Summary
이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.
Abstract
Biofilm 형성 박테리아 가혹한 환경 조건 또는 스트레스의 시간에에서 발생 하는 동적, 다단계 프로세스입니다. 장 병원 체에 대 한 상당한 스트레스 응답 위장 운송 중 고 노출 되 면 담 즙, 인간의 소화의 정상적인 구성 요소 유도 된다. 담 즙의 살 균 효과 극복 하기 위해 많은 장 병원 체는 소장을 통해 환승 하는 때 생존을 허용 하도록 가상 biofilm을 형성 합니다. 여기 우리가 고체 상 준수 분석으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 매트릭스 감지 및 시각화를 통해 biofilm 형성을 정의 하는 방법론을 제시. 또한, biofilm 분산 평가 감염 과정에서 박테리아의 릴리스를 실행 하는 이벤트의 분석을 모방 하기 위해 제공 됩니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 높은 처리량 96 잘 접시 준수 분석 결과에서 부착 박테리아를 검출 하는 데 사용 됩니다. EPS 생산 평가 즉 두 분석 실험에 의해 결정 됩니다 현미경 EPS 매트릭스와 붙일 활용 된 다 당 류 바인딩 lectin과 반 정량 분석의 얼룩. 마지막으로, biofilm 분산 식민지 및 도금을 통해 측정 된다. 여러 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 특성화를 지원 하 고 다른 세균성 긴장에 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 식별 하기 위해 이용 될 수 있다.
Introduction
Biofilm 형성은 가혹한 환경 조건 동안 유도 하는 중요 한 세균 생존 전략 이다. 살 균 화합물에 노출 항생제 또는 영양소의 변화 또는 biofilm 형성을 통해 완화 될 수 있다 박테리아에 스트레스 상태를 유도 하는 산소 가용성. biofilm 표면 또는 다른 박테리아에 세균성 부착 특징은 고 류1,2,3의 주로 구성 된 EPS 매트릭스의 분 비를 동반 된다. Biofilm 형성 있는 이벤트의 성숙한 부착 세균성 지역 사회1,2,3의 형성에서 절정 동적 과정 이다. 박테리아 생성 adhesins adhesin 유전자 식 프로필 강화 biofilm 성숙 하는 동안 첨부 파일을 이동 하는 동안 초기 연결을 촉진 하기 위하여. 동시에, EPS 생산 코트 초기 스트레스 로부터 세포를 보호 하기 위해 행렬에서 세균성 지역 사회에 발생 합니다. 박테리아는 biofilm에 포함 된는 느린 성장; 따라서, 대부분의 항생제 효과 렌더링. 또한, 느린 성장 조건 세균성 성장1,2,3를 바꿀 때까지 에너지를 절약 합니다. 가혹한 조건, 통과 후 박테리아는 biofilm를 분산 하 고 planktonic 라이프 스타일1,2,3을 다시 시작. 전통적으로, biofilms 표면에 관찰 하 고 감염 저수지 카 테 터 및 주거에 장치1,2,3에 따른 지속적인 임상 도전 대표.
Biofilm 형성 했다 최근 몇 장 병원 체;에 대 한 설명 작은 창 자 또는 결 장4감염 박테리아. Shigella 종의, 에 대 한 감염 위장의 대부분을 통해 환승 후 인간의 콜론에서 발생합니다. Shigella 담 즙;에 노출 되는 동안 작은 창 자 샛길, 동시에 대부분 박테리아5를 죽이 동안 지질 소화 촉진을 소장으로 분 비 지질 저하 세제. 장 병원 체 담 즙6의 살 균 효과 저항 하는 독특한 능력을가지고. 비보에우리의 최근 분석 활용-포도 당 및 S. flexneri 에서 강력한 biofilm 형성을 설명 하기 위해 담 즙 염의 조합 뿐만 아니라 이질균, 병원 성 대장균및 의 다른 종 처럼 살 모 넬 라4. 이전, 살 모 넬 라 enterica serovar 이다 만성 감염7,,89, 중 담 낭의 독특한 식민지 인 담 즙 유도 biofilm를 표시 했다 10. 브리11및 Campylobacter12 사전 연구 biofilm 형성 담 즙에 대 한 응답에서을 설명 하는 또한. 따라서, 분석 담 즙 유도 biofilm 형성 관찰 다른 병원 체를 확장 하 고 담 즙을 보존된 장 병원 체 응답의 데모를 설치 하는 데 도움이. 달리 만성 biofilms는 세균 유전자 전사 제한 되며 세포 노화1,2,3발생할 수 있습니다, 우리는 장의 담 즙 유도 biofilm 더 자연에 과도 제안 합니다. 이 과도 악성 biofilm (로 분산 분석 결과에 본) 급속 한 분해에 의해 hallmarked 고 독성 유전자 발현 biofilm 인구4,6에서 관찰.
Biofilm 형성은 다각적인 동적 프로세스와 담 즙 염의 사용 시작 요소가 최근 가장 장 병원 체에 대 한 설명 되었습니다만, 도구와 기술을 사용 하는 전통적인 방법의 독특하고 창의적인 응용 프로그램. 따라서, 여기에 제시 된 담 즙 소금 유도 biofilm 형성, 세균 부착, EPS 매트릭스의 생산 및 실행 가능한 박테리아의 분산은 biofilm에서를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 특성을 계량 3 무료 전략 있습니다. 이 기술은 주로 이질균;와 연구에 대 한 이용 되었습니다. 그리고 따라서 다른 장 병원 체의 평가 최적화 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 3 개의 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 식별을 지원 하 고 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜 설정.
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Protocol
1입니다. 시 약의 준비
- 담 즙 염 매체: 준비 하려면 tryptic 간장 국물 (TSB) 0.4% 담 즙 염 (무게/볼륨)를 포함, 50 mL에 담 즙 염의 200 mg resuspend 압력가 TSB. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 매주 신선한 매체를 확인 합니다.
참고: 정기적으로 사용 하는 담 즙 염 나트륨 cholate와 나트륨 deoxycholate 양 및 소 gallbladders에서 고립의 1:1 혼합물 이다. 같이 이전4, 포도의 존재 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 위해 필요 했다. TSB은 Luria Bertani (파운드) 국물; 상대적으로 포도 당을 추가 했습니다. 따라서, 이질균 및 다른 장 병원 체 분석에 biofilm 형성을 유발 하기에 충분 했다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도 당 농도 또는 다른 설탕 요구 사항이 필요할 수 있습니다. - 0.5 물에 %w / v 크리스탈 바이올렛: 2.5 g 크리스탈 바이올렛 500ml 소 주 물에의 해산. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독.
- Fluorescein isothiocyanate (FITC)에 활용 된 Concanavalin A (ConA): 1 x PBS에 재고를 다시 구성 하기. 25 µ g/mL의 최종 농도에 1 x PBS의 400 μ와 10 mg 집중 재고 희석 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
- PBS + 포도 당: 10 mL 1 x PBS (마지막 2 %w / v 포도) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
- PBS + 담 즙 소금: 10 mL 1 x PBS에서 40 mg을 분해 (0.4 %w / v 담 즙 염 최종). 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
- PBS + 포도 당 및 담 즙 소금: 40 mg 담 즙 염과 10 mL 1 x PBS (0.4 %w / v 담 즙 염과 포도 당 2 %w / v 최종) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
- 파운드 한 천 배지를 준비 합니다.
- 포름알데히드/글 수정: 추가 810 µ L 포름알데히드 (37% 재고 솔루션, 최종 농도 3%)와 14 mL 1 x PBS 125 µ L도 (25% 재고 솔루션, 0.25% 최종 농도). 철저 하 게 혼합 하 고 4 ° c.에 저장 수정 프로그램은 적절 한 사용에 대 한 감기 이어야 한다.
주의: 수정 유독 하 고 유해 폐기물 처리를 요구 한다. - Antifade mountant 솔루션: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 포함 하는 antifade mountant 솔루션을 사용 하 여 붙일 박테리아의 DNA를 착 색 하는 동안 immunofluorescent 현미경 샘플의 photobleaching를 억제.
2입니다. 박테리아의 준비
- 메 마른 문화 관에서 단일, 잘 고립 된 식민지와 TSB의 3 mL를 접종 하 여 테스트할 세균성 긴장의 숙박 문화를 성장. 야간 보육 (16-24 h)에 대 한 225 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
참고: 긴장 해야 될 restreaked 냉장고 주식에서 매 2 4 주, 그리고 유지에 접시를 더 2 주 이상.
3. 고체 상 준수 분석 결과
참고:이 분석 결과 96 잘 접시 메서드를 사용 하 여 부착 박테리아 단정. 박테리아는 편평한 바닥 접시에서 정적으로 성장 된다. 세탁 비 점착 박테리아를 제거 하 수행 되 고 부착 박테리아 크리스탈 바이올렛으로 얼룩이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 박테리아 세포 벽에 peptidoglycan 한다 에탄올을 사용 하 여 solubilized 될 수 있습니다. 부착 박테리아의 수는 크리스탈 바이올렛 보존에 따라 결정 됩니다.
- 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + 담 즙 염 (BS)와 레이블을 지정 합니다.
- 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
- 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
- 살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 3 제어 웰 스 (TSB와 TSB + 학사) 테스트를 각 미디어 유형에 대 한 설정.
- 3 웰 스로 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
- 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
- 플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세600 값을 사용할 수 있습니다.
- 배양 접시를 부드럽게 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 매체를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 세균성 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다. 경우 EPS 매트릭스 인큐베이션 기간 동안 제작 되었다, 매트릭스 흰색 침전으로 구상 될 것입니다. EPS 매트릭스를 방해 하지 마십시오.
- 부드럽게 세척 한 번 200 µ L 살 균 PBS와 우물. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
- 접시 건조를 반전. 건조 20 분의 최소를 허용 합니다.
참고: 때문에 biofilm 얼룩이 지기 전에 철저 하 게 건조 해야 합니다, 프로토콜 수 있습니다 몇 시간 동안이 단계에서 일시 중지 된 또는 심지어 하룻밤. 추가 건조 시간 동안 결과 재현성의 정량화에 영향을 미칠 것입니다 불완전 한 건조 얼룩 절차를 변경 되지 않습니다. - 150 µ L의 0.5% 크리스탈 바이올렛 각 실험 하 고 제어를 잘 추가 합니다.
- 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
- 400 µ L의 증류수와 한 번 웰 스 워시. 추가 볼륨 우물의 측면에서 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 제거 하는 데 도움이 됩니다. 진공 라인 세척을 제거 합니다.
- 5 번 증류수 200 µ L로 웰 스 워시. 진공 라인 세척을 제거 합니다.
참고: 철저 한 세척이 정량화에 대 한 중요 합니다. 때 빈 우물에 증류수에서 어떤 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 포함 하지 않습니다, 다음 단계로 진행 합니다. - 빛 으로부터 보호 건조, 접시에 반전. 위에 언급 된 대로 접시의 완전 한 건조 있는지 확인 합니다.
- 95% 에탄올의 200 µ L로 웰 스 destain 30 분 동안 통에 접시를 품 어. 특히 높은 온도에서 증발을 피하기 위해 4 ° c.에이 단계를 수행
- 플레이트 리더를 사용 하 여, OD540기록 합니다.
참고: 크리스탈 바이올렛의 최대 흡 광도 파장은 590 근처 nm. 문학에서 OD540 -OD5954,13,14,,1516 크리스탈 바이올렛 흡 광도;에 대 한 범위를 보고 따라서 파장 사용 가능한 플레이트 리더에 따라 선택 합니다.
4. EPS 매트릭스 검색
참고:이 무료 분석 계량 하 고 EPS를 시각화. 모두에서 EPS 류 바인딩하는 lectin를 사용 하 여 검색 됩니다. 붙일 활용 된 단백질에는 정량화 (4.1 단계) 또는 시각화 (4.2 단계) 수 있습니다.
- EPS의 반 정량적 검출
- 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
- 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
- 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분 희석).
- 살 균, 블랙, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다. 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
- 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
- 피 펫, 이상적으로 멀티 채널 피 펫과 명확한 96 잘 접시에 문화 매체를 전송. 부착 인구 및 플라스틱 표면에 있는 EPS를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 하도록 주의 해야 합니다. 따로 설정 합니다.
- 1 x PBS에 포름알데히드/글의 200 µ L/우물을 사용 하 여 실시간에 15 분 동안 검은 접시를 수정.
- 부착 인구를 수정 하는 동안 단계 4.1.6에서에서 표면에 뜨는 부분을 평가 합니다. 플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험.
- 또는, 전체 분석 결과 검은 분명 바닥판에서 수행할 수 있습니다. 그 상황에서 OD600 값은 기록 될 수 하 고 문화 중간 이후에 4.1.7 단계로 진행 하기 전에 삭제 될 수 있습니다. OD600 값 정규화 데이터를 사용할 수 있는 경우에 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있다.
- 수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.
- 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 부드럽게 접시를 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 워시를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
- 150 µ L/25 µ g/ml ConA FITC, 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
- 부드럽게 PBS의 200 µ L 두 번 씻어.
- 각 우물에 PBS의 150 µ L를 추가 합니다. 488에서 형광 기록 nm.
- EPS 생산 및 biofilm 두께의 계산의 confocal 현미경 시각화
- 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
- 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
- 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
- 라운드 유리 coverslips 살 균 멸 균 24-잘 접시 12 m m를 설정 합니다. 3 웰 스 빈 컨트롤 역할을 uninoculated 제어 미디어의 400 µ L/잘 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.
- 중복, 웰 스에 접종 문화의 400 µ L을 추가 하 고 모든 실험 조건 도금 될 때까지 반복.
- 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
- 시각적으로 TSB 조건, 성장 및 EPS 침전 (흰색)는 TSB에 + 학사 조건, 성장 그리고 어떠한 성장/살 균 제어 우물에 흰 침전 또는 확인 합니다. supernatants 제거 합니다.
- 1 x PBS에 포름알데히드/도 솔루션의 200 µ L/잘을 사용 하 여 실시간에 15 분에 대 한 수정.
- 수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.
- 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
- 150 µ L/25 µ g/mL ConA FITC의 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
- 부드럽게 PBS의 200 µ L/잘 두 번 씻어.
- DAPI antifade mountant 솔루션을 탑재 합니다.
참고: 솔루션 DAPI 하면서 동시에 counterstain으로 시각화를 위한 세균성 세포에서 DNA를 얼룩이 지기 형광 라벨을 보존 하기를 위한 포함 된 기성 품, 글리세롤 기반 마운트 솔루션이입니다. 이미징 샘플 전에 부 화 시간에 대 한 키트의 지침 및 권장 사항을 따릅니다. 절차를 얼룩 DAPI DAPI를 포함 하지 않는 antifade mountant 솔루션을 적용 하기 전에 수행할 수 있습니다. - Confocal 현미경 검사 법으로 평가 합니다. Confocal 현미경에 레이저 495 nm/519 nm 여기/방출 FITC 시각화에 대 한 설정. 두 번째 레이저 360 nm/460 nm 여기/방출 DAPI 시각화를 설정 합니다. DAPI 채널에 초점을 맞춤 으로써는 biofilm를 찾습니다. DAPI와 FITC 채널을 사용 하 여 전체 두께 결정 하 고 상단을 설정 하 고 낮은 테두리를 이미징. 기록 전체 두께 Z 스택 이미지 이미지를 포착 하 여 모든 0.25 µ m z-스택의 위아래에 경계를 설정 후. 에 대 한 자세한 내용은 confocal 현미경 검사 법를 참조 하십시오 게시에 의해 목장 외. 17 , 18 , 19 , 20
- ImageJ 전체 biofilm 형성을 시각화 하 고 계산 하는 biofilm 두께 (https://imagej.nih.gov/ij/)에서 3D 이미지를 재구성 합니다. S. flexneri 담 즙 소금 유도 biofilms 취득 평균 두께 14 µ m4이었다.
5. 분산 분석 결과
참고:이 분석 결과에서 세균 분산 통해 biofilm의 분해는 감지 됩니다. 여기, 성숙한 biofilms는 설립 하 고 이후 (보통 다음날), 미디어 PBS로 대체 또는 보완 PBS. 표면에 뜨는 구성 요소는 다음에 biofilm에서 해리는 박테리아의 수를 quantitate에 평가 됩니다.
- 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
- 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
- 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
- 살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 미디어 유형에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.
- 3 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
- 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 접시를 정적으로 품 어.
- 계속 하기 전에 따뜻한 PBS, PBS + 포도 당, PBS + 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + 포도 당 37 ° c 이 시 약의 신선한 매일을 준비 합니다.
- 플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 하는 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세600 값을 사용할 수 있습니다.
- 진공 라인을 사용 하 여 문화 매체를 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다.
- 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
- 3 우물에 다음의 130 µ L/잘 씻어 바꿉니다: PBS, PBS 포도 당, PBS 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + + 포도 당. 이 시 약 37 ° c에 미리 데워 되어야 합니다.
- 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 품 어
- 37 ° C 배양 기에서 접시를 조심 스럽게 제거. 신선 하 고 살 균 96 잘 접시는 supernatants 전송.
- 10 배 준비 96 잘 접시 또는 희석 블록을 사용 하 여 (1:10) 살 균 PBS에는 상쾌한의 직렬 희석.
참고: 희석 시리즈 undiluted에서 테스트할 세균성 긴장에 따라 10-6 다양 해야 합니다. 파일럿 실험 최적의 희석 범위를 결정 하기 위해 수행할 수 있습니다. - 플레이트 5 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 파운드 agar에 각 희석의 자리. 37 ° C에서 밤새 품 어. 복구 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 결정할 때 다음 날, 희석 비율에 대 한 계정에 식민지를 계산. X (100% 설정) PBS 제어 1 기준으로 백분율 분산을 계산 하려면 각 치료 조건에서 1 x PBS 컨트롤 샘플에서 CFU 복구에 의해 복구 CFU 나눕니다.
참고: 루틴 미디어 판 관심의 세균성 긴장에 대 한 사용할 수도 있습니다. 예를 들어 Shigella 콩고 레드 플레이트에 도금 될 수 있습니다. 플레이트는 적절 한 자리-도금 기술에 대 한 건조를 확인 하십시오.
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Representative Results
그림 1, biofilm 형성 성장의 대부분 6 장 병원 체 테스트 된 다음 담 즙 염을 포함 하는 미디어에서에서 유도 된다. 담 즙 염 노출은 거의 모든 긴장에서 관찰 후 부착 박테리아에 상당한 증가 테스트 합니다. 예외는 enteroaggregative 대장균 (EAEC); 그러나 , Δ4aaf 돌연변이 유발된 관찰 주의. 결과 표시 추가 부착 메커니즘 aggregative 준수 fimbriae의 부재에서 EAEC에서 담 즙 염 노출에 의해 유도 된다 난 (AAF / 난)21. 이 데이터 집합에서 결론, 각 스트레인 및 미디어 유형에 대 한 OD540 값 플롯 테스트. 미디어 컨트롤에서 각 스트레인 값 비교 (-학사) 미디어 상대적인 경우 담 즙 염 크게 biofilm의 형성을 유발 결정할 것입니다 포함 된 담 즙 소금. 세균성 긴장 및 돌연변이 걸쳐 비교 추가 특성 분석에 대 한 수행할 수 있습니다.
EPS의 ConA FITC 평가 그림 2에 표시 됩니다. 그림 2A ConA FITC는 biofilms 얼룩을 사용 하는 EPS 생산의 반 정량적 평가 나타냅니다. ConA EPS 매트릭스에 류 하 한다 유지 금액 형광 플레이트 리더에 의해 검출 된다. 데이터 제시, 각 조건에 대 한 평균 형광 단위를 플롯 하 고 부정적인 컨트롤에 biofilm 유도 조건을 비교. 또한, 세균성 긴장 또는 돌연변이 비교를 수행할 수 있습니다. 그것은 배경 접시 발생 ConA FITC 형광의 양을 결정 하는 미디어 전용, 부정적인 컨트롤을 분석 하는 중요 한. TSB 조건이 크게 다른 형광 판독 크게 증가 다음 담 즙 염 노출 하면서 미디어 제어, 아니었다. 데이터는 EPS 생산 biofilm 형성의 지표로 S. flexneri담 즙 염의 부재에서 발생 하지 않습니다 확인 합니다. S. flexneri 에서 담 즙 소금 유도 biofilms의 이미지는 그림 2B. 에 표시 ConA FITC DAPI counterstain DNA 얼룩으로 박테리아를 시각화 하는 데 사용 하는 동안 류 EPS 매트릭스에 얼룩 사용 됩니다. 담 즙 염 (부정적인 컨트롤)에 노출 되지 박테리아, DAPI만 검색 됩니다. 특히, 박테리아의 밀도 담 즙 염 상태에서 보다 훨씬 낮습니다. FITC 채널에 분명 배경 EPS 생산의 부족을 나타내는 얻을 수 있습니다. 예상 했던 대로, 데이터 EPS 생산 biofilm 형성1,2,3 담 즙 염 노출 다음에 연관 보여줍니다. 담 즙 소금 치료 샘플에서 제어 얼룩-ConA FITC 형광의 특이성을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 이러한 이미지에 대 한 1 x PBS ConA FITC 대신 사용 되었다 고 DAPI counterstain 유지 되었다. 이미지는 EPS 긍정적인 샘플4biofilms의 두께 평가 하기 위해 confocal 현미경으로 수행할 수 있습니다.
그림 3 에 biofilms에서 세균성 분산 잠복기 설립된 biofilms PBS 또는 보충된 PBS에 의해 감지 됩니다. 순수, 담 즙은 소장에 있는 순환으로 재흡수 하 고 담 즙의 5%만 입력 콜론5. 우리는 가설 Shigella 침공 장 상피로 담 즙의 재흡수 biofilm 분산에 대 한 중요 한 신호 이다. 이 그림에서 분산 biofilms PBS 또는 PBS + 포도 당; 노출에서 발생 그러나, 분산은 PBS + 포도 당의 존재에 담 즙 염에 저해 된다. 데이터 담 즙 염의 제거는 필요 하 고 충분 한 담 즙 소금 유도 biofilms4 S. flexneri 의 분산을 유도 하는 방법을 보여 줍니다. 데이터를, 박테리아의 복구 된 CFU 또는 상대 % 컨트롤 (다음과 같이)에 그릴 수 있습니다.
그림 1: 장 병원 체의 biofilm 형성을 유발 하는 담 즙 소금. 18 h biofilms TSB 또는 TSB + 0.4% 담 즙 염 미디어 치료 조직 문화 96 잘 접시에 성장 하 고 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 물 했다. 크리스탈 바이올렛 얼룩의 에탄올 가용 화 양적 값 OD540에서 분 광 광도 법에 의해 결정 했다. 담 즙 염 노출 크게 증가 Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic에서 biofilm 형성 대장균, 살 모 넬 라 enterica serovar 이다, 그리고 serovar S. enterica Typhimurium. 통계적 의미는 미디어 제어를 담 즙 염 치료 비교 각 변형에 대 한 스튜던트 T-검정에 의해 결정 되었다. 평균 (SEM)의 표준 오차 오차 막대 표시 됩니다. 모든 p-값은 < 0.0001. 하나는 데이터 표시 (n = 3) 이전 게시4에서 제공 하는 데이터의 완전 한 세트와 함께 대표적인 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 Concanavalin a FITC 표시 된 감지 되는 EPS 매트릭스의 생산 특징 이다 (A) 멸 균 검정, 96-잘 접시 1시 50분에 S. flexneri 와 시드 했다 TSB 또는 TSB + 담 즙 염에 희석 성장 18 헤 Biofilms 부드럽게 세척 하 고와 스테인드 ConA FITC 고정 했다. 유지 Concanavalin-A FITC 양의 형광 플레이트 리더에 의해 결정 되었다. 표시 값 EPS 정량화를 S. flexneri TSB 또는 TSB 포함 된 담 즙 소금에서의 성장에 따라 보여 줍니다. 의미는 일방통행 ANOVA에 의해 결정 되었다 및 p-값은 < 0.01. SEM은 오차 막대에 의해 표시 됩니다. 하나는 데이터 표시 (n = 3) 이전 게시4에서 제공 하는 데이터의 완전 한 세트와 함께 대표적인 실험. (B) 현미경 담 즙 소금 유도 Shigella biofilm에서 이미지. 메 마른 coverslips에 1시 50분 S. flexneri 와 시드 했다 TSB 또는 TSB + 담 즙 염에 희석 18 h에 대 한 성장. coverslips 했다 이후 고정 ConA FITC 물 및/또는 DAPI와 counterstained. ConA FITC만 EPS 매트릭스의 존재로 인해 담 즙 염 상태에서 발견 되었다. DAPI에서 TSB + 담 즙 염 치료로만 얼룩진 coverslip confocal 현미경에 FITC 설정에 대 한 최소한의 배경 형광을 설명 하기 위해 사용 되었다. 각 파장 채널 복합 오버레이 대 한 이미지는 모든 치료 조건에 대 한 제공 됩니다. 눈금 막대 표시 10 µ m. 표시 되는 데이터는 하나에서 (n = 3) 이전 게시4에서 제공 하는 데이터의 완전 한 세트와 함께 대표적인 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 담 즙 소금 유도 biofilms에서 세균성 분산 분석. 담 즙 소금 유도 18 h Shigella flexneri biofilms PBS 또는 포도 당, 담 즙 염, 또는 포도 당 및 담 즙 염의 조합으로 보충 하는 PBS에 노출 됐다. 상쾌한 이후에 순차적으로 희석 고 단위 (CFUs) 분산에서 biofilm을 형성 하는 식민지를 열거 한 천 판에 도금. 복구 하는 박테리아의 수는 PBS 컨트롤에 상대적인 플롯 이었다. 박테리아는 PBS 또는 PBS + 포도 당에 biofilm에서 분산 조건, 하지만 담 즙 염의 존재는 biofilm에서 세균성 분산을 억제 하기에 충분 했다. 하나는 데이터 표시 (n = 3) 이전 게시4에서 제공 하는 데이터의 완전 한 세트와 함께 대표적인 실험. 참고로, 100 더 많은 박테리아 PBS + 담 즙 염 치료 (약 7 × 105 CFU)에 비해 PBS 제어 치료 (약 7 × 107 CFU)에서 정기적으로 발견 했다. 의미는 일방통행 ANOVA에 의해 결정 되었다 및 p-값은 < 0.0001. SEM은 오차 막대에 의해 표시 됩니다.
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Discussion
Biofilm 형성 분석 biofilms 그리고 긴장, 재료, 실험실, 및 분석 실험 사이 가변성의 동적 특성으로 인해 도전 이다. 여기 몇 가지 전략 biofilm 형성 재현성을 홍보를 제공 하는 실험적인 통찰력으로 담 즙 염 노출 다음 장 병원 체에서를 확인 하 되 게 됩니다. 재현성을 보장 하기 위해 추가 고려 사항이 있습니다. 맨먼저, 각각 관찰과 발생할 수 있는 변이 때문에 통계적 의미를 확인 하려면 기술 triplicates 실험의 적어도 3 개의 독립적인 수행 하는 것이 좋습니다. 둘째, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 사용 분석 결과의 재현성을 지키기에 생명 이다. 그것은 매우 biofilm 형성에 대 한 돌연변이 평가할 때 긍정적인 제어로 강포한 유형 긴장을 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한, biofilm 형성에 중요 한 유전자 식별 됩니다 (예를 들어 참조22 비 브리 오, 살 모 넬 라7, 그리고 대장균23,,2425)의 사용 네거티브 컨트롤로 biofilm 돌연변이 분석 결과의 재현성을 확인 합니다. 셋째, 위의 방법은 특히 Shigella 와 S. flexneri 집중된 연구에 근거한 다. 프로토콜에 조정 평가 각 장 병원 체의 성장 요구에 따라 필요할 수 있습니다. 넷째,는 분석 실험 측정 세균성 긴장 응답; 그리고 그러므로, 냉동된 주식 (-80 ° C) 또는 더 이상 2 주 동안 냉장 (최대 4 ° C)에서 보관 스토리지 접시에서 적절 하 게 유지 박테리아와 함께 작동 하도록 긴요 하다. 일부 박테리아 Yersinia 속에 장 병원 체를 포함 하 여 0 ° C26에 가까운 온도에서 성장할 수 있는 psychrotrophs는 중요 하다. 이후 냉장된 온도에서 저장 세균 생리학을 변경 하 고 genotypic에서 발생할 수 있습니다 또는 phenotypic 교대27,,2829, 것이 좋습니다의 aliquots를 준비 하는 주식 초보 문화에 일상적인 접종-80 ° C에서 문화. 또한, 임상 분리 작업 필요-80 ° C 주식에서 더 자주 restreaks30,31 설정 실험실에 임상으로 파생 된 세균성 긴장을 전환할 때 유전 교대 빠르게 관찰 . 격리 Shigella 특히 작업, 긴장은 급속 하 게 적응 및 형 교대3332,자주 발생. 일단 한 달, 그리고 restreak는 주식 접시 마다 2 주 냉장고 주식에서 restreak 박테리아에 추천 된다.
재현성을 보장 하기 위해 또 다른 중요 한 요소는 분석 결과의 다양성을 제한 하는 담 즙 염 미디어의 신선한 준비 합니다. 담 즙 염 미디어 1 주일 보다 오래 된 부정적인 신선한 미디어 준비과 관찰 하는 강력한 표현 형에 영향을. 또한, 병원 체와 노출 수 분석된 (소장 결 장 대)의 종류에 따라 다른 소스와 담 즙 염의 혼합물 필요할 수 있습니다. 예를 들어 개별 담 즙 염, 활용 및 드 소스, 활용 또는 콜레스테롤과 빌리 루빈이 있을 수 있습니다와 같은 추가 담 즙 구성 요소를 포함 하는 원유 담 즙 추출 물 활용5,6. Shigella 분석 콜론에 감염 전에 소장의 운송 중 호스트에 세균성 적응에 집중 했다. 따라서, cholate 및 deoxycholate 혼합물의 사용 조건 소장5,,634의 모방. 또한 분산 분석 결과 (5 절)에 관해서는 그것은 PBS 보충 시 약 매일 신선한 만든 하 고 37 ° C 이전에 시험을 미리 예 열 하는 지정 됩니다. 시 약 몇 일 보다 오래 된 사용 된 경우 분석 결과의 재현성 심각 하 게 손상 되었다. 그것은 또한 분산 실내 온도 약으로 쉽게 발생 하지 않은 37 ° C에이 시 약을 미리 따뜻한 중요 한. 마지막으로,는 biofilm의 완전 한 titer 열거의 평가 위한 분산 방법은 사용할 수 있습니다, 쥡니다35,36 또는 효소 소화37를 포함 하는. 분산 분석 결과에 대 한 접근은 Shigella 이동 터미널 회장에서 고 결에로 담 즙 소금 재흡수의 효과 평가 하는 방향으로 지시 했다. 담 즙 염 손실 과도 biofilm의 분산을 활성화 것 그리고 Shigella 저 승 상피4,5에에서 감염을 일으키는 이전 biofilm를 분산 해야 합니다 가설 기반 분석 . 여기에 제시 된 전략 에뮬레이션 이질균에 대 한 생리 적 표현 형을 잡으려고 콜론 전환 회장 하는 동안 쥡니다 등 효소 소화 조건에 biofilm에서 미생물 집단의 전체 릴리스를 나타냅니다. 원하는 실험 조건에 따라 분산 분석 또는 biofilm 열거형에 대 한 추가 방법 필요할 수 있습니다.
분석 실험 알맞게 여러 개의 세균성 긴장의 조건 테스트 있도록 96 잘 접시의 사용으로 높은 처리량을 되도록 설계 되었습니다. 더 biofilm 형성의 재현성을 보장 하기 위해, 플랫, 96-잘 접시 조직 문화 취급 했다 사용 되었다. 기술적인 이유로 판 독자 흡 광도 또는 형광 라운드 하단 플레이트에 정확 하 게 측정할 수 없습니다. 또한, 코팅된 판 이질균, 현재 조사의 가로에 가변 준수 프로필 제공. 분석 실험 비례, 더 큰 잘 포맷 조절 될 수 있습니다 하지만 실험의 효율성을 줄일 수 있는 프로토콜을 변경 해야 합니다. 예를 들어 문화 미디어는 분 광 광도 계와 OD600 값을 기록 하는 큐 벳을 전송 해야 합니다. 크리스탈 바이올렛 스테인드 biofilm를 긁어 수 있습니다 또한, 다음 95% 에탄올에 30-60 분 인큐베이션 단계 destain와 내용을 OD540에서 분 광 광도 계 판독을 위한 베트로 옮겨질 수 있다. 주의 해야 합니다 각 잘에서 biofilm의 내용을 폐기 하는 때, splashing 피하기 위해 그리고 우리는 60 분 부 화에 따라 쉽게은 폐기 발견 했다.
분석과 이질균, 살 모 넬 라, 병원 성 대장균4 시연 biofilm 형성 장 병원 체 담 즙 염에 노출에 대 한 (24 시간) 이내 가속된 시간 규모에서 발생 하는 반복된 관찰. 48 ~ 72 h 정상적인 조건 하에서 biofilm 형성을 관찰 하는 것 필요로 하는 다른 박테리아, 반대로 담 즙 소금 유도 장 biofilm 초기 부착 단계 4 h 일찍 시작 합니다. 그 후, EPS 매트릭스 형성 6 h, 분명 이며 성숙 24 h에 의해 발생 합니다. 따라서, 24 h에 준수 형 너무 강력한 해독 biofilm 형성에 다른 준수 요인의 역할을 수 있습니다. 초기 분석을 수행 예 4-h, 일찍 수 있습니다 요인의 식별을 위해 그렇지 않으면 나중 시간에 놓친 것이 초기 biofilm 형성에 중요 한. 마지막으로, 그리고 프로토콜 단계에서 위에서 언급 한 이질균 에 대 한 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 하지 포도 당4의 부재에서 발견 되었다. EPS 매트릭스 류 주로 이루어져 있기 때문에 대부분 박테리아38biofilm 형성에 중요 한 단계, 포도 당 또는 미디어에서 다른 설탕의 존재 가능성이 높습니다 biofilm 형성을 관찰 하는 것이 중요입니다. 분석 하는 세균성 병원 체에 따라 다른 기본 미디어 공식 필요할 수 있습니다.
Biofilm 형성 영양소 플럭스 및 움직임 쉽게 발생1,2,3개방형 시스템에서 자주 발생 하는 다층된 과정 이다. 메서드는 닫힌된 문화 및 정적 성장 요구;에 의해 제한 됩니다. 그러나, 방법 실험실 설정에서 biofilm 형성의 평가 가능 Biofilm 표현 형의 식별, 따라 추가 실험 유체 세포 또는 연속 문화 전략39를 사용 하 여,,4041 수 있습니다 통찰력을 제공할 추가 기계 생리 적 또는 임상 biofilm 형성의 중요성입니다. EPS 매트릭스의 식별을 위해 프로토콜 다 당 류-바인딩 lectin ConA 사용합니다. ConA α-D-glucosyl 또는 sterically-밀접 하 게 관련 된 잔류물42바인딩합니다. 다른 lectins EPS 다른 속 또는 종에 대 한 생산의 종류에 따라 필요할 수 있습니다. EPS 생산을 식별 하는 대체 전략이 이다 질량 분석, EPS는 생성 하 고 EPS 매트릭스43,44의 구성 결정 모두 확인을 제공 합니다. 또한, 상당한 밝기는 biofilm 또는 EPS 매트릭스45,46에 종종 있는 extracellular DNA의 발생에 있는 박테리아의 수를 주어진 DAPI counterstain 사용 하 여 발생할 수 있습니다.
문학에서 설명 하는 위의 방법에 대 한 대안을 확인 하 고 있습니다. 예를 들어 고체 상 바인딩 분석 결과 다른 병원 체 (예를 들어 참조4,25,47,,4849)에 사용 하기 위해 보고 되었다. 간행물; 사이 프로토콜에 대 한 수정이 있다 그리고 그러므로, 여기에 제시 된 전략은 쉽게 복제 형식. 그것은 프로토콜 공기 biofilms biofilms를 해결 하기 위해 선호 하는 일부 그룹 동안 (3.10 단계)를 얼룩이 지기 전에 지정 해야 합니다. 두 가지 다른 방법 병원 체 관련 전략 변화를 나타낼 수 있습니다. 또한, 물에 크리스탈 바이올렛 얼룩을 준비 하 여 일관 된 biofilm 형성 표현 형이 검색 되었습니다. 다른 그룹 사용 하 여 에탄올 solubilize 크리스탈 바이올렛; 이질균 에 있는 biofilms의 불안정을 주도하 고 재현성을 손상. 우리가 현재 에탄올 Shigella biofilm에 용 해 될 수 있는 요소를 조사 하고있다. 또 다른 예는 ConA 얼룩으로 EPS 생산의 정량화. 96 잘 접시 형광 검출 방식 (4.1 단계)는 FITC 활용 ConA 바인딩 하는 biofilm의 양을 반영 하는 반 정량 값을 결정 하 여. 우리의 지식, 방법은 처음으로이 전략은 보고 되었습니다. 현미경 검사를 통해 EPS 탐지 문학에서 허용 하 고 EPS를 시각화 하는 무료, 하지만 다른, 전략에 대 한 수 있습니다. EPS의 confocal 현미경 탐지와 결합 하 여 반 정량적 형광 탐지는 확실히 특히 DAPI counterstain 절차의 한계 위에서 설명한 현미경 분석에서 주어진 데이터를 강화 했다. 여기서 설명 하는 분석 실험의 세트에 상당한 강도 각 기술 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 장 병원 체에서의 동적 평가 위해 또 다른 방법은 보완입니다.
이러한 메서드를 모델의 유효성을 검사, 특정 유전자의 역할 하 고, 알 수 없는 함수, 유전자를 식별 하 고 제공를 사용 하 게 될 예상 된다 담 즙 염과 악성 biofilms는 장의 세균 병 인의 패러다임으로 통합 하 고, 임상 긴장의의 일반적인 특성화 이 다각적인 접근 허용 손실 될 수 있습니다 한 번 성숙한 biofilm biofilm 형성의 한 측면에서 중요 한 유전자의 식별, 따라서의 각 세균성 구성의 전문 기능 식별 가능 하 게 설정 되는 biofilm입니다. 또한, 분명 인간의 대 장 내의 병원 체 적응은 빠르게 발생 현상, 사실에 의해 담 즙 소금 유도 biofilm 형성의 역할은 에서 발생 하는 새로 평가, 보존, 및 중요 한 현상의 예 Shigella 추가 장 병원 체로 감염.
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Disclosures
저자 아무 공개 있다.
Acknowledgments
우리 기술 지원에 대 한 레이첼 B. Chanin와 알 레 한 드 야 노스 Chea 감사합니다. 우리가이 연구에 사용 된 긴장에 대 한 앤서니 T. Maurelli, 브라이언 P. 헐리, 알 레 파 사노, 브렛 E. Swierczewski, 그리고 바비 Cherayil 감사 합니다. 이 작품은 알레르기의 국가 학회 및 감염 질환 그랜트 K22AI104755 (C.S.F.)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
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