Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Tilpasse 3 slutter raske forsterkning av CDNA å tilordne utskrifter i kreft

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

To forskjellige 3' rask forsterkningen på cDNA ender (3' RACE) protokoller beskrevet her gjør bruk av to forskjellige DNA polymerases tilordne sekvenser som inkluderer et segment åpent lesing (ORF), stopp codon, og det hele 3' UTR av en utskrift ved hjelp av RNA Hentet fra ulike kreftcelle linjer.

Abstract

Modning av eukaryote mRNAs innebærer 3 slutten formasjon, som involverer tillegg av en poly(A) hale. For å tilordne 3 slutten av et gen, er den tradisjonelle metoden valgfrihet 3 raske forsterkning av cDNA ender (3' RACE). Protokoller for 3' rase krever forsiktig design og utvalg av nestede primere i 3 uoversatt regionen (3' UTR) i målet genet av interesse. Men med noen modifikasjoner kan protokollen brukes å inkludere hele 3' UTR og sekvenser fra åpent lesing rammen (ORF), gir en mer helhetlig bilde av forholdet mellom ORF og de 3' UTR. Dette er i tillegg til identifikasjonen av polyadenylation (PAS), samt webområdet cleavage og polyadenylation levert av konvensjonelle 3' rase. Utvidet 3' rase kanne merker uvanlig 3' UTRs, inkludert gene fusjoner i de 3' UTR, og rekkefølgen informasjonen kan brukes til å forutsi mulige miRNA bindende områder samt AU rik destabiliserende elementer som kan påvirke stabiliteten i transkripsjon.

Introduction

Dannelsen av 3 slutten er en avgjørende skritt i mRNA holdbarhet som består i spalting av det pre-mRNA nedstrøms av en PAS etterfulgt av tillegg av ~ 250 untemplated adenines, som utgjør poly(A) hale1,2. Poly(A) binding protein (PABP) binder til poly(A) halen, og dette beskytter mRNA transkripsjon fra fornedrelse, og forenkler oversettelse1.

Aktuelle anslår foreslå at 70% av menneskets gener har flere PASs, og dermed gjennomgå alternative polyadenylation, som resulterer i flere 3 ender3. Derfor er det viktig å identifisere der poly(A) halen festes til resten av de 3' UTR, i tillegg til å identifisere PAS brukes av noen gitt transkripsjon. Bruk av neste generasjons sekvensering har resultert i samtidige identifikasjon av 3' UTRs og PASs av gener. Denne økningen i sekvensering evnen har krevd utvikling av bioinformatic algoritmer å analysere data med alternative polyadenylation 3 slutten. For de novo søket eller validering av PAS og dermed tilordning av 3 slutten av enkelte gener fra storskala sekvensering data, forblir 3' rase metoden for valg4,5. Sekvenser med i cDNA produkter av 3' rase vanligvis inkluderer bare en del av de 3' UTR som inneholder poly(A) halen, webområdet cleavage, PAS og sekvenser oppstrøms av PAS. I motsetning til PCR, som krever design og bruk av genet bestemt forover og bakover grunning, krever 3' RACE bare to genet bestemt nestede frem primere. Derfor krever PCR mer detaljert kunnskap om nukleotid sekvensen av et stort område av genet blir forsterket4,6. Siden 3' rase bruker omvendt samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA transkripsjoner, bare videresende primerne må være genet spesifikke, dermed kun krever kunnskap om en betydelig mindre region av mRNA. Dette gjør forsterkningen på områder som sekvensene ikke er fullt preget4,7. Dette har tillatt 3' rase ikke bare å finne 3 slutten av et gen, men å også bestemme og karakterisere store regioner oppstrøms PAS som utgjør en betydelig del av de 3' UTR. Ved å kombinere 5' løp med den endrede 3' rase som inkluderer større deler av de 3' UTR og flankemanøveren regioner, er det mulig å fullstendig rekkefølge eller klone en hele mRNA utskrift fra 5' slutten til sin 3 slutten8.

Et eksempel på dette programmet av endrede 3' rase er siste identifikasjon av en roman CCND1-MRCK fusion genet utskrift fra mantelen celle lymfom cellelinjer og pasienter. De 3' UTR besto av sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var motvillig til miRNA regulering9. To nestede CCND1 bestemt frem primerne var komplementær til regionen umiddelbart tilstøtende og nedstrøms CCND1 stopp codon. Selv om hele transcriptome sekvensering med bestemte bioinformatic verktøy kan brukes til å oppdage genet fusjoner i de 3 UTR10, mange laboratorier kan mangle den økonomiske ressurser eller bioinformatic kompetanse til å gjøre bruk av denne teknologien. Derfor er 3' RACE et alternativ for de novo identifikasjon og validering av romanen fusion gener som involverer den 3' UTR. Vurderer drastisk økning i antallet rapporterte fusion gener som lese gjennom transkripsjoner, har 3' rase blitt et kraftig verktøy i karakteriserer genet sekvenser11,12. I tillegg har studier vist at forskjellige sekvenser i de 3' UTR samt lengden på den 3' UTR kan påvirke mRNA transkripsjon stabilitet, lokalisering, translatability og funksjonen13. Delvis på grunn av en økt interesse i kartlegging av transcriptome, har det vært en økning i antall forskjellige DNA polymerases utviklet for bruk i laboratoriet. Det er viktig å finne ut hva endringstypene kan gjøres til 3' rase protokoll i å utnytte det tilgjengelige repertoaret av DNA polymerases.

Dette arbeidet rapporter tilpasse 3' rase å kartlegge den hele 3' UTR, PAS og 3 slutten cleavage området av ANKHD1 transkripsjon ved hjelp av nestede primere i delen ANKHD1 transkripsjon og to forskjellige DNA polymerases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruk en labfrakk, hansker og vernebriller når du utfører alle prosedyrer i denne protokollen. Kontroller at beholdere/rør med fenol og guanidine isothiocyanate reagens bare åpnes i en sertifisert hette, og kast fenol avfall i en egen beholder. Bruk DNAse RNAse-fri sterilt rør, tips og reagenser.

1. celle kultur

  1. Vokse HeLa celle linjen og to suspensjon mantelen celle lymfom cellelinjer, Granta-519 og Jeko-1, i DMEM som inneholder 10% FBS og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C. Fortynne celler 1:10 og telle bruk en partikkel teller14.
  2. For RNA utvinning, plate 500.000 celler/godt i en 6 godt plate (2 mL media per brønn). Etter inkubasjon 24 h, samle RNA fra cellene.

2. RNA utvinning

  1. Høste celler
    Merk: Med unntak av det sentrifugering trinnet, utføre alle nevnte trinnene i vev kultur hette å opprettholde sterilitet.
    1. For suspensjon celler (Jeko-1 og Granta-519):
      1. Overføre cellene (sammen med 2 mL medier) slik 15 mL og sentrifuge 1,725 x g for 5 min. leveringstanken media og la celle pellet i bunnen av røret.
      2. Resuspend celle pellet i 50 µL av 1 x fosfat Buffered Saline (PBS). Legg til 500 µL av monophasic fenol og guanidine isothiocyanate-reagensen i hvert utvalg i 1,5 mL microcentrifuge røret. Bland godt og la ved romtemperatur (RT) for 5 min mens snu microcentrifuge røret hver 1 min.
    2. For tilhenger celler (HeLa):
      1. Sug opp cellen kultur media i hver brønn. Tilsett 1 mL av PBS hver brønn vaske av rusk.
      2. Fjern PBS og legge 500 µL av monophasic fenol og guanidine isothiocyanate reagensen i hver brønn.
      3. Ruge på RT i 5 min med milde rocking. Overføre til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  2. Cellen lysis
    1. Fryse fenol og guanidine isothiocyanate celle blandingen på 20 ° C 1t.
      Merk: Blandingen kan stå på 20 ° C over natten eller inntil nødvendig.
    2. Tine fenol og guanidine isothiocyanate celle blandingen på is. Legge til 100 µL av kloroform microcentrifuge røret i PCR hette. Vortex utvalget for 10-15 s til blandingen er rosa og ugjennomsiktig. Inkuber prøven på is (på 4 ° C) 15 min.
    3. Sentrifuge prøven i 15 min på 20,800 x g og 4 ° C. Fjern forsiktig den øverste Fargeløse vandige fasen (~ 200 µL) og overføre til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  3. RNA nedbør
    1. Legge til en lik mengde isopropanol hvert utvalg. Legge 1 µL av coprecipitant (se Tabell for materiale) hver for å opptre som en bærer for RNA og hjelpe visualisere RNA i de etterfølgende trinnene. Inkuber prøven ved-80 ° C i minst 4 timer. De beste resultatene ruge over natten på-80 ° C.
    2. Overføre prøven til en avkjølt sentrifuge. Sentrifuge for 35 min 20,800 x g / 4 ° C; RNA vises som en blå prikk på bunnen av røret. Fjern forsiktig i isopropanol fra utvalget. Legg til 500 µL av 80% etanol og resuspend pellet av kort vortexing for 3 s.
    3. Sentrifuge prøven på 20,800 x g ved RT for 5 min. fjerne alle etanol fra utvalget. La prøven air-dry for om 10 min. Resuspend prøven i 35 µL RNAse uten vann. Plasser på varme blokk (65 ° C) i 5 min å sikre at RNA er helt i løsningen, og umiddelbart sett røret på is.
    4. Bestemme konsentrasjonen av totale RNA bruker et spektrofotometer som tidligere beskrevet, men 1,5 µL av RNA utvalget i stedet for 1 µL15. Eventuelt kjøre 1 µg av totalt på en 1% agarose gel å bestemme RNA integritet.

3. DNase behandling

  1. Etter kvantifisering av den, kan du utføre DNAse behandling på den totale RNA å nedverdige alle genomic DNA. For hver prøve, legger du til følgende reagensene fra RNAse-gratis DNAse kit å gjøre en 20 µL totale reaksjon bland i en separat microcentrifuge tube:
    1. Bland 2 µL av DNase 10 X reaksjon buffer med 4,4 µg av totalt. Få totalt 14 µL med vann.
    2. Legg 2 µL av RNase uten DNAse. Ruge på 37 ° C i 30 min i nærvær av 2 µL av RNase hemmer (fra reversere transkripsjon Kit).
    3. Legg 2 µL av stoppløsning og varme på varme blokk i 10 min på 70 ° C å deaktivere DNAse enzymet.
      Merk: DNAse behandling er valgfritt.

4. cDNA syntese

For et siste reaksjon volum av 50 µL:

  1. For et siste reaksjon volum av 50 µL: overføring 22 µL av DNase behandlet RNA til ny tube eller overføre 4 µg av totalt med ekstra vann til et totalt volum på 22 µL slik ny. Legg 2 µL av T7 oligo dT25 primer fra 10 µM primer løsning. Rekkefølgen for T7 oligo dT25 primer er 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ".
  2. Legge til 2 µL av RNase hemmer (20 U/µL), 8 µL av 5 x reaksjon bufferen, 4 µL av 10 mM dNTPs og 2 µL av revers transkriptase (200 U/µL) fra reversere transkripsjon kit.
    Merk: Sette opp en reaksjon uten revers transkriptase som en negativ kontroll.
  3. Ruge på 42 ° C i 1 h. overføring direkte til is. Varme røret ved 75 ° C i 5 min og sett røret på is.

5. primer etter Fusion Gene transkripsjon

  1. Primer design
    1. Last cDNA sekvensen fra Ensemble genomet leseren (ENST00000360839.6/NM_017747), og identifisere et område i ORF av målet transkripsjon (ANKHD1) oppstrøms av stopp codon. Kopier og lim inn hele regionen (700 nukleotider) sekvenser oppstrøms av stopp codon i regionen sekvens oppføring av primer programvare (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Velg alternativet Vis tilpasset design og 10 av primere at systemet skal generere (resultater tilbake) og la alle de andre parametrene satt til standard.
    3. Velg fem frem primere og to omvendte primere som ikke overlapper. Bestill primere og gjeninnføre med RNAse/DNAse-fritt vann til en siste konsentrasjon av 10 µM. Mer informasjon om generelle primer design for PCR er dekket andre steder16.
  2. PCR å identifisere potensielle primere for bruk i etterfølgende 3' RACE
    Merk: For å avgjøre de endelige frem primerne bruke i reaksjonen, teste designet primerne ved å angi forskjellige kombinasjoner av forover og bakover grunning for vanlige PCR i PCR hette.
    1. Overføre cDNA (2 µL) til en frisk 0,5 mL PCR rør. Legg 1 µL av fremover primer og 1 µL av omvendt primer (fra en 10 mM primer løsning). Gjøre opp til 12,5 µL ved å legge 8,5 µL nuclease uten vann. Legge til 12,5 µL av 2 x PCR-til-Gel Master Mix.
    2. Bruker PCR termisk sykling følgende: 95 ° C i 2 min etterfulgt av 29 sykluser av 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 1 satt siste syklusen på 68 ° C i 7 min.
    3. Etter PCR, kjøre produktene på en 1% agarose gel med ethidium bromide. Detaljer om geleelektroforese som tidligere beskrives med noen modifikasjoner17.
      1. Oppløse 1 g agarose i 100 mL Tris-Acetate (TAE) buffer i en 250 mL kolbe. Kok i en mikrobølgeovn.
      2. La avkjøles i 1 min og legger til 7,5 µL ethidium bromide løsning (10 mg/mL stock) i avtrekksvifte. Bland godt virvlende kolbe og hell i en horisontal gel apparater. La på RT i avtrekksvifte i minst 30 minutter til tillate gel å stivne.
      3. Dekke gel med 1 x TAE buffer og laste 10 µL av PCR produktet på agarose gel sammen med 3-5 µL av DNA molekylvekt stigen. Kjøre på 175 V for 10 min. visualisere produkter med en imager og ytterligere kreves separasjon av produkter, kjøre gel for en ytterligere 5-10 minutter.
  3. Utvalg av nestede primere for 3' RACE
    1. Analysere resultatene av PCR agarose gel å velge primere som har en distinkt, sterk, enkelt PCR band. Bruke 5'-mest primer (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') sammen med T7 oligodT25 primer i den første PCR kjøre.
    2. Velg nestet primer som ligger nedstrøms for den første primeren (ANKHD1 5-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), og bruke den med T7 primer (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3") i det andre settet av PCR reaksjoner.

6. optimalisere 3' rase å kartlegge den 3' UTR bruker to ulike enzymer

Merk: Det har vært en økning i mangfoldet av DNA polymerases brukes for PCR; Derfor ønsket vi å finne standard betingelser som kan brukes selv når du bruker forskjellige enzymer for 3' rase PCR reaksjoner. De omvendte primerne for noen transkripsjon holdes konstant. Det eneste endringene er i nestede frem primerne som er spesifikke for målet transkripsjon.

  1. Protokollen 1:3 ' rase med en modifisert DNA utvalg fra Pyrococcus furiosus (Pfu)
    1. Første PCR
      1. Overføre 1 µL av cDNA til en PCR-rør og legge 5 µL 10 x Pfu reaksjon bufferen. Legg 1 µL av den første kjedede fremre primeren, 1 µL av T7 oligodT25 primer og 1 µL av dNTPs (fra en 10 mM løsning).
      2. Gjøre opp til 49 µL totale volumet ved å legge 40 µL av vann. Tilsett 1 µL av Pfu DNA polymerase og bland godt. Kjør PCR bruker PCR-profil i tabell 1.
    2. Andre PCR
      1. Overføre 2 µL av produkter fra den første PCR til en ny PCR-rør og bland med 5 µL 10 x PfuUltra II reaksjon bufferen. Legg 1 µL av andre nestede PCR primer, 1 µL av T7 primer og 1 µL av dNTPs (10 mM løsning).
      2. Gjøre opp til 49 µL totale reaksjon volum ved å legge 39 µL av vann. Legg 1 µL av Pfu DNA polymerase. Kjør PCR bruker samme PCR profil som første PCR oppsett (tabell 1).
  2. Protokollen 2:3 ' rase med en chimeric DNA polymerase bestående av en DNA bindende domene sammensmeltet med en Pyrococcus-som korrekturlesing polymerase PCR master mix
    1. Første PCR
      1. Overføre 1 µL av cDNA til en PCR-rør. Legg 1 µL av den første kjedede fremre primeren og 1 µL av T7 oligodT25 primer. Lage opptil 25 µL ved å legge til 22 µL av vann.
      2. Legg til 25 µL av 2 x PCR Master Mix og bland godt. Bruk PCR sykling forholdene beskrevet i tabell 2.
    2. Andre PCR
      1. Overføre 2 µL av produkter fra den første PCR slik ny PCR. Legg 1 µL av andre nestede PCR primer med 1 µL av T7 omvendt primer.
      2. Lage opptil 25 µL ved å legge til 22 µL av vann. Legg til 25 µL av 2 X PCR Master Mix. Kjør PCR bruker samme PCR profil som første PCR oppsett (tabell 2).

7. Kontroller andre PCR produktet av 3' rase.

  1. Ta 5-10 µL av den andre PCR produktet (samt produkt fra første runde av PCRene hvis transkripsjon uttrykkes rikelig) og kjører på en agarose gel. Definere gel og kjøre geleelektroforese som beskrevet tidligere (trinn 5.2.3.1 til 5.2.3.3). Visualiser resultater på en imager.

8. produkt rensing og sekvensering

  1. Rense gel PCR produktene fra den andre PCR bruker Gel og PCR Fragment DNA opprydding-systemet etter produsentens protokollen.
  2. Utføre Sanger sekvensering (eventuelt sende gel renset PCR vareprøver og aktuell sekvensering primere for en sekvensering lab). Analysere sekvensering dataene etter Sanger sekvensering.
  3. Last ned sekvens-analysere programvare (se Tabell for materiale) og importere sporingsfilene til programvaren. Bruk den personlige ren Base QVs (kvalitet verdier) for å finne bunnen kaller informasjon18. Last ned chromatogram med høy kvalitet spor for visning.
    Valgfritt: Gel renset produktet kan klones ved hjelp av en passende kloning kit og isolert kloner sendt for Sanger sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nestede frem Primer søk:

Agarose gel fra Figur 1 viser to ulike PCR gel produkter (baner 1 og 2) som Bruk samme Videresend primer men forskjellige omvendt primere. Lane 3 har en distinkt PCR-produkt og en tydelig forover og bakover grunning. Ideell primerne bruke for PCR basert reaksjonen er de som gir en tydelig PCR produktet (Lane 3). Fremover primer brukes i baner 1 og 2 gir sterkeste bandet og gir de største PCR produktene (forventet), og brukes som den første fremre primeren. Andre nestede primer for det andre settet med PCR reaksjoner i 3' rase er fremover primer Lane 3.

Forskjellige DNA Polymerases brukt i 3 rase produserer lignende resultater:

To forskjellige DNA polymerases produsert de samme PCR produktene til tross for at ulike PCR sykling betingelser for de 3' rase (figur 2). Det er bare ett forskjellige band for forventet PCR produktet. Alle av minus revers transkriptase negative kontroller (-) har ikke et band, viser ingen genomisk forurensning av RNA i cDNA syntese samt i etterfølgende nedstrøms reaksjoner.

Sanger sekvensering resultater:

PCR produktene var gel renset og sendt for Sanger sekvensering. Resultatene som vises i figur 3A viser en del av en serie chromatograph fra Sanger sekvensering. En representant sekvens identifiserer plasseringen til stopp codon, antatte polyadenylation signal, og cleavage området, samt poly (A) halen i 3 rase produktet (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: identifisering av to nestede genet bestemt frem primere bruke i 3' rase. Vist er et eksempel på PCR produkter fra forskjellige kombinasjoner av genet bestemt frem og omvendt primere med HeLa cDNA kjøre på en ethidium bromide farget agarose gel med molekylvekt (mw) stigen. Baner 1 og 2 er PCR produkter fra samme genet bestemt frem primer men forskjellige omvendt primere. Pilene peker til forventet PCR produktet for hver bane. I tillegg til bandet for forventet PCR produktet er det en flere band. Enkelt PCR produktet i Lane 3 er fra en annen genet bestemt nestede fremover og bakover grunning og viser enkelt forventet bandet.

Figure 2
Figur 2: verifisering av 3 rase produkter fra det andre settet av PCR reaksjoner. Produkter fra andre PCR reaksjon med (A) Pressens faglige utvalg og (B) Chimeric DNA polymerase ble kjørt på en agarose gel med ethidium bromide. Baner avbildet av (-) er fra negativ kontroll prøven for hver celle linje når cDNA syntese fra RNA ble gjennomført i fravær av revers transkriptase enzym. Baner 1 og 2 er PCR produkter fra biologiske gjentak av hver celle linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tilordne PCR produkter av 3' rase. (A) A delen av en serie chromatogram gel renset 3 rase produktet viser anslått polyadenylation signalet og plasseringen av poly(A) halen. (B) representant sekvenser fra Sanger sekvensering data viser stop codon, polyadenylation signalet (PAS), området cleavage og vedlegg av poly(A) halen samt en del av poly (A) hale sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Syklus trinn Temperatur og varighet Antall sykluser
Første rødsprit 95 ° C i 3 min 1
Første avspenning og utvidelse 50 ° C for 5 min og 72 ° C i 10 min 1
Subcyles (rødsprit, annealing og extension) 95 ° C i 40 s, 50 ° C for 1 min, og 72 ° C for 3 min 20
Siste syklus (rødsprit, annealing og utvidelse) 95 ° C i 40 s, 50 ° C for 1 min, og 72 ° C i 15 min 1
Hold 4 ° C, ∞

Tabell 1: Pfu DNA Polymerase PCR sykling betingelser for 3' rase.

Syklus trinn Temperatur og varighet Antall sykluser
Første rødsprit 98 ° C i 3 min 1
Første avspenning og utvidelse 50 ° C for 5 min og 72 ° C i 10 min 1
Subcyles (rødsprit, annealing og extension) 98 ° C for 30 s, 50 ° C for 1 min, og 72 ° C i 4 min 20
Siste syklus (rødsprit, annealing og utvidelse) 98 ° C for 30 s, 50 ° C for 1 min, og 72 ° C i 15 min 1
Hold 4 ° C, ∞

Tabell 2: Chimeric DNA polymerase PCR sykling forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for bruk av massiv parallelle sekvensering teknologi på gene-av-genet basis, fortsatt 3' rase den enkleste og mest økonomiske metoden å identifisere PAS og nukleotider tilstøtende poly(A) halen. Tilpasningen beskrevet her utvider bruker 3' rase både forsterke og tilordne sekvenser som inkluderer en del av ORF, stopp codon og det hele 3' UTR av ANKHD1 mRNA transkripsjon. En stor fordel med 3' rase er at med noen mindre tilpasninger, kan produkter fra 3' rase klones i andre vektorer å lette nedstrøms avhør av 3 UTR funksjon inkludert miRNA målretting, stabilitet analyser samt andre mekanistisk analyser. Dette kan gjøres ved å inkludere begrensning enzym områder innenfor de nestede primer sekvenser9,10. Justeringer kan gjøres for å inkludere bare de 3' UTR uten noen sekvenser fra ORF for kloning 3 UTR funksjonelle analyser5.

En viktig determinant av suksessen til 3' rase er utviklingen av nestede primere at målet genet av interesse. CDNA sekvenser fra Ensembl genomet leseren anbefales å best identifisere områder uten polymorfismer for å utvikle optimal primere. Ideelt sett videresende flere nestede primere samt minst to omvendte primere i genet av interesse kan bli vist ved hjelp av standard PCR for å identifisere de beste to nestede genet bestemt primerne bruke. I denne studien ga den første gen bestemte frem primeren valgt for 3' rase opprinnelig to band med standard PCR rutinemessig brukes i laboratoriet. Dessverre var primer design begrenset av et betydelig antall SNPs i transkripsjon av interesse. SNPs i målet transkripsjon føre til manglende samsvar mellom primerne og målet, som kan resultere i ineffektiv avspenning og forsterkning og skal reduseres til et minimum19. Tilstedeværelsen av minst fire SNPs i en primer eller forekomsten av en kombinasjon av fem uoverensstemmelser (tre i en primer og to andre) kan resultere i fullstendig hemming av PCR reaksjonen, og derfor det eneste alternativet er å designe flere primere20. I stedet for å utforme flere primere å få ett enkelt band for standard PCR brukes for primer søk i eksperimenter rapporterte her, ble PCR sykling betingelsene og DNA polymerases brukt i 3' RACE endret for å optimalisere sannsynligheten for få ett bestemt band. Rødsprit temperaturen økt 98 ° c for en av DNA polymerases (en økning fra 95 ° C brukes i primer søk). For begge DNA polymerases brukes i 3' rase PCR, hele første rødsprit ble økt til 3 min i stedet for den anbefalte 30 å 2 min for å fullstendig denature malen cDNA. T7 oligo dT25 primer er for eksempel spådd til å potensielt skjemaet svak sekundære strukturer, noe som kan redusere tilgjengeligheten av primere21. Øke første rødsprit lengde og temperatur bryter eventuelle sekundære strukturer og hjelper gi én bestemt bandet etter siste syklus av 3' rase. I tillegg var uspesifisert bandet lettere enn forventet bandene, antyder at den dukket opp på høyere PCR sykluser (opptil 35 sykluser); begrense PCR-sykluser for å bare 20 reduserer forsterkningen på uspesifisert bandet.

En annen potensialet i 3' rase, som andre PCR basert reaksjoner, er ufullstendig forsterkning målet regionen22. Derfor for både varmekjære enzymer første annealing temperaturen ble satt til 50 ° C i 5 min å optimalisere annealing primerne til målet, og dette ble etterfulgt av en første utvidelse temperatur ved 72 ° C i 10 min. Den endelige PCR syklusen for hver enzym hadde en endelig utvidelse 15 min på 72 ° C. Følgende utvidelse var lengre enn det som er anbefalt av produsentene av DNA-polymerases. Det lange forlengelsen (forlengelse) trinnet kan fullstendig syntese av ufullstendig amplicons, slik at full forlengelse av innledende og avsluttende forsterkning produkter16.

PCR trinnene som forekommer i 3' rase er svært sensitive, slik at de kan oppdage genomisk DNA (eller andre DNA forurensning) i stedet for målet mRNA karakterutskriften, som resulterer i flere uventede band gel22. En måte å hindre forurensning er å utføre PCR arbeidet i en dedikert PCR-hette, bruk hansker, og bruke rene reagenser og autoklaveres sterilt rør og Pipetter tips. I vanlige PCR, kan forover og bakover grunning utformes slik at de ligger på forskjellige exons (over intron primere); på denne måten ville et unormalt stort PCR produkt bety at et område som inneholder en intron har blitt forsterket. Men kan dette ikke alltid være mulig at bare de 3' UTR sekvens, innenfor den samme terminalen ekson, er målet for 3 rase forsterkning. Alternativt kan av RNA være pre-behandlet med DNAse enzym før cDNA syntese. Bruk av T7 oligo dT25 primer Prime revers transkriptase reaksjonen i stedet for en tilfeldig hexanucleotide for første strand cDNA syntese fra RNA også reduserer forsterkningen av genomisk produktene. Sist men ikke minst, sette opp en negativ kontroll (den "-" kjørefelt i figur 2), der cDNA syntese er definert i fravær av revers transkriptase anbefales. Kontrollen gjennomgår identiske slik andre eksemplene i de påfølgende 3' rase prosedyrene. Tilstedeværelsen av et band i denne kontrollen betyr potensielle genomisk DNA forurensning.

Til tross for de nevnte utfordringene er 3' RACE et kraftig verktøy i kartlegging 3 ender på individuelle genet basis. Bruk av neste generasjons teknologi har ført til en økning i repertoaret av utskrifter som har alternativ 3' ender som følge av alternative polyadenylation, hvilke kanskje eller kanskje ikke involverer alternativ skjøting. Legge til komplisert, kreftceller, chromosomal rearrangements er hyppige og kan resultere i kreftfremkallende genet fusion produkter23. Fusjonen mellom de to genene kan innebære ORF, eller i noen tilfeller involverer bare sekvenser fra 3 UTR9,10. Videre er det også siamesiske/co-transcribed gener som er transkribert samtidig men kan oversettes til ulike proteiner11. 3' rase kan skreddersys til å tilordne alle disse unike, unormal transkripsjoner samt vanlige utskrifter. Dette er viktig fordi disse unormale utskrifter kan ende opp som sykdommen bestemte biomarkers eller bestemte narkotika mål, f.eks, stoffet Imatinib mål BCR-ABL1 fusion genet i kreft.

Derfor er 3' rase en svært allsidig teknikk som kan brukes til å forsterke vanlige utskrifter, identifisere romanen 3' UTRs og romanen genet fusjoner innen 3 UTR5,9. I denne rapporten, 3' RACE ble brukt til å forsterke og tilordne stopp codon, PAS og det hele 3' UTR av ANKHD1 transkripsjon bruker forskjellige DNA polymerases. Beskrevet tilnærming kan brukes til 3 slutten av noen polyadenylated utskrift.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å erkjenne Bettine Gibbs for hennes teknisk hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Tags

Genetikk problemet 133 utskrifter 3 slutten 3 raske forsterkning av cDNA ender (3' RACE) polymerasekjedereaksjons polyadenylation signal (PAS) polyadenylation
Tilpasse 3 slutter raske forsterkning av CDNA å tilordne utskrifter i kreft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter