Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

De to forskellige 3' hurtige forstærkning af cDNA ender (3' RACE) protokoller beskrevet her gøre brug af to forskellige DNA polymeraser til at knytte sekvenser, der omfatter et segment af åben behandling ramme (ORF), stop-codon og den hele 3' UTR af et udskrift ved hjælp af RNA fremstillet af forskellige kræft cellelinjer.

Abstract

Modning af eukaryote mRNAs indebærer 3' enden dannelse, som omfatter tilføjelse af en poly(A) hale. For at kortlægge 3' enden af et gen, er den traditionelle metode til valg 3' hurtige forstærkning af cDNA ender (3' RACE). Protokoller for 3' RACE kræver omhyggelige design og valg af indlejrede primere i den 3' utranslaterede region (3' UTR) target-gen af interesse. Dog med et par ændringer kan til protokollen bruges til at omfatte hele 3' UTR og sekvenser i åben læsning rammen (ORF), giver et mere omfattende billede af forholdet mellem ORF og 3' UTR. Dette er ud over identifikation af polyadenylation signalet (PAS), og på spaltning og polyadenylation webstedet leveres af konventionelle 3' RACE. Udvidet 3' RACE kan opdage usædvanlige 3' UTRs, herunder gen fusioner inden for 3' UTR, og sekvensen oplysninger kan bruges til at forudsige potentielle miRNA bindingssteder samt AU rige destabiliserende elementer, der kan påvirke stabiliteten i afskriften.

Introduction

Dannelsen af 3'-enden er et kritisk skridt i mRNA modning, der omfatter kløvningen af pre-mRNA nedstrøms for et PAS, efterfulgt af tilsætning af ~ 250 untemplated adenines, som udgør poly(A) hale1,2. Poly(A) bindende protein (PABP) bindes til poly(A) hale, og dette beskytter mRNA udskrift fra nedbrydning, og letter oversættelse1.

Aktuelle skøn viser, at 70% af menneskelige gener har flere PASs, og således gennemgår alternative polyadenylation, hvilket resulterer i flere 3' ender3. Det er således vigtigt at identificere hvor poly(A) hale tillægger resten af 3' UTR, samt identificere de PAS, anvendes af enhver given udskrift. Fremkomsten af næste generation sequencing har resulteret i den samtidige identifikation af 3' UTRs og PASs af tusindvis af gener. Denne stigning i sekventering kapacitet har kræves udvikling af bioinformatic algoritmer til analyse af data vedrørende alternative polyadenylation i 3' enden. For de novo påvisning eller validering af PAS og dermed tilknytning til 3' enden af enkelte gener fra store skala sequencing data, forbliver 3' RACE metode valg4,5. De sekvenser, der er inkluderet i cDNA produkter af 3' RACE normalt omfatter kun en del af 3' UTR, der indeholder poly(A) hale, webstedet kavalergang, PAS og sekvenser opstrøms af PAS. I modsætning til PCR, som kræver udformning og anvendelse af genet specifikke frem og bak primere, kræver 3' RACE kun to gen specifikke indlejrede fremad primere. Derfor, PCR kræver en mere detaljeret viden om nucleotidsekvensen af en stor region af genet bliver forstærket4,6. Siden 3' RACE bruger omvendt det samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA udskrifter, kun de forreste primere skal gen specifikke, således kun kræver kendskab til en betydeligt mindre region i mRNA. Dette giver mulighed for forstærkning af regioner, hvis sekvenser ikke er fuldt karakteriseret4,7. Dette har tilladt 3' RACE skal bruges ikke kun til at bestemme 3' enden af et gen, men at også bestemme og karakterisere store områder opstrøms i de PAS, der udgør en betydelig del af 3' UTR. Ved at kombinere 5' RACE med den modificerede 3' RACE, der omfatter større dele af 3' UTR og flanken regioner, er det muligt at fuldt sekvens eller klone en hele mRNA udskrift fra 5'-enden til sine 3' enden8.

Et eksempel på denne anvendelse af modificerede 3' RACE er den seneste identifikation af en roman CCND1-MRCK fusion gen udskrift fra Mantle celle lymfom cellelinjer og kræftpatienter. 3' UTR bestod af sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var genstridige miRNA forordning9. De to indlejrede CCND1 specifikke fremad primere var supplement til området umiddelbart tilstødende og neden for CCND1 stop-codon. Selv om hele transkriptom sekventering sammen med specifikke bioinformatic værktøjer kan anvendes til at påvise gen fusioner inden for 3' UTR10, mange laboratorier kan manglende finansielle midler eller bioinformatic ekspertise til at gøre brug af denne teknologi. Derfor, 3' RACE er et alternativ til de novo identifikation og validering af nye fusion gener der involverer 3' UTR. I betragtning af den drastiske stigning i antallet af rapporterede fusion gener samt læse gennem afskrifter, er 3' RACE blevet et stærkt værktøj i kendetegner gen sekvenser11,12. Derudover har nylige undersøgelser vist, at forskellige sekvenser i 3' UTR såvel som længden af 3' UTR kan påvirke mRNA udskrift stabilitet, lokalisering, translatability og funktion13. Delvis på grund af en øget interesse i kortlægning af transkriptom, har der været en stigning i antallet af forskellige DNA polymeraser der udvikles til brug i laboratoriet. Det er vigtigt at fastslå, hvad slags ændringer kan være foretaget 3' RACE protokol i for at udnytte det tilgængelige repertoire af DNA polymeraser.

Dette arbejde rapporter tilpasning 3' RACE at kortlægge den hele 3' UTR, PAS, og 3' enden kavalergang site af ANKHD1 udskrift ved hjælp af indlejret primere i afsnittet ANKHD1 i afskriften og to forskellige DNA polymeraser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bære en laboratoriekittel, handsker og sikkerhedsbriller til enhver tid mens de udfører alle procedurer i denne protokol. Sikre, at containere/rør indeholdende phenol og guanidin isothiocyanat reagens kun åbnes i et certificeret hood og bortskaffe phenol affald i en udpegede container. Bruge DNAse/RNAse-fri sterile rør, tips og reagenser.

1. cellekultur

  1. Vokse linjen HeLa celler og to suspension mantle celle lymfom cellelinjer, Granta-519 og Jeko-1, i DMEM som indeholder 10% FBS og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin i en fugtig kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C. Fortyndes 1:10 celler og tælle ved hjælp af en partikel counter14.
  2. RNA udvinding, plade 500.000 celler/brønd i en 6 godt plade (2 mL media pr. brønd). Efter inkubation i 24 timer, skal du indsamle RNA fra cellerne.

2. RNA udvinding

  1. Høst celler
    NOTE: Med undtagelse af trinnet centrifugering udføre alle de anførte trin i en vævskultur hood at opretholde sterilitet.
    1. For suspension celler (Jeko-1 og Granta-519):
      1. Overfør celler (sammen med 2 mL af media) til en 15 mL tube, og der centrifugeres ved 1,725 x g i 5 min. aspirat medierne og forlade celle pellet i bunden af røret.
      2. Resuspenderes celle i 50 µL 1 x fosfat Buffered saltvand (PBS). Tilføje 500 µL monofasiske phenol og guanidin isothiocyanat reagens til hver prøve i 1,5 mL microcentrifuge tube. Bland godt og lad ved stuetemperatur (RT) for 5 min mens invertere microcentrifuge tube hver 1 min.
    2. For vedhængende celler (HeLa):
      1. Opsug celle Kulturmedier fra hver brønd. Tilsæt 1 mL PBS til hver brønd til at vaske af vragrester.
      2. Fjern PBS og tilsæt 500 µL monofasiske phenol og guanidin isothiocyanat reagens til hver brønd.
      3. Der inkuberes ved RT i 5 min. med blid vuggende. Overførsel til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  2. Celle lysis
    1. Fryse phenol og guanidin isothiocyanat celle blandingen ved-20 ° C i 1 time.
      Bemærk: Blandingen kan stå ved-20 ° C natten over, eller indtil det skal bruges.
    2. Tø phenol og guanidin isothiocyanat celle blandingen på is. Tilføje 100 µL chloroform til microcentrifuge røret i en PCR hætte. Vortex prøve for 10-15 s indtil blandingen er pink og uigennemsigtig. Inkuber prøve på køl (ved 4 ° C) i 15 min.
    3. Centrifugeres prøve for 15 min på 20,800 x g og 4 ° C. Fjern forsigtigt den øverste farveløse vandig fase (~ 200 µL) og overførsel til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  3. RNA nedbør
    1. Tilføje et lige saa stort volumen af isopropanol til hver prøve. Tilføj 1 µL af coprecipitant (Se Tabel af materialer) til hver prøve indsamles for at fungere som en transportør for RNA og hjælpe med at visualisere RNA i efterfølgende trin. Inkuber prøve ved-80 ° C i mindst 4 h. For de bedste resultater, inkuberes natten over ved-80 ° C.
    2. Overføre prøven til et afkølet centrifuge. Der centrifugeres i 35 min. ved 20.800 x g / 4 ° C; RNA vises som en blå plet i bunden af røret. Fjern forsigtigt isopropanol fra prøven. Tilsættes 500 µL 80% ethanol og resuspenderes af kort vortexing for 3 s.
    3. Prøven på 20.800 x g på RT der centrifugeres i 5 min. Fjern alle ethanol fra prøven. Lad prøven lufttørre i ca 10 min. Resuspend prøven i 35 µL af RNAse-fri vand. Sted på en varme blok (65 ° C) i 5 min. til at sikre, at RNA er fuldt ud i løsning, og straks røret anbringes på is.
    4. Bestemme koncentrationen af total RNA bruger et spektrofotometer, som tidligere beskrevet, bortset fra at bruge 1,5 µL af RNA prøven i stedet for 1 µL15. Eventuelt køre 1 µg af total RNA på en 1% agarosegel at bestemme RNA integritet.

3. DNase behandling

  1. Efter kvantificering af RNA, udføre DNAse behandling på den samlede RNA til at forringe nogen genomisk DNA. For hver prøve, skal du tilføje følgende reagenser fra RNAse-fri DNAse kit til at gøre en 20 µL samlede reaktion blandes i en separat microcentrifuge tube:
    1. Bland 2 µL af DNase 10 X reaktion buffer med 4,4 µg af total RNA. Bringe til i alt 14 µL med vand.
    2. Tilføj 2 µL af RNase-fri DNAse. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. i overværelse af 2 µL af RNase inhibitor (fra Reverse transkription Kit).
    3. Tilføj 2 µL stopopløsning og varme på en varme blok i 10 min. ved 70 ° C til at inaktivere DNAse enzym.
      Bemærk: DNAse behandling er valgfri.

4. cDNA syntese

For en endelig reaktion volumen af 50 µL:

  1. For en endelig reaktion volumen af 50 µL: overførsel 22 µL af DNase behandlet RNA til en ny tube, eller overføre 4 µg af total RNA med tilsat vand til en samlet maengde paa 22 µL til en ny tube. Tilføj 2 µL af T7 oligo dT25 primer fra 10 µM primer løsning. Sekvens for T7 oligo dT25 primer er 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. Tilføj 2 µL af RNase-hæmmer (20 U/µL), 8 µL af 5 x reaktion buffer, 4 µL af 10 mM dNTP'er og 2 µL af Reverse transkriptase (200 U/µL) fra Reverse transkription kit.
    Bemærk: Oprette en reaktion uden reverse transkriptase til at fungere som en negativ kontrol.
  3. Inkuber ved 42 ° C i 1 h. overførsel direkte til is. Varme rør ved 75 ° C i 5 min og Læg røret på is.

5. primer søgning efter Fusion gen udskrift

  1. Primer design
    1. Download cDNA sekvens fra Ensemble-genom-browser (ENST00000360839.6/NM_017747), og identificere en region inden for ORF af target afskriften (ANKHD1) opstrøms af stop-codon. Kopier og Indsæt hele regionen (op til 700 nukleotider) der indeholder sekvenser opstrøms af stop-codon i regionen sekvens indrejse af primer design software (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Vælg indstillingen Vis brugerdefinerede design og vælg 10 for antallet af primere at systemet skal generere (resultater tilbage) og forlader alle de andre parametre sat til standard.
    3. Vælge fem fremad primere og to omvendte primere, der ikke overlapper. Bestil primere og rekonstruere med RNAse/DNAse-frit vand til en slutkoncentration på 10 µM. Flere oplysninger om generelle primer design til PCR er dækket andetsteds16.
  2. PCR til at identificere potentielle primere til brug i efterfølgende 3' RACE
    Bemærk: For at bestemme de endelige fremad primere til brug i reaktionen, teste de designede primere ved at angive forskellige kombinationer af forward og reverse primere for regelmæssig PCR i en PCR hætte.
    1. Overføre cDNA (2 µL) til en frisk 0,5 mL PCR rør. Tilføj 1 µL af den fremskudte primer og 1 µL af den omvendte primer (fra en 10 mM primer løsning). Gøre op til 12,5 µL ved at tilføje 8,5 µL nukleasen-gratis vand. Tilføje 12,5 µL af 2 x PCR til Gel Master Mix.
    2. Brug følgende PCR termisk cykling betingelser: 95 ° C i 2 min. efterfulgt af 29 cyklusser af 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s, og mindst 72 ° C i 1 min. sat den sidste cyklus på 68 ° C i 7 min.
    3. Efter PCR, køre produkterne på en 1%-agarosegel, farves med ethidiumbromid. Detaljer af elektroforese er som tidligere beskrevet med et par modifikationer17.
      1. 1 g Agarosen i 100 mL af Tris-acetat (TAE) buffer i en 250 mL målekolbe opløses. Koge i en mikrobølgeovn.
      2. Lad det afkøle i 1 min og tilføje 7,5 µL af ethidium bromid løsning (10 mg/mL stock) i et stinkskab. Bland godt af hvirvlende kolben og hæld i en vandret gel apparater. Forlade på RT i stinkskab i mindst 30 min at tillade gel til at størkne.
      3. Dække gel med 1 x TAE buffer og indlæse 10 µL af PCR produkt på agarosegel sammen med 3-5 µL DNA molekylvægt stigen. Køre på 175 V for 10 min. visualisere produkter ved hjælp af en imager, og hvis yderligere adskillelse af produkterne er nødvendig, køre gel for en yderligere 5-10 min.
  3. Udvalg af indlejrede primere for 3' RACE
    1. Analysere resultaterne af PCR agarosegel at vælge primere, der har en tydelig, stærk, enkelt PCR band. Brug 5'-de fleste primer (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') sammen med T7 oligodT25 primer i den første PCR køre.
    2. Vælg den indlejrede primer, der er placeret nedstrøms for den første primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), og bruge det med T7 primer (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') i det andet sæt af PCR-reaktionerne.

6. optimering af 3' RACE at kortlægge 3' UTR ved hjælp af to forskellige enzymer

Bemærk: Der har været en stigning i forskellige DNA polymeraser anvendes til PCR; Vi ønskede derfor, at bestemme standardbetingelser, der kan anvendes selv når ved hjælp af forskellige enzymer til 3' RACE PCR reaktioner. De omvendte primere for enhver udskrift holdes konstant; de eneste ændringer er i de indlejrede fremad primere, der er specifikke for mål-udskrift.

  1. Protokol 1:3 ' RACE ved hjælp af en modificeret DNA polymerase fra Pyrococcus furiosus (Pfu)
    1. Første PCR
      1. Overføre 1 µL cDNA til en PCR rør og tilsæt 5 µL af 10 x Pfu reaktion buffer. Tilføj 1 µL af den første indlejrede fremad primer, 1 µL af T7 oligodT25 primer og 1 µL af dNTP'er (fra en 10 mM løsning).
      2. Gøre op til 49 µL samlede volumen ved at tilføje 40 µL vand. Tilføj 1 µL af Pfu DNA polymerase og bland godt. Køre PCR ved hjælp af PCR profil i tabel 1.
    2. Anden PCR
      1. Overføre 2 µL af produkter fra den første PCR til en ny PCR rør og bland med 5 µL af 10 x PfuUltra II reaktion buffer. Tilføj 1 µL af den anden indlejrede PCR primer, 1 µL af T7 primer og 1 µL af dNTP'er (10 mM løsning).
      2. Gøre op til 49 µL samlede reaktion diskenheden ved at tilføje 39 µL vand. Tilføj 1 µL af Pfu DNA polymerase. Køre PCR ved hjælp af den samme PCR profil som den første PCR opsætning (tabel 1).
  2. Protokol 2:3 ' RACE ved hjælp af en kimære DNA polymerase består af et DNA bindende domæne smeltet til en Pyrococcus-ligesom korrekturlæsning polymerase PCR master mix
    1. Første PCR
      1. Overføre 1 µL cDNA til en PCR rør. Tilføj 1 µL af den første indlejrede fremad primer og 1 µL af T7 oligodT25 primer. Gøre op til 25 µL ved at tilføje 22 µL vand.
      2. Tilsæt 25 µL af 2 x PCR Master Mix og bland godt. Bruge PCR cykling betingelserne beskrevet i tabel 2.
    2. Anden PCR
      1. Overføre 2 µL af produkter fra den første PCR til en ny PCR rør. Tilføj 1 µL af den anden indlejrede PCR primer sammen med 1 µL af T7 omvendt primer.
      2. Gøre op til 25 µL ved at tilføje 22 µL vand. Tilsæt 25 µL af 2 X PCR Master Mix. Køre PCR ved hjælp af den samme PCR profil som den første PCR opsætning (tabel 2).

7. Kontrollér den anden PCR produkt af 3' RACE.

  1. Tage 5-10 µL af den anden PCR produkt (samt produkt fra den første runde af PCR'er hvis afskriften er overflod udtrykt) og køre på en agarosegel. Konfigurere gel og køre elektroforese som tidligere beskrevet (trin 5.2.3.1 til 5.2.3.3). Visualisere resultater på en imager.

8. vare rensning og sekventering

  1. Rense gel PCR produkter fra den anden PCR ved hjælp af Gel og PCR Fragment DNA Clean-Up System som pr fabrikantens protokol.
  2. Udføre Sanger sekventering (Alternativt sende gelen renset PCR produkt prøver og passende sekventering primere til en sekvensering lab). Analysere sequencing data efter Sanger sekvensering.
  3. Download sekvens-analyse software (Se Tabel af materialer) og importere sporingsfilerne til softwaren. Brug den enkelte ren Base QVs (kvalitet værdier) til at opnå basen kalder information18. Download kromatogrammet med høj kvalitet spor til visning.
    Valgfrit: Gel renset produkt kan klones ved hjælp af en passende kloning kit og isolerede kloner sendt til Sanger sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Indlejrede fremad Primer søgning:

Agarosegel fra Figur 1 viser to forskellige PCR gel produkter (spor 1 og 2) hvilken brug de samme videresende primer men forskellige omvendt primere. Lane 3 har en særskilt PCR produkt og har en særskilt frem og bak primer. De ideelle primere til brug for PCR baseret reaktion er dem, der giver en særskilt PCR produkt (Lane 3). Den fremad primer anvendes i spor 1 og 2 giver den stærkeste band og giver de største PCR produkter (forventet), og bruges som den første fremad primer. Den anden indlejrede primer for det andet sæt af PCR reaktioner i 3' RACE er den forreste primer fra Lane 3.

Forskellige DNA polymeraser anvendes i 3' løb give lignende resultater:

To forskellige DNA polymeraser produceret de samme størrelse PCR produkter trods forskellige PCR cykling betingelser for 3' RACE (figur 2). Der er kun én særskilt band for den forventede PCR produkt. Alle af minus reverse transkriptase negative kontroller (-) ikke har et band, viser ingen genomisk kontaminering af RNA bruges i cDNA syntese såvel som i efterfølgende downstream reaktioner.

Sanger sekventering resultater:

PCR produkter var gel renset og sendt til Sanger sekvensering. Resultaterne vist i fig. 3A viser en del af en sekvens chromatografen fra Sanger sekvensering. En repræsentativ sekvens identificerer placeringen af stop-codon, formodede polyadenylation signal, og webstedet kavalergang og poly (A) hale i 3' RACE produktet (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: identifikation af to indlejrede gen specifikke fremad primere til brug i 3' RACE. Vist er et eksempel på PCR-produkter fra forskellige kombinationer af genet specifikke frem og omvendt primere bruger HeLa cDNA køre på en ethidiumbromid farves agarosegel med molekylevægt (mw) stigen. Baner 1 og 2 er PCR produkter fra den samme gen specifikke fremad primer, men forskellige omvendt primere. Pilene peger på de forventede PCR produkt for hver lane. Udover band for den forventede PCR produkt er der en yderligere band. Enkelt PCR produktet i Lane 3 er fra en anden gen specifikke indlejrede frem og bak primer og viser den enkelt forventede band.

Figure 2
Figur 2: verifikation af 3' RACE produkter fra det andet sæt af PCR-reaktionerne. Produkter fra den anden PCR reaktion med (A) Pfu DNA Polymerase og (B) kimære DNA polymerase blev kørt på en agarosegel med ethidiumbromid. Baner skildret af (-) er fra negative kontrol prøven for hver cellelinje når cDNA syntese af RNA blev udført i mangel af reverse transkriptase enzym. Baner 1 og 2 er PCR produkter fra biologiske replikater af hver cellelinje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kortlægning af PCR-produkter af 3' RACE. (A) A del af en sekvens kromatogram af en gel renset 3' RACE produkt viser den forudsagte polyadenylation signal og placeringen af poly(A) hale. (B) repræsentant sekvenser fra Sanger sequencing data, der viser stop-codon, polyadenylation signal (PAS), webstedet kavalergang og fastgørelse af poly(A) hale og en del af poly (A) hale sekvenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cyklus trin Temperatur og varighed Antal cyklusser
Indledende denaturering 95 ° C i 3 min 1
Indledende udglødning og udvidelse 50 ° C i 5 min og 72 ° C i 10 min 1
Subcyles (denaturering, udglødning og udvidelse) 95 ° C til 40 s, 50 ° C i 1 min., og 72 ° C i 3 min 20
Sidste cyklus (denaturering, udglødning og udvidelse) 95 ° C til 40 s, 50 ° C i 1 min., og 72 ° C i 15 min 1
Hold 4 ° C, ∞

Tabel 1: Pfu DNA Polymerase PCR cykling betingelser for 3' RACE.

Cyklus trin Temperatur og varighed Antal cyklusser
Indledende denaturering 98 ° C i 3 min 1
Indledende udglødning og udvidelse 50 ° C i 5 min og 72 ° C i 10 min 1
Subcyles (denaturering, udglødning og udvidelse) 98 ° C til 30 s, 50 ° C i 1 min., og 72 ° C i 4 min 20
Sidste cyklus (denaturering, udglødning og udvidelse) 98 ° C til 30 s, 50 ° C i 1 min., og 72 ° C i 15 min 1
Hold 4 ° C, ∞

Tabel 2: Kimære DNA polymerase PCR cykel betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På trods af fremkomsten af massive parallelle sekventering teknologier, på grundlag af genet af genet, 3' RACE er stadig den nemmeste og mest økonomiske metode til at identificere de PAS og nukleotider støder op til poly(A) hale. Tilpasning beskrives her udvides ved hjælp af 3' RACE til både forstærke og knytte sekvenser, der omfatter en del af ORF, stop-codon og den hele 3' UTR af ANKHD1 mRNA udskrift. En stor fordel ved 3' RACE er, at med et par mindre tilpasninger, produkter fra 3' RACE kan klones til andre vektorer til lette downstream forhør af 3' UTR funktion herunder miRNA målretning, stabilitet assays samt andre mekanistiske assays. Dette kan gøres ved at medtage begrænsning enzym websteder inden for indlejrede primer sekvenser9,10. Kan foretages justeringer, som omfatter kun 3' UTR uden nogen sekvenser fra ORF for kloning til 3' UTR funktionelle assays5.

En væsentlig faktor for succes af 3' RACE er udvikling af indlejrede primere, der er målrettet gen af interesse. CDNA sekvenser fra Ensembl genom browser anbefales til bedst identificere regioner uden polymorfier for at udvikle optimale primere. Ideelt set videresende flere indlejrede primere samt mindst to omvendte primere inden for gen af interesse kan blive screenet ved hjælp af standard PCR til at identificere de bedste to indlejrede gen specifikke primere til at bruge. I denne undersøgelse gav den første gen specifikke fremad primer valgt for 3' RACE i første omgang to bands med standard PCR rutinemæssigt anvendes i laboratoriet. Desværre, primer design var begrænset af det betydelige antal SNPs i afskriften af interesse. SNPs i target udskrift føre til uoverensstemmelse mellem primere og mål, hvilket kan resultere i ineffektive udglødning og forstærkning, og bør reduceres til et minimum19. Tilstedeværelsen af mindst fire SNPs i en primer, eller forekomsten af en kombination af fem mismatchproblemer (tre i en primer og to i den anden) kan resultere i komplet hæmning af PCR reaktion, og derfor den eneste mulighed er at designe flere primere20. I stedet for at designe mere primere til at få én enkelt band for standard PCR anvendes til primer Søg i forsøg rapporteret her, blev PCR cykling betingelser og DNA polymeraser efterfølgende brugt i 3' RACE ændret for at optimere sandsynligheden for at få en bestemt frekvensbånd. Denaturering temperaturen var steget til 98 ° C i en af DNA polymeraser (en stigning fra 95 ° C bruges i primer-søgning). For begge DNA polymeraser anvendes i 3' RACE PCR, indledende denaturering varighed blev øget til 3 min. i stedet for de anbefalede 30 s til 2 min for at fuldt denaturere cDNA skabelon. T7 oligo dT25 primer forventes for eksempel at potentielt form svage sekundære strukturer, som kan reducere tilgængeligheden af primere21. Stigende første denaturering længde og temperatur bryder enhver sekundær strukturer og hjælper med at give enkelt specifikke bandet efter den sidste cyklus af 3' RACE. Derudover var uspecifikke bandet lettere end de forventede bands, tyder på, at det dukkede op på højere PCR cyklusser (op til 35 cykler); begrænse PCR-cykler til kun 20 reducerer forstærkningen af uspecifik band.

Et andet potentiale af 3' RACE, ligesom andre PCR baseret reaktioner, er ufuldstændige forstærkning af target region22. Dermed for begge termofile enzymer den udgloedning begyndelsestemperatur blev sat ved 50 ° C i 5 min at optimere Udglødning af primere til målet og dette blev fulgt op af en første udvidelse temperatur på mindst 72 ° C i 10 min. Den endelige PCR cyklus for hvert enzym havde gangen endelige udvidelse af 15 min på 72 ° C. Disse udvidelse trin var længere end dem, der anbefales af fabrikanter af DNA polymeraser. Den lange forlængelse (forlængelse) trin giver mulighed for komplet syntese af ufuldstændige amplikoner, muliggør fuld udvidelse af de indledende og afsluttende forstærkning produkter16.

PCR trin, der forekommer i 3' RACE er meget følsomme, så de kan påvise genomisk DNA (eller andre DNA-kontaminering) i stedet for målet mRNA udskrift, hvilket resulterer i flere uventede bands på gel22. En måde at forhindre forurening er at udføre PCR arbejde i en dedikeret PCR hætte, handsker, og bruge ren reagenser og autoklaveres sterile rør og afpipetteres tips. I regelmæssig PCR, kan frem og bak primere designes, så de er placeret på forskellige exons (på tværs af intron primere); på denne måde, ville en unormalt stor PCR produkt betyde, at en region, der indeholder en intron er blevet forstærket. Men dette kan ikke altid være muligt i tilfælde af, at kun 3' UTR sekvens, som ligger inden for den samme terminal exon, er målet for 3' RACE forstærkning. Alternativt, RNA kan blive forbehandlet med DNAse enzym før cDNA syntese. Brug af T7 oligo dT25 primer til prime reverse transkriptase reaktion i stedet for en tilfældig hexanucleotide for første streng cDNA syntese af RNA nedsætter også forstærkning af de genomiske produkter. Sidst men ikke mindst, at oprette en negativ kontrol (den "–" baner i figur 2), hvor cDNA syntese er sat op i mangel af reverse transkriptase er stærkt anbefales. Kontrolelementet gennemgår identiske trin til de andre prøver i de efterfølgende 3' RACE procedurer. Tilstedeværelsen af et band i denne kontrol betyder potentiel genomisk DNA-kontaminering.

Trods de førnævnte udfordringer er 3' RACE et kraftfuldt værktøj i kortlægning 3' ender på grundlag af individuelle genet. Fremkomsten af næste generations teknologi har ført til en stigning i repertoiret af udskrifter, der har alternativ 3' ender som følge af alternative polyadenylation, som kan eller kan ikke involvere alternativ splicing. For at tilføje kompleksitet i kræftceller, kromosomale rearrangementer er hyppige og kan resultere i muterede gen fusion produkter23. Fusion mellem de to gener kan inddrage ORF eller i nogle tilfælde, involverer kun sekvenser i 3' UTR9,10. Derudover er der også konjunktion/co-transcribed gener, som er transskriberet samtidig men kan omsættes til forskellige proteiner11. 3' RACE kan skræddersyes til at knytte alle disse unikke, unormal udskrifter samt normale udskrifter. Dette er vigtigt fordi disse unormale udskrifter kan ende tjener som sygdom specifikke biomarkører eller specifikke stof mål, f.eks., at stoffet Imatinib mål BCR-ABL1 fusion gen i kræft.

Derfor, 3' RACE er et meget alsidigt teknik, som kan bruges til at forstærke normale udskrifter, identificere roman 3' UTRs, og romanen gen fusioner inden for 3' UTR5,9. I denne betænkning, 3' RACE blev brugt til at forstærke og kort stop-codon, PAS og det hele 3' UTR af ANKHD1 udskrift ved hjælp af forskellige DNA polymeraser. Den beskrevne metode kan bruges til at knytte 3' slutningen af enhver polyadenylated udskrift.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Bettine Gibbs for hendes teknisk hjælp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Tags

Genetik sag 133 udskrifter 3' enden 3' hurtige forstærkning af cDNA ender (3' RACE) polymerase kædereaktion polyadenylation signal (PAS) polyadenylation
Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter