Summary
(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。
Abstract
真核生物 Mrna の成熟には、ポリ a 尾部の付加を含む 3' 端形成が含まれます。遺伝子の 3' 末端をマップするために選択する従来の方法は (3' レース) の cDNA の端の急速な拡大は 3' です。3' 競争のプロトコルには、入念な設計と興味のターゲット遺伝子の 3' 非翻訳領域 (3' UTR) 内でネストされたプライマーの選択が必要です。ただし、いくつかの変更で全体 3' UTR と ORF と 3' UTR の関係のより包括的な画像を提供するオープンリーディング フレーム (ORF) 内のシーケンスを含めるプロトコルを使用できます。これは従来 3' 競争によって提供される、胸の谷間と起こるサイトだけでなく、起こる信号 (PAS) の識別に加えてです。拡張された 3' レース珍しい 3' 3' UTR、内融合遺伝子を含む UTRs を検出できるし、AU 豊富なトラン スクリプトの安定性に影響を与える要素の不安定化と同様、潜在的なマイクロ Rna 結合部位を予測するシーケンス情報を使用できます。
Introduction
3' 末端の形成は、ポリ a テール1,2を作る ~ 250 untemplated アデニンの添加に続いて PAS のプレ mRNA の下流の胸の谷間を含む mRNA 成熟の重要なステップです。ポリ a 結合蛋白質 (PABP) ポリ a の尾に、これは、劣化から mRNA の転写を保護し、容易に翻訳1。
現在の推定では、ひと遺伝子の 70% を複数のパスを持ってしたがって代替起こる、結果は複数の 3' 端3を受けるとを示唆しています。したがって、任意の特定のコピーで使用される PAS を識別し同様、ポリ a の尾が 3' UTR の残りの部分に接続する位置を特定することが重要です。次世代シーケンシングの出現は UTRs とたくさんの遺伝子の 3' の同時同定になりました。シーケンス機能のこの増加は、3' 末端の代替起こるに関連するデータを分析するバイオインフォマティクス アルゴリズムの開発を求められています。De novo検出や PAS の検証、それゆえ大規模な配列データから個々 の遺伝子の 3' 末端のマッピング、3' レース選択4、5の方法のままです。通常 3' 競争の cDNA 製品に含まれるシーケンスには 3' UTR ポリ a の尾、胸の谷間サイト、PAS および PAS の上流のシーケンスが含まれている部分だけが含まれます。3' レースはデザインと遺伝子特定の前方および逆のプライマーの使用必要とする PCR とは異なり、2 つの遺伝子特定入れ子になった前方プライマーのみ必要があります。したがって、PCR 増幅4,6をされている遺伝子の大きな領域の塩基配列の詳細な知識が必要です。3' レースを使用するので同じ逆、ポリ a テールすべて polyadenylated RNA 転写産物のターゲット、前方プライマーのみする必要がある遺伝子を特定、したがって、だけ mRNA の非常に小さい領域の知識を必要とする入門書です。これにより、そのシーケンスがあります完全に特徴づけられる4,7の領域の増幅。これは、3' だけでなく遺伝子の 3' 終わりを決定するが、また判断して上流 3' UTR の重要な部分を形成する PAS の大きい地域を特徴づけるのための競争を許可しています。5' 変更された 3' 3' UTR のより大きい部分と並ぶ地域を含むレースとレースを組み合わせて、完全にシーケンスまたは 3' 端8に 5' 端から全体 mRNA のコピーのクローンを作成することが可能です。
この変更された 3' 競争の適用の例は、小説CCND1 MRCK融合遺伝子転写マントル細胞リンパ腫細胞株およびがん患者からの最近の id です。3' UTR CCND1とMRCKの両方の遺伝子配列から成り、miRNA 規制9に反抗しました。2 つ入れ子になったCCND1特定前方プライマーがすぐに隣接してCCND1の終止コドンの下流領域に補足。財源やバイオ情報を作る専門知識に多くの研究所がない場合があります特定 bioinformatic ツールと共に全体のトランスクリプトーム シーケンスを使用して、3' UTR10内遺伝子融合を検出できますが、この技術を使って。したがって、3' レースは 3' UTR を含む新規融合遺伝子のde novoの識別と確認のための代替。考えると、抜本的な報告された融合遺伝子の数の増加し同様に議事録を読んで、3' レース ツールとなっている強力な遺伝子シーケンス11,12を特徴付けること。また、最近の研究は、3' UTR の長さと同様、そのさまざまなシーケンス内で 3' UTR mRNA 転写安定性、ローカリゼーション、訳し、および関数13に影響することができますを示しています。関心の高まりの一部によるトランスクリプトームをマッピングの研究室で使用するため開発されている種類の DNA ポリメラーゼの数が増加しています。どのような種類の変更させることができます 3' DNA ポリメラーゼの使用可能なレパートリーを活用するための競争のプロトコルを決定することが重要です。
この作業を適応 3' マップ全体 3' UTR にレース レポート、PAS とを使用してANKHD1の転写産物の 3' 終わり胸の谷間サイト ネスト トラン スクリプトの 2 つの種類の DNA ポリメラーゼANKHD1セクション内のプライマー。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルのすべてのプロシージャの実行中は常に白衣、手袋と安全メガネを着用します。フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬容器/チューブが認定フードで指定されたコンテナー内のフェノール廃棄物処分のみ開かれているを確認します。DNAse、RNAse フリーの生殖不能の管、ヒント、および試薬を使用します。
1. 細胞培養
- HeLa 細胞ラインと 2 懸濁液マントル細胞リンパ腫細胞株、グランタ 519 と Jeko-1、10% を含む DMEM を成長 FBS と 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで 100 の U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンセル 1:10 を希釈し、粒子カウンター14を使用してをカウントします。
- RNA の抽出、細胞/ウェル 6 ウェル プレート (ウェルあたり 2 mL メディア) の 500,000 をプレートします。24 時間培養した後、細胞から RNA を収集します。
2. RNA の抽出
- セルを収穫
注: 遠心分離のステップを除いて、無菌性を維持するティッシュ文化フードの記載されたすべての手順を実行します。- 浮遊細胞 (Jeko 1 およびグランタ 519): の場合
- 15 mL チューブに (一緒に 2 mL の培地) セルを転送し、1,725 x g で 5 分間吸引メディアで遠心管の底で細胞ペレットを残します。
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。500 μ L の単相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬を 1.5 mL 遠心チューブ内の各サンプルに追加します。よく混ぜ、5 分間室温 (RT) で遠心チューブを反転しながら 1 分毎のまま。
- 付着性のセル (hela 細胞)。
- 各ウェルからの細胞培養媒体を吸い出しなさい。破片を洗浄する各ウェルに 1 mL の PBS を追加します。
- PBS を削除し、相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の試薬の 500 μ L を各ウェルに追加します。
- RT で穏やかな揺動で 5 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブに転送します。
- 浮遊細胞 (Jeko 1 およびグランタ 519): の場合
- セル換散
- フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合 1 時間-20 ° c の凍結します。
注:-20 ° c 夜間、または必要になるまでは、ミックスが残すことができます。 - フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合氷の上を解凍します。PCR フード遠心チューブに 100 μ L のクロロホルムを追加します。渦混合物まで 10-15 秒のサンプルは不透明なピンクです。15 分間 (4 ° C) で氷のサンプルをインキュベートします。
- 20,800 x g と 4 ° C で 15 分間のサンプルを遠心分離します。上部の無色の水相を慎重に取り外します (〜 200 μ L) と新しい 1.5 mL 遠心チューブに移転。
- フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合 1 時間-20 ° c の凍結します。
- RNA の沈殿物
- 各サンプルに等量のイソプロパノールを追加します。クロムの 1 μ L を追加 (材料表を参照) を各サンプルの RNA のためのキャリアとして機能して、以降の手順で RNA の視覚化に役立ちます。少なくとも 4 時間-80 ° C でサンプルをインキュベートします。-80 ° C で一晩インキュベート最高の結果を得るには、
- サンプルを冷却遠心機に転送します。20,800 x g で 35 分間遠心分離機/4 ° C;RNA は、管の底に青い斑点として表示されます。サンプルからイソプロパノールを慎重に取り外します。80% エタノール 500 μ L を追加し、簡潔に 3 のボルテックスでペレットを再懸濁します s。
- 5 分間遠心する RT で 20,800 x g でサンプルは、すべてのエタノールをサンプルから削除します。みましょうサンプルは、約 10 分は、RNAse フリー水の 35 μ L のサンプルを再懸濁しますのために空気乾燥します。熱ブロック (65 ° C) RNA で完全にソリューションであることを確認する 5 分間に、すぐに氷のチューブを置きます。
- 前述したように、代わりに 1 μ L151.5 μ L の RNA のサンプルを使用して除いて分光光度計を使用して総 RNA の濃度を決定します。必要に応じて、RNA の整合性を判断 1% の agarose のゲルの総 RNA の 1 μ g を実行します。
3. DNase 処理
- RNA の定量化後、ゲノム DNA を低下させる総 RNA の DNAse 処理を実行します。各サンプルは、RNAse フリーの DNAse キットを 20 μ L の全反応別の微量遠心チューブにミックスを作るから次の試薬を追加します。
- ミックス 2 μ L の 10 DNase 反応バッファー X 総 RNA の 4.4 μ g と。水 14 μ L の合計をもたらします。
- RNase フリーの DNAse の 2 μ L を追加します。37 ° c (逆転写キット) から RNase 阻害剤の 2 μ L の存在下で 30 分間インキュベートします。
- DNAse 酵素を不活化する 70 の ° C で 10 分間の熱ブロックの停止ソリューションと熱の 2 μ L を追加します。
注: DNAse 処理はオプションです。
4. cDNA 合成
50 μ l 反応ボリューム。
- 50 μ L 反応量: DNase の転送 22 μ L 新しいチューブ、または新しい管へ 22 μ L の総ボリュームに追加された水の総 RNA の転送 4 μ g に RNA を扱われます。10 μ M プライマー溶液から 2 μ L の T7 オリゴ dT25プライマーを追加します。T7 オリゴ dT25プライマー シーケンスは 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。
- 逆転写キットから RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 2 μ L、8 μ L の反応液の 5 倍、10 mM の dNTPs の 4 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 2 μ L を追加します。
注: は、ネガティブ コントロールとして機能する逆転写酵素のない反応を設定します。 - 1 h. 氷に直接転送の 42 ° C で孵化させなさい。5 分 75 ° C でチューブを加熱し、氷の上管を配置します。
5. プライマー融合遺伝子転写産物の検索
-
プライマー デザイン
- アンサンブルのゲノムのブラウザー (ENST00000360839.6/NM_017747) から cDNA シーケンスをダウンロードし、ターゲットのトラン スクリプト (ANKHD1) 上流停止コドンの ORF 内の領域を識別します。プライマー デザイン ソフトウェアのシーケンスのエントリ領域に終止コドンの上流シーケンスを含んでいる全体の地域 (最大 700 ヌクレオチド) のコピペ (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>)。
- ショー カスタム デザイン オプションを選択し、プライマーの数の 10 を選択 (返される結果) をシステムが生成するすべての他のパラメーターはデフォルトに設定しています。
- 5 前方プライマーと重複しない 2 つの逆プライマーを選択します。プライマーを注文し、10 μ M の最終的な集中に RNAse/DNAse 自由水で再構成します。PCR のための一般的なプライマー デザインの詳細については、別途説明16。
-
その後 3' レースで使用するための潜在的なプライマーを識別するために PCR
注: 反応で使用する最終的な前方プライマーを確認するには、PCR フード正規 PCR のため前方および逆のプライマーのさまざまな組み合わせを設定することによって設計されたプライマーをテストします。- 新鮮な 0.5 mL PCR チューブに cDNA (2 μ L) を転送します。前方のプライマーの 1 μ L と 1 μ L (10 mM プライマー液) から逆プライマーの追加します。ヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を追加することで最大 12.5 μ L を作る。12.5 μ L の PCR のゲル マスター ミックス × 2 を追加します。
- 次 PCR 熱サイクリング条件を使用: 95 ° C、2 分に続いて 29 サイクル 95 ° C の 30 s、60 ° C、30 秒と 1 分の 72 ° C、7 分 68 ° C で最終的なサイクルを設定。
- PCR 後に、エチジウム ブロマイドで染色 1% アガロースゲルの製品を実行します。電気泳動の詳細、いくつかの変更17以前に解説しています。
- 250 mL のフラスコでトリス酢酸 (TAE) バッファーの 100 mL の寒天 1 g を溶解します。電子レンジで沸騰させます。
- まま 1 分間冷却して発煙のフード エチジウム ブロマイド溶液 (10 mg/mL 在庫) 7.5 μ L を追加します。フラスコを旋回でよく混ぜるし、水平のゲル装置に注ぐ。常温固化するゲルを許可するように、少なくとも 30 分の発煙のフードを残します。
- 1 x TAE バッファーでゲルをカバーし、一緒に 3-5 μ L の DNA 分子量の梯子の agarose のゲルに PCR の製品の 10 μ L をロードします。10 分、撮像素子を使用している製品を可視化するため 175 V で実行し、さらに製品の分離が必要な場合追加の 5-10 分のためのゲルを実行します。
-
入り込まれたプライマー 3' 競争のための選択
- 明確な強力な単一 PCR バンドを持っているプライマーを選択する PCR agarose のゲルの結果を分析します。5'-ほとんどのプライマーを使用 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC 3') 一緒に実行最初の PCR の T7 oligodT25プライマー。
- 最初のプライマーの下流側にある入れ子になったプライマーを選択 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3')、T7 プライマーとして使用 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR の反作用の 2 番目のセット。
6. 最適化 3' 3' UTR の 2 つの異なる酵素を使用してマップするレース
注: ある pcr 法に使用される DNA ポリメラーゼの多様性の増加をしています。したがって、我々 は 3' レース PCR の反作用のための異なる酵素を使用した場合でも適用することができます標準の条件を決定したいです。任意のトラン スクリプトの逆のプライマーは一定します。唯一の変更は、ターゲットのトラン スクリプトの特定される入れ子になった前方プライマーです。
-
1:3 のプロトコル 'ピュロ コックス ・ フリオスス (Pfu)から変更された DNA ポリメラーゼを用いたレース
- 最初の PCR
- PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送し、10 x Pfu反応バッファーの 5 μ L を追加します。(10 mM ソリューション) から最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L、T7 oligodT25プライマーの 1 μ L および dNTPs の 1 μ L を追加します。
- 水の 40 μ L を追加することによって最大 49 μ L の総ボリュームを作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を加え、よく混ぜます。表 1に PCR のプロファイルを使用して PCR を実行します。
- 第 2 PCR
- 新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送し、10 x Pfuウルトラ II 反応バッファーの 5 μ L でミックスします。第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L、T7 プライマーの 1 μ L および dNTPs (10 mM 液) 1 μ L を追加します。
- 水の 39 μ L を追加することによって最大 49 μ L 全反応量を作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を追加します。最初の PCR の設定 (表 1) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。
- 最初の PCR
-
2:3 のプロトコル 'パイロコッカス融合した DNA 結合ドメインから成るキメラ DNA ポリメラーゼを用いたレース-校正のポリメラーゼ PCR マスター ミックスのような
- 最初の PCR
- PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送します。最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L と T7 oligodT25プライマーの 1 μ L を追加します。水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。
- PCR マスター ミックス × 2 の 25 μ L を加え、よく混ぜます。表 2に記載されている PCR サイクリング条件を使用します。
- 第 2 PCR
- 新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送します。T7 逆プライマーの 1 μ L と共に第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L を追加します。
- 水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。25 μ L の PCR マスター ミックス × 2 を追加します。最初の PCR の設定 (表 2) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。
- 最初の PCR
7. 3「レースの 2 番目 PCR 製品を確認します。
- 2 番目の PCR の製品 (と同様のトラン スクリプトが豊富に記述された場合は pcr 法の最初のラウンドから製品) を 5-10 μ L と agarose のゲルの実行。ゲルを設定し、前述泳 (5.2.3.1 に 5.2.3.3 の手順) を実行します。イメージャーの結果を可視化します。
8. 製品の精製とシーケンス
- 製造元のプロトコルに従ってゲルおよび PCR フラグメント DNA クリーンアップ システムを使用して 2 番目の PCR からゲルの PCR の製品を浄化します。
- サンガーを実行シーケンス (または、ゲル精製 PCR 製品サンプルと適切なシーケンス プライマー シーケンスの研究室に送信)。サンガーにシーケンス データを分析シーケンス。
- シーケンス分析ソフトウェアをダウンロード (材料の表を参照) し、トレース ファイルをソフトウェアにインポートします。呼び出し情報18を利用して個々 の純粋なベース QVs ベースを取得する (品質値)。高品質のトレース表示でクロマト グラムをダウンロードします。
省略可能: ゲル精製した製品は適切なクローン作成キットとサンガーの送信分離のクローンを使用してを複製することができますシーケンス。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
入れ子になった前方プライマー検索:
Agarose のゲルから使用する同じ転送別逆プライマーはプライマー 2 個別 PCR のゲル製品 (レーン 1 と 2) を図 1に示します。レーン 3 個別 PCR の製品、異なる前方および逆プライマーを有しています。理想的なプライマーによる PCR 反応に使用する、1 種類の PCR 製品 (3 車線) を与えます。レーン 1 と 2 で使用される転送プライマー最強のバンドを与える (予想)、最大の PCR の製品を与えるし、最初の前方のプライマーとして使用されます。3' レースでの PCR の反作用の 2 番目のセットの第 2 ネストされたプライマーは、車線 3 から前方のプライマーです。
異なる DNA ポリメラーゼは、3' のレースと同様の結果が得を使用しました。
2 つの異なる DNA ポリメラーゼは、3' レース (図 2) を PCR サイクリング条件が異なる場合にもかかわらず同じ大きさで分類された PCR の製品を生産しました。予想される PCR の製品の 1 つだけの異なるバンドがあります。すべてマイナスの逆転写酵素ネガティブ コントロール (-) はそれに続く下流の反作用と同様に cDNA を合成するだけでなく、RNA のゲノムの汚染を示さない、バンドを持っていません。
サンガー シーケンスを結果します。
PCR の製品いたゲル精製され、サンガーのシーケンス。図 3 aに示すように結果はサンガーからシーケンスのクロマト グラフの部分を示すシーケンス。代表的なシーケンスは、終止コドン、推定上起こる信号と胸の谷間のサイトだけでなく、ポリ () の尾 3' レース製品 (図 3 b) の場所を識別します。
図 1: 2 つの入れ子になった遺伝子特定前方プライマーの 3' レースで使用する識別します。表示は異なる遺伝子の組み合わせからの PCR の製品の例の特定を進むと分子量 (mw) の梯子の agarose のゲルを染色エチジウム ブロマイドで hela 細胞 cDNA を用いた逆プライマーを実行します。レーン 1 と 2 は、同じ遺伝子の特定の前方からのプライマーが異なる逆プライマー PCR 産物です。矢印は、各レーンの予想の PCR の製品をポイントします。予想される PCR の製品のためのバンド、に加えて追加のバンドがあります。レーン 3 の単一の PCR の製品異なる遺伝子特定入れ子になった前方および逆プライマーからは、シングルの期待されるバンド。
図 2: 3' レース製 PCR の反作用の 2 番目のセットの検証します。(A) Pfu DNA ポリメラーゼと (B) キメラ DNA ポリメラーゼで 2 番目の PCR の反作用からの製品は、エチジウム ブロマイドで agarose のゲルで実行されました。(-) によって描かれたレーンは、RNA からの cDNA の合成は、逆転写酵素の不在で実施された各セルライン陰性対照サンプルからです。レーン 1 と 2 は、各細胞の生物学的複製からの PCR の製品です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 3' 競争の PCR の製品をマッピングします。精製ゲル 3' レース製品の予測される起こる信号とポリ a の尾の場所を示すシーケンス クロマト グラムの (A) の部分。(B) 代表は、終止コドン、起こる信号 (PAS)、ポリ a テールの胸の谷間と添付ファイルのサイトだけでなく、多 (A) 尾シーケンスのセクションを示すサンガー シーケンス データからシーケンスします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| サイクルのステップ | 温度と期間 | サイクル数 |
| 初期変性 | 95 ° C、3 分 | 1 |
| 初期アニーリングをおよび拡張 | 50 ° C 5 分と 10 分のための 72 ° C | 1 |
| Subcyles (変性、アニーリングをおよび拡張) | 95 ° C、40 s、50 ° C 1 分、72 ° C、3 分 | 20 |
| 最終サイクル (変性、アニーリングをおよび拡張) | 95 ° C、40 s、50 ° C 1 分と 15 分のための 72 ° C | 1 |
| ホールド | 4 ° C、∞ |
表 1: Pfu DNA ポリメラーゼの PCR サイクリング条件 3' 競争のため。
| サイクルのステップ | 温度と期間 | サイクル数 |
| 初期変性 | 98 ° C、3 分 | 1 |
| 初期アニーリングをおよび拡張 | 50 ° C 5 分と 10 分のための 72 ° C | 1 |
| Subcyles (変性、アニーリングをおよび拡張) | 98 ° C、30 秒、1 分の 50 ° C と 4 分の 72 ° C | 20 |
| 最終サイクル (変性、アニーリングをおよび拡張) | 98 ° C、30 秒、1 分の 50 ° C と 15 分のための 72 ° C | 1 |
| ホールド | 4 ° C、∞ |
表 2: キメラ DNA ポリメラーゼ PCR の循環状態。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
遺伝子によ遺伝子単位での大規模な並列シーケンス技術の出現にもかかわらず 3' レースまだまま PAS とポリ a の尾に隣接したヌクレオチドを識別する最も簡単なと最も経済的な方法です。ここで説明した適応は 3' レースを使用して両方を増幅し、ORF、終止コドンと全体 3' UTR ANKHD1 mRNA のコピーの部分を含むシーケンスをマップするを展開します。3' 競争の主な利点は、いくつかのマイナーな適応から 3' レース製品ことができます 3' UTR 機能 miRNA ターゲット、安定性試金、その他の機構のアッセイを含む下流の尋問を容易にする他のベクトルに複製します。これは、入れ子になったプライマー シーケンス9,10内の制限の酵素のサイトを含めることによって行うことができます。調整を行われると、のみ、3' UTR なし 3' UTR 機能アッセイ5のクローニングのための ORF からの任意のシーケンスを含めることができます。
3' 競争の成功の主要な決定要因は、興味の遺伝子を対象とするネストされたプライマーの開発です。Ensembl ゲノム ブラウザーから cDNA シーケンスは、最高最適なプライマーを開発するために多型のない領域を識別するために推奨されます。理想的には、いくつか入れ子になったは標準 PCR を使用して、最高 2 つ入れ子になった遺伝子特異的プライマーを使用するを識別する興味の遺伝子内に少なくとも 2 つの逆プライマーを上映することができますと同様プライマーを転送します。本研究では最初の遺伝子特定前方プライマー 3' 競争の最初選択はラボで日常的に使用する標準 PCR と 2 つのバンドを与えた。残念ながら、プライマー設計は興味のトラン スクリプトの SNPs の重要な数によって限られました。ターゲット コピーの SNPs は、プライマーと非効率的なアニールされ、増幅、最小19に減るべきであるターゲットとの間の不一致に します。PCR の反作用の完全な阻止の 1 つのプライマーで、少なくとも 4 つの Snp の有無や 5 つの不一致 (3 つのプライマーおよび他の 2 つ) の組み合わせの発生可能性があります、したがって唯一のオプションより多くのプライマー20を設計することです。PCR のプライマー検索ここで報告した実験のために使用する標準の 1 つの単一のバンドを取得するより多くのプライマーを設計するのではなく PCR サイクリング条件とその後 3' レースで使用された DNA ポリメラーゼは、の確率を最適化するために変更されました。1 つの特定のバンドを取得します。変性温度 98 ° C (95 ° c 増加はプライマー検索で使用される) DNA ポリメラーゼの 1 つに増加。3' で使用される両方の DNA ポリメラーゼのためレース PCR 初期変性時間に増加した代わりに、推奨される 30 分 cDNA テンプレートを完全に変性するために 2 分する s。T7 オリゴ dT25プライマーなど潜在的弱い二次構造を形成、プライマー21の可用性が低下する可能性があると予測されます。任意の二次構造を改初期変性長さおよび温度の増加と支援が 3' 競争の最終サイクル後単一の特定のバンドをもたらします。さらに、非特異的バンドだったには高い PCR サイクル (最大 35 サイクル) で登場した示唆している期待のバンドよりも軽い唯一 20 に PCR のサイクルを制限する非特定帯域の増幅が減少します。
3' レース、他のベース PCR の反作用のような別の可能性は、ターゲット地域の22の不完全な増幅です。したがって、両方の耐熱性酵素初期のアニーリング温度はターゲットにプライマーのアニーリングの最適化に 5 分間、50 ° C に設定しました、これは 72 ° c 10 分の最初の拡張温度が続いた。各酵素の最終的な PCR のサイクルは 72 ° C で 15 分の最後の拡張時間を過ごしました拡張手順は DNA ポリメラーゼの製造元によって推奨されているよりも長かった。長い延長 (伸び) ステップでは、不完全な産物、最初と最後の増幅製品16の完全な拡張を有効にするの完全な合成をことができます。
3' 競争で発生する PCR のステップは、ゲル22にいくつか予期しないバンドの結果ターゲット mRNA 転写ではなく DNA (または他の DNA 汚染) を検出する可能性があります非常に敏感です。汚染を防ぐ 1 つの方法は、専用の PCR フードで PCR 作業を実行、手袋を着用、きれいな試薬とオートクレーブ滅菌チューブを使用し、ピペットのヒント。(イントロン プライマーのような) の間で異なるエクソンにあるので通常の pcr できる前方および逆プライマーこのように、イントロンを含む領域が増幅されていますが異常に大きい PCR の製品を意味するでしょう。ただし、このできないことがあります常に、のみ 3' UTR のシーケンス、内にある同じターミナル エクソン 3' レース増幅のターゲットであります。また、RNA は DNAse 酵素 cDNA を合成する前に前処理することができます。RNA からの cDNA の統合のためのランダムな hexanucleotide ではなく逆転写酵素反応を首相に T7 オリゴ dT25プライマーの使用では、ゲノムの製品の増幅も減少します。最後になりましたが、ネガティブ コントロールを設定 (、"-"図 2車線)、逆転写酵素の不在で cDNA 合成を設定した場所を強く推奨します。コントロールは、その後 3' レースの手順で、他のサンプルを同じ手順を経る。このコントロールのバンドの存在は潜在的なゲノム DNA 汚染を意味します。
前述の課題にもかかわらず 3' 競争は個々 の遺伝子的に 3' 端のマッピングにおける強力なツールです。次世代の技術の出現は、代替の 3' 端代替起こる、または選択的スプライシングを含まない場合がありますから、その結果が成績のレパートリーの増加につながっています。癌細胞での複雑さに追加するには、染色体再配列は頻繁し、発癌遺伝子融合製品23になります。2 つの遺伝子の融合が ORF 操作や、いくつかのケースで含まれて 3' UTR9,10内のシーケンスのみ。さらに、教職大学院/共同 transcribed 遺伝子が同時に書き換えられるが、異なった蛋白質11に変換可能性がありますもあります。3' レースすべてこれらユニークな異常な成績証明書だけでなく、通常の成績証明書をマップに合わせて調整できます。これらの異常な成績は病特定バイオ マーカーまたは特定の薬剤ターゲット、例えばとして終わる可能性がありますので、これは重要です、薬イマチニブ癌におけるBCR ABL1融合遺伝子を対象とします。
したがって、3' レース小説 3' UTRs、および 3' UTR5,9内遺伝子融合を識別、通常の成績証明書を増幅するために使用できる汎用性の高いテクニックです。本報告では 3' レースに使用された増幅し、停止 codon、PAS と全体 3' UTR 種類の DNA ポリメラーゼを使用してANKHD1のトラン スクリプトのマップします。記述されているアプローチは、任意の polyadenylated の転写産物の 3' 末端をマップする使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
彼女の技術的なヘルプ Bettine ギブスを認識したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
