Summary
Cet article décrit une méthode pour analyser le contenu de la cellule immunitaire du tissu adipeux par l’isolement de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et l’analyse ultérieure à l’aide de cytométrie en flux.
Abstract
Infiltration de cellules immunitaires dans le tissu adipeux sous-cutané et viscéral (AT) dépôts conduit à une inflammation de bas grade qui contribuent à l’apparition de complications associées à l’obésité comme le diabète de type 2. Pour quantitativement et qualitativement, étudier les sous-ensembles de cellules immunitaires chez l’homme à des dépôts, nous avons développé une approche de cytométrie de flux. La fraction stroma vasculaire (SVF), contenant les cellules immunitaires, est isolée de sous-cutané et viscéral à biopsies par digestion de collagénase. Les adipocytes sont supprimés après centrifugation. Les cellules SVF sont colorées pour plusieurs marqueurs membranaires choisie pour différencier les sous-ensembles de cellules immunitaires et analysés par cytométrie en flux. Grâce à cette approche, pro - et anti-inflammatoires, sous-ensembles macrophages, cellules dendritiques (CD), les lymphocytes B, les CD4+ et CD8+ T-cellules, et les cellules NK peuvent être détectés et quantifiées. Cette méthode donne des informations détaillées sur les cellules immunitaires en AT et le montant de chaque sous-ensemble spécifique. Puisqu’il y a de nombreux anticorps fluorescents disponibles, notre approche de cytométrie de flux peut être ajusté pour mesurer divers autres marqueurs cellulaires et intracellulaires d’intérêt.
Introduction
L’obésité est caractérisée par de bas grade AT inflammation1 et l’infiltration de cellules immunitaires pro-inflammatoires en sous-cutané et viscéral à (TVA, samedi). L’accumulation de cellules immunitaires pro-inflammatoires dans la cuve mène à l’insulinorésistance qui est le principal facteur de risque pour développer le type 2 diabète2. Les cellules immunitaires du système immunitaire inné et adaptatif sont trouvent en l’obésité, tels que les macrophages, les mastocytes, les polynucléaires neutrophiles, CD4+ et CD8+ T-cellules et cellules B3,4,5,6 ,,7. Ces cellules immunitaires, ainsi que les cellules endothéliales, les cellules du stroma, progéniteurs adipocytaires, fibroblastes et péricytes, constituent le SVF8 et sont la principale source de substances pro-inflammatoires dans les AT9.
L’état inflammatoire de la TA est couramment étudiée par techniques dont la tache occidentale10, qPCR11et immunohistochimie11. Toutefois, lorsque vous utilisez ces techniques, l’ensemble AT, adipocytes et SVF, est utilisé. Cela rend difficile de déterminer le montant et les sous-ensembles de cellules immunitaires présentes dans l’AT. Les cellules immunitaires ont divers marqueurs de cellule à définir et à classer, tels que les macrophages. Macrophages montrent une hétérogénéité significative dans les deux fonctions et cellule marqueur de surface expression12. Donc, ils sont souvent classés en deux populations de macrophage : M1 et M2. M2 macrophages sont généralement appelés macrophages activés par ailleurs12,13 et résident en l’homme maigre, métaboliquement normaux14. Toutefois, au cours de l’obésité, un switch phénotypique se produit de macrophages M2 aux macrophages M1. Classiquement, ces activé M1 macrophages expriment CD11C12 et s’accumulent autour des adipocytes morts pour former des structures ressemblant à couronne13. Il a été démontré que CD11C+ macrophages en l’entraver l’action de l’insuline et sont associés à la résistance à l’insuline dans les humains obèses15. Pour identifier les macrophages M1 et M2 dans l’AT, l’immunohistochimie est une option. Cette technique donne des informations sur l’emplacement des macrophages dans les tissus. Cependant, il limitera le nombre de marqueurs qui peuvent être utilisés dans une coloration. En outre, il est également difficile à quantifier. Par conséquent, afin d’étudier les sous-ensembles de différentes cellules immunitaires dans les cuves et dépôts sAT, nous avons développé une approche de cytométrie de flux. Cette approche nous donne la possibilité d’utiliser des marqueurs multiples par cellule avec analyse en cytométrie en un flux à définir des sous-ensembles de cellules et de compter le nombre de chaque sous-ensemble présent dans les dépôts AT.
Protocol
Viscérale et sous-cutanée à échantillons proviennent de sujets inclus dans l’étude de l’éthique médicale de l’hôpital du Comité Jessa, Hasselt et Université de Hasselt (Belgique), conformément à la déclaration d’Helsinki a approuvé.
1. préparation des réactifs
- Solution de collagènase
- Dissoudre 1 g de collagénase I dans 10 mL de phosphate solution saline tamponnée (PBS, sans calcium et magnésium) pour faire une solution stock de 100 mg/mL. Préparer 200 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C.
- Dissoudre 1 g de collagénase XI dans 10 mL de PBS pour faire une solution stock de 100 mg/mL. Préparer 200 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C.
- Dissoudre 10 mg de DNase I dans 10 mL de PBS pour faire une solution stock de 10 mg/mL. Préparer 180 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C.
- Ajouter 100 µL collagénase I (100 mg/mL), 100 µL collagénase XI (100 mg/mL) et 90 µL DNase I (10 mg/mL) à 10 mL de DMEM Ham F12. Solution de collagènase faire frais pour chaque isolement.
- Tampon de lyse des érythrocytes
- Dissoudre 0,84 g NH4Cl dans 100 mL d’eau ultrapure.
- Régler le pH à 7,4 avant utilisation. Stocker dans un flacon en verre à 4 ° C.
- Placer le tampon de lyse des érythrocytes sur la glace avant utilisation.
- Tampon de FACS
- Dissoudre 0,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 100 mL de PBS pour obtenir 0,5 % BSA PBS.
- Dissoudre 65 mg de NaN3 en 100 mL 0,5 % BSA PBS pour obtenir 10 mM NaN3 0,5 % BSA PBS. Conserver la solution dans un flacon en verre à 4 ° C.
- Tampon de FACS de place sur la glace avant utilisation.
ATTENTION : NaN3 est hautement toxique. Travailler sous une hotte et porter des lunettes de sécurité et gants de protection lorsque vous maniez NaN3.
- Bloc d’IgG humaine
- Dissoudre 10 mg d’IgG humaines dans 10 mL de PBS pour obtenir 1 mg/mL. Préparer 100 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C.
- Déposer le bloc IgG humain sur la glace avant utilisation.
2. isolement de SVF d’AT
- Couper 1 g d’à biopsie en petits morceaux (± 2 mm2) avec un bistouri et transférer dans un tube à centrifuger de 50 mL (p. ex., tube Falcon). Ajouter 10 mL de solution de collagènase à chaque échantillon.
Remarque : Fermez le couvercle du tube complètement et retourner le couvercle ¼ de tour. - Incuber pendant 60 min à 37 ° C dans un bain d’eau en agitant doucement (60 cycles/min).
- Filtrer la suspension qui en résulte avec un filtre de 200 µM et recueillir l’échantillon dans un tube à centrifuger de 50 mL nouveau. Ajouter 7 mL de PBS sur le dessus du filtre pour rincer le filtre et obtenir toutes les cellules.
- Centrifuger l’échantillon à 280 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Enlever une fraction en adipocytes flottant de pipetage. Le culot cellulaire est le SVF.
Remarque : Retirez la fraction d’adipocytes pour obtenir SVF. Évitez d’immerger la pointe entière dans l’échantillon parce que cela va supprimer seulement le PBS et pas les adipocytes flottants. - Resuspendre le SVF dans 5 mL de PBS à supprimer la collagénase, filtrer la suspension avec un filtre de 70 µM, rincer le filtre avec 5 mL de PBS et centrifuger l’échantillon à 280 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de lyse des érythrocytes.
- Incuber pendant 5 min sur la glace. Ajouter 7 mL de PBS après incubation.
- Centrifuger l’échantillon à 280 x g pendant 5 min à 4 ° C.
3. coloration de SVF pour analyse en cytométrie en flux
- Dissoudre le culot cellulaire en 90 µL de tampon de FACS 4 ° C et ajouter 10 µL de bloc d’IgG humaine 1 mg/mL. Diviser la suspension cellulaire dans les 2 puits d’une plaque bien 96 v-forme. Placer la plaque sur la glace et laisser le bloc IgG humain à incuber pendant 15 min.
- Ajouter 100 µL de tampon de FACS à chaque échantillon pour laver et centrifuger la plaque pendant 5 min avec 280 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant en inclinant la plaque de tête en bas dans un mouvement lisse sans taper la plaque.
Remarque : Veillez à supprimer n’importe quel liquide restant du haut de la plaque avec un mouchoir en papier, tout en gardant la plaque à l’envers. - Préparer des cocktails anticorps macrophage et sous-ensembles DC (panneau 1 de FACS) et de sous-ensembles de cellules B et T (panneau de FACS 2) tel que décrit dans le tableau 1 et tableau 2. Les volumes décrits dans le tableau 1 et tableau 2 sont sélectionnés après avoir optimisé les concentrations d’anticorps et sont suffisants pour une TVA ou échantillon de sAT.
Remarque : Dans le panneau de FACS 1, utiliser les marqueurs CD303 et CD141 pour confirmer que CD11C+ CD11Bfaible de cellules sont DCs. Toutefois, il est recommandé d’exclure ces marqueurs dans le panneau pour inclure une coloration de vivre/morts. Les deux panneau de FACS 1 et 2 peut être associé à la viabilité LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit coloration quand excluant CD303 dans Panneau 1 comme le canal PE sera inutilisée. Effectuer la viabilité coloration selon les instructions du fabricant. - Resuspendre le culot dans 29,5 anticorps µL cocktail de panneau de FACS 1 et 23 µL anticorps cocktail pour panneau de FACS 2. Incuber 30 min à l’obscurité sur la glace.
- Ajouter 150 µL de tampon de FACS dans chaque puits et Resuspendre le culot cellulaire pour effectuer un second lavage. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 280 x g et 4 ° C. Retirez le surnageant en inclinant la plaque à l’envers.
- Ajouter 150 µL de solution de formaldéhyde 1 % dans chaque puits pour fixer les cellules. Transférer la suspension cellulaire de chaque puits au tube de FACS correspondant en pipettant également, avec une pipette de P200. Stocker les FACS tubes à 4 ° C dans le noir jusqu'à 7 jours.
Remarque : Mesure directe est également possible. Ajouter 150 µL de tampon de FACS dans chaque puits au lieu de 1 % de formaldéhyde, les cellules de transfert en pipettant également, avec une pipette de P200 pour les tubes correspondants de FACS et d’analyser les cellules.
ATTENTION : Le formaldéhyde est très toxique. Préparer des solutions de formaldéhyde tout en travaillant dans une hotte aspirante pour éviter toute inhalation et porter des gants et des lunettes de protection.
4. analyse en cytométrie en flux
- Avant la première mesure, utilisez un contrôle négatif non coloré pour définir le forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC). Régler les tensions de la cytomètre de flux selon les instructions du fabricant afin que toutes les populations d’intérêt sont visibles dans le graphique FSC et SSC et peut faire une distinction entre les débris et des cellules vivantes.
- Effectuer une analyse de la rémunération multicolore avec perles de capture des anticorps suivant le protocole du fabricant.
- Préparer la fluorescence moins un contrôles (FMO) en faisant le mélange d’anticorps mais exclure un anticorps du mélange. Procéder ainsi pour chaque anticorps, créant 8 anticorps mélanges pour panneau de FACS 1 et 6 mélanges d’anticorps pour panneau de FACS 2. Ces mélanges d’anticorps FMO sont utilisés pour colorer les SVF comme décrit précédemment dans le présent protocole.
- Mesurer tous les contrôles de la FMO et définir la stratégie de blocage basée sur les contrôles de la FMO. Utilisez les commandes de la FMO à détecter de possible auto-fluorescence des cellules.
Remarque : En supprimant un anticorps du mélange, n’importe quel niveau de fluorescence détectée dans ce canal est un signal de fond/auto-fluorescente. Donc, en comparant la FMO différent contrôle résultats des FACS, portes peuvent être tirées sur des populations spécifiques, veiller à ce que les soufflets sont basées sur les cellules positives et pas basés sur l’auto-fluorescence. - Tubes vortex les FACS à 800 tr/min avant de les placer dans le cytomètre en flux et commencer la mesure.
NOTE : Un minimum de 50 000 événements dans la porte direct est recommandé pour assurer que suffisamment de cellules est mesurés à partir de chaque sous-population.
Representative Results
Le SVF isolé de la TVA et s’assit a été mesurée par cytométrie en flux. Mesures d’écoulement cytometry génèrent des parcelles montrant différentes populations cellulaires de marqueurs cellulaires (Figure 1 a et 1 b). Tout d’abord, en traçant le forward scatter largeur (FSC-W) et avant dispersion zone (FSC-A), cell agrégats peuvent être éliminées de l’analyse en bloquant les cellules individuelles comme basse FSC-W. Ensuite, direct des cellules sont sélectionnées, et les débris cellulaires sont exclue en bloquant les cellules de la bonne taille et la complexité à l’aide de FSC-côté A et le scatter zone (SSC-A), respectivement. Les cellules mortes sont petits et donc visible comme une population distincte avec un petit FSC.-a. Ensuite, le système immunitaires des cellules ont été sélectionnés par l’utilisation du lanceur pan-leucocyte CD45 (groupe 1 et 2, de la Figure 1 a). Pour analyser les macrophages, les autre immunitaire cellules comme les lymphocytes T (CD3), les lymphocytes B (CD19), neutrophiles (CD66b+ CD11b+), et cellules NK (CD56) ont été exclus d’une analyse plus approfondie en utilisant des anticorps distinctes ciblant ces cellules, mais avec le même fluorochrome. Nouvelle subdivision des cellules restantes reposait sur l’expression CD11b et CD11c. Il en est résulté dans les populations suivantes : CD11b+ CD11c+ macrophages, CD11b+ CD11c CD11b et macrophages– faible /- CD11c+ DCs (panneau de FACS 1, Figure 1 b). La mesure de l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) a permis la quantification de l’expression du CD303 (plasmacytoides DC marqueur) et CD141 (marqueur de DC), sur CD11b+ CD11c+ macrophages et CD11bfaible /- CD11c+ DCs. Expression de ces deux marqueurs étaient plus élevées chez CD11bfaible /- CD11c+ cellules confirmant que CD11bfaible /- CD11c+ cellules étaient DCs (Figure 1).
Le CD45+ cellules (Figure 1 a) ont été divisés en cellules T et cellules B en utilisant le CD3 et CD19, respectivement. Les cellules T ont été subdivisées en lymphocytes T-auxiliaires (CD4+) et les cellules T cytotoxiques (CD8+). Enfin, CD3–CD19–cellules ont été tracées pour quantifier les cellules NK avec le marqueur CD56 (panneau de FACS 2, Figure 1). Le nombre de cellules dans chaque porte est quantifié et peut être utilisé pour calculer le pourcentage de ce type de cellule de toutes les cellules vivantes (tableau 3).
Le pourcentage de cellules vivantes peut être calculé pour chaque sujet, ce qui permet le calcul d’une moyenne de tous les sujets dans un groupe de par exemple maigres ou obèses hommes affichant l’abondance d’une cellule spécifique d’abri, c'est-à-direle CD11b pro-inflammatoires+ CD11c+ macrophage dans AT viscérale (Figure 2).
Figure 1. FACS gating stratégie du tissu adipeux viscéral. (A), FACS terrain de tous les événements (noir) avec intensité de largeur avant dispersion (FSC-W) et l’intensité de zone forward scatter (FSC-A) contenant une porte pour sélectionner seulement monocellules (rouge) suivies d’une parcelle de FACS basées sur FSC-A et sur les côtés en nuages de points XY zone intensité (SSC-A) contenant une grille de sélection des cellules vivantes (vert clair). Tracer ensuite avec SSC-A et de l’intensité de fluorescence CD45 contient un portail sélectionnant CD45 tous+ (immunitaire) cellules (bleu). Terrain (B), FACS de l’intensité de fluorescence CD19, CD3, CD66b et CD56 versus CD11b intensité de fluorescence et une porte en sélectionnant toutes les cellules qui sont CD19, CD3, CD66b et CD56 négatif (brun) pour davantage de division dans les populations. Nouvelle subdivision dans la parcelle suivante basée sur l’intensité de fluorescence CD11b et CD11c. Gates sont affichent contenant CD11b+ CD11c+ macrophages (vert foncé), CD11b+ CD11c macrophages– (violets) et CD11bfaible /- CD11c+ les cellules dendritiques (bleu). (C) montant de CD11b+, CD11c+, ou CD11bfaible /- CD11c+ affichant leurs niveaux d’intensité de fluorescence (axe x) CD303 CD141 et la quantification correspondante de la moyenne des cellules (axe y) intensité de la fluorescence (IFM). (D), FACS intrigue affichant le CD45 précédent+ (bleu) de la population basée sur l’intensité de fluorescence CD3 et CD19 contenant des portes en sélectionnant des T-cellules (magenta), (vert foncé) les lymphocytes B et cellules non auto-fluorescente (vert) négatifs pour les deux CD3 et CD19. L’intrigue suivant est issu des CD4 et CD8 fluorescence avec portes en sélectionnant CD4+ (vert clair) et CD8+ (magenta) T-cellules. Une stratégie de blocage identique est utilisée pour du tissu adipeux sous-cutané. Une stratégie de blocage identique est utilisée pour du tissu adipeux sous-cutané. Ce chiffre a été modifié par Wouters et al. 16 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Obèse TVA contient plus de macrophages pro-inflammatoires. Le montant de CD11b+ CD11c+ macrophages présentés comme pourcentage de toutes les cellules vivantes en TVA des hommes maigres et obèses. Toutes les données sont des moyens ± SEM ; n = 20 pour lean et n = 31 pour les obèses. p ≤ 0,01 vs maigre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Objectif | Cible de définition | Présenter sur | Fluorochrome | Quantité | Clone |
| CD11B | marqueur de l’intégrine myéloïde | granulocytes, monocytes/macrophages, cellules dendritiquesfaible et les cellules tueuses naturelles | BV421 | 2,5 ΜL | ICRF44 |
| CD19 | antigène commun de lymphocytes B | Développement de cellules de b de lymphocytes pro-B à blastoïdes les lymphocytes B et plasmocytes B | FITC | 3 ΜL | HIB19 |
| CD3 | antigène des lymphocytes T commun | Les lymphocytes T, des cellules de T tueuses naturelles et des thymocytes | FITC | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD66B | membre de l’antigène carcino-embryonnaire (CEA)-comme la famille de glycoprotéines | granulocytes | FITC | 5 ΜL | G10F5 |
| CD56 | protéine d’adhésion fortement glycosylée | les cellules NK et les cellules de T de tueur naturels | FITC | 5 ΜL | B159 |
| CD303 | tapez la glycoprotéine transmembranaire II | cellules dendritiques plasmacytoides | PE | 1 ΜL | 201 A |
| CD141 | thrombomoduline | monocytes/macrophagesfaible, sous-population de cellules dendritiques | APC | 1 ΜL | M80 |
| CD11C | J’ai tapez glycoprotéine transmembranaire ; intégrine αx | sous-ensemble de cellules B et T, granulocytes, monocytes/macrophages, cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques | APC-Cy7 | 0,5 ΜL | Bu15 |
| CD45 | antigène leucocytaire commun | tous les leucocytes humains, y compris les lymphocytes, les monocytes, les granulocytes, les éosinophiles et les thymocytes | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| Tampon de FACS | - | - | - | 7,5 µl | - |
Tableau 1. Cocktail d’anticorps FACS panel 1 à identifier les sous-ensembles de macrophages et cellules dendritiques populations. Quantité d’anticorps décrit est pour l’analyse d’un échantillon.
| Objectif | Cible de définition | Présenter sur | Fluorochrome | Quantité | Clone |
| CD19 | antigène commun de lymphocytes B | Développement de cellules de b de lymphocytes pro-B à blastoïdes les lymphocytes B et plasmocytes B | BV421 | 1 ΜL | HIB19 |
| CD3 | antigène des lymphocytes T commun | Les lymphocytes T, des cellules de T tueuses naturelles et des thymocytes | V500 | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD56 | protéine d’adhésion fortement glycosylée | les cellules NK et les cellules de T de tueur naturels | APC | 5 ΜL | HCD56 |
| CD4 | Superfamille des IG, glycoprotéine transmembranaire de type I | T helper cell, thymocytes, monocytes/macrophages, cellules de T tueuses naturelles II de type | PerCP-Cy5.5 | 1 ΜL | L’ARMÉE PATRIOTIQUE RWANDAISE-T4 |
| CD8 | Sous-unité α d’un complexe bimoléculaire disulfure liés | les cellules T cytotoxiques, thymocytes, sous-ensemble de cellules tueuses naturelles | APC-H7 | 2 ΜL | SK1 |
| CD45 | antigène leucocytaire commun | tous les leucocytes humains, y compris les lymphocytes, les monocytes, les granulocytes, les éosinophiles et les thymocytes | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| Tampon de FACS | - | - | - | 10 µl | - |
Le tableau 2. Cocktail d’anticorps FACS panneau 2à identifier les populations de cellules T et B. Quantité d’anticorps décrit est pour l’analyse d’un échantillon.
| Panneau de macrophage | ||
| Nom de la porte | # Cellules | % de vivants |
| Cellules individuelles | 183054 | |
| vivre | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39.13 |
| benne basculante– | 771 | 7.36 |
| CD11c CD11B– + | 430 | 4.1 |
| CD11c+ CD11B+ | 104 | 0.99 |
| CD11c+ CD11Bfaible /- | 15 | 0,14 |
| Panneau de NK-cellules lymphocytes T, lymphocytes B, | ||
| Nom de la porte | #Cells | % de vivants |
| Cellules individuelles | 34616 | |
| Vivre | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42,62 |
| NK-cellules | 29 | 0,78 |
| CD3+ | 953 | 25.56 |
| CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8.8 |
| CD19+ | 20 | 0,54 |
Tableau 3. Abondance des cellules immunitaires de différents types cellulaires en cuve. Nombre de cellules dans chaque porte et le pourcentage des types de cellules différents basés sur le montant total des cellules vivantes.
Discussion
Ces méthodes décrivent comment isoler le SVF de TVA et assis et quantifier les quantités relatives des cellules immunitaires dans ces tissus. En outre, les méthodes indiquent comment déterminer l’expression de marqueurs sur les types spécifiques de cellules.
Cytométrie en flux des cellules immunitaires de tissus est une technique puissante pour phénotype l’État immunologique des tissus. La quantification des cellules immunitaires tissulaires peut avoir de nombreuses applications. Comme décrit dans les résultats, il est possible de comparer la présence de cellules immunitaires spécifiques entre les groupes de patients (p. ex., maigre ou obèse). En outre, en effectuant aussi cytométrie en flux sur le sang des patients mêmes, les associations entre cellules circulantes et les cellules des tissus peuvent être étudiées. Avec cette application, nous avons pu déterminer qu’un sous-ensemble spécifique des monocytes circulants est associé par CD11C pro-inflammatoires+ de macrophages de tissu adipeux16.
Ajustements au protocole décrit accroîtra ses demandes de nombreux anticorps fluorescents disponibles font de cytométrie en flux très polyvalent. Avec différents anticorps se distingués presque tous les types de cellules et l’expression de plusieurs marqueurs peut être détectée. En outre, il est possible de colorer les marqueurs dans les cellules de perméabiliser la membrane cellulaire pour autoriser la liaison intracellulaire des anticorps fluorescents. Ces caractéristiques permettent la distinction des populations très diverses macrophage au-delà les sous-types de macrophage M1 et M2 trop simplifiées. Outre mesure de l’expression du marqueur de surface, les protéines (c.-à-d., cytokines) peuvent être colorés intracellulairement fournissant des informations sur la fonctionnalité de macrophages. En outre, marqueurs de prolifération comme Ki67 servent à quantifier le taux de prolifération. Tel que décrit, distinction entre macrophages et DCs reposait sur les niveaux de l’IFM de marqueurs de DC. Un marqueur de macrophage générales, telles que CD68 peut être incorporé dans le panneau de macrophages (FACS panneau 1). Toutefois, CD68 doit être teinté intracellulairement nécessitant une perméabilisation de la membrane cellulaire qui n’est pas préférable et étendrait le protocole. Autres marqueurs de macrophages sont des marqueurs de sous-ensemble comme CD163 et CD206 ou CD11c, intégré dans le panneau de macrophage présenté ici.
Nos panneaux de FACS, un marqueur pour distinguer les cellules vivantes et mortes n’a pas été inclus, qui serait préférable car elle permet une exclusion plus précise des cellules mortes que l’utilisation du FSC et SSC. Fréquemment utilisés est l’ADN coloration viabilité colorants iodure de propidium (PI) ou 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ainsi que l’amine libre réagissant colorants tels que le LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, qui est disponible en colorant de différentes couleurs. Cependant, PI et DAPI ne peuvent servir pour la fixation des cellules. Comme décrit dans le protocole, la coloration de la viabilité LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell peut être intégrée dans les deux panneaux sans affecter la FACS globale stratégie de blocage.
En outre, les données sont exprimées en pourcentage de cellules vivantes, ce qui signifie que toutes les données sont relatives. Seulement en participant à une exacte, connu nombre de cellules dans le cytomètre en flux, serait-il possible de déterminer le nombre exact de chaque type de cellule. Un nombre approximatif de cellules pourrait être calculé après avoir compté les cellules de la fraction SVF à l’aide d’une chambre de comptage. Toutefois, ce numéro devra être ajustée pour la quantité de tissu biopsie utilisé pour isoler le SVF, mais cela a des limites lorsque l'on compare les maigres d’obèses au. Une masse semblable d’obèse AT consiste moins adipocytes car ils sont remplis de lipides et ont augmenté considérablement. Cela pourrait conduire à une sous-estimation du nombre de cellules immunitaires si présenté comme nombre de cellules immunitaires par gramme d’à ou par les adipocytes.
Dans les études chez l’homme, l’inclusion des patients se faite généralement sur une longue période de temps à faire de la normalisation des procédures expérimentales de grande importance. Pour la comparaison des données de cytométrie de flux entre les patients, il y a plusieurs options. Comme décrit dans le présent protocole, les cellules peuvent être fixés avant la mesure permettant l’analyse de plusieurs échantillons le jour même. Ceci peut être aussi réalisé en gelant le SVF avant leur coloration, qui permet à la procédure de marquage égal entre tous les échantillons, mais la viabilité de cellules peut-être être touchée. Enfin, également employée dans cette étude, sont des perles fluorescentes pour installer des niveaux de rémunération, et cytomètre suivi perles servaient toutes les deux semaines à normaliser les mesures quotidiennes du cytomètre. Cette dernière option est la plus efficace lors de la mesure des échantillons provenant d’une étude s’étendant sur une longue période de temps.
Un facteur limitant pour la cytométrie en flux est en général l’utilisation de la fluorescence. Le nombre d’étiquettes fluorescentes peuvent être mesurées simultanément est limité en raison du chevauchement des spectres d’émission. Cependant, avec développement de panneau de FACS smart et l’utilisation de plusieurs cocktails d’anticorps par TVA ou échantillon sAT, ce problème peut être surmonté comme décrit dans le présent protocole. Un aspect important du développement de panneau de FACS est FMO contrôles. En utilisant les anticorps du panneau sauf un, des niveaux d’autofluorescence potentiels peuvent être appréciés lorsque l'on compare la FMO avec le panneau plein. Cela permet un blocage précis des populations et ces procédures doivent être effectuées lorsque vous configurez un nouveau panneau de FACS. En outre, les nouvelles générations d’appareils FACS peuvent détecter jusqu'à 50 paramètres permettant la détection simultanée de nombreuses caractéristiques par cellule. Une autre question liée à l’aspect de la fluorescence est l’autofluorescence des cellules, notamment les macrophages. Après l’excitation des cellules avec le laser de FACS (principalement avec 488 nm longueur d’onde d’excitation), ces cellules émettent un signal fluorescent (principalement < 640 nm) que peut chevauchement avec les spectres d’émission de l’anticorps étiquettes17,18. Pour expliquer cela, cellules incolores doivent être mesurés afin de déterminer l’autofluorescence dans chaque canal. Sachant cela, il faut choisir fluorochromes qui affichent une puissance du signal qui dépasse le signal auto-fluorescente. Ce signal de fond auto-fluorescente devrait tenir compte lorsqu’il détermine la stratégie de blocage des populations. Donc, par application du présent protocole et de la conception des panneaux intelligente FACS, il est possible d’en sous-types de profondeur phénotype macrophage. Nouveau AT distincte macrophages et leurs fonctions peuvent être caractérisées.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier J. van de RGAÉ et M. Vroomen (Université de Maastricht, Pays-Bas) pour leur soutien technique. En outre, nous tenons à remercier Verboven K., D. Hansen, J. SoFrano, et E. Blaak pour fournir les biopsies de sang et les tissus utilisés pour mettre en place ce protocole et les expériences ultérieures.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
