Summary
CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.
Abstract
진 핵 mRNAs의 성숙 3' 끝 형성을, 많은 꼬리의 추가 포함 하는 포함 한다. 유전자의 3' 끝, 지도 하기 위하여 선택의 전통적인 방법은 cDNA 끝 (3' 경주)의 3' 급속 한 확대 이다. 3' 레이스에 대 한 프로토콜 설계 및 관심의 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역 (3' UTR) 내에서 중첩 된 뇌관의 선택을 요구 한다. 그러나, 몇 가지 수정 프로토콜 포함 전체 3' UTR 및 ORF와 3' UTR 사이의 관계의 더 포괄적인 그림을 제공 하는 열려있는 독서 프레임 (ORF), 내에서 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 이것은 기존의 3' 경쟁에서 제공 하는 분열 polyadenylation 사이트 뿐만 아니라 polyadenylation 신호 (PA)의 외 이다. 특이 한 3' Utr, 3' UTR, 내 유전자 융해를 포함 하 여 검색할 수 있습니다 확장 된 3' 경주 그리고 시퀀스 정보 잠재적인 미르 바인딩 사이트 뿐만 아니라, 누구나 풍부한 사본의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요소를 불안정을 예측에 사용할 수 있습니다.
Introduction
3' 끝의 형성은 사전-mRNA의 하류 ~ 250 untemplated adenines 많은 꼬리1,2를 구성 하는 추가 다음 파의 분열을 구성 하는 mRNA 성숙에 중요 한 단계입니다. 많은 의무적인 단백질 (PABP) 많은 꼬리를 한다이 저하에서 mRNA 사본 보호 하 고 번역1을 용이 하 게 한다.
현재 견적 인간 유전자의 70% 여러 패스, 따라서 여러 3' 끝3인 양자 택일 polyadenylation 받아야 좋습니다. 따라서, 많은 꼬리의 3' UTR, 나머지 연결 식별 어떤 주어진된 대 본에서 사용 하는 파를 식별 하는 것이 중요 하다. 차세대 시퀀싱의 출현 Utr 및 유전자의 수천의 패스의 3' 동시 식별에 결과 있다. 시퀀싱 기능에 있는이 증가 bioinformatic 3' 끝의 양자 택일 polyadenylation 관련 데이터를 분석 하는 알고리즘의 개발을 요구 했다. 드 노 보 탐지 또는 유효성 검사는 파의 및 그러므로 대규모 시퀀싱 데이터에서 개별 유전자의 3' 끝의 매핑, 3' 경주 남아 선택4,5의 방법. 3' 경주의 cDNA 제품에 일반적으로 포함 하는 시퀀스의 3' UTR 많은 꼬리, 분열 사이트, 우선권, 및 상류는 파의 순서에 있는 부분에만 포함 됩니다. 디자인 및 유전자 특정 앞으로 역 뇌관의 사용 필요, PCR와 달리 3' 레이스만 요구 한다 2 개의 유전자 특정 중첩된 앞으로 뇌관을. 따라서, PCR 증폭된4,6되 고 유전자의 큰 영역의 뉴클레오티드 순서의 더 상세한 지식이 필요 합니다. 3' 레이스 사용 같은 뇌관 그 목표는 많은 모든 polyadenylated RNA 사본에 대 한 꼬리, 앞으로 뇌관 될 필요가 유전자 특정, 따라서,만 요구 하는 mRNA의 크게 작은 영역의 지식 역. 그 시퀀스는 완전히 특징이4,7영역의 확대 수 있습니다. 이 수 있다 3' 경주 뿐만 아니라, 유전자의 3' 끝을 결정 하지만 또한 결정 하 고 큰 지역 상류의 3' UTR 상당 부분을 형성 하는 파의 특성 사용. 5'는 수정 3' 3' UTR의 큰 부분 및 측면에 서 지구를 포함 하는 레이스와 레이스를 결합 함으로써 완전히 순서 또는 그것의 3' 끝85' 끝에서 한 전체 mRNA 사본 복제 가능 하다.
이 응용 프로그램의 수정 3' 레이스의 예는 소설 CCND1 MRCK 융합 유전자 사본 맨 틀 세포 림프 종 세포 선 암 환자에서의 최근 id입니다. 3' UTR CCND1 및 MRCK 유전자에서 시퀀스의 구성 그리고 미르 규정9완강히 저항 했다. 두 개의 중첩 된 CCND1 특정 앞으로 뇌관 즉시 인접 하 고 CCND1 정지 codon의 하류 지역에 보완 했다. 금융 자원 또는 수 있도록 bioinformatic 전문 많은 연구소 있습니다 부족 특정 bioinformatic 도구 함께 전체 transcriptome 시퀀싱 3' UTR10유전자 융해를 감지 사용할 수 있습니다, 있지만이 기술의 사용. 따라서, 3' 레이스 드 노 보 식별 및 소설 퓨전 유전자 포함 3' UTR의 유효성 검사에 대 한 대안 이다. 고려는 과감 한 보고 융합 유전자의 수에 있는 증가 뿐 아니라 성적 증명서를 통해 읽기, 3' 경주 되고있다 유전자 시퀀스11,12특성화에 강력한 도구. 또한, 최근 연구의 3' UTR 길이 뿐 아니라 3' UTR에서 서로 다른 시퀀스를 영향을 미칠 수 mRNA 사본 안정성, 현지화, translatability, 및 기능13나타났습니다. 때문에 부분 관심 증가 transcriptome 매핑, 실험실에서 사용 하기 위해 개발 되 고 다른 DNA polymerases의 증가 되었습니다. 그것은 어떤 유형의 수정 할 수 있다 3 ' 경주 프로토콜에서 DNA polymerases 사용할 수 있는 레 퍼 토리를 활용 하기 위해서는 결정 해야 합니다.
이 작품 보고 적응 3' 경주에 매핑하는 전체 3' UTR, 우선권, 및 3' 끝 분열의 사이트를 사용 하 여 ANKHD1 사본 중첩 사본 및 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 ANKHD1 섹션에서 뇌관.
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Protocol
이 프로토콜에서 모든 절차를 수행 하는 동안 항상 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 유리를 착용. 용기/튜브 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약만 인증된 후드, 그리고 지정 된 컨테이너에 페 놀 폐기물의 처분에 열려 있는지 확인 합니다. 무 균 튜브 DNAse/RNAse 무료, 팁, 그리고 시 약을 사용 합니다.
1. 세포 배양
- 헬러 세포 선 및 두 정지 맨 틀 세포 림프 종 셀 라인, Granta-519 및 Jeko-1, 10% 포함 된 DMEM 성장 FBS와 37 ° c.에 5% CO2 습도 인큐베이터에서 100 U/mL 페니실린/스 셀 1시 10분 희석 및 입자 카운터14를 사용 하 여.
- RNA 추출, 셀/잘 6 잘 플레이트 (잘 당 2 mL 미디어)에 50만 플레이트. 24 h에 대 한 보육, 후 세포에서 RNA를 수집 합니다.
2. RNA 추출
- 세포를 수확
참고: 원심 분리 단계를 제외 하 고 불 임을 유지 하기 위해 조직 문화 후드에 나열 된 모든 단계를 수행 합니다.- 현 탁 액 셀 (Jeko-1 및 Granta-519):
- 15 mL 튜브를 (함께 미디어의 2 개 mL) 셀을 전송 하 고 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 1,725 x g에서 원심 튜브의 아래쪽에 셀 펠 릿을 두고.
- 1 인산 염 Buffered 식 염 수 (PBS) x 50 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 각 샘플 1.5 mL microcentrifuge 관에서 monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 500 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 두고 5 분 동안 실내 온도 (RT) microcentrifuge 튜브를 반전 하는 동안 모든 1 분.
- 부착 세포 (HeLa)에 대 한:
- 각 우물에서 세포 배양 발음 각 잘 씻어 파편을 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
- PBS를 제거 하 고 각 잘 500 µ L monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 추가.
- 부드러운 락으로 5 분 동안 RT에서 품 어. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송.
- 현 탁 액 셀 (Jeko-1 및 Granta-519):
- 세포 세포의 용 해
- 1 시간 동안-20 ° C에서 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합물을 고정 합니다.
참고: 필요한 때까지 또는-20 ° C 하룻밤에 믹스를 남아 있을 수 있습니다. - 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합 얼음에 녹여 PCR 후드에서 microcentrifuge 튜브에 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 혼합물까지 10-15 s에 대 한 샘플은 핑크와 불투명. (4 ° C)에서 15 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
- 원심 20,800 x g와 4 ° C에서 15 분에 대 한 샘플 위 무색 수성 단계를 조심 스럽게 제거 (~ 200 µ L) 및 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 전송.
- 1 시간 동안-20 ° C에서 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합물을 고정 합니다.
- RNA 강 수
- 각 샘플에 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 합니다. Coprecipitant의 1 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각각 샘플링 하는 RNA에 대 한 캐리어로 고 이후 단계에서 RNA를 시각화 하는 데 도움이. 적어도 4 h-80 ° C에서 샘플을 품 어. 최상의 결과 얻으려면 밤새-80 ° c.에 품 어
- 냉각된 원심 분리기 샘플 전송. 35 분 20,800 x g에서 원심 분리기 / 4 ° C; RNA는 튜브의 하단에 푸른 반점으로 나타납니다. 조심 스럽게 샘플에서는 소 프로 파 놀을 제거. 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 간단히 3 vortexing에 의해 펠 릿 resuspend s.
- 원심 분리기 샘플 RT에서 20,800 x g에서 5 분에 대 한 샘플에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 하자 샘플 약 10 분 Resuspend 샘플 RNAse 무료 물 35 µ L에 대 한 건조. RNA가 완전히 솔루션을 보장 하기 위해 5 분 동안 열 블록 (65 ° C)에 배치 하 고 즉시 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 앞에서 설명한, 1 µ L15대신 RNA 샘플의 1.5 µ L를 사용 하 여 제외 하 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 전체 RNA의 농도 결정 합니다. 필요에 따라 RNA 무결성을 확인 하는 1 %agarose 젤에 총 RNA의 1 µ g를 실행 합니다.
3. DNase 치료
- RNA의 정량화, 후 어떤 genomic DNA 저하 총 RNA에 DNAse 치료를 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 별도 microcentrifuge 튜브에서 믹스 20 µ L 총 반응 수 있도록 RNAse 무료 DNAse 키트에서 다음과 같은 시 약을 추가:
- 믹스 2 µ L DNase 10의 반응 버퍼 X 총 RNA의 4.4 µ g. 물으로 14 µ L의 총을가지고.
- 2 µ L의 RNase 무료 DNAse 추가 합니다. (반전 전사 Kit)에서 RNase 억제제의 2 µ L의 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 열 블록 DNAse 효소 비활성화를 70 ° C에서 10 분 동안에 중지 솔루션 및 열 2 µ L를 추가 합니다.
참고: DNAse 치료 선택 사항입니다.
4입니다. cDNA 합성
50 µ L의 최종 반응 볼륨:
- 50 µ L의 최종 반응 볼륨: 전송 22 µ L는 DNase의 새로운 튜브, 또는 전송 4 µ g 새 튜브를 22 µ L의 총 볼륨에 추가 된 물 총 RNA의 RNA 취급. 10 µ M 뇌관 솔루션에서 T7 올리고 dT25 뇌관의 2 µ L를 추가 합니다. T7 올리고 dT25 뇌관을 위한 순서는 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- 반전 녹음 방송에서 키트 RNase 억제제 (20 U / µ L)의 2 µ L, 5 배 반응 버퍼의 8 µ L, 10 mM dNTPs의 4 µ L 및 역전사 (200 U / µ L)의 2 µ L를 추가 합니다.
주: 부정적인 컨트롤 역할 없이 역전사 반응을 설정. - 1 헤 얼음에 직접 전송에 대 한 42 ° C에서 품 어. 5 분 동안 75 ° C에 튜브가 열 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
5. 뇌관 융합 유전자 사본에 대 한 검색
-
뇌관 디자인
- 앙상블 게놈 브라우저 (ENST00000360839.6/NM_017747)에서 cDNA 순서를 다운로드 하 고 대상 (ANKHD1) 상류의 사본 정지 codon의 ORF 내의 영역을 식별. 복사 및 붙여넣기 뇌관 디자인 소프트웨어의 시퀀스 항목 영역으로 정지 codon의 상류 시퀀스를 포함 하는 전체 지역 (최대 700 뉴클레오티드) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- 표시 사용자 지정 디자인 옵션을 선택 하 고 선택 뇌관의 수에 대 한 10 시스템 (반환 결과)를 생성 한다 고 모든 다른 매개 변수를 기본값으로 설정.
- 5 앞으로 프라이 머와 오버랩 되지 않는 2 개의 반전 뇌관을 선택 합니다. 뇌관을 주문 하 고 10 µ M의 최종 농도에 RNAse/DNAse 무료 물으로 다시 구성 하기. PCR 위한 뇌관 일반적인 디자인에 대 한 자세한 내용은 다른 덮여 있다16.
-
후속 3' 경주에 사용에 대 한 잠재적인 뇌관을 식별 하는 PCR
참고: 반응에 사용 하 여 마지막 앞으로 뇌관을 확인 하려면 일반 PCR PCR 후드에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 다른 조합을 설정 하 여 설계 된 뇌관을 테스트 합니다.- 신선한 0.5 mL PCR 튜브에 cDNA (2 µ L)를 전송 합니다. 앞으로 뇌관의 1 µ L (10 mM 뇌관 솔루션)에서 역방향 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. Nuclease 무료 물 8.5 µ L을 추가 하 여 최대 12.5 µ L를 확인 합니다. 젤에 PCR 주인 혼합 x 2의 12.5 µ L를 추가 합니다.
- 다음 PCR 열 사이클링 조건을 사용: 95 ° C 30에 대 한 29 주기 뒤에 2 분 동안 95 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 7 분 동안 68 ° C에서 최종 주기를 설정 1 분에 72 ° C.
- PCR, 후 ethidium 평범한 사람으로 물 1 %agarose 젤에는 제품을 실행 합니다. 전기 이동 법의 세부 사항은 이전 몇 가지 수정17설명 합니다.
- Agarose 250 mL 플라스 크에 트리 아세테이트 (태) 버퍼의 100 ml에서의 1 g을 분해. 전자 레인지에 끓인 다.
- 1 분 동안 냉각 하 고 증기 두건에서 7.5 µ L ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL 주식)의 추가를 떠나. 플라스 크를 소용돌이로 잘 혼합 하 고 수평 젤 기구에 부 어. 응고를 젤 수 있도록 30 분 이상 증기 두건에서 RT에 둡니다.
- 1 x TAE 버퍼와 젤을 커버 하 고 DNA 분자량 사다리의 3-5 µ L 함께 agarose 젤에 PCR 제품의 10 µ L를 로드 합니다. 10 분 시각화는 영상 장치를 사용 하 여 제품에 대 한 175 V에서 실행 하 고 추가 제품의 분리가 필요한 경우, 추가 5-10 분에 대 한 젤을 실행 합니다.
-
3' 레이스에 대 한 중첩 된 뇌관의 선택
- PCR agarose 젤 별개, 강한, 단일 PCR 밴드 프라이 머 선택의 결과 분석 합니다. 5'-대부분 뇌관을 사용 하 여 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') 실행 하는 첫 번째 PCR에 T7 oligodT25 입문서와 함께.
- 첫 번째 뇌관의 하류에 있는 중첩 된 뇌관을 선택 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), T7 뇌관으로 그것을 사용 하 여 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR 반응의 두 번째 세트에서.
6. 최적화 3' 3' UTR 두 개의 서로 다른 효소를 사용 하 여 지도를 경주
참고: 계속 있다 DNA polymerases PCR;에 대 한 사용의 다양성 증가 따라서, 우리는 3' 경주 PCR 반응에 대 한 다른 효소를 사용 하는 경우에 적용 될 수 있는 표준 조건을 확인 싶 었 어 요. 어떤 사본에 대 한 역방향 뇌관; 일정 하 게 유지 됩니다. 유일한 변화는 중첩된 앞으로 뇌관 대상 성적에 대 한 관련 된에 있습니다.
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1: 3 프로토콜 ' Pyrococcus furiosus (Pfu) 에서 수정 된 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 경주
- 첫 번째 PCR
- PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송 하 고 10 x Pfu 반응 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다. (10 m m 솔루션)에서 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L, T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs의 1 µ L를 추가 합니다.
- 물 40 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 1에 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
- 두 번째 PCR
- 첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송 하 고 5 µ L 10 x Pfu울트라 II 반응 버퍼의 혼합. 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L, T7 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs (10 m m 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다.
- 물 39 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 반응 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 1)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
- 첫 번째 PCR
-
2: 3 프로토콜 '는 공상 DNA 중 합 효소 Pyrococcus를 융합 하는 DNA 바인딩 도메인의 구성을 사용 하 여 경주-중 합 효소는 PCR 마스터 믹스 교정 처럼
- 첫 번째 PCR
- PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송. 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다.
- PCR 마스터 믹스 x 2의 25 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 2에 설명 된 PCR 순환 상태를 사용 합니다.
- 두 번째 PCR
- 첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송. T7 역방향 뇌관의 1 µ L 함께 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.
- 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다. PCR 주인 혼합 X 2의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 2)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
- 첫 번째 PCR
7. 3' 경주의 두 번째 PCR 제품을 확인 하십시오.
- 받아 5-10 µ L의는 두 번째 PCR 제품 (PCRs 사본을 풍부 하 게 표현 하는 경우의 첫 번째 라운드에서 제품) 고는 agarose 젤에 실행 합니다. 젤 고 앞에서 설명한 전기 (5.2.3.1 5.2.3.3 단계)를 실행 합니다. 영상에 결과 시각화 한다.
8. 제품 정화 및 시퀀싱
- 젤 PCR 파편 DNA 청소 시스템을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 두 번째 PCR에서 젤 PCR 제품을 정화.
- 수행 생어 시퀀싱 (또는 젤 정화 PCR 제품 샘플 및 시퀀싱 실험실에 적절 한 시퀀싱 뇌관 보낼). 후 생어 시퀀싱 데이터 분석 순서.
- 시퀀스 분석 소프트웨어 다운로드 ( 재료의 표참조) 소프트웨어에 추적 파일을 가져옵니다. 개별 순수 베이스 QVs (품질 값) 기지를 사용 하 여 전화 정보18. 보기에 대 한 높은 품질 추적으로 크로마 다운로드.
선택 사항: 젤 정화 제품 수 복제 될 적절 한 복제 키트와 격리 된 클론 생어에 대 한 전송 사용 하 여 연속.
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Representative Results
중첩 된 앞으로 뇌관 검색:
Agarose 젤에서 그림 1 에서는 두 가지 PCR 젤 제품 (1, 2 차선)는 사용 같은 전달 하지만 다른 역방향 뇌관 뇌관. 레인 3 뚜렷한 PCR 제품 고 뚜렷한 정방향 및 역방향 뇌관을 있다. 기반으로 하는 PCR 반응에 사용할 이상적인 뇌관은 하나의 뚜렷한 PCR 제품 (3 차선) 하는 그. 레인 1과 2에 사용 앞으로 입문서 강한 밴드를 제공 고 (예상), 가장 큰 PCR 제품을 제공 하 고 첫 번째 앞으로 뇌관으로 사용 됩니다. 3' 경주에서 PCR 반응의 두 번째 집합에 대 한 두 번째 중첩 된 뇌관 레인 3에서 앞으로 입문서가입니다.
3' 레이스와 비슷한 결과 생산에에서 사용 되는 다른 DNA Polymerases:
두 개의 다른 DNA polymerases 3' 레이스 (그림 2)에 대 한 서로 다른 PCR 순환 조건 불구 하 고 같은 크기의 PCR 제품을 생산. 예상된 PCR 제품에 대 한 단 한 가지 밴드가입니다. 모두 마이너스의 역전사 부정적인 컨트롤 (-) 하지 않은 후속 다운스트림 반응에서 뿐만 아니라 cDNA 합성에 사용 하는 RNA의 게놈 오염 없이 보여주는 밴드.
생어 시퀀싱 결과:
PCR 제품 젤 생어에 대 한 전송 및 순화 했다 순서. 그림 3A 에 표시 된 결과 생어에서 시퀀스 크로마 토 그래프의 일부를 표시 순서. 대표 시퀀스 정지 codon, 상 상속 polyadenylation 신호, 분열 사이트 뿐만 아니라 폴 리 3' 경쟁 제품 (그림 3B) (A) 꼬리의 위치를 나타냅니다.
그림 1: 3' 경주에 사용 하 여 두 개의 중첩 된 유전자 특정 앞으로 뇌관의 식별. 표시 된 유전자의 서로 다른 조합에서 PCR 제품의 예를 들어 특정 앞으로 이며 분자량 (mw) 사다리 agarose 젤을 얼룩이 지는 ethidium 평범한 사람에서 역방향 뇌관 헬러 cDNA를 사용 하 여 실행. 레인 1과 2는 같은 유전자 특정 앞으로 뇌관 하지만 다른 역방향 뇌관에서 PCR 제품. 화살표는 각 레인에 대 한 예상된 PCR 제품을 가리킵니다. 예상된 PCR 제품에 대 한 밴드 이외에 추가 밴드가 이다. 레인 3에 단일 PCR 제품 다른 유전자 특정 앞으로 중첩 및 반전 뇌관에서 이며 단일 예상된 밴드를 보여줍니다.
그림 2: PCR 반응의 두 번째 세트에서 3' 경쟁 제품의 확인. (A) Pfu DNA 중 합 효소와 (B) 공상 DNA 중 합 효소와 함께 두 번째 PCR 반응에서 제품 ethidium 평범한 사람으로는 agarose 젤에 실행 했다. 레인 (-)에 의해 묘사는 각 셀 라인에 대 한 부정적인 컨트롤 샘플에서 cDNA 합성 RNA에서 역전사 효소의 결핍에서 실시 되었다. 레인 1과 2는 각 셀 라인의 생물 복제에서 PCR 제품. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 3' 경주의 PCR 제품을 매핑. (A) A의 젤 정화 3' 레이스 제품 예측된 polyadenylation 신호 및 많은 꼬리의 위치를 보여주는 시퀀스 크로마의 부분. (B) 대표 정지 codon, polyadenylation 신호 (PA), 폴 리 (A) 꼬리 시퀀스의 부분 뿐만 아니라 많은 꼬리의 절단, 첨부 파일 사이트를 보여주는 생어 시퀀싱 데이터에서 시퀀스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 사이클 단계 | 온도 및 기간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 3 분 동안 95 ° C | 1 |
| 초기 어 닐 링 및 확장 | 50 ° C 5 분 및 10 분 동안 72 ° C | 1 |
| Subcyles (변성, 어 닐 링 및 확장) | 95 ° C 40에 대 한 s, 1 분, 50 ° C 그리고 3 분 동안 72 ° C | 20 |
| 마지막 주기 (변성, 어 닐 링 및 확장) | 95 ° C 40에 대 한 s, 1 분, 50 ° C 그리고 15 분 동안 72 ° C | 1 |
| 보류 | 4 ° C, ∞ |
표 1: Pfu DNA 중 합 효소 PCR 순환 조건 3' 레이스에 대 한.
| 사이클 단계 | 온도 및 기간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 3 분에 98 ° C | 1 |
| 초기 어 닐 링 및 확장 | 50 ° C 5 분 및 10 분 동안 72 ° C | 1 |
| Subcyles (변성, 어 닐 링 및 확장) | 98 ° C 30 초, 1 분, 50 ° C 및 4 분 동안 72 ° C | 20 |
| 마지막 주기 (변성, 어 닐 링 및 확장) | 98 ° C 30 초, 1 분, 50 ° C 그리고 15 분 동안 72 ° C | 1 |
| 보류 | 4 ° C, ∞ |
표 2: 공상 DNA 중 합 효소 PCR 순환 조건.
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Discussion
대규모 병렬 시퀀싱 기술, 유전자에 의해 유전자 기준의 출현에도 불구 하 고 3' 경주 여전히 남아 있다 파 및 많은 꼬리에 인접 한 뉴클레오티드를 식별 하기 위해 쉽고 가장 경제적인 방법. 여기에 설명 된 적응을 증폭 ORF, 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR ANKHD1 mRNA 사본 중의 일부를 포함 하는 시퀀스를 지도 3' 레이스 사용 하 여 확장 합니다. 3' 경주의 주요 이점은 그 몇 가지 사소한 조정으로 3' 경주에서 제품 수 복제 함수의 3' UTR 미르 타겟팅, 안정성 분석으로 다른 기계적 분석을 포함 한 다운스트림 심문을 촉진 하기 위하여 다른 벡터에 이다. 이 중첩 된 뇌관 시퀀스9,10금지 효소 사이트를 포함 하 여 수행할 수 있습니다. 조정만는 3' UTR 3' UTR 기능 분석 실험5복제 ORF에서 어떤 순서 없이 포함 하도록 만들 수 있습니다.
3' 경주의 성공의 주요 결정은 관심사의 유전자를 대상으로 하는 중첩 된 뇌관의 개발 이다. 합 게놈 브라우저에서 cDNA 순서는 가장 최적의 프라이 머를 개발 하기 위하여 동 질 다 상 없이 영역을 식별 하는 것이 좋습니다. 이상적으로, 여러 중첩 된 뇌관 전달 뿐만 아니라 관심사의 유전자 내의 적어도 2 개의 반전 뇌관 최고의 두 개의 중첩 된 유전자 특정 뇌관 사용할 식별 하기 위해 표준 PCR를 사용 하 여 상영 될 수 있습니다. 이 연구에서 첫 번째 유전자 특정 앞으로 뇌관 선택 3' 레이스 처음 일상적으로 실험실에서 사용 하는 표준 PCR로 두 밴드를 했다. 불행 하 게도, 뇌관 디자인의 기록에서 Snp의 상당한 수에 의해 제한 되었다. 대상 기록에서 Snp 뇌관 및 비효율적인 어 닐 링 및 증폭, 발생할 수 있습니다 최소19감소 한다 대상 사이의 불일치도 이어질. 한 뇌관에 적어도 4 개의 Snp의 존재 또는 5 불일치 (3에 하나의 뇌관과 다른 2)의 조합의 발생 수 PCR 반응의 완전 한 억제 되며 따라서 더 뇌관20를 디자인 하는 방법 밖에. PCR 뇌관 검색 여기 보고 실험에 사용 되는 표준에 대 한 하나의 단일 밴드를 얻으려면 더 많은 뇌관 설계, 대신 PCR 순환 상태와 이후 3' 경주에서 사용 하는 DNA polymerases의 가능성을 최적화 하기 위해 변경 했다 하나의 특정 밴드를 지 고 있습니다. 변성 온도 (뇌관 검색에 사용 되는 95 ° c에서 증가) DNA polymerases 중 하나에 대 한 98 ° C에 증가 되었다. 3'에 사용 된 두 DNA polymerases에 대 한 경주 PCR, 초기 변성 기간 증가 했다 권장된 30 대신 3 분 완전히 변성 cDNA 템플릿을 위해 2 분에 s. T7 올리고 dT25 뇌관 예 잠재적으로 약한 2 차 구조 형성, 뇌관21의 가용성을 줄일 수 있는 전망 이다. 초기 변성 길이 온도 증가 어떤 보조 구조와 도움 3' 경주의 마지막 주기 이후 단일 특정 밴드를 얻을. 또한, 일반적인 밴드 예상된 밴드, 그것은 더 높은 PCR 사이클 (최대 35 주기);에서 등장 제안 보다는 20에 PCR 주기를 제한 아닌 특정 대역의 증폭을 줄일 수 있습니다.
3' 인종, 같은 다른 기반으로 PCR 반응의 또 다른 가능성은 대상 지역22의 불완전 한 증폭. 따라서, 두 thermophilic 효소에 대 한 초기 어 닐 링 온도 50 ° C 5 분 대상에 뇌관의 어 닐 링 최적화에서 설정 하 고이 분 동안 72 ° C에서 초기 확장 온도 의해 그 뒤를 이었다. 각 효소에 대 한 마지막 PCR 주기 72 ° c.에 15 분의 최종 확장 시간을 했다 이러한 확장 단계 이상 그 DNA polymerases의 제조 업체에서 권장 했다. 긴 확장 (신장) 단계 불완전 amplicons,16의 초기 및 최종 증폭 제품 전체 확장 사용의 완전 한 종합을 허용 한다.
PCR 단계 3' 경주에서 발생 하는 매우 민감합니다, 그들은 genomic DNA (또는 다른 DNA 오염) 대상 mRNA 사본 대신 젤22에 여러 가지 예기치 않은 밴드의 결과로 검색할 수 있습니다. 오염을 방지 하기 위해 한 가지 방법은 전용된 PCR 후드에서 PCR 작업을 수행, 장갑을 착용 하 고 깨끗 한 시 약 압력가 마로 소독 살 균 튜브를 사용 하 여 및 플라스틱 팁입니다. 일반 PCR에서 정방향 및 역방향 뇌관 디자인 될 수 있다 그래서 그들은 (intron 뇌관);를 통해 다른 exons에 있는 이 방법에서는, 비정상적으로 큰 PCR 제품은 intron을 포함 하는 영역 증폭 되었다 의미 것입니다. 그러나,이 항상 수 없습니다 실현만 3' UTR 시퀀스, 동일한 터미널 exon 내는 3' 경쟁 확대를 위한 목표는. 또는, RNA는 DNAse 효소 cDNA 합성 전에 미리 치료 될 수 있습니다. T7 올리고 dT25 프라임 RNA에서 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한 임의의 hexanucleotide 대신 역전사 반응 하는 뇌관의 사용은 또한 게놈 제품의 확대를 감소 합니다. 마지막으로, 부정적인 제어 설정 (는 "-" 그림2에서 차선), cDNA 합성 역전사의 부재에 설정 되어 있는 것이 좋습니다. 컨트롤은 후속 3' 경주 절차에 다른 견본에 동일한 단계를 거칩니다. 이 컨트롤에서 밴드의 존재는 잠재적인 genomic DNA 오염을 의미합니다.
상기 과제에도 불구 하 고 3' 경주는 강력한 도구입니다 매핑 개별 유전자에 3' 끝에. 다음-세대 기술의 출현 대체 3' 끝 대체 접합 포함 하지 수 있는 양자 택일 polyadenylation에서 결과 성적표의 레 퍼 토리에 있는 증가를 주도하 고 있다. 암 세포에서 복잡성을 추가 하려면 염색체 재배열 자주 하 고 종양 유전자 융합 제품23귀 착될 수 있다. 두 유전자 사이의 융합 수 있습니다 ORF를 포함 하거나, 어떤 경우에는 3' UTR9,10만 시퀀스를 포함. 또한, 쌍둥이/공동 transcribed 유전자, 동시에 복사할 수는 있지만 다른 단백질11로 번역 될 수 있습니다. 3' 경주 이러한 독특한, 비정상적인 성적 뿐 아니라 모든 정상적인 성적 지도를 맞출 수 있습니다. 이러한 비정상적인 성적 질병 특정 생체 또는 특정 약물 목표, 예를 들면으로 끝날 수 있기 때문에 이것은 중요 하다, 마약 Imatinib 대상 암에서 BCR ABL1 융합 유전자.
따라서, 3' 경주 정상적인 성적을 증폭 소설 3' Utr, 및 3' UTR5,9내 소설 유전자 융해를 식별 하는 데 사용할 수 있는 매우 다양 한 기술입니다. 이 보고서에서 3' 경주 증폭 하 고 정지 codon, 우선권, 그리고는 전체 3' UTR의 다른 DNA polymerases를 사용 하 여 ANKHD1 사본에 사용 되었다. 기술된 접근 어떤 polyadenylated 사본의 3' 끝을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그녀의 기술 도움 Bettine 깁스를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
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