Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Abstract

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3' הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3' של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע). פרוטוקולים עבור 3' המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3' האזור לא מתורגם (3' UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3' UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3' UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3' המירוץ. המורחב 3' גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3' UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3' UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

Introduction

היווצרות של הקצה 3' הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום1.

הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3' קצוות3. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3' UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3' UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3'. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3' סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3' המירוץ נשאר לשיטת הבחירה4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3' המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3' UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3' המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר4,6. מאז 3' המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין4,7. זו אפשרה 3' גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3' של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3' UTR. על ידי שילוב 5' המירוץ עם ששונה 3' המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3' UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5' שלה 3' סוף8.

דוגמה של יישום זה של ששונה 3' המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז'ן ג'ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3' UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה9. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3' UTR10, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3' המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז'ן הרומן גנים מעורבים של 3' UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז'ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3' המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג'ין-רצפים-11,-12. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3' UTR, כמו גם את אורך 3' UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה13. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3' פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.

עבודה זו דוחות התאמה 3' גזע כדי למפות את כל 3' UTR, מלון פאס, ואתר 3' סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים.

1. תרבית תאים

  1. לגדול הלה תא ואת שני ההשעיה מנטל לימפומה התא שורות תאים, Granta-519 ו- Jeko-1, ב- DMEM המכיל 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C. לדלל 1:10 תאים ולספור באמצעות חלקיקים מונה14.
  2. לחילוץ RNA, צלחת 500,000 תאים/היטב לתוך צלחת טוב 6 (2 מ ל מדיה לכל טוב). לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה, לאסוף RNA התאים.

2. RNA החילוץ

  1. קציר תאים
    הערה: למעט השלב צנטריפוגה, לבצע את כל השלבים המפורטים בברדס תרביות רקמה כדי לשמור על עקרות.
    1. עבור תאים ההשעיה (Jeko-1 ו- Granta-519):
      1. להעביר את התאים (יחד עם 2 מ"ל של מדיה) צינור 15 mL, ו צנטריפוגה-1,725 g x עבור 5 דק וביופסיה התקשורת ולהשאיר בגדר תא בתחתית של הצינור.
      2. Resuspend בגדר תא ב- 50 µL 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS). להוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל מדגם בצינור microcentrifuge 1.5 mL. ערבבו היטב והמתינו בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות תוך כדי היפוך הצינור microcentrifuge לכל 1 דקות.
    2. עבור תאים חסיד (הלה):
      1. האחות התקשורת התרבות התא מכל קידוח. להוסיף 1 מ"ל של PBS כל טוב לשטוף את הלכלוך.
      2. להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל טוב.
      3. תקופת דגירה-RT של 5 דקות עם נדנדה עדין. העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  2. פירוק התא
    1. הקפאת התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, ב-20 ° C עבור 1 h.
      הערה: התמהיל יכול להיות שמאל ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד הצורך.
    2. להפשיר את התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, על קרח. להוסיף 100 µL של כלורופורם הצינור microcentrifuge בשכונה ה-PCR. מערבולת המדגם עבור s 10-15 עד התערובת הוא ורוד אטום. דגירה המדגם על קרח (ב 4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות.
    3. Centrifuge המדגם למשך 15 דקות ב 20,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את השלב העליון מימית השקופה (~ 200 µL), העברת צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  3. RNA משקעים
    1. להוסיף אמצעי שווה של אלכוהול איזופרופיל כל דגימה. להוסיף 1 µL של coprecipitant (ראה טבלה של חומרים) אחד לטעום לפעול כנשא עבור הרנ א. ולעזור להמחיש את הרנ א בצעדים העוקבים. דגירה המדגם ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה בין לילה ב- 80 ° c
    2. להעביר את הדגימה צנטריפוגה מקורר. צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 20,800 x g / 4 ° C; הרנ א תופיע כתם כחול על החלק התחתון של הצינור. הסר בזהירות את אלכוהול איזופרופיל מדגם. להוסיף 500 µL של 80% אתנול, resuspend בגדר מאת בקצרה vortexing עבור 3 s.
    3. צנטריפוגה המדגם ב g x 20,800 ב RT עבור 5 דק להסיר כל האתנול המדגם. תן הדגימה מילה נהדרת כ 10 דקות Resuspend הדגימה ב µL 35 RNAse ללא מים. מניחים על גוש חום (65 ° C) במשך 5 דקות להבטיח הרנ א יהיה מלא בפתרון, מיד במקום הצינור על קרח.
    4. לקבוע את הריכוז של RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים כאמור תיאר, אלא להשתמש µL 1.5 המדגם RNA במקום 1 µL15. באופן אופציונלי, להפעיל µg 1 של RNA הכולל ג'ל agarose 1% כדי לקבוע את תקינות ה-RNA.

3. DNase טיפול

  1. לאחר כימות RNA, מבצע טיפול DNAse הרנ א הכולל כדי להשפיל את כל הדנ א. עבור כל דגימה, הוסף את ריאגנטים הבאים ערכת DNAse RNAse-חופשית כדי לגרום לתגובה הכולל 20 µL לערבב פנימה צינור microcentrifuge נפרדים:
    1. לערבב 2 µL של DNase 10 X תגובת מאגר עם µg 4.4 של RNA הכולל. מביאים סכום כולל של 14 µL עם מים.
    2. להוסיף 2 µL של נטול RNase DNAse. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות 2 µL של RNase מעכב (מתוך הערכה שעתוק לאחור).
    3. להוסיף 2 µL של פתרון להפסיק וחום על גוש חום למשך 10 דקות ב 70 ° C כדי להשבית את האנזים DNAse.
      הערה: DNAse הטיפול היא אופציונלית.

4. cDNA סינתזה

עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL:

  1. עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL: 22 העברת µL של DNase מטופלים RNA צינור חדש או העברה 4 µg של RNA הכולל עם מים נוסף לאמצעי סך של 22 µL על צינור. להוסיף 2 µL של הראשיים25 . dT oligo T7 מהפתרון תחל 10 מיקרומטר. הרצף עבור הראשיים25 . dT oligo T7 הוא 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. הערכה הפוכה שעתוק להוסיף 2 µL של המדכא RNase (20 U µL), µL 8 המאגר התגובה 5 x, µL 4 של 10 מ מ dNTPs ו 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL).
    הערה: להגדיר תגובה בלי רוורס טרנסקריפטאז לפעול כמו פקד שלילי.
  3. דגירה ב 42 ° C עבור ה 1 העברה ישירות לקרח. מחממים את הצינור ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים את הצינורית על קרח.

5. פריימר חיפוש של פיוז'ן ג'ין התעתיק

  1. העיצוב תחל
    1. הורד את רצף cDNA מהדפדפן הגנום אנסמבל (ENST00000360839.6/NM_017747) וזהה של אזור בתוך ORF של היעד תמליל (ANKHD1) במעלה הזרם של stop codon. העתקה והדבקה של האזור כולו (עד 700 נוקלאוטידים) המכיל רצפי במעלה הזרם stop codon אל אזור הזנת רצף של תוכנת עיצוב פריימר (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. בחרו באפשרות ' הצג עיצוב מותאם אישית ' ובחרו 10 עבור מספר תחל כי המערכת צריכה לייצר (תוצאות כדי להחזיר) להשאיר את כל הפרמטרים האחרים, קבע כברירת מחדל.
    3. לבחור חמישה צבעי בסיס קדמי של שני צבעי יסוד הפוך שאינם חופפים. סדר תחל, לשקם עם RNAse/DNAse ללא מים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. פרטים נוספים על פריימר כללי עיצוב עבור ה-PCR מכוסים במקום אחר16.
  2. PCR לזיהוי תחל פוטנציאל לשימוש הבאים 3' המירוץ
    הערה: כדי לקבוע את צבעי בסיס קדמי הסופי כדי להשתמש בהתגובה, יש לבדוק את צבעי בסיס מעוצב על-ידי הגדרת שילובים שונים של צבעי יסוד ואחורה עבור PCR רגיל בשכונה ה-PCR.
    1. להעביר את cDNA (2 µL) צינור PCR טריים 0.5 מ. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים µL 1 של ומהצמיגים הפוכה (מתוך פתרון תחל 10 מ מ). להפוך µL עד 12.5 על-ידי הוספת 8.5 µL של נוקלאז ללא מים. להוסיף 12.5 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR-כדי-ג'ל.
    2. השתמש PCR תרמי אופניים בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחריו 29 מחזורים של 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C עבור מינימלית 1 להגדיר את המעגל הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.
    3. לאחר PCR, להפעיל את המוצרים agarose 1% ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. פרטים על אלקטרופורזה מתוארים כאמור עם שינויים מספר17.
      1. להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של טריס-אצטט (טה) מאגר בבקבוקון 250 מ. מרתיחים במיקרוגל.
      2. להשאיר להתקרר למשך 1 דקות ולהוסיף µL 7.5 של אתידיום ברומיד פתרון (המניות 10 מ"ג/מ"ל) בברדס fume. מערבבים היטב בעזרת מתערבל את הבקבוקון ויוצקים לתוך מנגנון ג'ל אופקי. יוצאים RT בשכונה fume במשך לפחות 30 דקות לאפשר את הג'ל לגבש.
      3. לכסות את הג'ל עם מאגר x TAE 1 וטען µL 10 של המוצר PCR על גבי הג'ל agarose יחד עם 3-5 µL של הסולם משקל מולקולרי הדנ א. לרוץ במהירות 175 V עבור 10 דקות לדמיין את המוצרים באמצעות imager ולאחר אם נוספת נדרשת הפרדה של מוצרים, הפעל את ג'ל למשך דקות נוספות 5-10.
  3. מבחר תחל מקוננים על 3' המירוץ
    1. לנתח את התוצאות של הג'ל agarose PCR לבחירת צבעי יסוד שיש להקה PCR ברורים, חזק יחיד. להשתמש את פריימר 5'-רוב (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') יחד עם הראשיים25 oligodT T7. ב ה-PCR הראשון לרוץ.
    2. בחר את פריימר מקוננת שנמצאת במורד הזרם של מן המפתח הראשון (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), ולהשתמש בו עם ומהצמיגים T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') במערכה השנייה של תגובות PCR.

6. ייעול 3' גזע כדי למפות את 3' UTR באמצעות שני אנזימים שונים

הערה: חלה עלייה המגוון של ה-DNA polymerases המשמש PCR; לכן, רצינו לקבוע תנאים סטנדרטיים שניתן להחיל גם כאשר באמצעות אנזימים שונים עבור 3' תגובות PCR המירוץ. צבעי יסוד הפוך כל תעתיק נשמרים קבוע; השינויים היחידים הם צבעי בסיס קדמי מקוננים ספציפיים על-ידי היעד.

  1. פרוטוקול 1:3 ' המירוץ באמצעות של פולימראז דנ א שונה מ- Pyrococcus furiosus (Pfu)
    1. PCR הראשון
      1. 1 µL של cDNA להעביר צינור PCR ולהוסיף µL 5 10 x Pfu התגובה המאגר. להוסיף 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 T7 oligodT, 1 µL של dNTPs (מתוך פתרון 10 מ מ).
      2. להפוך עד 49 µL הנפח הכולל על-ידי הוספת 40 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז ומערבבים היטב. הפעל את ה-PCR שימוש בפרופיל ה-PCR בטבלה1.
    2. PCR השני
      1. להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR ומערבבים עם µL 5 x 10 PfuII אולטרה התגובה המאגר. הוסף µL 1 של פריימר PCR מקונן השנייה, µL 1 של ומהצמיגים T7 µL 1 של dNTPs (פתרון 10 מ מ).
      2. להפוך עד 49 µL התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי הוספת 39 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 1).
  2. פרוטוקול 2:3 ' המירוץ באמצעות פולימראז DNA chimeric המורכב של תחום איגוד ה-DNA דבוקה של Pyrococcus-כמו הגהה פולימראז PCR מיקס מאסטר
    1. PCR הראשון
      1. העברת µL 1 של cDNA צינור ה-PCR. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 oligodT T7. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים.
      2. להוסיף 25 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR ומערבבים היטב. השתמש PCR אופניים בתנאים המתוארים בטבלה מס ' 2.
    2. PCR השני
      1. להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR. להוסיף 1 µL של השנייה תחל PCR מקוננים יחד עם µL 1 של פריימר הפוך T7.
      2. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים. להוסיף 25 µL של 2 X מיקס מאסטר PCR. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 2).

7. ודא המוצר PCR השני של 3' המירוץ.

  1. µL 5-10 לקחת המוצר PCR השני (כמו גם מוצר מבית בסיבוב הראשון של מותני אם התעתיק מתבטא בשפע) ולהפעיל על agarose ג'ל. להגדיר את הג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה כאמור תיאר (שלבים 5.2.3.1 כדי 5.2.3.3). לדמיין את התוצאות imager.

8. המוצר טיהור ורצף

  1. לטהר את המוצרים באמצעות PCR ג'ל PCR השני באמצעות ג'ל PCR מקטע DNA לנקות מערכת לפי הפרוטוקול של היצרן.
  2. לבצע סנגר רצף (לחלופין, שלח הג'ל מטוהרים רצף המתאים תחל למעבדה רצף ודוגמאות של מוצר ה-PCR). לנתח את הנתונים רצף לאחר סנגר רצף.
  3. להוריד תוכנה-ניתוח רצף (ראה טבלה של חומרים) ולייבא בקבצי המעקב לתוך התוכנה. שימוש בודדים טהור בסיס QVs (ערכי איכות) כדי להשיג את הבסיס לקרוא מידע18. הורד את chromatogram עם איכות גבוהה עקבות לצפייה.
    אופציונלי: המוצר מטוהרים ג'ל יכול להיות משובטת באמצעות ערכת השכפול המתאים שיבוטים מבודד שלח סנגר רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חיפוש מקוננים פריימר לפנים:

הג'ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג'ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עבור התגובה PCR מבוסס הם אלה שנותנים את מוצר ה-PCR נפרדים אחד (ליין 3). פריימר לפנים בשימוש מסלולים 1 ו- 2 נותן את הלהקה הכי חזק, נותן את המוצרים PCR הגדול (מצופה), משמש את פריימר לפנים הראשון. למתחילים מקוננים השני הסט השני של ה-PCR בתגובות 3' המירוץ הוא פריימר לפנים 3 ליין.

Polymerases דנ א שונים המשמשים 3' המירוץ לייצר תוצאות דומות:

שני polymerases דנ א שונה הפיק את אותם מוצרים PCR בגודל למרות שיש PCR אופניים תנאים שונים 3' המירוץ (איור 2). יש רק אחד הלהקה נפרדות עבור המוצר PCR הצפוי. כל של המינוס רוורס טרנסקריפטאז פקדים שלילי (-) אין להקה, מציג שום זיהום גנומית RNA המשמשים סינתזה cDNA באותה מידה כמו תגובות עוקבות במורד הזרם.

סאנגר רצף תוצאות:

המוצרים PCR היו ג'ל טהור ושלח סנגר רצף. התוצאות שמוצג באיור 3A מראות על חלק כרומטוגרפיה רצף מ סנגר רצף. רצף נציג מזהה את המיקום של stop codon, הסימן פוליאדנילציה בשם, האתר המחשוף, כמו גם את פולי הזנב (א) 3' המירוץ במוצר (איור 3B).

Figure 1
איור 1: זיהוי של שני גנים מקוננים תחל קדימה ספציפיים כדי להשתמש ב- 3' המירוץ. המוצג הוא דוגמה של מוצרי ה-PCR של צירופים שונים של גן ספציפי קדימה ולהפעיל תחל הפוכה באמצעות הלה cDNA של אתידיום ברומיד צבעונית agarose ג'ל עם הסולם משקל מולקולרי (mw). מסלולים 1 2 מוצרים PCR באותו הגן פריימר לפנים ספציפי אולם תחל הפוכה שונים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. החצים הצבע המוצר PCR הצפוי עבור כל ליין. בנוסף הלהקה עבור המוצר PCR הצפוי, יש להקת נוספים. המוצר PCR יחידה 3 ליין הוא מן הגן שונה ספציפי מקוננים קדימה ולא לאחור פריימר ומראה הלהקה צפויה יחיד.

Figure 2
איור 2: אימות של גזע מוצרים 3' הסט השני של תגובות PCR. מוצרים מן התגובה PCR השני עם פולימראז () Pfu DNA פולימראז ו DNA Chimeric (B) היו פועלים על ג'ל agarose עם אתידיום ברומיד. מסלולים מתואר על ידי (-) בעת מדגם שליטה שלילי עבור כל קו תא cDNA סינתזה של RNA בוצע בהיעדרו של האנזים רוורס טרנסקריפטאז. מסלולים 1 2 מוצרי ה-PCR משכפל הביולוגי של כל שורה תא בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מיפוי מוצרים PCR של 3' המירוץ. (א) א חלק chromatogram רצף של ג'ל טהור 3' המירוץ מוצר מציג את הסימן פוליאדנילציה החזוי ואת המיקום של הזנב poly(A). (B) נציג רצף סנגר רצף נתונים מציג את stop codon, הסימן פוליאדנילציה (PAS), האתר המחשוף וקובץ מצורף של הזנב poly(A), כמו גם קטע של הרצף זנב poly (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב מחזור טמפרטורה ומשך מספר מחזורי
דנטורציה הראשונית 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות 1
חישול הראשונית ולא סיומת 50 מעלות במשך 5 דקות ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 1
Subcyles (דנטורציה, חישול וסיומת) 95 ° C 40 s, 50 ° C עבור 1 דקות, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות 20
במחזור האחרון (דנטורציה, חישול וסיומת) 95 ° C 40 s, 50 ° C עבור 1 דקות, ו-72 מעלות למשך 15 דקות 1
. תחזיק 4 ° C, ∞

טבלה 1: Pfu DNA פולימראז PCR תנאי הרכיבה עבור 3' המירוץ.

שלב מחזור טמפרטורה ומשך מספר מחזורי
דנטורציה הראשונית 98 ° C למשך 3 דקות 1
חישול הראשונית ולא סיומת 50 מעלות במשך 5 דקות ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 1
Subcyles (דנטורציה, חישול וסיומת) 98 ° C ל 30 s, 50 ° C עבור 1 דקות, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות 20
במחזור האחרון (דנטורציה, חישול וסיומת) 98 ° C ל 30 s, 50 ° C עבור 1 דקות, ו-72 מעלות למשך 15 דקות 1
. תחזיק 4 ° C, ∞

טבלה 2: Chimeric DNA פולימראז PCR תנאי הרכיבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג'ין-מאת-גן, 3' המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3' גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3' UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרון העיקרי של 3' המירוץ הוא כי עם כמה עיבודים קלים, מוצרים מ 3' גזע יכולים להיות משובטים לתוך וקטורים אחרים כדי להקל על חקירתו במורד הזרם של 3' UTR פונקציה כולל מיקוד miRNA, מבחני יציבות וכן מבחני מכניסטית אחרים. ניתן לבצע זאת על-ידי הכללת אתרים אנזים הגבלה בתוך9,רצפים10תחל מקוננים. ניתן לבצע התאמות כדי לכלול רק את 3' UTR ללא כל רצפי מ ORF לקראת שיבוט 3' UTR מבחני פונקציונלי5.

דטרמיננטה העיקריים של ההצלחה של 3' המירוץ הוא התפתחות תחל מקוננים שמכוונות את הגן עניין. רצפי cDNA מהדפדפן הגנום Ensembl מומלץ ביותר לזהות אזורים ללא פולימורפיזמים כדי לפתח תחל אופטימלית. באופן אידיאלי, מספר המקונן קדימה תחל כמו גם לפחות שני צבעי יסוד הפוך בתוך הגן עניין יכולים להיות מוקרן באמצעות תקן ה-PCR לזיהוי את הכי טוב שני גנים מקוננים ספציפי תחל להשתמש. במחקר זה הראשון גנים ספציפיים קדימה ומהצמיגים שנבחר עבור 3' המירוץ בתחילה נתן שתי להקות עם תקן ה-PCR בשימוש שגרתי במעבדה. למרבה הצער, העיצוב תחל היה מוגבל על ידי מספר משמעותי של SNPs נמצא בתעתיק עניין. SNPs נמצא בתעתיק למטרה להוביל אי-התאמה בין תחל את המטרה, אשר יכול לגרום ריפוי לא יעיל, הגברה, והוא צריך להיות מופחת כדי מינימום19. הנוכחות של פחות ארבעה SNPs ב פריימר אחד, או ההתרחשות של שילוב של חמישה הבדלים (פריימר שלוש אחד ו-2 השני) עלול לגרום עיכוב מוחלט של התגובה PCR, ולכן האפשרות היחידה היא לעצב תחל עוד20. במקום לעצב תחל עוד כדי לקבל אחד הלהקה יחיד עבור תקן שה-PCR המשמש עבור החיפוש פריימר בניסויים דיווחו כאן, את תנאי הרכיבה של ה-PCR ואת polymerases דנ א לאחר מכן בשימוש 3' המירוץ שונו כדי לייעל את ההסתברות של מקבל אחד הלהקה ספציפיים. הטמפרטורה דנטורציה היה גדל עד 98 ° C לאחד polymerases ה-DNA (עלייה מ- 95 ° C בשימוש החיפוש פריימר). עבור שני polymerases DNA בשימוש 3' המירוץ PCR, משך דנטורציה הראשונית הוגדל ל 3 דקות במקום ה-30 המומלצת s כדי 2 דקות כדי באופן מלא denature התבנית cDNA. T7 oligo dT25 ומהצמיגים לדוגמה הוא חזה שעשוי להיות טופס חלש משני מבנים, אשר עשוי להפחית את הזמינות של תחל21. הגדלת האורך דנטורציה הראשונית ואת הטמפרטורה שובר כל מבנה משניות, מסייע תשואות הלהקה ספציפי אחד לאחר מחזור הסופי של 3' המירוץ. בנוסף, הלהקה לא ספציפית היה בהיר יותר הלהקות הצפוי, רומז כי זה הופיע ב- PCR גבוה יותר מחזורי (מחזורים עד 35); הגבלת את מחזורי PCR ל-20 היחידה מפחית ההגברה של הלהקה לא ספציפית.

עוד פוטנציאלית של 3' מירוץ, כמו אחרים תגובות PCR מבוסס, הוא לא שלם הגברה של אזור היעד22. לפיכך, עבור שני אנזימים לרום הטמפרטורה מחזק הראשוני היה להגדיר ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות למטב חישול של תחל היעד, זאת בעקבות הטמפרטורה סיומת הראשונית ב-72 מעלות למשך 10 דקות. מחזור ה-PCR הסופי עבור כל אנזים היה זמן סיומת הסופי של 15 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס. השלבים סיומת היו ארוכות מאלו המומלץ על ידי היצרנים של polymerases ה-DNA. הצעד סיומת ארוכה (התארכות) מאפשרת סינתזה מלאה של amplicons לא שלם, הפעלת בשליפה מלאה של מוצרי הגברה התחלתי וסופי ה16.

צעדים PCR המתרחשים 3' המירוץ רגישים מאוד, כך הם עשויים לזהות הדנ א הגנומי (או זיהום אחרים DNA) במקום בתמליל mRNA היעד, וכתוצאה מכך מספר להקות לא צפוי על ג'ל22. אחת הדרכים למניעת זיהום היא לבצע את העבודה PCR בשכונה PCR ייעודי, ללבוש כפפות, והשימוש בהם ריאגנטים נקי וצינורות סטרילי בלוק, פיפטה טיפים. ב- PCR רגיל, תחל ואחורה ניתן לעצב ולכן הם נמצאים על exons שונים (מעבר אינטרון תחל); בדרך זו, מוצר ה-PCR גדולה באופן חריג יכול לציין אזור המכיל של אינטרון מוגבר. עם זאת, לא תמיד ייתכן ריאלי במקרה בו רק 3' רצף UTR, ממוקם במרחק אקסון מסוף אותו, הם מטרה 3' המירוץ הגברה. לחלופין, הרנ א יכול להיות מטופלים מראש עם אנזים DNAse לפני cDNA סינתזה. השימוש פריימר25 T7 dT oligo לשפר את התגובה רוורס טרנסקריפטאז במקום hexanucleotide אקראית של סינתזה cDNA סטרנד הראשון מ- RNA מקטין גם הגברה של המוצרים גנומית. ואחרון חביב, הגדרת פקד שלילי ("–" נתיבי באיור2), שבו מוגדר cDNA סינתזה בהעדר רוורס טרנסקריפטאז מומלץ בחום. הפקד עובר שלבים זהים כדי דגימות אחרות בהליכים גזע עוקבות 3'. הנוכחות של להקה בפקד זה מרמז על אפשרות זיהום הדנ א הגנומי.

למרות האתגרים הנ ל, 3' המירוץ הוא כלי רב עוצמה של מיפוי 3' מסתיים על בסיס ג'ין בודדים. כניסתו של טכנולוגיית הדור הבא הוביל לעלייה הרפרטואר של הפרוטוקולים שיש חלופה 3' קצוות הנובע פוליאדנילציה חלופיים, אשר עשויה או לא עשויה להיות כרוכה שחבור חליפי. כדי להוסיף למורכבות, של תאים סרטניים, rearrangements כרומוזומליות שכיחים, יכול לגרום ג'ין oncogenic fusion מוצרי23. המיזוג בין שני גנים לערב את ORF או, במקרים מסוימים, כרוכים רק רצפים 3' UTR9,10. יתר על כן, ישנם גם מחוברים/co-transcribed גנים, אשר משוקלטים בו זמנית, אבל יכול להיות מתורגם חלבונים שונים11. 3' המירוץ התפורות למפות כל אלה חריג, ייחודית התמלילים כמו גם תעתיקים נורמלי. זה חשוב כי אלה תעתיקים חריג עלול בסופו של דבר הגשה סמנים ספציפי למחלת או סמים מסוימים מטרות, למשל, התרופה Imatinib מטרות הגן BCR-ABL1 פיוז'ן בסרטן.

ומכאן, 3' המירוץ הוא טכניקה רב תכליתי אשר יכול לשמש כדי להגביר את התמלילים נורמלי, לזהות את הרומן 3' UTRs, ג'ין הרומן fusions בתוך 3' UTR5,9. בדו ח זה, 3' הגזע שימשה להגביר ולמפות את stop codon מלון פאס, את כולה 3' UTR של התעתיק ANKHD1 באמצעות polymerases דנ א שונים. הגישה המתוארת ניתן למפות 3' בסוף כל תעתיק polyadenylated.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות Bettine גיבס עזרה טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 133 תעתיקים קצה 3' 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע) תגובת שרשרת פולימראזית הסימן פוליאדנילציה (PAS) פוליאדנילציה
התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter