Summary
I denne artikel beskrives en metode til at analysere immun celleindhold af fedtvæv ved isolering af immunceller fra fedtvæv og efterfølgende analyse ved hjælp af flowcytometri.
Abstract
Infiltrationen af immunceller i det subkutane og visceralt fedtvæv (AT) indskud fører til en lav-grade inflammation bidrager til udviklingen af fedme-associerede komplikationer såsom type 2-diabetes. Kvantitativt og kvalitativt undersøge immun celle subsets i menneskelige ved indskud, har vi udviklet en flow flowcytometri tilgang. De stromale vaskulære brøkdel (SVF), der indeholder immunceller, er isoleret fra subkutane og visceralt på biopsier af collagenase fordøjelsen. Adipocytter er fjernet efter centrifugering. SVF celler er farvet for flere membran-bundet markører valgt at skelne mellem immun celle subsets og analyseret ved hjælp af flowcytometri. Som følge af denne tilgang, pro - og anti - inflammatoriske makrofag delmængder, dendritiske celler (DCs), B-celler, CD4+ og CD8+ T-celler, og NK-celler kan påvises og kvantificeres. Denne metode giver detaljerede oplysninger om immunceller i på og mængden af hvert specifik undersæt. Da der findes talrige fluorescerende antistoffer, kan vores flow flowcytometri tilgang indstilles til at måle forskellige andre cellulære og intracellulære markører af interesse.
Introduction
Fedme er kendetegnet hos lav-grade inflammation1 og infiltration af pro-inflammatoriske immunceller i både visceral og subkutane på (moms, sad). Ophobning af pro-inflammatoriske immunceller i momsen, der fører til insulinresistens, som er en primære risikofaktor for at udvikle type 2-diabetes2. Immunceller af både medfødte og adaptive immunsystem er fundet i den fede på, såsom makrofager, mastceller, neutrofiler, CD4+ og CD8+ T-celler og B-celler3,4,5,6 ,7. Disse immunceller, samt endotelceller, stromale celler, adipocyt progenitorceller, fibroblaster og pericytes, udgør SVF8 og er den vigtigste kilde til pro-inflammatoriske stoffer i på9.
VED inflammatorisk status er almindeligt undersøgt af teknikker, herunder vestlige skamplet10, qPCR11og Immunhistokemi11. Men når du bruger disse teknikker, hele ATT, adipocytter og SVF, bruges. Dette gør det vanskeligt at bestemme de beløb og delmængder af immunceller til stede ved. Immunceller har forskellige celle-markører til at definere og kategorisere dem, såsom makrofager. Makrofager viser signifikant heterogenitet i både funktion og celle overflade markør udtryk12. Derfor, de er ofte kategoriseret i to makrofag populationer: M1 og M2. M2 makrofager kaldes normalt alternativt aktiveret makrofager12,13 og opholde sig i på af lean, metabolisk normale mennesker14. Dog under fedme opstår en fænotypiske switch fra M2 makrofager at M1 makrofager. Disse aktiveret klassisk M1 makrofager express CD11C12 og akkumulerer omkring døde adipocytter at danne krone-lignende strukturer13. Det har vist sig at CD11C+ makrofager ved forringe insulin action og er associeret med insulinresistens i fede mennesker15. For at identificere M1 og M2 makrofager ved, er Immunhistokemi en mulighed. Denne teknik giver oplysninger om placeringen af makrofager i vævet. Dog vil det begrænse antallet af mærker, der kan bruges i en farvning. Derudover er det også vanskeligt at kvantificere. Derfor, for at undersøge de forskellige immun celle subsets i moms og lør indskud, har vi udviklet en flow flowcytometri tilgang. Denne tilgang giver os mulighed for at bruge flere markører pr. celle med ét flow flowcytometri analyse til at definere celle subsets og tælle antallet af hver delmængde i AT indskud.
Protocol
Visceral og subkutane på prøver taget fra fag indskrevet i undersøgelsen er godkendt af lægelige etiske udvalg luffe Hospital, Hasselt og Hasselt Universitet i Belgien, i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.
1. forberedelse af reagenser
- Collagenase løsning
- 1 g opløses af Collagenase jeg i 10 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS, uden calcium og magnesium) for at gøre en 100 mg/mL stamopløsning. Forberede 200 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C.
- Opløse 1 g Collagenase XI i 10 mL PBS til at gøre en 100 mg/mL stamopløsning. Forberede 200 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C.
- 10 mg DNase opløses I 10 mL PBS til at gøre en 10 mg/mL stamopløsning. Forberede 180 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C.
- Tilføj 100 µL Collagenase jeg (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) og 90 µL DNase I (10 mg/mL) til 10 mL af DMEM skinke F12. Gøre collagenase løsning frisk for hver isolation.
- Erytrocyt lysisbuffer
- Opløse 0.84 g NH4Cl i 100 mL i ultrarent vand.
- Indstille pH-værdi på 7,4 før brug. Opbevares i et glas kolbe ved 4 ° C.
- Sted erytrocyt lysisbuffer på is før brug.
- FACS buffer
- Opløs 0,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 100 mL PBS at opnå 0,5% BSA PBS.
- Opløses 65 mg af NaN3 i 100 mL 0,5% BSA PBS at opnå 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Gemme løsning i et glas kolbe ved 4 ° C.
- Sted FACS buffer på is før brug.
Forsigtig: NaN3 er meget giftigt. Arbejde i et stinkskab og bære beskyttelsesbriller og handsker til beskyttelse under håndtering NaN3.
- Humant IgG blok
- 10 mg af humant IgG i 10 mL PBS til at opnå 1 mg/mL opløses. Forberede 100 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C.
- Sted human IgG blokken på is før brug.
2. isolering af SVF fra AT
- Skær 1 g på biopsi i små stykker (± 2 mm2) med en skalpel og overførsel til en 50 mL-centrifugerør (fx, Falcon tube). Der tilsættes 10 mL af collagenase løsning til hver på prøve.
Bemærk: Luk låget af glasset helt og drej låget ¼ tur tilbage. - Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C i et vandbad under blid ryster (60 cyklusser/min.).
- Filtrere den resulterende suspension med en 200 µM filter og indsamle prøven i et nyt 50 mL-centrifugerør. Tilføje 7 mL PBS på toppen af filteret for at skylle filteret og få alle celler.
- Centrifugeres prøve på 280 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjerne den flydende adipocyt brøkdel af pipettering. Celle pellet er SVF.
Bemærk: Fjern adipocyt fraktion for at opnå SVF. Undgå nedsænkning hele spidsen i stikprøven, fordi dette vil kun fjerne PBS og ikke de flydende adipocytter. - Resuspend på SVF i 5 mL PBS fjerne collagenase, filtrere suspension med en 70 µM filter, skyl filteret med 5 mL PBS og centrifugeres prøve på 280 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 3 mL af erytrocyt lysisbuffer.
- Inkuber i 5 min på is. Tilføje 7 mL PBS efter inkubation.
- Centrifugeres prøve på 280 x g i 5 min. ved 4 ° C.
3. farvning af SVF for Flow flowcytometri analyse
- Opløse den celle pellet i 90 µL 4 ° C FACS buffer og tilsæt 10 µL af 1 mg/mL humant IgG blok. Opdele cellesuspension i 2 brønde i en 96 v-form godt plade. Pladen anbringes på is og lad den menneskelige IgG blok inkuberes i 15 min.
- Tilføje 100 µL FACS buffer til hver prøve at vaske og centrifugeres plade for 5 min med 280 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved deponering pladen op og ned i en jævn bevægelse uden at trykke på pladen.
Bemærk: Sørg for at fjerne enhver resterende væske fra toppen af pladen med en væv, mens holde pladen op og ned. - Forberede antistof cocktails for makrofag og DC delmængder (FACS panel 1) og T - og B-celle subsets (FACS panel 2), som beskrevet i tabel 1 og tabel 2. De mængder, der er beskrevet i tabel 1 og tabel 2 er valgt efter optimering antistof koncentrationer og er tilstrækkelig for et moms eller lør prøve.
Bemærk: I FACS panel 1, bruge markører CD303 og CD141 for at bekræfte, at CD11C+ CD11Blav celler er DCs. Det anbefales dog at udelukke disse markører fra panelet til at omfatte en live/døde farvning. Begge FACS panel 1 og 2 kan kombineres med LIVE/døde Fixable Red Dead celle pletten Kit levedygtighed farvning når eksklusive CD303 i panelet 1 som PE-kanal vil være ubrugt. Udføre levedygtighed farvning ifølge producentens anvisninger. - Resuspend pellet i 29,5 µL antistof cocktail for FACS panel 1 og 23 µL antistof cocktail for FACS panel 2. Inkuber i 30 min. i mørke på is.
- Tilsæt 150 µL FACS buffer til hver brønd og resuspenderes celle for at udføre en anden vask trin. Centrifugeres plade i 5 min på 280 x g og 4 ° C. Fjern supernatanten ved deponering pladen op og ned.
- Tilsæt 150 µL 1% formaldehyd løsning til hver brønd fix cellerne. Overføre cellesuspension fra hver brønd til tilsvarende FACS røret af pipettering med P200 pipette. Gemme FACS rør ved 4 ° C i mørke op til 7 dage.
Bemærk: Direkte måling er også muligt. Tilsæt 150 µL FACS buffer til hver brønd i stedet for 1% formaldehyd, overføre cellerne af pipettering med P200 pipette til tilsvarende FACS rør, og analysere cellerne.
Forsigtig: Formaldehyd er meget giftige. Forberede formaldehyd løsninger mens du arbejder i et stinkskab at undgå indånding og bære handsker og sikkerhedsbriller til beskyttelse.
4. flow flowcytometri analyse
- Før den første måling, skal du bruge en unstained negativ kontrol for at indstille forward scatter (FSC) og side scatter (SSC). Justere spændinger af flow forskellige ifølge producentens anvisninger, så alle populationer af interesse er synlige på grafen, FSC og SSC og kan foretages en sondring mellem snavs og levende celler.
- Udføre flerfarvet kompensation analyse med antistof capture perler efter producentens protokol.
- Forberede fluorescens minus én (FMO) kontrolelementer ved at gøre antistof blanding men udelukke et antistof fra mix. Gør dette for hver antistof, oprettelse af 8 antistof blander for FACS panel 1 og 6 antistof blander for FACS panel 2. Disse FMO antistof blander bruges til at plette SVF som beskrevet tidligere i denne protokol.
- Måle alle FMO kontrol og indstille den gating strategi baseret på FMO kontrol. Brug kontrolelementerne FMO for at opdage mulige auto-fluorescens af celler.
Bemærk: Ved at fjerne et antistof fra mix, enhver fluorescens niveau fundet i denne kanal er en baggrund/autofluorescent signal. Derfor, ved at sammenligne de forskellige FMO styre FACS resultater, gates kan tegnes på specifikke populationer sikrer, at gatings er baseret på positive celler og ikke baseret på auto-fluorescens. - Vortex FACS rør på 800 rpm før placere dem i flow Flowcytometret og start måling.
Bemærk: Minimum 50.000 begivenheder i den levende gate anbefales at sikre nok celler er målt fra hver af de delpopulationer.
Representative Results
SVF isoleret fra moms og sad blev målt ved hjælp af flowcytometri. Flow flowcytometri målinger generere parceller viser forskellige cellepopulationer baseret på cellular markører (figur 1A og 1B). Først ved at plotte Videresend scatter bredde (FSC-W) og videresende scatter område (FSC-A), celle aggregater kan blive fjernet fra yderligere analyse af gating de enkelte celler som lav FSC-W. Næste, levende celler er markeret, og celleaffald er udelukket af gating cellerne i den korrekte størrelse og kompleksitet ved hjælp af FSC-en og siden scatter område (SSC-A), henholdsvis. Døde celler er små og derfor ses som en særskilt population med en lille FSC-A. Næste, immun celler blev valgt ved brug af pan-leukocyt markør CD45 (Panel 1 og 2, figur 1A). For at analysere makrofager, andre immun celler såsom T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b+ CD11b+), og NK-celler (CD56) blev udelukket fra yderligere analyse ved hjælp af forskellige antistoffer rettet mod disse celler, men med det samme fluorokrom. Yderligere underopdeling af de resterende celler var baseret på CD11b og CD11c udtryk. Dette resulterede i de følgende bestande: CD11b+ CD11c+ makrofager, CD11b+ CD11c- makrofager og CD11blav /- CD11c+ DCs (FACS panel 1, figur 1B). Måling af gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) tilladt kvantificering af udtryk for CD303 (plasmacytoid DC markør) og CD141 (DC markør), på CD11b+ CD11c+ makrofager og CD11blav /- CD11c+ DCs. Udtryk for begge disse markører var højere i CD11blav /- CD11c+ celler, bekræfter, at CD11blav /- CD11c+ celler var DCs (figur 1 c).
CD45+ celler (figur 1A) blev opdelt i T-celler og B-celler ved hjælp af CD3 og CD19, henholdsvis. T-celler blev opdelt i T-hjælper celler (CD4+) og cytotoksiske T-celler (CD8+). Endelig CD3-CD19-celler blev afbildet at kvantificere NK-celler ved hjælp af bogmærkeværktøj CD56 (FACS panel 2, figur 1 d). Antallet af celler i hver gate er kvantificeret og kan bruges til at beregne procentdelen af denne celletype af alle levende celler (tabel 3).
Procentdelen af levende celler kan beregnes for hvert emne, så beregningen af et gennemsnit af alle fag i en gruppe af for eksempel magre eller fede mænd viser overfloden af en bestemt immun celle, dvs., det pro-inflammatoriske CD11b+ CD11c+ makrofag i visceral på (figur 2).
Figur 1. FACS gating strategi af visceralt fedtvæv. (A) FACS plot af alle begivenheder (sort) med forward scatter bredde intensitet (FSC-W) og forward scatter område intensitet (FSC-A) indeholdende en gate for at vælge kun enkelt celler (rød) efterfulgt af en FACS plot baseret på FSC-A og side scatter område intensitet (SSC-A) indeholdende en gate at vælge levende celler (lysegrøn). Næste plot med SSC-A og CD45 fluorescens intensitet indeholder en gate at vælge alle CD45+ (immun) celler (blå). (B) FACS plot af CD19, CD3, CD66b og CD56 fluorescens intensitet versus CD11b fluorescens intensitet, og en gate, der vælger alle celler, der er CD19, CD3, CD66b og CD56 negative (brun) til yderligere opdeling i populationer. Yderligere underopdeling i den næste plot, baseret på CD11b og CD11c fluorescens intensitet. Gates vises indeholdende CD11b+ CD11c+ makrofager (mørk grøn), CD11b+ CD11c- makrofager (lilla), og CD11blav /- CD11c+ dendritiske celler (blå). (C) beløb af CD11b+, CD11c+, eller CD11blav /- CD11c+ celler (y-aksen) vise deres niveauer af fluorescens intensitet (x-aksen) for CD303 og CD141 og den tilsvarende kvantificering af middelværdien Fluorescens intensitet (MFI). (D) FACS plot viser den forrige CD45+ befolkning (blå) baseret på CD3 og CD19 fluorescens intensitet indeholdende låger at vælge T-celler (magenta), B-celler (mørk grøn), og ikke-autofluorescent celler (grønne) negative for begge CD3 og CD19. De følgende plot er baseret på CD4 og CD8 fluorescens med låger at vælge CD4+ (lysegrøn) og CD8+ (magenta) T-celler. En identisk gating strategi bruges til subkutane fedtvæv. En identisk gating strategi bruges til subkutane fedtvæv. Dette tal er blevet ændret fra Wouters et al. 16 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fede moms indeholder mere pro-inflammatoriske makrofager. Mængden af CD11b+ CD11c+ makrofager præsenteret som procentdel af alle levende celler i moms af magre og fede mænd. Alle data er middel ± SEM; n = 20 for lean og n = 31 for overvægtige. p ≤ 0,01 vs. lean. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Target | Definition mål | Præsentere på | Fluorokrom | Mængde | Klon |
| CD11B | myeloid integrin markør | granulocytter, monocytter/makrofager, dendritiske cellerlavt og naturlige dræberceller | BV421 | 2,5 ΜL | ICRF44 |
| CD19 | fælles B-celle antigen | B celle udvikling fra pro-B-celle blastoid B-celle og plasma B celle | FITC | 3 ΜL | HIB19 |
| CD3 | fælles T-celle antigen | T-lymfocytter, naturlige dræberceller T og thymocytter | FITC | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD66B | medlem af carcioembryonisk antigen (CEA)-som glycoprotein familie | granulocytter | FITC | 5 ΜL | G10F5 |
| CD56 | stærkt glykosyleret vedhæftning protein | Natural killer celler og naturlige dræberceller T | FITC | 5 ΜL | B159 |
| CD303 | type II transmembrane glycoprotein | plasmacytoid dendritiske celler | PE | 1 ΜL | 201A |
| CD141 | thrombomodulin | monocytter/makrofagerlav, delpopulation af dendritiske celler | APC | 1 ΜL | M80 |
| CD11C | type I-transmembrane glycoprotein; integrin αx | monocytter/makrofager, dendritiske celler, granulocytter, naturlige dræberceller, undersæt af B og T celler | APC-Cy7 | 0,5 ΜL | Bu15 |
| CD45 | fælles leukocyt antigen | alle menneskelige leukocytter og lymfocytter, monocytter, granulocytter, eosinofile, thymocytter | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffer | - | - | - | 7.5 µl | - |
Tabel 1. Antistof cocktail for FACS panel 1 identificere makrofag delmængder og dendritiske celler populationer. Mængden af antistof beskrevet er til analyse af en prøve.
| Target | Definition mål | Præsentere på | Fluorokrom | Mængde | Klon |
| CD19 | fælles B-celle antigen | B celle udvikling fra pro-B-celle blastoid B-celle og plasma B celle | BV421 | 1 ΜL | HIB19 |
| CD3 | fælles T-celle antigen | T-lymfocytter, naturlige dræberceller T og thymocytter | V500 | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD56 | stærkt glykosyleret vedhæftning protein | Natural killer celler og naturlige dræberceller T | APC | 5 ΜL | HCD56 |
| CD4 | IG superfamilien, type I-transmembrane glycoprotein | T-hjælper celle, thymocytter, monocytter/makrofager, skrive II naturlige dræberceller T | PerCP-Cy5.5 | 1 ΜL | RPA-T4 |
| CD8 | Α-underenhed af en disulfid-linked bimolecular kompleks | cytotoksiske T-celler, thymocytter, undersæt af naturlige dræberceller | APC-H7 | 2 ΜL | SK1 |
| CD45 | fælles leukocyt antigen | alle menneskelige leukocytter og lymfocytter, monocytter, granulocytter, eosinofile, thymocytter | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffer | - | - | - | 10 µl | - |
Tabel 2. Antistof cocktail for FACS panel 2til at identificere T - og B-celle populationer. Mængden af antistof beskrevet er til analyse af en prøve.
| Makrofag panel | ||
| Gate navn | # Celler | % af levende |
| Enkelt celler | 183054 | |
| Live | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39.13 |
| dump- | 771 | 7.36 |
| CD11C- CD11B+ | 430 | 4.1 |
| CD11C+ CD11B+ | 104 | 0,99 |
| CD11C+ CD11Blav /- | 15 | 0,14 |
| T-celle, B-celle, NK-celle panel | ||
| Gate navn | #Cells | % af levende |
| Enkelt celler | 34616 | |
| Live | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42.62 |
| NK-celler | 29 | 0,78 |
| CD3+ | 953 | 25.56 |
| CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8.8 |
| CD19+ | 20 | 0,54 |
Tabel 3. Immun celle overflod af forskellige celletyper i moms. Antal celler i hver gate og procentdelen af de forskellige celletyper baseret på den samlede mængde af levende celler.
Discussion
Disse metoder beskriver, hvordan du isolere SVF fra moms og sad og kvantificere de relative mængder af immunceller i disse væv. Derudover oplyse metoderne sådan bestemme udtryk markører på specifikke celletyper.
Flowcytometri af væv immunceller er en kraftfuld teknik til fænotype immunologiske status for væv. Kvantificering af væv immunceller kan have mange programmer. Som beskrevet i resultaterne, er det muligt at sammenligne tilstedeværelsen af specifikke immunceller mellem grupper af patienter (fxlean vs fede). Derudover også udfører flowcytometri på blod af de samme patienter, kan sammenslutninger mellem cirkulerende celler og væv celler blive undersøgt. Med dette program kunne vi fastslå, at et bestemt undersæt af cirkulerende monocytter er tilknyttet pro-inflammatoriske CD11C+ fedtvæv makrofager16.
Justeringer til de beskrevne protokol vil udvide sine programmer som mange tilgængelige fluorescerende antistoffer gøre flowcytometri meget alsidigt. Med forskellige antistoffer kan skelnes mellem næsten alle celletyper og udtryk for mange markører kan påvises. Derudover er det muligt at plette markører intracellulært af permeabilizing cellemembranen for at tillade intracellulære binding af fluorescerende antistoffer. Disse egenskaber tillader sondring af de meget forskelligartede makrofag befolkninger ud over de alt for forenklet M1 og M2 makrofag undertyper. Ud over måling af overflade markør udtryk, kan proteiner (dvs., cytokiner) farves intracellulært giver oplysninger om makrofag funktionalitet. Derudover bruges spredning markører som Ki67 til at kvantificere spredning priser. Som beskrevet, var sondringen mellem makrofager og DCs baseret på MFI niveauer af DC markører. En generel makrofag markør, som CD68 kan indarbejdes i panelet makrofag (FACS panel 1). CD68 skal dog være plettet intracellulært kræver permeabilization af cellemembranen, som er ikke at foretrække og vil forlænge protokollen. Andre makrofag markører er undersæt markører som CD163 og CD206 eller CD11c, den sidstnævnte at blive integreret i panelet makrofag præsenteres her.
En markør for at skelne mellem levende og døde celler i vores FACS paneler, ikke var medtaget, som ville være at foretrække, fordi det giver mulighed for en mere præcis udelukkelse af døde celler end brugen af FSC og SSC. Hyppigt anvendte er DNA farvning levedygtighed farvestoffer propidium Iodid (PI) eller 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) samt og gratis Amin reagerer farvestoffer såsom LIVE/døde Fixable døde celle pletten Kit, som er tilgængelig i forskellige farve farver. Dog kan ikke PI og DAPI anvendes ved fastsættelsen af cellerne. Som beskrevet i protokollen, kan LIVE/døde Fixable Red Dead celle levedygtighed farvning integreres i begge paneler uden at påvirke den overordnede FACS gating strategi.
Desuden er dataene, der udtrykt som en procentdel af levende celler, hvilket betyder, at alle data er relativ. Kun ved at indtaste en nøjagtig, ville kendt antal celler i flow forskellige, det være muligt at bestemme de nøjagtige tal for hver celle. En omtrentlig antal celler kunne beregnes efter tælle celler i SVF-fraktionen ved hjælp af en optælling kammer. Dette tal skulle justeres for den biopsi væv bruges til at isolere SVF, men det har begrænsninger, når man sammenligner lean til overvægtige på. En lignende masse fede AT består af mindre adipocytter da de er fyldt med lipider og har udvidet betydeligt. Dette kunne føre til en undervurdering af immun celle nummer hvis præsenteret som antallet af immunceller pr. gram på eller adipocyt.
I humane undersøgelser, er inklusion af patienter normalt gøres over en længere periode at foretage standardisering af eksperimentelle procedurer af stor betydning. Til sammenligning af flow flowcytometri data mellem patienter er der flere muligheder. Som beskrevet i denne protokol, kan der fastsættes celler før måling giver mulighed for analyse af flere prøver på samme dag. Dette kan også opnås ved nedfrysning af SVF før farvning dem, som giver mulighed for at være lige mellem alle prøver farvning procedure, men levedygtigheden af celler kan blive påvirket. Endelig også ansat i denne undersøgelse, er fluorescerende perler at installere kompensationsniveauer, og forskellige tracking perler blev brugt bi-ugentlige for at standardisere daglige målinger af forskellige. Denne sidste mulighed er den mest effektive når måling prøver fra en undersøgelse, der spænder over en lang periode.
En begrænsende faktor for flowcytometri er generelt brugen af fluorescens. Antallet af fluorescerende etiketter, der kan registreres samtidigt er begrænset på grund af overlapning i emission spektre. Med smart FACS panel udvikling og brug af flere antistof cocktails pr. moms eller sAT prøven, kan der dog overvindes et dette spørgsmål, som beskrevet i denne protokol. Et vigtigt aspekt af FACS panel udvikling er FMO kontrol. Ved hjælp af alle antistoffer af panelet med undtagelse af en, kan blive værdsat potentielle autofluorescence niveauer, når man sammenligner FMO med panelet fuld. Dette giver mulighed for nøjagtig gating af befolkninger og disse procedurer bør udføres, når du opretter en ny FACS panel. Derudover kan nye generationer af FACS enheder registrere op til 50 parametre tillader samtidig registrering af mange egenskaber pr. celle. Et andet spørgsmål vedrører fluorescens aspekt er autofluorescence af celler, især makrofager. Efter excitation af celler med FACS laser (hovedsagelig med 488 nm bølgelængde excitation), disse celler udsender en fluorescerende signal (hovedsagelig < 640 nm) at kan overlapning med emission spektre af antistoffet etiketter17,18. For at tage hensyn til dette, bør unstained celler måles for at bestemme autofluorescence i hver kanal. Med denne viden, skal være markeret fluorokromer, der viser en signalstyrke, der overstiger autofluorescent signalet. Denne autofluorescent baggrund signal bør tages i betragtning ved fastsættelsen af den gating strategi for befolkningerne. Ved anvendelse af denne protokol og intelligent FACS panel design er det derfor muligt at i dybde fænotype makrofag undertyper. Nye særskilte AT makrofager og deres funktion kan karakteriseres.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke J. van de Gaar og M. Vroomen (Maastricht Universitet, Holland) for deres tekniske support. Derudover vil vi gerne takke K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, og E. Blaak for at give blod og væv biopsier bruges til oprettelse af denne protokol og de efterfølgende forsøg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
