reversos primeiras demão usando cDNA HeLa executar em um brometo de ethidium manchado de gel de agarose com a escada de peso molecular (mw). Faixas 1 e 2 são produtos do PCR do mesmo gene específico para a frente da primeira demão, mas diferentes cartilhas reversos. As setas apontam para o produto do PCR esperado para cada raia. Além da banda para o produto do PCR esperado, há uma banda adicional. O único produto PCR em Lane 3 é de diferentes genes específicos aninhados para a frente e verso primário e mostra a banda única e esperada.
Figura 2: verificação de 3' corrida produtos a partir do segundo conjunto de reações de PCR. Produtos da reação de PCR segundo com o polymerase (um) Pfu DNA polimerase e DNA Quimérico (B) foram executados em um gel de agarose com brometo de etídio. Lanes, representados por (-) são da amostra para cada linha de celular controle negativo quando a síntese do cDNA de RNA foi executada na ausência da enzima transcriptase reversa. Faixas 1 e 2 são produtos PCR de réplicas biológicas de cada linhagem celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: mapeamento dos produtos PCR de 3' corrida. (A), A porção de um cromatograma de sequência de um gel purificada 3' corrida produto mostrando o sinal de poliadenilação previsto e a localização da cauda poli (a). Representante (B) sequências de dados de sequenciamento Sanger mostrando o códon de parada, o sinal de poliadenilação (PAS), o site de clivagem e a fixação da cauda poli (a), bem como uma seção das sequências de cauda poli (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Etapa do ciclo | Temperatura e duração | Número de ciclos |
| Desnaturação inicial | 95 ° C por 3 min | 1 |
| Inicial de recozimento e extensão | 50 ° C por 5 min e 72 ° C por 10 min | 1 |
| Subcyles (desnaturação, recozimento e extensão) | 95 ° C por 40 s, 50 ° C por 1 min e 72 ° C por 3 min | 20 |
| Ciclo final (desnaturação, recozimento e extensão) | 95 ° C por 40 s, 50 ° C por 1 min e 72 ° C por 15 min | 1 |
| Segure | 4 ° C, ∞ |
Tabela 1: Pfu DNA polimerase PCR ciclismo condições para 3' corrida.
| Etapa do ciclo | Temperatura e duração | Número de ciclos |
| Desnaturação inicial | 98 ° C por 3 min | 1 |
| Inicial de recozimento e extensão | 50 ° C por 5 min e 72 ° C por 10 min | 1 |
| Subcyles (desnaturação, recozimento e extensão) | 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 1 min e 72 ° C por 4 min | 20 |
| Ciclo final (desnaturação, recozimento e extensão) | 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 1 min e 72 ° C por 15 min | 1 |
| Segure | 4 ° C, ∞ |
Tabela 2: Quimérico DNA polimerase PCR ciclismo condições.
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Discussion
Apesar do advento das tecnologias de sequenciação paralelo maciço, numa base de gene-gene-por, 3' corrida continua a ser o método mais fácil e mais econômico para identificar o PAS e nucleotídeos adjacentes à cauda poli (a). A adaptação descrita aqui expande usando 3' corrida para amplificar e mapear sequências que incluem uma parte da ORF, o códon de parada e o inteiro 3' UTR a transcrição do mRNA de ANKHD1 . Uma grande vantagem do 3' corrida é que, com algumas adaptações menores, produtos de 3' corrida podem ser clonados em outros vetores para facilitar o interrogatório a jusante de 3' função UTR incluindo miRNA direcionamento, ensaios de estabilidade, bem como outros ensaios mecanicistas. Isso pode ser feito, incluindo sites de enzima de restrição dentro do primer aninhados sequências9,10. Ajustes podem ser feitos para incluir somente os 3' UTR sem quaisquer sequências de ORF para clonagem para 3' UTR5ensaios funcionais.
Um determinante importante do sucesso da corrida de 3' é o desenvolvimento das primeiras demão aninhadas que destino o gene de interesse. As sequências de cDNA do navegador do genoma de Ensembl são recomendadas para melhor identificar as regiões sem polimorfismos para desenvolver as primeiras demão ideal. Idealmente, vários aninhados encaminhar as primeiras demão, bem como pelo menos duas primeiras demão reversos dentro do gene de interesse podem ser exibidas usando PCR padrão para identificar os melhor dois aninhados gene específico primers para usar. Neste estudo, o primeiro gene específico para frente primer selecionado para 3' corrida inicialmente deu duas bandas com PCR padrão usado rotineiramente no laboratório. Infelizmente, o projeto da primeira demão foi limitado pelo número significativo de SNPs na transcrição de interesse. SNPs na transcrição do alvo levam a incompatibilidade entre os primers e o alvo, que pode resultar em recozimento ineficiente e amplificação e deve ser reduzido para um mínimo de19. A presença de pelo menos quatro SNPs em uma cartilha, ou a ocorrência de uma combinação de cinco incompatibilidades (cartilha de três em um e dois no outro) pode resultar em inibição completa da reação de PCR, e, portanto, a única opção é desenhar mais primeiras demão20. Em vez de projetar primers mais para obter uma única banda para o padrão que PCR usado para a pesquisa da primeira demão nas experiências relatadas aqui, as condições de ciclagem do PCR e os polymerases do DNA usados posteriormente em 3' corrida foram alterados a fim de otimizar a probabilidade de recebendo uma faixa específica. A temperatura de desnaturação foi aumentada a 98 ° C, por um dos polymerases do DNA (um aumento de 95 ° C utilizado na busca da primeira demão). Para ambos os polymerases do DNA usados em 3' corrida de PCR, a duração de desnaturação inicial foi aumentada para 3 min em vez do recomendado 30 s para 2 min para desnaturar completamente o modelo de cDNA. A cartilha do T7 oligo dT25 por exemplo prevê-se que potencialmente formulário fraco estruturas secundárias, que podem reduzir a disponibilidade das primeiras demão21. Aumentar o comprimento inicial de desnaturação e temperatura quebra qualquer estruturas secundárias e ajuda a produzir a única banda específica após o último ciclo de 3' corrida. Além disso, a banda não-específica foi mais leve que as bandas esperadas, sugerindo que ele apareceu no maior PCR ciclos (até 35); limitar os ciclos PCR para apenas 20 reduz a amplificação da banda não-específica.
Outro potencial de 3' corrida, como outras reações de PCR com base, é incompleta amplificação do alvo região22. Portanto, para ambas as enzimas termofílicas a temperatura do recozimento inicial foi fixada em 50 ° C por 5 min otimizar o recozimento dos primers para o destino... e este foi seguido por uma temperatura inicial de extensão a 72 ° C por 10 min. O ciclo final do PCR para cada enzima tinha um tempo de extensão final de 15 min a 72 ° C. Esses passos de extensão eram mais do que os recomendados pelos fabricantes dos polymerases do DNA. A etapa de longa extensão (alongamento) permite a síntese completa de amplicons incompleta, permitindo a extensão completa dos produtos amplificação inicial e final16.
Etapas PCR que ocorrem em 3' corrida são altamente sensíveis, assim podem detectar DNA genômico (ou outra contaminação de DNA) em vez da transcrição do mRNA alvo, resultando em várias bandas inesperadas no gel de22. Uma maneira para evitar a contaminação é realizar o trabalho PCR em uma capa PCR dedicada, use luvas e usar reagentes limpos e esterilizados tubos estéreis e pipetar dicas. No PCR regular, primers para diante e reversos podem ser projetados para que eles estão localizados em diferentes exões (através de cartilhas intrão); desta forma, um produto PCR anormalmente grande iria significar que uma região contendo um intrão tem sido amplificada. No entanto, isto pode não sempre ser viável no caso em que somente o 3' UTR sequência, localizada dentro o mesmo exon terminal, é o alvo para a amplificação de corrida 3'. Como alternativa, o RNA pode ser previamente tratado com enzima DNAse antes síntese do cDNA. O uso do primer T7 oligo dT25 para aprontar a reação transcriptase reversa em vez de um hexanucleotide aleatório para primeira síntese do cDNA de Costa do RNA também diminui a amplificação dos produtos genômicas. Por último mas não menos importante, configurar um controle negativo (o "–" pistas na Figura 2), onde a síntese do cDNA é configurado na ausência de transcriptase reversa é altamente recomendado. O controle passa por medidas idênticas para as outras amostras nos procedimentos subsequentes 3' corrida. A presença de uma banda nesse controle significa potencial contaminação de DNA genômica.
Apesar dos desafios acima mencionados, 3' corrida é uma poderosa ferramenta no mapeamento 3' extremidades numa base de genes individuais. O advento da tecnologia de última geração tem levado a um aumento do repertório de transcrições que têm alternativa 3' extremidades resultantes de poliadenilação alternativa, que pode ou não envolver splicing alternativo. Para aumentar a complexidade, em células cancerosas, rearranjos cromossômicos são frequentes e podem resultar em fusão de genes oncogênicos produtos23. A fusão entre os dois genes pode envolver a ORF ou, em alguns casos, envolvem apenas sequências dentro do 3' UTR9,10. Além disso, também existem em conjunto/co-transcribed genes, que são transcritas simultaneamente, mas podem ser traduzidos em proteínas diferentes11. 3' corrida pode ser adaptado para mapear todas estas transcrições originais, anormais, bem como transcrições normais. Isto é importante porque essas transcrições anormais podem acabar servindo como biomarcadores específicos de doença ou alvos de drogas específicas, por exemplo, a droga imatinibe alveja o gene de fusão BCR-ABL1 em câncer.
Portanto, 3' corrida é uma técnica altamente versátil que pode ser usada para amplificar as transcrições normais, identificar romance 3' UTRs e fusões de gene romance dentro do 3' UTR5,9. Neste relatório, 3' corrida foi usado para amplificar e mapear o códon de parada, o PAS e o inteiro 3' UTR da transcrição ANKHD1 usando diferentes polimerases de DNA. A abordagem descrita pode ser usada para mapear a extremidade 3' de qualquer transcrição polyadenylated.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer Bettine Gibbs para sua ajuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
