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Immunology and Infection

पित्त नमक-प्रेरित-प्रवेश रोगजनकों में फिल्म गठन: पहचान और ठहराव के लिए तकनीक

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

इस प्रोटोकॉल को सक्षम बनाता है पाठक पित्त नमक का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जीवाणुओं की गतिशील प्रकृति पर कब्जा रोगजनकों में-प्रेरित फिल्म गठन के पालन का आकलन, extracellular बहुलक पदार्थ मैट्रिक्स गठन द्वारा बैक्टीरिया की फिल्म, और फैलाव ।

Abstract

फिल्म निर्माण एक गतिशील, multistage प्रक्रिया है कि कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों या तनाव के समय के तहत बैक्टीरिया में होता है । के लिए प्रवेश रोगजनकों, एक महत्वपूर्ण तनाव प्रतिक्रिया जठरांत्र पारगमन के दौरान और पित्त जोखिम पर प्रेरित है, मानव पाचन का एक सामांय घटक । पित्त के जीवाणुनाशक प्रभाव को दूर करने के लिए, कई प्रवेश रोगजनकों एक फिल्म फार्म का अस्तित्व जब छोटी आंत के माध्यम से पारगमन की अनुमति के लिए परिकल्पना की । यहां हम वर्तमान के तरीके ठोस चरण पालन परख के रूप में के रूप में अच्छी तरह से extracellular बहुलक पदार्थ (EPS) मैट्रिक्स का पता लगाने और दृश्य के माध्यम से फिल्म निर्माण को परिभाषित करने के लिए । इसके अलावा, फिल्म फैलाव आकलन संक्रमण की प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया की रिहाई को ट्रिगर घटनाओं के विश्लेषण की नकल करने के लिए प्रस्तुत किया है । क्रिस्टल वायलेट धुंधला एक उच्च प्रवाह ९६-अच्छी तरह से थाली पालन परख में अनुयाई बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । eps उत्पादन मूल्यांकन दो परख, अर्थात् EPS मैट्रिक्स और अर्द्ध एक फ्लोरोसेंट-संयुग्मित polysaccharide बंधन लेक्टिन के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के माइक्रोस्कोपी धुंधला द्वारा निर्धारित किया जाता है । अंत में, फिल्म फैलाव के माध्यम से मापा जाता है कॉलोनी गिनती और चढ़ाना । एकाधिक परख से सकारात्मक डेटा का समर्थन करता है और फिल्म के लक्षण वर्णन के लिए पित्त नमक की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है-प्रेरित अंय जीवाणु उपभेदों में फिल्म निर्माण ।

Introduction

फिल्म निर्माण एक महत्वपूर्ण जीवाणु अस्तित्व कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों के दौरान प्रेरित रणनीति है । एंटीबायोटिक दवाओं या पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की उपलब्धता में परिवर्तन की तरह जीवाणुनाशक यौगिकों के संपर्क बैक्टीरिया है कि जैव फिल्म गठन के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है में एक तनाव राज्य लाती है । एक फिल्म एक सतह या अंय बैक्टीरिया को बैक्टीरियल लगाव की विशेषता है और एक EPS मैट्रिक्स के स्राव के साथ मुख्य रूप से polysaccharides1,2,3से बना है । फिल्म निर्माण एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें घटनाओं का झरना एक परिपक्व अनुयाई बैक्टीरियल समुदाय1,2,3के गठन में समापन । बैक्टीरिया adhesins उत्पादन के लिए जल्दी लगाव की सुविधा जबकि adhesin जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल स्थानांतरण के लिए फिल्म परिपक्वता के दौरान लगाव को मजबूत । इसके साथ ही, EPS उत्पादन के लिए एक मैट्रिक्स में जीवाणु समुदाय के लिए प्रारंभिक तनाव से कोशिकाओं की रक्षा कोट होता है । इस फिल्म के भीतर निहित बैक्टीरिया धीमी गति से बढ़ रहे हैं; और इस तरह के रूप में, renders सबसे एंटीबायोटिक दवाओं अप्रभावी । इसके अलावा, धीमी गति से विकास ऊर्जा को संरक्षित रखता है जब तक शर्तों को बदलने के लिए बैक्टीरियल विकास1,2,3एहसान । कठोर स्थितियों के बीत जाने के बाद, जीवाणुओं को विसर्जित करना और एक planktonic जीवनशैली1,2,3को फिर से शुरू करना । परंपरागत रूप से, फिल्मों पर मनाया जाता है और एक लगातार नैदानिक चुनौती कैथेटर और में आवास उपकरणों1,2,3पर मौजूद संक्रमण जलाशयों की वजह से प्रतिनिधित्व करते हैं ।

हाल ही में कई प्रवेश रोगजनकों के लिए फिल्म निर्माण का वर्णन किया गया; बैक्टीरिया है कि छोटी आंत या4बृहदांत्र संक्रमित । शिगेला प्रजातियों के लिए, संक्रमण जठरांत्र संबंधी मार्ग के बहुमत के माध्यम से एक पारगमन के बाद मानव बृहदांत्र में होता है । छोटी आंत के माध्यम से पारित होने के दौरान, शिगेला पित्त के संपर्क में है; एक लिपिड अपमानजनक डिटर्जेंट लिपिड के पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए आंत में स्रावित जबकि एक साथ सबसे अधिक बैक्टीरिया की हत्या5. प्रवेश रोगजनकों पित्त की जीवाणुनाशक प्रभाव का विरोध करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता है6. हमारे हाल ही में vivo-ग्लूकोज और पित्त लवण की तरह संयोजन में एस. flexneri के साथ ही शिगेला, रोगजनक ई कोलाईकी अंय प्रजातियों में मजबूत फिल्म गठन का प्रदर्शन विश्लेषण का उपयोग किया है, और साल्मोनेला4. इससे पहले, साल्मोनेला enterica serovar Typhi जीर्ण संक्रमण के दौरान पित्ताशय की थैली के अद्वितीय औपनिवेशीकरण के कारण एक पित्त प्रेरित सी फिल्म बनाने के लिए दिखाया गया था7,8,9, 10. इसके अतिरिक्त, Vibrio11और कैम्पिलोबैक्टर12 के साथ पूर्व अनुसंधान पित्त के जवाब में एक फिल्म के गठन का प्रदर्शन किया । इसलिए, विश्लेषण पित्त प्रेरित-फिल्म गठन की टिप्पणियों को अन्य रोगजनकों के लिए विस्तारित और पित्त के लिए एक संरक्षित रोगजनक प्रतिक्रिया के प्रदर्शन को स्थापित करने में मदद । पुरानी सी के विपरीत फिल्म है जिसमें बैक्टीरियल जीन प्रतिलेखन सीमित है और कोशिका वार्धक्य हो सकता है1,2,3, हम प्रस्ताव है कि प्रवेश पित्त प्रेरित-फिल्म प्रकृति में अधिक क्षणिक है । यह क्षणिक, विषमय फिल्म एक तेजी से विधानसभा द्वारा की पहचान की है (के रूप में फैलाव परख में देखा) और बढ़ाया डाह जीन अभिव्यक्ति में कहा गया है कि फिल्म की जनसंख्या4,6। 

के रूप में फिल्म निर्माण एक बहुमुखी, गतिशील प्रक्रिया है और एक शुरुआत कारक के रूप में पित्त लवण का उपयोग केवल हाल ही में सबसे प्रवेश रोगजनकों के लिए वर्णित किया गया है, उपकरण और इस्तेमाल तकनीक पारंपरिक तरीकों के अद्वितीय और रचनात्मक अनुप्रयोगों रहे हैं । इस प्रकार, यहां प्रस्तुत तीन मानार्थ रणनीति पित्त नमक के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं, बैक्टीरियल पालन, EPS मैट्रिक्स का उत्पादन, और इस फिल्म से व्यवहार्य जीवाणुओं के फैलाव सहित प्रेरित फिल्म गठन, कर रहे हैं । इन तकनीकों को मुख्य रूप से शिगेलाके साथ अनुसंधान के लिए उपयोग किया गया है; और इसलिए, अंय दर्जी रोगजनकों के मूल्यांकन अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, सभी तीन परख से सकारात्मक डेटा का समर्थन करता है और फिल्म की पहचान के लिए reproducible प्रोटोकॉल स्थापित पित्त नमक प्रेरित-फिल्म गठन ।

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Protocol

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. पित्त लवण मध्यम: tryptic सोया शोरबा (TSB) युक्त ०.४% पित्त लवण (वजन मात्रा) को तैयार करने के लिए, reसस्पेंड २०० मिलीग्राम ५० मिलीलीटर autoclaved TSB में पित्त लवण । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर. ताजा मध्यम साप्ताहिक बनाओ ।
    नोट: पित्त लवण नियमित रूप से इस्तेमाल किया ovine और गोजातीय gallbladders से पृथक सोडियम cholate और सोडियम deoxycholate का एक 1:1 मिश्रण है । जैसा कि पहले4प्रदर्शन किया, ग्लूकोज की उपस्थिति पित्त नमक प्रेरित-फिल्म गठन के लिए आवश्यक था । TSB Luria-Bertani (पौंड) शोरबा के सापेक्ष ग्लूकोज जोड़ा गया है; और इसलिए, शिगेला और अंय प्रवेश रोगजनकों विश्लेषण में फिल्म गठन प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था । बैक्टीरिया पर निर्भर करता है विश्लेषण किया जा करने के लिए, अलग ग्लूकोज सांद्रता या अलग चीनी आवश्यकताओं की जरूरत हो सकती है.
  2. ०.५% w/v पानी में क्रिस्टल वायलेट: भंग ५०० एमएल आसुत जल में क्रिस्टल वायलेट के २.५ जी । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर.
  3. Concanavalin ए (ConA) संयुग्मित to fluorescein isothiocyanate (FITC): 1x पंजाब में शेयर का पुनर्गठन । 25 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पंजाबियों के ४०० μL के साथ 10 मिलीग्राम केंद्रित शेयर पतला, और प्रकाश से रक्षा करना ।
  4. पंजाबियों + ग्लूकोज: 10 मिलीलीटर 1x पंजाबियों (2% डब्ल्यू/वी ग्लूकोज अंतिम) में ०.२ जी ग्लूकोज को भंग । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर. उपयोग के दिन पर ताजा बनाओ ।
  5. पंजाबियों + पित्त लवण: भंग ४० 10 मिलीलीटर 1x पंजाबियों (०.४% डब्ल्यू/वी पित्त लवण अंतिम में मिलीग्राम) । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर. उपयोग के दिन पर ताजा बनाओ ।
  6. पंजाबियों + ग्लूकोज और पित्त लवण: भंग ४० मिलीग्राम पित्त लवण और ०.२ g ग्लूकोज में 10 मिलीलीटर 1x पंजाबियों (०.४% डब्ल्यू/वी पित्त लवण और 2% w/v ग्लूकोज अंतिम) । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर. उपयोग के दिन पर ताजा बनाओ ।
  7. पौंड आगर प्लेटें तैयार करें ।
  8. Formaldehyde/glutaraldehyde फिक्स: जोड़ें ८१० µ l Formaldehyde (३७% शेयर समाधान, 3% अंतिम एकाग्रता) और १२५ µ एल glutaraldehyde (25% शेयर समाधान, ०.२५% अंतिम एकाग्रता) 14 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के लिए । अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । ठीक उचित उपयोग के लिए ठंडा होना चाहिए ।
    चेतावनी: फिक्स विषाक्त है और खतरनाक अपशिष्ट निपटान की आवश्यकता है ।
  9. Antifade mounter समाधान: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) दाग Antifade का प्रयोग करें mounter photobleaching सूक्ष्म नमूनों की immunofluorescent को बाधित जबकि फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के डीएनए धुंधला ।

2. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. जीवाणु उपभेदों की रात भर बढ़ती संस्कृतियों एक बाँझ संस्कृति ट्यूब में एक एकल, अच्छी तरह से पृथक कॉलोनी के साथ TSB के inoculating 3 मिलीलीटर द्वारा परीक्षण किया जाना है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर की गर्मी (16-24 एच) के लिए २२५ rpm पर मिलाते के साथ मशीन ।
    नोट: उपभेदों फ्रीजर स्टॉक से हर 2 को 4 सप्ताह reधारिया होना चाहिए, और नहीं 2 सप्ताह से अधिक पुरानी प्लेटों पर बनाए रखा ।

3. ठोस चरण पालन परख

नोट: यह परख quantifies अनुयाई एक ९६-अच्छी तरह से थाली विधि का उपयोग कर बैक्टीरिया । बैक्टीरिया स्थिर रूप से फ्लैट नीचे प्लेटों में उगाया जाता है । धोने के लिए गैर अनुयाई बैक्टीरिया और अनुयाई बैक्टीरिया क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग रहे है हटाने के लिए किया जाता है । क्रिस्टल वायलेट दाग जीवाणु कोशिका दीवार में peptidoglycan बांधता है और इथेनॉल का उपयोग कर solubilized जा सकता है । अनुयाई बैक्टीरिया की संख्या क्रिस्टल वायलेट प्रतिधारण के आधार पर निर्धारित किया जाता है ।

  1. दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें । TSB या TSB + पित्त लवण (बी एस) के साथ लेबल ।
  2. संबंधित ट्यूबों के लिए TSB या TSB + बी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. रात भर संस्कृति के 20 µ एल के साथ Inoculate ट्यूबों (एक 1:50 कमजोर पड़ने पर) ।
  4. एक बाँझ, स्पष्ट, सपाट तली में, ऊतक संस्कृति-इलाज ९६-अच्छी तरह से प्लेट, जोड़ें १३० µ एल/uninoculated नियंत्रण मीडिया के तीन कुओं को खाली नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । प्रत्येक मीडिया प्रकार (TSB और TSB + बी एस) के लिए तीन नियंत्रण कुओं का परीक्षण किया जा करने के लिए सेट करें ।
  5. inoculated संस्कृति के तीन कुओं में १३० µ l/अच्छी तरह जोड़ें, और दोहराने जब तक सभी प्रयोगात्मक शर्तों तपसिल में चढ़ाया जाता है ।
  6. स्थिर रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-24 ज के लिए मशीन ।
  7. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर,६००आयुध डिपो रिकॉर्ड । नियंत्रण कुओं को ' रिक्त ' के रूप में सेट करें । नियंत्रण मध्यम turbidity का कोई सबूत के साथ स्पष्ट है की पुष्टि करें । यदि किसी turbidity का पता लगाया जाता है, तो प्रयोग छोड़ें । यदि जीवाणु उपभेदों के बीच वृद्धि दर में महत्वपूर्ण अंतर हो तो डेटा को सामान्य करने के लिए आयुध डिपो६०० मानों का उपयोग किया जा सकता है ।
  8. धीरे-धीरे प्लेट झुकाकर एक वैक्यूम लाइन का उपयोग कर संस्कृति माध्यम को दूर करें और धीमे से मीडियम को अच्छी तरह से निचले किनारे पर aspirating. प्लास्टिक की सतह पर स्थित अनुयाई जीवाणु जनसंख्या को बाधित किए बिना सभी संस्कृति माध्यमों को एकत्र करना सुनिश्चित करें । यदि EPS मैट्रिक्स मशीन समय के दौरान उत्पादन किया गया था, मैट्रिक्स एक सफेद वेग के रूप में visualized किया जाएगा । EPS मैट्रिक्स परेशान मत करो ।
  9. धीरे कुओं धो २०० µ l बाँझ पंजाबियों के साथ एक बार । वैक्यूम लाइन का उपयोग करके पंजाबियों धो निकालें ।
  10. प्लेट को सूखने के लिए उलटा करें । शुष्क करने के लिए 20 मिनट की एक ंयूनतम अनुमति दें ।
    नोट: चूंकि इस फिल्म को अच्छी तरह से धुंधला करने से पहले सूख जाना चाहिए, प्रोटोकॉल कुछ घंटे या यहां तक कि रात के लिए इस कदम पर रोका जा सकता है । जोड़ा सुखाने समय धुंधला प्रक्रिया को बदल नहीं है, जबकि अधूरा सुखाने परिणाम और reproducibility के ठहराव को प्रभावित करेगा ।
  11. प्रत्येक प्रयोगात्मक और अच्छी तरह से नियंत्रण करने के लिए ०.५% क्रिस्टल वायलेट के १५० µ एल जोड़ें ।
  12. कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए मशीन ।
  13. आसुत जल के ४०० µ l के साथ एक बार कुएं को धोएं । जोड़ा मात्रा कुओं के किनारों से अवशिष्ट क्रिस्टल वायलेट दाग को दूर करने में मदद करता है । वैक्यूम लाइन के साथ धोने निकालें ।
  14. आसुत जल के २०० µ l के साथ पांच बार कुएँ को धोएं । वैक्यूम लाइन के साथ धोने निकालें ।
    नोट: पूरी तरह से धुलाई ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है । जब खाली कुओं आसुत पानी से स्पष्ट कर रहे है और किसी भी अवशिष्ट क्रिस्टल वायलेट दाग शामिल नहीं है, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
  15. प्लेट पलटना सूखी, प्रकाश से सुरक्षित । प्लेट की पूरी सुखाने सुनिश्चित करें के रूप में ऊपर उल्लेख किया ।
  16. ९५% इथेनॉल के २०० µ एल के साथ कुओं को दाग । 30 मिनट के लिए शेखर पर थाली मशीन । वाष्पीकरण से बचने के लिए, विशेष रूप से उच्च तापमान पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर इस कदम का प्रदर्शन ।
  17. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर,५४०आयुध डिपो रिकॉर्ड ।
    नोट: क्रिस्टल वायलेट के अधिकतम अवशोषण के लिए तरंग दैर्ध्य ५९० एनएम के पास है । साहित्य से एक सीमा की रिपोर्ट आयुध डिपो५४० -आयुध डिपो५९५4,13,14,15,16 क्रिस्टल वायलेट अवशोषक के लिए; इस प्रकार एक तरंग दैर्ध्य प्लेट रीडर के आधार पर उपलब्ध चुनें ।

4. EPS मैट्रिक्स का पता लगाने

नोट: इन मानार्थ परख यों तो और EPS कल्पना । दोनों में, EPS polysaccharides बाइंड करने के लिए एक लेक्टिन का उपयोग कर पाया है । फ्लोरोसेंट-संयुग्मित प्रोटीन ठहराव (कदम ४.१) या दृश्य (४.२ कदम) की अनुमति देता है ।

  1. EPS का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना
    1. दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें । TSB या TSB + बी एस के साथ लेबल ।
    2. संबंधित ट्यूबों के लिए TSB या TSB + बी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. रात भर संस्कृति के 20 µ एल के साथ Inoculate ट्यूबों (एक 1:50 कमजोर पड़ने) ।
    4. एक बाँझ, काले, फ्लैट तली में, ऊतक संस्कृति-इलाज ९६-अच्छी तरह से थाली, जोड़ें १३० µ एल uninoculated नियंत्रण मीडिया के तीन कुओं को खाली नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । प्रत्येक मध्यम प्रकार के लिए तीन नियंत्रण कुओं की स्थापना के लिए परीक्षण किया जाएगा । जोड़ें १३० µ inoculated संस्कृति के कुओं को अच्छी तरह से, और दोहराने जब तक सभी प्रयोगात्मक शर्तों तपसिल में चढ़ाया जाता है ।
    5. स्थिर रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-24 ज के लिए मशीन ।
    6. एक पिपेट के साथ एक स्पष्ट ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए संस्कृति माध्यम हस्तांतरण, आदर्श रूप से एक मल्टीचैनल पिपेट । अनुयाई की आबादी और/या प्लास्टिक की सतह पर स्थित EPS में खलल डाले बिना सभी संस्कृति माध्यम एकत्र करने के लिए सतर्क रहें । अलग सेट करें ।
    7. आरटी पर 15 मिनट के लिए काली प्लेट फिक्स २०० µ का उपयोग कर/formaldehyde/glutaraldehyde 1x पंजाब में ।
    8. जबकि अनुयाई जनसंख्या फिक्सिंग है, चरण 4.1.6 से supernatant अंश का मूल्यांकन करें । एक प्लेट रीडर का उपयोग कर,६००आयुध डिपो रिकॉर्ड । नियंत्रण कुओं को ' रिक्त ' के रूप में सेट करें । नियंत्रण मध्यम turbidity का कोई सबूत के साथ स्पष्ट है की पुष्टि करें । यदि किसी turbidity का पता लगाया जाता है, तो प्रयोग छोड़ें ।
      1. वैकल्पिक रूप से, पूरे परख एक काले साफ नीचे की थाली में प्रदर्शन किया जा सकता है । उन परिस्थितियों में, आयुध डिपो६०० मान रिकॉर्ड किया जा सकता है और संस्कृति माध्यम बाद में चरण 4.1.7 करने के लिए आगे बढ़ने से पहले छोड़ दिया जा सकता है । आयुध डिपो६०० मानों का उपयोग उस स्थिति में डेटा को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है जहां जीवाणु उपभेदों के बीच वृद्धि दर में महत्वपूर्ण अंतर होते हैं ।
    9. फिक्स निकालें और खतरनाक कचरे में निपटाने ।
    10. धीरे से कुओं धो दो बार के साथ २०० µ/ पंजाबियों को हटाकर वैक्यूम लाइन का उपयोग करके धीरे-धीरे प्लेट को झुकाकर अच्छी तरह से aspirating के निचले किनारे पर धो लें ।
    11. 25 µ g/mL ConA-FITC, और RT पर 15 मिनट के लिए मशीन जोड़ें १५० µ l/
    12. धीरे दो बार पंजाब के २०० µ एल के साथ धो लो ।
    13. प्रत्येक वेल को पंजाब के १५० µ एल जोड़ें । ४८८ एनएम पर प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड ।
  2. EPS उत्पादन और फिल्म मोटाई की गणना के फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्य
    1. दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें । TSB या TSB + बी एस के साथ लेबल ।
    2. संबंधित ट्यूबों के लिए TSB या TSB + बी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. रात भर संस्कृति के 20 µ एल के साथ Inoculate ट्यूबों (एक 1:50 कमजोर पड़ने पर) ।
    4. 12 मिमी बाँझ गोल गिलास coverslips के साथ एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली सेट. जोड़ें ४०० µ एल uninoculated नियंत्रण मीडिया के तीन कुओं को रिक्त नियंत्रण के रूप में सेवा के लिए । प्रत्येक मध्यम प्रकार के लिए तीन नियंत्रण कुओं की स्थापना के लिए परीक्षण किया जाएगा ।
    5. डुप्लिकेट में कुओं के लिए inoculated संस्कृति के ४०० µ एल जोड़ें, और दोहराने जब तक सभी प्रयोगात्मक शर्तों चढ़ाया जाता है ।
    6. स्थिर रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-24 ज के लिए मशीन ।
    7. नेत्रहीन TSB + बी एस हालत में TSB हालत, विकास और EPS हाला (सफेद) में वृद्धि की पुष्टि करें, और बाँझ नियंत्रण कुओं में कोई वृद्धि और/या सफेद हाला । supernatants निकालें ।
    8. आरटी में 15 मिनट के लिए फिक्स का उपयोग २०० µ एल/formaldehyde/glutaraldehyde समाधान 1x पंजाब में ।
    9. फिक्स निकालें और खतरनाक कचरे में निपटाने ।
    10. धीरे से कुओं धो दो बार के साथ २०० µ/ वैक्यूम लाइन का उपयोग करके पंजाबियों धो निकालें ।
    11. जोड़ें १५० µ 25 µ जी/एमएल ConA-FITC और आरटी में 15 मिनट के लिए मशीन के ठीक/
    12. धीरे से दो बार २०० µ एल के साथ धो/
    13. DAPI के साथ antifade mounter समाधान के साथ माउंट ।
      ध्यान दें: समाधान एक तैयार किया है, ग्लिसरॉल आधारित DAPI युक्त फ्लोरोसेंट लेबल के संरक्षण के लिए समाधान माउंट जबकि एक साथ एक counterstain के रूप में दृश्य के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं में डीएनए धुंधला । किट के निर्देशों और इमेजिंग नमूनों से पहले गर्मी समय के लिए सिफारिशों का पालन करें । DAPI धुंधला प्रक्रिया antifade mounter समाधान है कि DAPI शामिल नहीं है लागू करने से पहले किया जा सकता है ।
    14. फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा मूल्यांकन । एक फोकल माइक्रोस्कोप पर, लेजर सेट करने के लिए ४९५ एनएम/519 एनएम उत्तेजना/FITC दृश्य के लिए उत्सर्जन । DAPI कल्पना करने के लिए ३६० एनएम/460 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन करने के लिए एक दूसरी लेजर सेट करें । DAPI चैनल पर ध्यान केंद्रित करके इस फिल्म का पता लगाएं । पूर्ण मोटाई निर्धारित करने और ऊपरी और निचली इमेजिंग बॉर्डर्स सेट करने के लिए दोनों DAPI और FITC चैनल का उपयोग करें । रिकॉर्ड पूर्ण मोटाई z-ढेर छवियों को कैप्चर करने से छवियों हर ०.२५ µm के बाद ऊपर और Z-स्टैक के नीचे करने के लिए परिधि की स्थापना के बाद । फोकल माइक्रोस्कोप के बारे में अधिक जानकारी के लिए, मेढक एट अल द्वारा प्रकाशनों का उल्लेख करें । 17 , 18 , 19 , 20
    15. ImageJ में 3 डी छवियों को फिर से संगठित (https://imagej.nih.gov/ij/) पूर्ण फिल्म निर्माण की कल्पना और फिल्म की मोटाई की गणना । एस flexneri पित्त-नमक प्रेरित के लिए प्राप्त औसत मोटाई 14 µm4था ।

5. फैलाव परख

नोट: इस परख में, बैक्टीरियल फैलाव के माध्यम से फिल्म के विधानसभा का पता चला है । यहां, परिपक्व फिल्म और बाद में स्थापित कर रहे है (आमतौर पर अगले दिन), मीडिया पंजाबियों या पूरक पंजाबियों के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं । इसके बाद supernatant घटक को quantitate करने वाले जीवाणुओं की संख्या का आकलन किया जाता है जो कि इस फिल्म से असंबद्ध है.

  1. दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें । TSB या TSB + बी एस के साथ लेबल ।
  2. संबंधित ट्यूबों के लिए TSB या TSB + बी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. रात भर संस्कृति के 20 µ एल के साथ Inoculate ट्यूबों (एक 1:50 कमजोर पड़ने पर) ।
  4. एक बाँझ, स्पष्ट, सपाट तली में, ऊतक संस्कृति-इलाज ९६-अच्छी तरह से प्लेट, जोड़ें १३० µ एल/uninoculated नियंत्रण मीडिया के तीन कुओं को खाली नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । प्रत्येक मीडिया प्रकार के लिए तीन नियंत्रण कुओं का परीक्षण किया जा करने के लिए सेट करें ।
  5. जोड़ें १३० µ inoculated संस्कृति के तीन कुओं को अच्छी तरह से, और दोहराने जब तक सभी प्रयोगात्मक शर्तों तपसिल में चढ़ाया जाता है ।
  6. स्थिर रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-24 ज के लिए थाली मशीन ।
  7. जारी रखने से पहले, पंजाबियों, पंजाबियों + ग्लूकोज, पंजाबियों + पित्त लवण, और पंजाब + पित्त लवण + ग्लूकोज ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म । इन रिएजेंट्स को रोज फ्रेश तैयार करें ।
  8. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर,६००आयुध डिपो रिकॉर्ड । नियंत्रण कुओं को ' रिक्त ' के रूप में सेट करें । मध्यम की पुष्टि turbidity के कोई सबूत के साथ स्पष्ट है । यदि किसी turbidity का पता लगाया जाता है, तो प्रयोग छोड़ें । यदि जीवाणु उपभेदों के बीच वृद्धि दर में महत्वपूर्ण अंतर हो तो डेटा को सामान्य करने के लिए आयुध डिपो६०० मानों का उपयोग किया जा सकता है ।
  9. एक वैक्यूम लाइन का उपयोग कर संस्कृति मध्यम निकालें । प्लास्टिक की सतह पर स्थित अनुयाई आबादी को बाधित किए बिना सभी संस्कृति माध्यमों को एकत्र करना सुनिश्चित करें ।
  10. धीरे से कुओं धो दो बार के साथ २०० µ/ वैक्यूम लाइन का उपयोग करके पंजाबियों धो निकालें ।
  11. १३० µ के साथ धो बदलें l/तीन कुओं में निंनलिखित में से प्रत्येक: पंजाबियों, पंजाबियों + ग्लूकोज, पंजाबियों + पित्त लवण, और पंजाब + पित्त लवण + ग्लूकोज । ये रिएजेंट ३७ ° c करने के लिए पूर्व गर्म होना चाहिए ।
  12. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली मशीन ।
  13. ध्यान से प्लेट ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन से हटा दें । supernatants एक ताजा, बाँझ ९६-अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण ।
  14. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट या कमजोर पड़ने ब्लॉक का उपयोग करना, 10 गुना (1:10) बाँझ पंजाबियों में supernatant के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं ।
    नोट: कमजोर पड़ने की श्रृंखला के लिए पतला से लेकर 10 तक होना चाहिए-6 बैक्टीरियल तनाव के आधार पर परीक्षण किया जा करने के लिए । पायलट प्रयोगों इष्टतम कमजोर पड़ने रेंज निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ।
  15. स्पॉट प्लेट 5 µ पौंड एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर आगर पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के एल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन । वसूली कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) का निर्धारण करते समय कमजोर पड़ने कारक के लिए अगले दिन और खाते पर कालोनियों गिनती । प्रतिशत फैलाव 1x पंजाबन नियंत्रण के सापेक्ष गणना करने के लिए (१००% पर सेट), 1x पंजाबियों नियंत्रण नमूने से वसूली CFU द्वारा प्रत्येक उपचार हालत से वसूली CFU विभाजित ।
    नोट: ब्याज के जीवाणु तनाव के लिए नियमित मीडिया प्लेटें भी इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, शिगेला कांगो लाल प्लेटों पर चढ़ाया जा सकता है । सुनिश्चित प्लेटें उपयुक्त स्थान चढ़ाना तकनीक के लिए शुष्क कर रहे हैं ।

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Representative Results

चित्रा 1में, फिल्म गठन छह में से अधिकांश में प्रेरित किया जाता है रोगजनकों पित्त लवण युक्त मीडिया में निंनलिखित विकास का परीक्षण किया । पित्त लवण जोखिम के बाद अनुयाई बैक्टीरिया में एक महत्वपूर्ण वृद्धि लगभग सभी परीक्षण उपभेदों में मनाया जाता है । अपवाद enteroaggregative ई. कोलाई (EAEC) है; हालांकि, Δ aaf उत्परिवर्ती4के प्रेरित अवलोकन ध्यान दें । परिणाम संकेत मिलता है कि अतिरिक्त पालन तंत्र एकत्रीकरण पालन के अभाव में EAEC में पित्त लवण जोखिम से प्रेरित कर रहे हैं fimbriae मैं (AAF/ इस डेटा सेट से निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए, प्रत्येक तनाव और मीडिया प्रकार का परीक्षण के लिए आयुध डिपो५४० मान । मीडिया नियंत्रण में प्रत्येक तनाव से मूल्यों की तुलना (बी एस) पित्त लवण युक्त मीडिया के सापेक्ष निर्धारित करेगा अगर पित्त लवण काफी प्रेरित करने के लिए फिल्म निर्माण । बैक्टीरियल उपभेदों और/या म्यूटेंट भर में तुलना भी आगे लक्षण वर्णन विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ।

ईपीएस का ConA-FITC असेसमेंट चित्रा 2में प्रस्तुत किया गया है । चित्र 2a EPS उत्पादन के अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ConA-FITC को विरूपण फिल्मों के दाग के लिए प्रयोग किया जाता है । ConA EPS मैट्रिक्स में polysaccharides के लिए बांध और रखी गई राशि एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर द्वारा पता चला है । डेटा को प्रस्तुत करने के लिए, प्रत्येक शर्त के लिए औसत प्रतिदीप्ति इकाइयों प्लॉट और नकारात्मक नियंत्रण के लिए फिल्म उत्प्रेरण स्थितियों की तुलना करें । इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल उपभेदों या म्यूटेंट भर की तुलना प्रदर्शन किया जा सकता है । यह एक केवल मीडिया का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है, नकारात्मक नियंत्रण प्लेट के लिए होता है कि पृष्ठभूमि ConA-FITC प्रतिदीप्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए. TSB हालत मीडिया नियंत्रण से काफी अलग नहीं था, जबकि प्रतिदीप्ति रीडिंग काफी पित्त लवण जोखिम के बाद वृद्धि हुई है । डेटा की पुष्टि करते हैं कि ईपीएस उत्पादन में फिल्म निर्माण का संकेत है और एस flexneriके लिए पित्त लवण के अभाव में नहीं होती है । एस flexneri में पित्त नमक प्रेरित-फिल्म के चित्र चित्रा बीमें प्रतिनिधित्व किया है। ConA-FITC EPS मैट्रिक्स में polysaccharides दाग के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि एक DAPI counterstain डीएनए दाग द्वारा बैक्टीरिया की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पित्त लवण (नकारात्मक नियंत्रण) के संपर्क में नहीं बैक्टीरिया के लिए, केवल DAPI का पता चला है । विशेष रूप से, बैक्टीरिया का घनत्व पित्त लवण हालत की तुलना में बहुत कम है । FITC चैनल पर एक स्पष्ट पृष्ठभूमि EPS उत्पादन की कमी का संकेत प्राप्त है । जैसा कि अपेक्षित, डेटा प्रदर्शित करता है कि EPS उत्पादन1,2,3 निम्नलिखित पित्त लवण जोखिम के साथ फिल्म निर्माण के साथ संबंधित है । -ConA दाग पित्त नमक-उपचारित नमूनों में नियंत्रण FITC प्रतिदीप्ति की विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए प्रदान की जाती है । इन छवियों के लिए, 1x पंजाबियों ConA-FITC के स्थान पर इस्तेमाल किया गया था और DAPI counterstain रखा गया था । इमेजिंग एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है के लिए EPS-सकारात्मक नमूने4के साथ फिल्म की मोटाई का आकलन करें ।

चित्रा 3 में एक से अधिक जीवाणु फैलाव से पता चला है कि पंजाबियों या अनुपूरक पंजाबियों में फिल्म की स्थापना की है । शारीरिक, पित्त संचलन में छोटी आंत में अवशोषित कर लेता है और पित्त का केवल 5% बृहदांत्र5में प्रवेश करती है । के रूप में शिगेला बृहदांत्र उपकला पर आक्रमण, हम परिकल्पना कि पित्त के पुनर्अवशोषण के लिए एक महत्वपूर्ण संकेत है कि फिल्म के फैलाव । इस आंकड़े में, फैलाव पंजाब या पंजाब + ग्लूकोज के संपर्क में आने वाली फ़िल्मों में होता है; हालांकि, प्रसार पंजाब में बाधा + पित्त लवण ग्लूकोज की उपस्थिति की परवाह किए बिना है । डेटा पित्त लवण को हटाने के लिए आवश्यक है और पित्त नमक से प्रेरित एस flexneri के फैलाव को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है कि प्रदर्शन4। डेटा प्लॉट करने के लिए, या तो बैक्टीरिया के बरामद CFU या नियंत्रण के लिए रिश्तेदार प्रतिशत (जैसा कि यहां दिखाया गया है) की साजिश रची जा सकती है ।

Figure 1
चित्रा 1: पित्त लवण प्रवेश रोगजनकों में फिल्म निर्माण के लिए प्रेरित । 18 एच की फिल्मी टिशू-कल्चर पर हो गए थे इलाज ९६-अच्छी तरह से या तो TSB या TSB + ०.४% पित्त लवण मीडिया में प्लेटों और ०.५% क्रिस्टल वायलेट के साथ सना हुआ । क्रिस्टल वायलेट दाग के इथेनॉल solubilization से मात्रात्मक मूल्यों spectrophotometry द्वारा आयुध डिपो५४०पर निर्धारित किया गया । पित्त लवण एक्सपोजर गौरतलब है कि शिगेला flexneri, एस. dysenteriae, enteropathogenic ई कोलाई, साल्मोनेला enterica serovar Typhi, और एस. enterica serovar Typhimurium में फिल्म गठन में वृद्धि हुई. सांख्यिकीय महत्व के छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था प्रत्येक मीडिया नियंत्रण के लिए पित्त लवण उपचार की तुलना तनाव के लिए । माध्य (SEM) के मानक त्रुटि त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रस्तुत किया जाता है । सभी p-मान < 0.0001 हैं । दिखाया गया डेटा एक (n = 3) प्रतिनिधि प्रयोग, पिछले प्रकाशन4में प्रदान किए गए डेटा के पूर्ण सेट के साथ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पित्त नमक प्रेरित-फिल्म गठन एक EPS मैट्रिक्स है कि FITC के साथ का पता लगाया है के उत्पादन की विशेषता है-Concanavalin लेबल । (क) बाँझ काले, ९६-अच्छी तरह से थाली TSB या TSB + पित्त लवण में एक 1:50 कमजोर पड़ने पर एस. flexneri के साथ वरीयता प्राप्त थे और 18 ज. के लिए बड़े हो गए, धीरे से धोया, और ConA-FITC के साथ दाग थे । रखी Concanavalin की राशि-एक FITC एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर द्वारा निर्धारित किया गया था । प्लॉट किए गए मान TSB या TSB-युक्त पित्त लवण में उगाई गई flexneri के EPS ठहराव के विकास को प्रदर्शित करते हैं । महत्व एक-तरफ़ा ANOVA और p-मान द्वारा निर्धारित किया गया < 0.01 है । SEM त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रस्तुत किया जाता है । दिखाया गया डेटा एक (n = 3) प्रतिनिधि प्रयोग, पिछले प्रकाशन4में प्रदान किए गए डेटा के पूर्ण सेट के साथ है । (ख) एक पित्त नमक से माइक्रोस्कोपिक छवियां-प्रेरित शिगेला फिल्म । बाँझ coverslips TSB या TSB + पित्त लवण में एक 1:50 कमजोर पड़ने पर एस. flexneri के साथ बीज और 18 एच के लिए उगाया गया । coverslips बाद में तय कर रहे थे और ConA के साथ दाग-FITC और/ ConA-FITC केवल EPS मैट्रिक्स की उपस्थिति के कारण पित्त लवण हालत में पाया गया था । एक coverslip केवल TSB में DAPI के साथ दाग + पित्त लवण उपचार के लिए फोकल माइक्रोस्कोप पर FITC सेटिंग के लिए ंयूनतम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया गया था । प्रत्येक तरंग दैर्ध्य चैनल के लिए छवियां और एक समग्र ओवरले सभी उपचार शर्तों के लिए प्रदान की जाती हैं । स्केल पट्टियां 10 µm दर्शाती हैं । दिखाया गया डेटा एक (n = 3) प्रतिनिधि प्रयोग, पिछले प्रकाशन4में प्रदान किए गए डेटा के पूर्ण सेट के साथ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पित्त नमक से प्रेरित विरोधी फिल्म से बैक्टीरियल फैलाव का विश्लेषण । 18 एच पित्त नमक प्रेरित शिगेला flexneri फिल्म पंजाब या पंजाब ग्लूकोज, पित्त लवण, या ग्लूकोज और पित्त लवण का एक संयोजन के साथ पूरक के संपर्क में थे । supernatant क्रमिक रूप से पतला था और प्लेटें आगर पर चढ़ाया को कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) कि फिल्म फैलाने की गणना । बरामद बैक्टीरिया की संख्या को पंजाब कंट्रोल के रिश्तेदार ने साजिश रची थी । पंजाबियों या पंजाबियों + ग्लूकोज की स्थिति में इस फिल्म से बैक्टीरिया फैलाया, लेकिन पित्त लवण की उपस्थिति के लिए इस फिल्म से जीवाणु फैलाव को बाधित करने के लिए पर्याप्त था । दिखाया गया डेटा एक (n = 3) प्रतिनिधि प्रयोग, पिछले प्रकाशन4में प्रदान किए गए डेटा के पूर्ण सेट के साथ है । संदर्भ के लिए, १०० गुना अधिक बैक्टीरिया नियमित रूप से पंजाब नियंत्रण उपचार (लगभग 7 x 107 CFU) से पंजाब + पित्त लवण उपचार (लगभग 7 x 105 CFU) की तुलना में बरामद किया गया । महत्व एक-तरफ़ा ANOVA और p-मान द्वारा निर्धारित किया गया था < 0.0001 । SEM त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रस्तुत किया जाता है ।

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Discussion

फिल्म निर्माण के विश्लेषण के कारण और उपभेदों, सामग्री, प्रयोगशालाओं के बीच परिवर्तनशीलता, और परख के लिए गतिशील प्रकृति के लिए चुनौतीपूर्ण है । यहां, कई रणनीतियों को reproducibility को बढ़ावा देने के लिए प्रदान प्रयोगात्मक अंतर्दृष्टि के साथ पित्त लवण जोखिम निंनलिखित प्रवेश रोगजनकों में फिल्म गठन का निर्धारण करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । reproducibility सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त विचार कर रहे हैं । पहली और महत्वपूर्ण बात, हम प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ कम से तीन स्वतंत्र प्रयोग करने की सलाह देते है जो कि भिंनता के कारण टिप्पणियों और सांख्यिकीय महत्व की पुष्टि करते हैं । दूसरा, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग परख के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह अत्यधिक एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार तनाव का उपयोग करें जब म्यूटेंट का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है फिल्म गठन । इसके अलावा, के रूप में जीन है कि फिल्म निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान की (उदाहरण के लिए, देख रहे है Vibrio22, साल्मोनेला7, और E. कोलाई23,24,25), का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में फिल्म म्यूटेंट परख के reproducibility मांय होगा । तीसरा, उपरोक्त तरीके शिगेला और एस flexneri के साथ विशेष रूप से केंद्रित अनुसंधान पर आधारित हैं । प्रोटोकॉल के लिए समायोजन प्रत्येक दर्जी रोगजनक मूल्यांकन की वृद्धि आवश्यकताओं के आधार पर आवश्यक हो सकता है । चौथा, परख एक जीवाणु तनाव प्रतिक्रिया को मापने; और इसलिए, यह जमे हुए शेयरों से उचित बनाए रखा बैक्टीरिया के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है (-८० डिग्री सेल्सियस) या भंडारण प्लेटें प्रशीतन के तहत रखा (अधिकतम 4 डिग्री सेल्सियस) कोई दो सप्ताह से अधिक के लिए । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि Yersinia जीनस में प्रवेश रोगजनकों सहित कुछ बैक्टीरिया psychrotrophs कि 0 डिग्री सेल्सियस के करीब26तापमान पर विकसित कर सकते हैं । प्रशीतित तापमान पर भंडारण के बाद से बैक्टीरियल फिजियोलॉजी को बदल सकते हैं और संभवतः genotypic या phenotypic पाली में परिणाम27,28,29, यह अत्यधिक के aliquots तैयार करने के लिए सिफारिश की है स्टॉक संस्कृति-८० में स्टार्टर संस्कृतियों में दिनचर्या टीका के लिए ° c । इसके अलावा, नैदानिक अलग के साथ काम करने से अधिक लगातार reधारिता की आवश्यकता होती है-८० ° c शेयरों के रूप में आनुवंशिक बदलाव तेजी से मनाया जब प्रयोगशाला में एक नैदानिक-व्युत्पंन बैक्टीरियल तनाव संक्रमण की स्थापना30,31 . विशेष रूप से शिगेला के साथ काम कर अलग, उपभेदों तेजी से अनुकूलन और phenotype पाली अक्सर होते हैं३२,३३. यह एक महीने में एक बार फ्रीजर स्टॉक से बैक्टीरिया लकीर की सिफारिश की है, और स्टॉक प्लेट हर दो सप्ताह reलकीर ।

reproducibility सुनिश्चित करने के लिए एक अंय महत्वपूर्ण कारक पित्त लवण मीडिया की ताजा तैयारी परख की परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए है । पित्त लवण 1 सप्ताह से पुराने मीडिया नकारात्मक मजबूत phenotype ताजा मीडिया की तैयारी के साथ मनाया प्रभावित । इसके अलावा, रोगज़नक़ और जोखिम के प्रकार के आधार पर विश्लेषण किया जा करने के लिए (छोटी आंत बनाम बृहदांत्र), विभिन्न स्रोतों और पित्त लवण के मिश्रण की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत पित्त लवण, संयुग्मित और de-संयुग्मित स्रोतों, या क्रूड पित्त अर्क है कि कोलेस्ट्रॉल और बिलीरुबिन जैसे अतिरिक्त पित्त घटक शामिल है5,6का उपयोग किया जा सकता है । शिगेला विश्लेषण के बृहदांत्र में संक्रमण से पहले छोटी आंत के पारगमन के दौरान मेजबान के लिए बैक्टीरियल अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है । इसलिए, एक cholate और deoxycholate मिश्रण का उपयोग छोटी आंत की स्थिति5,6,३४की नकल । इसके अलावा के साथ फैलाव परख (खंड 5) का संबंध है, यह निर्दिष्ट किया है कि पंजाबियों के पूरक एजेंट है ताजा दैनिक और पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस को गर्म करने से पहले परख कर रहे हैं । जब कुछ दिनों से पुराने रिएजेंट इस्तेमाल किए जाते थे, तो परख के reproducibility बुरी तरह से समझौता कर लिया करते थे । यह भी पहले से गर्म करने के लिए महत्वपूर्ण था ३७ ° c के लिए इन रिएजेंट फैलाव के रूप में कमरे के साथ आसानी से उत्पन्न नहीं हुआ तापमान रिएजेंट. अंत में, के आकलन के लिए फैलाव विधियों की पूरी titer गणन के लिए फिल्म का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें शामिल sonication३५,३६ या एंजाइमी पाचन३७। फैलाव परख करने के लिए दृष्टिकोण को टर्मिनल लघ्वान्त्र से और बृहदांत्र में शिगेला पारगमन के रूप में पित्त नमक पुनर्अवशोषण के प्रभाव का आकलन करने की ओर निर्देशित किया गया था । विश्लेषण परिकल्पनाओं के आधार पर किया गया था कि पित्त लवण के नुकसान क्षणिक फिल्म के फैलाव को सक्षम और है कि शिगेला से पहले इस फिल्म को फैलाने के लिए कालोनी उपकला में संक्रमण के कारण होगा4,5 . इस तरह के sonication और एंजाइमी पाचन के रूप में शर्तों को जैविक फिल्म से माइक्रोबियल द्रव्यमान की कुल रिहाई का प्रतिनिधित्व करते हुए रणनीति यहां प्रस्तुत लघ्वान्त्र बृहदांत्र संक्रमण के लिए एक शारीरिक phenotype पर कब्जा करने के लिए अनुकरणीय शिगेला। वांछित प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर, फैलाव विश्लेषण या फिल्म गणन के लिए अतिरिक्त तरीकों की आवश्यकता हो सकती है ।

परख के लिए मामूली उच्च ९६ के उपयोग के साथ प्रवाह-अच्छी तरह से कई जीवाणु उपभेदों के परीक्षण को सक्षम करने के लिए और/ आगे फिल्म गठन के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, फ्लैट तली, ९६-अच्छी तरह से प्लेटों कि ऊतक संस्कृति का इलाज किया गया था । तकनीकी कारणों से, प्लेट रीडर गोल नीचे प्लेटों में अवशोषित या प्रतिदीप्ति को मापने के लिए सही नहीं कर सकते । इसके अतिरिक्त, अनकोट प्लेटों शिगेला, जो वर्तमान जांच का एक अवसर है में चर पालन प्रोफाइल की पेशकश की । परख बड़ा अच्छी तरह से आनुपातिक प्रारूपों के लिए स्केल किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल है कि प्रयोगात्मक दक्षता को कम कर सकते है परिवर्तन की आवश्यकता होगी । उदाहरण के लिए, एक spectrophotometer के साथ आयुध डिपो६०० मान रिकॉर्ड करने के लिए cuvettes को स्थानांतरित करने के लिए culture मीडिया की आवश्यकता होगी । इसके अतिरिक्त, क्रिस्टल वायलेट-सना हुआ फिल्म ९५% इथेनॉल दाग कदम में एक 30-60 मिनट की मशीन के बाद परिमार्जन किया जा सकता है और सामग्री को spectrophotometer रीडिंग के लिए एक cuvette में स्थानांतरित किया जा सकता हैओडी५४० । ध्यान रखा जाना चाहिए जब एक अच्छी तरह से समाप्त में फिल्म की सामग्री के लिए छप से बचने के लिए, और हमने पाया है कि समाप्त आसान है एक ६० मिनट की मशीन के बाद ।

शिगेला, साल्मोनेला, और रोगजनक ई. कोलाई4 के साथ विश्लेषण एक दोहराया अवलोकन है कि फिल्म गठन एक त्वरित समय के पैमाने में होता है (24 घंटे के भीतर) में प्रवेश किया रोगजनकों पित्त लवण को उजागर के लिए प्रदर्शन किया । अंय बैक्टीरिया है कि ४८ से ७२ एच की आवश्यकता के विपरीत सामांय परिस्थितियों में फिल्म निर्माण का पालन करने के लिए, पित्त नमक प्रेरित एंट्रेंस फिल्म प्रारंभिक पालन चरण के साथ 4 एच के रूप में के रूप में जल्दी शुरू होता है । बाद में, EPS मैट्रिक्स गठन 6 एच द्वारा स्पष्ट है, और परिपक्वता 24 एच द्वारा होता है । जैसे, 24 ज में पालन phenotype भी मजबूत हो सकता है के लिए फिल्म निर्माण में अलग पालन कारकों की भूमिका को समझने । जल्दी विश्लेषण प्रदर्शन, उदाहरण के लिए के रूप में 4 एच के रूप में जल्दी, जल्दी फिल्म निर्माण में महत्वपूर्ण कारकों की पहचान के लिए अनुमति देता है कि अंयथा एक बाद में समय पर याद किया जाएगा । अंत में, और के रूप में प्रोटोकॉल कदम में ऊपर उल्लेख किया है, शिगेला के लिए पित्त नमक प्रेरित-फिल्म गठन ग्लूकोज4के अभाव में नहीं पाया गया । चूंकि EPS मैट्रिक्स मुख्य रूप से polysaccharides के शामिल है और सबसे बैक्टीरिया३८के लिए फिल्म निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम है, ग्लूकोज या मीडिया में अंय चीनी की उपस्थिति सबसे अधिक संभावना है कि फिल्म निर्माण का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है । बैक्टीरियल रोगज़नक़ के आधार पर विश्लेषण, विभिंन आधार मीडिया योगों की आवश्यकता हो सकती है ।

फिल्म निर्माण एक multilayered प्रक्रिया है कि अक्सर एक खुली प्रणाली में होता है, जहां पोषक तत्व प्रवाह और द्रव गति आसानी से हो1,2,3। पद्धतियां बंद संस्कृति और स्थैतिक वृद्धि आवश्यकताओं द्वारा सीमित हैं; हालांकि, विधियां प्रयोगशाला की स्थापना में फिल्म निर्माण के आकलन को सक्षम बनाती हैं । फिल्म phenotype की पहचान पर, आगे द्रव कोशिकाओं या सतत संस्कृति रणनीतियों का उपयोग कर प्रयोगों३९,४०,४१ शारीरिक या नैदानिक में अतिरिक्त यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है फिल्म निर्माण का महत्व । EPS मैट्रिक्स की पहचान के लिए, प्रोटोकॉल polysaccharide-बाइंडिंग लेक्टिन ConA का उपयोग करें । ConA बांधों α-D-glucosyl या sterically-बारीकी से संबंधित अवशेषों४२। विभिन्न lectins अलग पीढ़ी या प्रजातियों के लिए उत्पादित EPS के प्रकार के आधार पर आवश्यक हो सकता है । eps उत्पादन की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री है, जो दोनों सत्यापन कि eps का उत्पादन किया है प्रदान करेगा और eps मैट्रिक्स की संरचना का निर्धारण४३,४४. इसके अतिरिक्त, DAPI counterstain का उपयोग महत्वपूर्ण चमक में इस फिल्म में बैक्टीरिया की संख्या या extracellular डीएनए है कि अक्सर EPS मैट्रिक्स४५,४६में मौजूद है की घटना को देखते हुए परिणाम कर सकते हैं ।

साहित्य में वर्णित उपरोक्त विधियों के विकल्प हैं । उदाहरण के लिए, ठोस चरण बाइंडिंग परख अन्य रोगजनकों में उपयोग के लिए रिपोर्ट किया गया है (उदाहरण के लिए, संदर्भ4,25,४७,४८,४९) । प्रकाशनों के बीच प्रोटोकॉल में संशोधन कर रहे हैं; और इसलिए, यहां प्रस्तुत रणनीतियों के लिए एक आसान प्रारूप दोहराने हैं । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल हवा को निर्दिष्ट करने से पहले धुंधला (३.१० कदम), जबकि कुछ समूहों को फिल्म तय करना पसंद करते हैं । दो विभिंन तरीकों रोगजनक विशिष्ट रणनीतियों अलग प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, पानी में क्रिस्टल वायलेट दाग तैयार करके, एक सुसंगत फिल्म निर्माण phenotype का पता लगाया गया था । अंय समूहों solubilize क्रिस्टल वायलेट इथेनॉल का उपयोग करें; जो शिगेला के लिए , के लिए नेतृत्व में और फिल्म के स्थिरीकरण reproducibility समझौता किया । वर्तमान में हम उन कारकों की जांच कर रहे हैं जो शिगेला फिल्म में घुलनशील इथेनॉल हो सकते हैं । एक अंय उदाहरण के ConA धुंधला द्वारा EPS उत्पादन के ठहराव है । एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट फ्लोरोसेंट जांच विधि (चरण ४.१) अर्द्ध मात्रात्मक मान FITC-संयुग्मित ConA के लिए बाध्यकारी की मात्रा को प्रतिबिंबित निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है । हमारी जानकारी के लिए, विधि पहली बार इस रणनीति की रिपोर्ट किया गया है । सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से eps का पता लगाने के साहित्य में स्वीकार किया जाता है और एक अलग है, लेकिन मानार्थ, रणनीति EPS कल्पना करने के लिए अनुमति देता है । अर्द्ध मात्रात्मक प्रतिदीप्ति जांच EPS के फोकल सूक्ष्म पता लगाने के साथ संयुक्त निश्चित रूप से डेटा को मजबूत, विशेष रूप से ऊपर वर्णित सूक्ष्म विश्लेषण में DAPI counterstain प्रक्रिया की सीमाओं को देखते हुए । सभी में, यहां वर्णित परख के सेट में एक महत्वपूर्ण ताकत यह है कि प्रत्येक तकनीक एक और दृष्टिकोण पूरक के लिए एक गतिशील आकलन करने के लिए वृद्धि दे पित्त नमक-प्रेरित-प्रवेश रोगजनकों में फिल्म निर्माण ।

पित्त लवण और विषमय के रूप में विचित्रता दर्जी बैक्टीरियल रोगजनन के प्रतिमान में शामिल कर रहे हैं, यह पूर्वानुमानित है कि इन तरीकों को मॉडल को मांय करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, विशिष्ट जीन की भूमिकाओं की पहचान, अज्ञात समारोह के जीन की पहचान, और प्रदान नैदानिक उपभेदों के सामांय लक्षण वर्णन । इस बहुमुखी दृष्टिकोण की अनुमति देता है कि एक बार परिपक्व फिल्म है, जो इसलिए के प्रत्येक जीवाणु घटक के विशेष कार्यों की पहचान में सक्षम बनाता है खो दिया जा सकता है के एक पहलू में महत्वपूर्ण जीन की पहचान फिल्म । इसके अलावा, के रूप में तथ्य यह है कि मानव आंत के भीतर रोगज़नक़ अनुकूलन द्वारा स्पष्ट एक तेजी से होने वाली घटना है, पित्त नमक की भूमिका प्रेरित-फिल्म निर्माण एक नव की सराहना की, संरक्षित, और महत्वपूर्ण घटना है कि में होता है का एक उदाहरण है शिगेला संक्रमण के साथ ही अतिरिक्त दर्जी रोगजनकों ।

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Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

Acknowledgments

हम Rachael बी Chanin और ऐलेजैंड्रो Llanos-Chea तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । हम एंथनी टी Maurelli, ब्रायन पी हर्ले, Alessio Fasano, ब्रेट ई. Swierczewski, और बॉबी Cherayil इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों के लिए धंयवाद । इस काम को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान ग्रांट K22AI104755 (C.S.F.) ने समर्थन दिया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

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References

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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

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