Summary
De twee verschillende 3' snelle versterking van cDNA uiteinden (3' RACE) protocollen beschreven hier maken gebruik van twee verschillende polymerase van DNA sequenties die bevatten een segment van het open leesraam (ORF), de stop codon en de gehele 3' UTR van een afschrift van het gebruik van RNA in kaart verkregen cellijnen van andere kanker.
Abstract
Rijping van eukaryotische mRNAs omvat 3' eind vorming, waarbij de toevoeging van een poly(A) staart. Om de kaart van de 3'-eind van een gen, is de traditionele methode van keuze 3' de snelle versterking van cDNA uiteinden (3' RACE). Protocollen voor 3' RACE vereisen het zorgvuldige ontwerp en de selectie van genestelde inleidingen binnen de 3' niet-vertaalde regio (3' UTR) van het target-gen van belang. Echter, met een paar wijzigingen het protocol kan worden gebruikt met de gehele 3' UTR en sequenties binnen het open leesraam (ORF), die een vollediger beeld van de relatie tussen de ORF en de 3' UTR. Dit is naast de identificatie van het polyadenylatie signaal (BK), evenals de website van het decolleté en polyadenylatie geboden door conventionele 3' RACE. Uitgebreide 3' RACE kan detecteren ongebruikelijke 3' UTRs, met inbegrip van gene fusies binnen de 3' UTR, en de reeks informatie kan worden gebruikt om te voorspellen van potentiële miRNA bandplaatsen evenals AU rijke destabiliserende elementen die de stabiliteit van het transcript kunnen beïnvloeden.
Introduction
De vorming van de 3'-eind is een cruciale stap in de maturatie van mRNA dat bestaat uit het splijten van de pre-mRNA stroomafwaarts van een PAS gevolgd door de toevoeging van ~ 250 untemplated adenines, waaruit de poly(A) staart1,2. De poly(A)-bindend-proteïne (PABP) bindt aan de staart van de poly(A), en dat de transcriptie van mRNA beschermt tegen afbraak, en vergemakkelijkt vertaling1.
Huidige schattingen blijkt dat 70% van menselijke genen meerdere PASs hebben, en dus het ondergaan van alternatieve polyadenylatie, wat resulteert in meerdere 3' einden3. Het is dus belangrijk om te identificeren waar de poly(A) staart hecht aan de rest van de 3' UTR, evenals het identificeren van de PAS gebruikt door een bepaald afschrift. De komst van de volgende generatie sequencing heeft geleid tot de gelijktijdige identificatie van de 3' UTRs en de PASs van duizenden genen. Deze toename van sequencing mogelijkheden heeft de ontwikkeling van bioinformatic algoritmen voor het analyseren van gegevens met betrekking tot alternatieve polyadenylatie van de 3'-eind vereist. Voor de detectie van DOVO of validering van de PAS en vandaar in kaart brengen van 3' eind van afzonderlijke genen van grootschalige sequencing gegevens, blijft 3' RACE de methode van keuze4,5. De sequenties die zijn opgenomen in de cDNA producten van 3' RACE normaal bevatten slechts een gedeelte van de 3' UTR waarin de poly(A) staart, de breukzijde, de PAS en de sequenties stroomopwaarts van de PAS. In tegenstelling tot de PCR, waarvoor het ontwerp en gebruik van gene specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen, vereist 3' RACE alleen twee gene specifieke geneste voorwaartse primers. Vandaar, PCR vereist een meer gedetailleerde kennis van de nucleotide-volgorde van een groot gebied van het gen wordt versterkte4,6. Aangezien 3' RACE gebruikt keren hetzelfde primer dat doelstellingen de poly(A) staart voor alle polyadenylated RNA afschriften, alleen de voorwaartse inleidingen moeten gene specifieke, dus alleen vereist kennis van een aanzienlijk kleinere regio van het mRNA. Hierdoor is de versterking van de regio's waarvan sequenties niet volledig gekenmerkt4,7 zijn. Dit heeft toegestaan 3' RACE worden gebruikt niet alleen om te bepalen van de 3'-eind van een gen, maar om ook bepalen en karakteriseren van grote gebieden stroomopwaarts van de PAS die een aanzienlijk deel van de 3' UTR vormen. Door het combineren van 5' RACE met de gewijzigde 3' RACE die grotere porties van de 3' UTR en flankerende gebieden omvat, is het mogelijk om volledig volgnummer of kloon van een hele mRNA transcriptie van het einde 5' aan de 3'-eind8.
Een voorbeeld van deze toepassing van gemodificeerde 3' RACE is de recente identificatie van een roman CCND1-MRCK fusion gene transcriptie van mantel cel lymfoom cellijnen en kankerpatiënten. De 3' UTR bestond uit sequenties van genen van zowel de CCND1 als MRCK en was recalcitrante aan miRNA voorschrift9. De twee geneste CCND1 specifieke voorwaartse primers zijn complementair aan de regio onmiddellijk aangrenzende en "downstream" van de CCND1 stop codon. Hoewel de hele transcriptoom sequentie samen met specifieke bioinformatic hulpmiddelen kan worden gebruikt voor het detecteren van gene fusies binnen de 3'-UTR10, vele labs kunnen onvoldoende financiële middelen of bioinformatic deskundigheid om te maken gebruik van deze technologie. Vandaar, 3' RACE is een alternatief voor DOVO identificatie en validatie van nieuwe fusion genen met betrekking tot de 3' UTR. Gezien de drastische toename van het aantal gerapporteerde fusion genen, alsmede afschriften doorlezen, 3' RACE uitgegroeid tot een krachtig instrument in het karakteriseren van gen-sequenties11,12. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat verschillende reeksen binnen de 3' UTR, evenals de lengte van de 3' UTR kan invloed hebben op mRNA transcript stabiliteit, lokalisatie, vertaalbaarheid en functie13. Gedeeltelijk het gevolg van een verhoogde belangstelling voor in kaart brengen van de transcriptome, is er een toename van het aantal verschillende polymerase van DNA wordt ontwikkeld voor gebruik in het lab. Het is belangrijk om te bepalen wat typen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de 3' wedstrijdprotocol in om te gebruiken het beschikbare repertoire van de polymerase van DNA.
Dit werk verslagen aanpassing 3' RAS om de gehele 3' UTR in kaart, de PAS, en de 3' eind breukzijde van het afschrift van de ANKHD1 met behulp van geneste inleidingen binnen de ANKHD1 afdeling van de chat-kopie en twee verschillende DNA-polymerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril dragen te allen tijde tijdens het uitvoeren van alle procedures in dit protocol. Ervoor zorgen dat de containers/buizen met de fenol en guanidine isothiocyanaat reagens alleen worden geopend in een gecertificeerde kap, en de afzet van fenol afval in een container aangewezen. Het gebruik van steriele buizen DNAse/RNAse-vrije, tips, en reagentia.
1. de celkweek
- Groeien de cellijn van HeLa en twee schorsing mantel cel lymfoom cellijnen, Granta-519 en Jeko-1, in DMEM met 10% FBS en 100 U/mL penicilline/streptomycine in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C. De cellen 1:10 verdunnen en tellen met behulp van een deeltje teller14.
- Plaat voor RNA extractie, 500.000 cellen per putje in een 6 goed bord (media 2 mL per putje). Na incubatie gedurende 24 h, RNA te verzamelen uit de cellen.
2. RNA extractie
- Oogsten van cellen
Opmerking: Met uitzondering van de stap van centrifugeren, voeren alle vermelde stappen in de kap van een weefselkweek te handhaven van de steriliteit.- Voor schorsing cellen (Jeko-1 en Granta-519):
- Centrifugeer bij 1,725 x g gedurende 5 min. Aspirate de media, de cellen (samen met 2 mL media) overbrengen in een tube van 15 mL, en laat de cel pellet in de onderkant van de buis.
- Resuspendeer de pellet cel in 50 µL van 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS). Voeg toe 500 µL van monofasische fenol en guanidine isothiocyanaat reagens aan elk monster in de buis 1,5 mL microcentrifuge. Meng goed en laat op kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten terwijl het omkeren van de buis microcentrifuge elke 1 min.
- Voor Adherente cellen (HeLa):
- De cel cultuurmedia van elk putje gecombineerd. Voeg 1 mL PBS aan elk putje te wassen uit puin.
- Verwijder de PBS en 500 µL van monofasische fenol en guanidine isothiocyanaat reagens toevoegen aan elk putje.
- Incubeer bij RT gedurende 5 min met zachte rockende. Overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Voor schorsing cellen (Jeko-1 en Granta-519):
- Lysis van de cel
- Het bevriezen van de fenol en guanidine isothiocyanaat cel mengsel bij-20 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: De mix kan worden gelaten bij-20 ° C's nachts of totdat het nodig is. - Ontdooi de fenol en guanidine isothiocyanaat cel mengsel op ijs. Voeg 100 µL chloroform aan de buis van de microcentrifuge in de kap van een PCR. Vortex het monster voor 10-15 s tot het mengsel roze en ondoorzichtig. Incubeer het monster op ijs (bij 4 ° C) gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten op 20,800 x g- en 4 ° C. Verwijder voorzichtig de bovenste kleurloze waterfase (~ 200 µL) en transfer naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Het bevriezen van de fenol en guanidine isothiocyanaat cel mengsel bij-20 ° C gedurende 1 uur.
- RNA neerslag
- Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol aan elk monster. Voeg 1 µL van coprecipitant (Zie Tabel van materialen) aan elk monster om te fungeren als een drager voor RNA en helpen visualiseren het RNA in opeenvolgende stappen. Incubeer het monster bij-80 ° C gedurende ten minste 4 uur. Voor de beste resultaten, na een nacht bebroeden bij-80 ° C.
- Het monster overbrengen in een gekoelde centrifuge. Centrifugeer gedurende 35 min bij 20.800 x g / 4 ° C; het RNA wordt weergegeven als een blauw stipje op de onderkant van de buis. Verwijder voorzichtig het isopropanol uit het monster. Voeg 500 µL van 80% ethanol en resuspendeer de pellet door kort vortexing voor 3 s.
- Centrifugeer het monster bij 20.800 x g bij RT gedurende 5 min. verwijderen alle de ethanol uit het monster. Laat het monster drogen voor ongeveer 10 min. resuspendeer de steekproef in 35 µL van RNAse-gratis water. Plaats op een warmte blok (65 ° C) gedurende 5 minuten om ervoor te zorgen dat de RNA volledig in oplossing is, en onmiddellijk plaats de buis op ijs.
- Bepaal de concentratie van totale RNA met behulp van een spectrofotometer zoals eerder beschreven, behalve 1.5 µL van het RNA-monster gebruiken in plaats van 1 µL15. Eventueel 1 µg totaal RNA worden uitgevoerd op een 1% agarose gel om de integriteit van RNA.
3. DNase behandeling
- Voer na kwantificering van het RNA, DNAse behandeling op de totale RNA te degraderen alle genomic DNA. Voor elk monster, voegt u de volgende reagentia uit de RNAse-Vrije DNAse kit om een totale reactie van 20 µL Meng in een aparte microcentrifuge buis:
- Meng 2 µL DNase 10 X reactie buffer met 4.4 µg totaal RNA. Brengen tot een totaal van 14 µL met water.
- Voeg 2 µL van RNase-Vrije DNAse. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het bijzijn van 2 µL van RNase remmer (uit de Reverse transcriptie Kit).
- Voeg 2 µL van stoppen oplossing en warmte op een warmte blok gedurende 10 minuten bij 70 ° C tot de inactivering van het enzym DNAse.
Opmerking: DNAse behandeling is optioneel.
4. cDNA synthese
Voor een definitieve reactie volume van 50 µL:
- Voor een definitieve reactie volume van 50 µL: overdracht 22 µL van de DNase RNA getrakteerd op een nieuwe buis of overdracht 4 µg totaal RNA met toegevoegde water tot een totaal volume van 22 µL aan een nieuwe buis. Voeg 2 µL van de T7 oligo dT25 primer van 10 µM primer oplossing. De volgorde voor de T7 oligo dT25 primer is 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- Uit de Reverse transcriptie kit 2 µL van de RNase remmer (20 U/µL), 8 µL van de 5 x reactie buffer, 4 µL van 10 mM dNTPs en 2 µL van de Reverse-transcriptase (200 U/µL) toevoegen.
Opmerking: Instellen een reactie zonder reverse-transcriptase fungeren als een negatieve controle. - Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 h. overdracht rechtstreeks aan het ijs. Verwarm de buis op 75 ° C gedurende 5 minuten en plaats de buis op ijs.
5. primer Fusion Gene Transcript zoeken
-
Primer ontwerp
- De volgorde van cDNA downloaden vanuit de browser genoom Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) en de identificatie van een regio binnen de ORF van het doel transcript (ANKHD1) stroomopwaarts van de stop codon. Kopiëren en plakken van de hele regio (tot 700 nucleotiden) met sequenties stroomopwaarts van de stop codon in de reeks post regio van de primer designsoftware (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- Selecteer de optie van de aangepaste ontwerp weergeven en selecteer 10 voor het aantal inleidingen dat het systeem (resultaten om terug te keren) moet genereren en laat al het andere parameters ingesteld op standaard.
- Kies vijf voorwaartse primers en twee omgekeerde inleidingen die elkaar niet overlappen. Bestel inleidingen en reconstrueren met RNAse/DNAse-gratis water met een eindconcentratie van 10 µM. Meer details over algemene primer design voor PCR vallen elders16.
-
PCR te identificeren van potentiële inleidingen voor gebruik in latere 3' RACE
Opmerking: Om te bepalen van de uiteindelijke voorwaartse inleidingen te gebruiken in de reactie, test de ontworpen inleidingen door het opzetten van verschillende combinaties van voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor regelmatige PCR in de kap van een PCR.- CDNA (2 µL) overbrengen in een tube van de PCR verse 0,5 mL. Voeg 1 µL van de voorwaartse primer en 1 µL van de omgekeerde primer (van een 10 mM primer oplossing). Maximaal 12,5 µL maken door toevoeging van 8,5 µL van nuclease-gratis water. Voeg 12,5 µL van de 2 x PCR-naar-Gel Master Mix.
- Gebruik van PCR thermische fietsen oorzaken: 95 ° C gedurende 2 min gevolgd door 29 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 1 min. de laatste cyclus vastgesteldop 68 ° C gedurende 7 minuten.
- Na PCR, de producten worden uitgevoerd op een 1% agarose gel bevlekt met ethidiumbromide. Details voor elektroforese zijn zoals eerder beschreven met een paar wijzigingen17.
- Los 1 g agarose in 100 mL voor Tris-acetaat (TAE)-buffer in een maatkolf van 250 mL. Koken in een magnetron.
- Laat afkoelen voor 1 min en voeg 7,5 µL van ethidium bromide oplossing (10 mg/mL stockoplossing) in een zuurkast. Meng goed door de kolf zwenken en giet in een horizontale gel-apparaat. Verlaat bij RT in de zuurkast voor minstens 30 min om de gel te stollen.
- Bedek de gel met 1 x TAE buffer en laden 10 µL van het PCR-product op de agarose gel samen met 3-5 µL van de DNA-moleculair gewicht ladder. Op 175 V uitgevoerd voor 10 min. visualiseren de producten met behulp van een imager, en als verdere scheiding van producten noodzakelijk is, voert u de gel voor een extra 5-10 min.
-
Selectie van genestelde inleidingen voor 3' RACE
- Het analyseren van de resultaten van de PCR agarose gel te selecteren van de inleidingen die een duidelijke, sterke, één PCR band hebben. De 5' meest primer gebruiken (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') samen met de T7 oligodT25 primer in de eerste PCR uitvoeren.
- Selecteer de geneste primer die zich downstream bevindt van de eerste primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), en met de T7 primer gebruiken (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') in de tweede set van de PCR reacties.
6. optimaliseren van 3' RACE naar kaart de 3' UTR met behulp van twee verschillende enzymen
Opmerking: Er is een toename van de diversiteit van de polymerase van DNA gebruikt voor PCR; Daarom wilden we bepalen standaardvoorwaarden die kunnen worden toegepast, zelfs bij het gebruik van verschillende enzymen voor de 3' RACE PCR reacties. De omgekeerde inleidingen voor een transcript worden constant; gehouden de enige veranderingen zijn in de geneste voorwaartse primers die specifiek voor het doel transcript zijn.
-
Protocol 1:3 ' RACE met behulp van een gemodificeerde polymerase van DNA uit Woesei Pyrococcus (Pfu)
- Eerste PCR
- 1 µL van cDNA overbrengen in een PCR-buis en voeg 5 µL van 10 x Pfu reactie buffer. Voeg 1 µL van de eerste geneste voorwaartse primer, 1 µL van de T7 oligodT25 primer en 1 µL van dNTPs (van een oplossing van 10 mM).
- Tot 49 µL totale volume maken door 40 µL van water toe te voegen. Voeg 1 µL van de polymerase van DNA van Pfu en meng goed. Voer de PCR met behulp van de PCR-profiel in tabel 1.
- Tweede PCR
- 2 µL van de producten van de eerste PCR overbrengen naar een nieuwe PCR-buis en meng met 5 µL van 10 x PfuUltra II reactie buffer. Voeg 1 µL van de tweede geneste PCR Inleiding, 1 µL van de T7 inleiding en 1 µL van dNTPs (10 mM-oplossing).
- Tot 49 µL totale reactie volume maken door 39 µL van water toe te voegen. Voeg 1 µL van de polymerase van DNA van Pfu . Voer de PCR met behulp van PCR hetzelfde profiel als de eerste PCR setup (tabel 1).
- Eerste PCR
-
Protocol 2:3 ' RACE met behulp van een chimeer polymerase van DNA uit een DNA bindend domein gesmolten tot een Woesei-zoals het corrigeren polymerase-PCR master mix
- Eerste PCR
- 1 µL van cDNA overbrengen in een PCR-buis. Voeg 1 µL van de eerste geneste voorwaartse primer en 1 µL van de T7 oligodT25 primer. Maximaal 25 µL maken door 22 µL van water toe te voegen.
- Voeg 25 µL van 2 x PCR Master Mix en meng goed. Gebruik de PCR fietsen voorwaarden beschreven in tabel 2.
- Tweede PCR
- 2 µL van de producten van de eerste PCR overbrengen naar een nieuwe PCR-buis. Voeg 1 µL van de tweede geneste PCR Inleiding samen met 1 µL van de T7 omgekeerde primer.
- Maximaal 25 µL maken door 22 µL van water toe te voegen. Voeg 25 µL van 2 X PCR Master Mix. Voer de PCR met behulp van PCR hetzelfde profiel als de eerste PCR setup (tabel 2).
- Eerste PCR
7. Controleer of de tweede PCR-product van 3' RACE.
- Neem 5-10 µL van de tweede PCR product (evenals product uit de eerste ronde van PCRs indien het afschrift wordt overvloedig uitgedrukt) and run op een agarose gel. Instellen van de gel en uitvoeren van de elektroforese zoals hiervoor is beschreven (stappen 5.2.3.1 aan 5.2.3.3). Visualiseer resultaten op een imager.
8. product zuivering en Sequencing
- Zuiveren van de gel PCR producten van de tweede PCR met behulp van de Gel en PCR Fragment DNA Clean-Up systeem volgens protocol van de fabrikant.
- Uitvoeren van Sanger sequencing (ook, zenden de gel gezuiverd PCR productmonsters en passende sequencing inleidingen naar een sequencing lab). Analyseren van de gegevens rangschikken na Sanger sequencing.
- Downloadsoftware sequentie-analyse (Zie Tabel van materialen) en de bestanden spoor in de software importeren. Gebruik de individuele PURE Base QVs (kwaliteit waarden) te verkrijgen de Base Bel informatie18. Download het chromatogram met hoge kwaliteit sporen voor weergave.
Optioneel: Het gezuiverde product gel kan worden gekloond met behulp van een passende klonen kit en het geïsoleerde klonen verzonden voor Sanger sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geneste voorwaartse Primer zoeken:
De agarose gel van Figuur 1 toont twee verschillende PCR gel producten (banen 1 en 2) die gebruik hetzelfde toekomen primer maar verschillende omgekeerde inleidingen. Lane 3 heeft een onderscheiden PCR product en heeft een aparte voorwaartse en omgekeerde primer. De ideale inleidingen te gebruiken voor de PCR gebaseerde reactie zijn die een onderscheiden PCR product (Lane 3) geven. De voorwaartse primer gebruikt in rijstroken 1 en 2 geeft de sterkste band geeft de grootste PCR producten (verwacht) en wordt gebruikt als de eerste voorwaartse primer. De tweede geneste primer voor de tweede reeks van PCR reacties in 3' RACE is de voorwaartse primer van Lane 3.
Verschillende DNA-polymerase gebruikt in 3' RACE produceren vergelijkbare resultaten:
De polymerase van DNA voor twee verschillende geproduceerd dezelfde grootte PCR producten ondanks het feit dat verschillende PCR fietsen voorwaarden voor de 3-' RACE (Figuur 2). Er is slechts één duidelijke band voor de verwachte PCR product. Alle van de minus reverse-transcriptase negatieve controles (-) hoeft niet een band, geen genomic besmetting van het RNA gebruikt in cDNA synthese zo goed als in latere downstream reacties tonen.
Sanger Sequencing resultaten:
De PCR-producten waren gel gezuiverd en verzonden voor Sanger sequencing. De resultaten die worden weergegeven in figuur 3A Toon een gedeelte van een reeks chromatograaf van Sanger sequencing. Een representatieve reeks geeft de locatie van de stop codon, vermeende polyadenylatie signaal, en de breukzijde, evenals de poly (A) staart in de RACE product 3' (figuur 3B).
Figuur 1: identificatie van twee geneste gene specifieke voorwaartse inleidingen te gebruiken in 3' RACE. Komt te staan is een voorbeeld van PCR producten van verschillende combinaties van gene specifiek naar voren en omgekeerde inleidingen met behulp van HeLa cDNA draaien op een agarose gel met de ladder molecuulgewicht (mw) gekleurd ethidiumbromide. Rijstroken 1 en 2 zijn PCR producten uit het hetzelfde gen specifieke voorwaartse primer, maar verschillende omgekeerde inleidingen. De pijlen wijzen naar het verwachte PCR-product voor elke baan. Naast de band voor de verwachte PCR product is er een extra band. De één PCR product in Lane 3 is uit een ander gen specifieke geneste vooruit en achteruit primer en toont de enkele verwachte band.
Figuur 2: controle van 3' RACE producten van de tweede reeks van PCR reacties. Producten van de tweede PCR reactie met (een) Pfu DNA Polymerase en (B) chimeer DNA polymerase zijn uitgevoerd op een agarose gel met ethidiumbromide. Rijstroken afgebeeld door (-) zijn uit de steekproef van de negatieve controle voor elke cel regel wanneer cDNA synthese van RNA werd uitgevoerd in de afwezigheid van de reverse-transcriptase enzym. Rijstroken 1 en 2 zijn PCR producten uit biologische replicatieonderzoeken van elke regel van de cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Mapping van de PCR-producten van 3' RACE. (A) A gedeelte van een reeks chromatogram van een gel gezuiverd 3' RACE product waaruit het voorspelde polyadenylatie-signaal en de locatie van de poly(A) staart. (B) vertegenwoordiger sequenties van Sanger sequencing gegevens waaruit de stop codon, het polyadenylatie signaal (BK), de site van het decolleté en de gehechtheid van de poly(A) staart en een deel van de sequenties van de staart poly (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Cyclus stap | Temperatuur en duur | Aantal cycli |
| Eerste denaturatie | 95 ° C gedurende 3 min | 1 |
| Eerste gloeien en uitbreiding | 50 ° C gedurende 5 minuten en 72 ° C gedurende 10 minuten | 1 |
| Subcyles (denaturatie, gloeien en uitbreiding) | 95 ° C gedurende 40 s, 50 ° C gedurende 1 minuut, en 72 ° C gedurende 3 minuten | 20 |
| Laatste cyclus (denaturatie, gloeien en uitbreiding) | 95 ° C gedurende 40 s, 50 ° C gedurende 1 minuut, en 72 ° C gedurende 15 minuten | 1 |
| Houd | 4 ° C, ∞ |
Tabel 1: Pfu Polymerase van DNA PCR fietsen voorwaarden 3' RACE.
| Cyclus stap | Temperatuur en duur | Aantal cycli |
| Eerste denaturatie | 98 ° C gedurende 3 minuten | 1 |
| Eerste gloeien en uitbreiding | 50 ° C gedurende 5 minuten en 72 ° C gedurende 10 minuten | 1 |
| Subcyles (denaturatie, gloeien en uitbreiding) | 98 ° C gedurende 30 s, 50 ° C gedurende 1 minuut, en 72 ° C gedurende 4 minuten | 20 |
| Laatste cyclus (denaturatie, gloeien en uitbreiding) | 98 ° C gedurende 30 s, 50 ° C gedurende 1 minuut, en 72 ° C gedurende 15 minuten | 1 |
| Houd | 4 ° C, ∞ |
Tabel 2: Chimeer DNA polymerase PCR fietsen voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de komst van massale parallelle sequencing technologieën, op basis van het gen-door-gen, blijft 3' RACE de gemakkelijkste en meest economische methode om de PAS en nucleotiden grenzend aan de staart van de poly(A) te identificeren. De hier beschreven aanpassing breidt uit met behulp van 3' RACE te versterken én sequenties die ook een deel van de ORF, de stop codon en de gehele 3' UTR van het afschrift van de mRNA ANKHD1 kaart. Een groot voordeel van 3' RACE is dat de producten van 3' RACE met een paar kleine aanpassingen, kunnen worden gekloond in andere vectoren om downstream ondervraging van 3' UTR functie met inbegrip van miRNA targeting, stabiliteit testen, evenals andere mechanistische testen. Dit kan worden gedaan door met inbegrip van restrictie-enzym sites binnen de geneste primer sequenties9,10. Aanpassingen kunnen worden gemaakt om op te nemen alleen de 3' UTR zonder enige sequenties van de ORF voor het klonen voor 3' UTR Functionele assays5.
Een belangrijke determinant van het succes van 3' RACE is de ontwikkeling van genestelde inleidingen die gericht zijn op het gen van belang. De cDNA-sequenties van de Ensembl genoom browser worden aanbevolen aan de beste regio's zonder polymorfismen identificeren teneinde optimale inleidingen. In het ideale geval toekomen meerdere geneste inleidingen, alsmede ten minste twee omgekeerde inleidingen binnen het gen van belang kunnen worden gescreend met behulp van Standaardpcr te identificeren van de beste twee geneste gene specifieke primers te gebruiken. In deze studie gaf de eerste gen specifieke voorwaartse primer geselecteerd voor 3' RACE aanvankelijk twee bands met Standaardpcr routinematig gebruikt in het lab. Helaas, het ontwerp van de primer werd beperkt door het grote aantal SNPs in het transcript van belang. SNPs in het transcript doel leiden tot wanverhouding tussen de inleidingen en de doelstelling, die kan leiden tot inefficiënte gloeien en versterking, en moet worden teruggebracht tot een minimum19. De aanwezigheid van ten minste vier SNPs in een primer, of het voorkomen van een combinatie van vijf incongruenties (drie in één primer en twee in de andere) kan leiden tot volledige remming van de PCR reactie, en vandaar de enige optie is om te ontwerpen meer inleidingen20. In plaats van meer inleidingen om een enkele band voor de standaard die PCR voor het zoeken van de primer in experimenten gemeld hier gebruikt ontwerpen, werden de fietsen voorwaarden van PCR en de polymerase van DNA, vervolgens gebruikt in 3' RACE veranderd om het optimaliseren van de waarschijnlijkheid van een specifieke band te krijgen. De temperatuur van de denaturatie werd verhoogd naar 98 ° C voor een van de DNA-polymerase (een stijging van 95 ° C gebruikt bij het zoeken van de primer). Voor beide polymerase van DNA gebruikt in de 3' RACE PCR, de duur van de initiële denaturatie werd verhoogd naar 3 min in plaats van de aanbevolen 30 s tot 2 min om de sjabloon cDNA volledig te denatureren. De T7 oligo dT25 primer is bijvoorbeeld voorspeld dat potentieel formulier zwakke secondaire structuren, die de beschikbaarheid van inleidingen21kunnen verminderen. Verhogen van de eerste denaturatie lengte en temperatuur breekt een secondaire structuren en helpt de enkele specifieke band opbrengst na de laatste cyclus van 3' RACE. Bovendien, was de niet-specifieke band lichter dan de verwachte bands, suggereren dat bleek op hogere PCR cycles (maximaal 35 cycli); beperking van de cycli van PCR aan slechts 20 vermindert de versterking van de niet-specifieke band.
Een ander potentieel van 3' RACE, zoals andere PCR gebaseerde reacties, is onvolledig versterking van de target regio22. Vandaar, voor beide thermofiele enzymen de aanvankelijke onthardende temperatuur werd vastgesteld op 50 ° C gedurende 5 minuten om te optimaliseren ontharden de inleidingen aan de doelgroep en dit werd gevolgd door een eerste uitbreiding temperatuur bij 72 ° C gedurende 10 minuten. De laatste cyclus van het PCR voor elk enzym had een tijd van de laatste uitbreiding van 15 min bij 72 ° C. Deze extensie stappen waren langer dan die aanbevolen door de fabrikanten van de polymerase van DNA. De lange extensie (rek) stap kunt volledige synthese van onvolledige waarbij, waardoor volledige uitbreiding van de eerste en laatste versterking producten16.
PCR de stappen die zich in 3' RACE voordoen zijn zeer gevoelig, zodat ze detecteren kunnen genomic DNA (of andere besmetting van DNA) in plaats van het doel mRNA transcript, wat resulteert in verschillende onverwachte bands op de gel-22. Unidirectioneel om besmetting te voorkomen is om de PCR werk uitvoeren in een specifieke PCR kap, Draag handschoenen, en gebruik schone reagentia en gesteriliseerde met autoclaaf steriel buizen en Pipetteer tips. In regelmatige PCR, kunnen voorwaartse en omgekeerde inleidingen worden ontworpen, zodat ze bevinden zich op verschillende exons (tegenover intron inleidingen); op deze manier zou een abnormaal grote PCR product betekenen dat een regio met een intron heeft versterkt. Echter, dit kan niet altijd haalbaar in het geval dat alleen de 3' UTR volgorde, gelegen binnen de dezelfde terminal exon, de doelstelling van 3' RACE versterking is. Alternatief, kunnen de RNA vooraf behandeld met DNAse enzym voordat cDNA synthese. Het gebruik van de T7 oligo dT25 primer aan de reactie van de reverse-transcriptase in plaats van een willekeurige hexanucleotide voor eerste strand cDNA synthese van RNA prime vermindert ook de versterking van de genomic producten. Last but not least het opzetten van een negatieve controle (de "–" rijstroken in Figuur 2), waar de cDNA synthese is ingesteld in afwezigheid van reverse-transcriptase wordt ten zeerste aanbevolen. Het besturingselement ondergaat identiek stappen om de andere monsters in de daarop volgende 3' RACE procedures. De aanwezigheid van een band in dit besturingselement geeft potentiële genomic DNA-besmetting.
Ondanks de bovengenoemde uitdagingen is 3' RACE een krachtig hulpmiddel in kaart brengen van 3' einden op basis van de individuele gen. De komst van volgende-generatie technologie heeft geleid tot een toename van het repertoire van afschriften die hebben alternatieve 3' einden als gevolg van alternatieve polyadenylatie, die kan of kan geen alternatieve splicing. Te voegen aan de complexiteit, in kankercellen, chromosomale herschikkingen zijn frequent en kunnen resulteren in oncogene gene fusion producten23. De fusie tussen de twee genen kan betrekken de ORF of, in sommige gevallen alleen reeksen binnen de 3' UTR9,10te betrekken. Verder zijn er ook conjoined/co-transcribed genen, die gelijktijdig worden getranscribeerd, maar mag worden vertaald in verschillende eiwitten11. 3' RACE kan worden afgestemd op alle deze unieke, abnormale afschriften, alsmede afschriften van de normale kaart. Dit is belangrijk omdat deze abnormale afschriften kunnen eindigen bijeenkomen ziekte specifieke biomarkers of specifieke drug doelstellingen, bijvoorbeeld, het medicijn Imatinib richt zich op het BCR-ABL1 fusion gen in kanker.
Vandaar, 3' RACE is een uiterst veelzijdige techniek die kan worden gebruikt om normale afschriften versterken, roman 3' UTRs en roman gene fusies binnen de 3' UTR5,9te identificeren. In dit verslag, 3' RACE werd gebruikt om te versterken en de stop codon, de PAS en de gehele 3' UTR van het afschrift van de ANKHD1 met behulp van verschillende DNA-polymerase. De beschreven benadering kan worden gebruikt om het 3' einde van een afschrift van de polyadenylated in kaart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen erkennen Bettine Gibbs voor haar technische hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
