Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Galle Salt-indusert Biofilm formasjonen i Enteric patogener: teknikker for identifikasjon og måling

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Denne protokollen gjør leseren til å analysere galle salt-indusert biofilm formasjonen i enteric patogener med en mangefasettert tilnærming for å fange dynamikken i bakteriell biofilm ved å vurdere etterlevelse, ekstracellulære polymere stoff matrix formasjon, og spredning.

Abstract

Biofilm formasjon er en dynamisk, flertrinns prosess som skjer i bakterier under harde forhold eller tider med stress. For enteric patogener, er en betydelig stressrespons indusert under gastrointestinal transport og galle eksponering, en normal del av menneskelige fordøyelse. For å overvinne bakteriedrepende effekten av galle, danne mange enteric patogener en biofilm hypotesen for å tillate overlevelse når transitt gjennom tynntarmen. Her presenterer vi metoder for å definere biofilm formasjon gjennom solid-fase tilslutning analyser samt ekstracellulære polymere stoff (EPS) matrix gjenkjenning og visualisering. Videre er biofilm spredning vurdering presentert for å etterligne analyse av hendelser utløse utgivelsen av bakterier under infeksjon prosessen. Crystal violet flekker brukes til å oppdage tilhenger bakterier i en høy gjennomstrømming 96-brønns plate overholdelse av analysen. EPS produksjon vurdering bestemmes av to analyser, nemlig mikroskopi farging av EPS matrise og semi kvantitativ analyse med en fluorescently-konjugerte polysakkarid bindende Lektiner. Endelig måles biofilm spredning gjennom kolonien teller og plating. Positive data fra flere analyser støtte karakterisering av biofilm og kan brukes til å identifisere galle salt-indusert biofilm formasjon i andre bakterielle stammer.

Introduction

Biofilm dannelsen er en viktig bakteriell overlevelsesstrategi indusert under harde forhold. Eksponering for bakteriedrepende forbindelser som antibiotika eller endringer i næringsstoffer eller oksygen tilgjengelighet induserer en stresset stat i bakterier som kan lindres gjennom biofilm dannelsen. En biofilm er preget av bakteriell vedlegg til en overflate eller andre bakterier og ledsages av utskillelsen av en EPS matrise hovedsakelig består av polysakkarider1,2,3. Biofilm formasjon er en dynamisk prosess der en kaskade av hendelser kulminerer i dannelsen av en moden tilhenger bakterielle samfunnet1,2,3. Bakterien produserer adhesins for å lette tidlig vedlegg skifting av adhesin genet uttrykket profiler for å styrke vedlegg under biofilm modning. Samtidig, slår EPS produksjon strøk den bakterielle samfunnet i en matrise å beskytte cellene fra det første trykk. Bakterier i biofilm er langsom voksende; og som sådan, gjør de fleste antibiotika ineffektive. Videre sparer den langsomme veksten energi til forholdene endres til fordel bakterievekst1,2,3. Etter de harde forholdene har gått, bakterier spre biofilm og gjenoppta en planktoniske livsstil1,2,3. Tradisjonelt biofilm er observert på overflater og en vedvarende klinisk utfordring på grunn av smitte reservoarene på katetre og i-bolig enheter1,2,3.

Biofilm formasjon ble nylig beskrevet for flere enteric patogener; bakterier som smitter tynntarmen eller kolon4. For Shigella arter, oppstår infeksjon i menneskelig kolon etter transitt gjennom fleste gastrointestinaltraktus. Under passasje gjennom tynntarm, er Shigella utsatt for galle; en lipid-nedverdigende vaskemiddel utskilles i tarmen til rette for fordøyelsen av lipider mens samtidig drepe de fleste bakterier5. Innstigning patogener har en unik evne til å motstå bakteriedrepende effekten av galle6. Vår siste analyse benyttet i vivo-liker kombinasjoner av glukose og galle salter å demonstrere robuste biofilm formasjon i S. flexneri og andre arter av Shigella, sykdomsfremkallende Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere Salmonella enterica serovar Typhi ble vist å danne en galle-indusert biofilm på grunn av unike kolonisering av gallbladder under kronisk infeksjon7,8,9, 10. i tillegg tidligere forskning med Vibrio11og12 vist biofilm formasjon svar galle. Derfor analysene utvidet galle-indusert biofilm formasjon observasjoner til andre patogener og bidra til å etablere demonstrasjon av bevarte enteric patogen svar til galle. I motsetning til kronisk biofilm som bakteriell genet transkripsjon er begrenset og celle senescence kan oppstå1,2,3, foreslår vi at enteric galle-indusert biofilm er mer midlertidig i naturen. Denne forbigående, virulente biofilm er stemplet av en rask demontering (som sett i spredning analysen) og forbedret virulens genuttrykk observert i biofilm befolkningen4,6. 

Biofilm formasjon er en multifaceted, dynamisk prosess og bruk av galle salter som en initiering faktor har bare vært nylig beskrevet for mest enteric patogener, er verktøy og teknikker som brukes unike og kreative programmer av tradisjonelle metoder. Dermed er presenteres her tre gratis strategier for å kvantifisere flere viktige egenskaper av galle salt-indusert biofilm formasjon, inkludert bakteriell etterlevelse, produksjon av EPS matrix og spredning av levedyktig bakterier fra biofilm. Disse teknikkene har vært benyttet for forskning med Shigella; og derfor evaluering av andre enteric patogener kan kreve optimalisering. Likevel positive data fra alle tre analyser støtter identifikasjon av biofilm og etablere reproduserbar protokoller for galle salt-indusert biofilm formasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av reagenser

  1. Galle salter medium: for å forberede tryptic soya kjøttkraft (TSB) som inneholder 0,4% gallesalter (vekt/volum), resuspend 200 mg av galle salter i 50 mL autoklaveres TSB. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk medium ukentlig.
    Merknader: Galle salter som rutinemessig brukes er en 1:1 blanding av natrium cholate og natrium deoxycholate isolert fra ovine og storfe gallbladders. Som vist tidligere4, var tilstedeværelsen av glukose nødvendig for galle salt-indusert biofilm-formasjonen. TSB har lagt til glukose i forhold til Luria-Bertani (LB) kjøttkraft; og derfor var tilstrekkelig til å indusere biofilm formasjon i Shigella og andre enteric patogener analysert. Avhengig av bakterier som skal analyseres, kan ulike glukose konsentrasjoner eller annen sukker krav være nødvendig.
  2. 0,5% w/v-crystal violet i vann: oppløse 2.5 g av crystal fiolett i 500 mL destillert vann. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm.
  3. Concanavalin A (ConA) konjugert til fluorescein isothiocyanate (FITC): Rekonstituer bestanden i 1 x PBS. Fortynne 10 mg konsentrert aksjen med 400 μL 1 x PBS til en siste konsentrasjon av 25 µg/mL, og beskytte mot lyset.
  4. PBS + glukose: Oppløse 0.2 g glukose i 10 mL 1 x PBS (2% w/v glukose siste). Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk ved bruk.
  5. PBS + galle salter: Oppløse 40 mg i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v gallesalter siste). Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk ved bruk.
  6. PBS + glukose og galle salter: oppløse 40 mg gallesalter og 0.2 g glukose i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v gallesalter og 2% w/v glukose siste). Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk ved bruk.
  7. Forberede LB agar plater.
  8. Formaldehyd/glutaraldehyde fastsette: legge til 810 µL formaldehyd (37% lagerløsning, 3% siste konsentrasjon) og 125 µL glutaraldehyde (25% lagerløsning, 0,25% siste konsentrasjon) å 14 mL 1 x PBS. Bland godt og lagre på 4 ° C. Hurtigreparasjonen skal kaldt for riktig bruk.
    Forsiktig: Reparasjonen er giftig og krever farlig avfall avhending.
  9. Antifade tilstopper løsning: Bruk antifade tilstopper løsning som inneholder 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) flekken for å hemme photobleaching av immunofluorescent mikroskopi prøver mens fluorescently flekker DNA av bakterier.

2. forberedelse av bakterier

  1. Vokse overnatting kulturer av bakteriell stammene å bli testet av vaksinere 3 mL TSB med en enkel, godt isolerte koloni i et sterilt kultur rør. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 225 rpm for overnatting inkubering (16-24 h).
    Merk: Stammer bør være restreaked fra fryseren aksjer hver 2 til 4 uker, og vedlikeholdt på platene ikke mer enn 2 uker gamle.

3. solid-fase tilslutning analysen

Merk: Denne analysen kvantifiserer tilhenger bakterier bruke en 96-brønns plate. Bakterier er dyrket statisk i flat bunnplater. Vask utføres for å fjerne ikke-tilhenger bakterier og tilhenger bakterier er farget med crystal fiolett. Crystal violet flekken binder Peptidoglykan i bakteriell celleveggen og kan være solubilized med etanol. Antall tilhenger bakterier bestemmes basert på crystal violet oppbevaring.

  1. Definere to 1,5 mL rør. Etikett med TSB eller TSB + galle salter (BS).
  2. Legge til 1 mL av TSB eller TSB + BS respektive rørene.
  3. Vaksinere rør med 20 µL av natten kultur (på en 1:50 fortynning).
  4. Legg 130 µL/vel uninoculated kontroll medier i en steril, klare, flat bunn, vev kultur-behandlet 96-brønns plate, tre brønner som Tom kontrollen. Definere tre kontroll brønner for hver medietype (TSB og TSB + BS) skal testes.
  5. Legge til 130 µL/vel inokulerte kultur i tre brønner og gjenta til alle eksperimentelle forhold er belagt i tre eksemplarer.
  6. Inkuber 4-24 h på 37 ° C statisk.
  7. Bruke en plate leser, post OD600. Angi kontroll brønnene som "tomt." Bekreft kontroll mediet klart med bevis for turbiditet. Hvis noen turbiditet oppdages, forkaste eksperimentet. OD600 verdiene kan brukes til å normalisere dataene hvis det er betydelige forskjeller i vekst mellom bakteriell stammer.
  8. Fjerne kultur medium med en vakuum linje ved forsiktig vippe platen og langsomt aspirating middels på nedre kant av brønnen. Husk å samle alle kultur medium uten å forstyrre tilhenger bakteriell befolkningen på plast overflaten. Hvis EPS matrix ble produsert under inkubasjon tid, visualiseres matrisen som en hvit utløse. Ikke forstyrr EPS matrix.
  9. Forsiktig vaske brønnene gang med 200 µL sterilt PBS. Fjerne PBS vask ved hjelp av vakuum linjen.
  10. Invertere plate tørke. Beregn minst 20 min tørke.
    Merk: Siden biofilm må tørkes grundig før farging, protokollen kan være midlertidig stanset på dette trinnet i noen timer eller selv over natten. Den ekstra tørketid vil ikke endre flekker prosedyren mens ufullstendig tørking påvirker kvantifisering av resultatene og reproduserbarhet.
  11. Tilsett 150 µL av 0,5% crystal fiolett til hver eksperimentelle og kontroll godt.
  12. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
  13. Vask brønnene gang med 400 µL destillert vann. Ekstra volumet bidrar til å fjerne gjenværende crystal violet flekk fra sidene av brønnene. Fjerne vask med vakuum linjen.
  14. Vask brønnene fem ganger med 200 µL destillert vann. Fjerne vask med vakuum linjen.
    Merk: Grundig vask er viktig for kvantifisering. Når tom brønnene er klart fra destillert vann og ikke inneholder noen gjenværende crystal violet flekken, fortsette til neste trinn.
  15. Invertere plate tørke, beskyttet mot lyset. Sikre fullstendig tørke av platen som nevnt ovenfor.
  16. Destain brønner med 200 µL av 95% etanol. Inkuber plate shaker i 30 min. For å unngå fordamping, spesielt ved høyere temperaturer-utføre dette trinnet på 4 ° C.
  17. Bruke en plate leser, post OD540.
    Merk: Bølgelengden for maksimal absorbansen av crystal fiolett er nær 590 nm. Litteraturen rapporterer et område fra OD540 - OD5954,13,14,15,16 for crystal violet absorbansen; dermed velge en bølgelengde tilgjengelig basert på plate leseren.

4. EPS Matrix gjenkjenning

Merk: Disse gratis analyser kvantifisere og visualisere LOO. I begge, er EPS oppdaget bruker en Lektiner binde polysakkarider. Fluorescently-konjugerte protein kan kvantifisering (trinn 4.1) eller visualisering (trinn 4.2).

  1. Semi kvantitative påvisning av LOO
    1. Definere to 1,5 mL rør. Etikett med TSB eller TSB + BS.
    2. Legge til 1 mL av TSB eller TSB + BS respektive rørene.
    3. Vaksinere rør med 20 µL av natten kultur (en 1:50 fortynning).
    4. Legg 130 µL/vel uninoculated kontroll medier i en steril, svart, flat bunn, vev kultur-behandlet 96-brønns plate, tre brønner som Tom kontrollen. Definere tre kontroll brønner for hver middels skal testes. Legg 130 µL/vel inokulerte kultur fordelt, og gjenta til alle eksperimentelle forhold er belagt i tre eksemplarer.
    5. Inkuber 4-24 h på 37 ° C statisk.
    6. Overføre kultur mediet til en klar 96-brønns plate med en pipette, ideelt en flerkanals pipette. Være forsiktig å samle alle kultur medium uten å forstyrre tilhenger befolkningen og/eller EPS på plast overflaten. Avsatt.
    7. Fastsette den svarte platen i 15 min på RT med 200 µL/brønn av formaldehyd/glutaraldehyde i 1 x PBS.
    8. Mens befolkningen tilhenger er feste, evaluere supernatant brøken fra trinn 4.1.6. Bruke en plate leser, post OD600. Angi kontroll brønnene som "tomt." Bekreft kontroll mediet klart med bevis for turbiditet. Hvis noen turbiditet oppdages, forkaste eksperimentet.
      1. Alternativt kan hele analysen utføres i en svart klart bunnplaten. I de tilfeller OD600 verdiene som kan registreres og kultur medium kan deretter kastes før du fortsetter å gå 4.1.7. OD600 verdiene kan brukes til å normalisere dataene i tilfelle det er betydelige forskjeller i vekst mellom bakteriell stammer.
    9. Fjern hurtigreparasjonen og kast i farlig avfall.
    10. Forsiktig vaske brønnene to ganger med 200 µL/godt av sterile PBS. Fjerne PBS vask med vakuum linjen ved forsiktig vippe platen og langsomt aspirating vask i nedre kant av brønnen.
    11. Legge til 150 µL/vel 25 µg/ml ConA-FITC og ruge i 15 min på RT.
    12. Forsiktig vaske to ganger med 200 µL av PBS.
    13. Tilsett 150 µL av PBS hver brønn. Registrere fluorescens på 488 nm.
  2. AC confocal mikroskopi visualisering av EPS produksjon og beregning av biofilm tykkelse
    1. Definere to 1,5 mL rør. Etikett med TSB eller TSB + BS.
    2. Legge til 1 mL av TSB eller TSB + BS respektive rørene.
    3. Vaksinere rør med 20 µL av natten kultur (på en 1:50 fortynning).
    4. Definere en steril 24-vel plate med 12 mm sterilt runde glass coverslips. Legge til 400 µL/vel uninoculated kontroll medier tre brønner som Tom kontrollen. Definere tre kontroll brønner for hver middels skal testes.
    5. Legge til 400 µL inokulerte kultur i brønnene i duplikat, og gjenta til alle eksperimentelle forhold er belagt.
    6. Inkuber 4-24 h på 37 ° C statisk.
    7. Visuelt kontrollere veksten i TSB tilstand, vekst og EPS utløse (hvit) i TSB + BS tilstand, og ingen vekst og/eller hvit bunnfall i sterilt kontroll brønner. Fjerne supernatants.
    8. Fastsette for 15 min på RT med 200 µL/brønn formaldehyd/glutaraldehyde løsning på 1 x PBS.
    9. Fjern hurtigreparasjonen og kast i farlig avfall.
    10. Forsiktig vaske brønnene to ganger med 200 µL/godt av sterile PBS. Fjerne PBS vask ved hjelp av vakuum linjen.
    11. Legge til 150 µL/vel 25 µg/ml ConA-FITC og ruge i 15 min på RT.
    12. Forsiktig vaske to ganger med 200 µL/godt av PBS.
    13. Montere antifade tilstopper løsning med DAPI.
      Merk: Løsningen er en ferdige, glyserol-baserte mount løsning som inneholder DAPI for å bevare fluorescerende etiketten mens samtidig flekker DNA i bakterieceller for visualisering som en counterstain. Følg kit retninger og anbefalinger for inkubasjon ganger før imaging prøver. DAPI flekker prosedyren kan utføres før du installerer antifade tilstopper løsning som ikke inneholder DAPI.
    14. Vurdere ved AC confocal mikroskopi. I en AC confocal mikroskop, sett laseren til 495 nm/519 nm eksitasjon/utslipp for FITC visualisering. Angi en andre laser 360 nm/460 nm eksitasjon/utslipp å visualisere DAPI. Finn biofilm ved å fokusere på DAPI kanalen. Bruke både DAPI og FITC kanaler angi full tykkelsen og angi øvre og lavere imaging grenser. Registrere tykkhet Z stabel bilder ved å ta bilder hver 0,25 µm etter perimeters til toppen og bunnen av z-stakken. For mer informasjon om AC confocal mikroskopi, se publikasjoner av Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Rekonstruere 3D-bilder i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) å visualisere hele biofilm dannelse og beregne biofilm tykkelsen. Den gjennomsnittlige tykkelsen innhentet for S. flexneri galle-salt-indusert biofilm var 14 µm4.

5. spredning analysen

Merk: I denne analysen, demontering av biofilm gjennom bakteriell dispersjon er oppdaget. Her modne biofilm opprettes og senere (vanligvis neste dag), erstattes med PBS media eller suppleres PBS. Komponenten supernatant vurderes deretter for å quantitate antall bakterier som har skilt fra biofilm.

  1. Definere to 1,5 mL rør. Etikett med TSB eller TSB + BS.
  2. Legge til 1 mL av TSB eller TSB + BS respektive rørene.
  3. Vaksinere rør med 20 µL av natten kultur (på en 1:50 fortynning).
  4. Legg 130 µL/vel uninoculated kontroll medier i en steril, klare, flat bunn, vev kultur-behandlet 96-brønns plate, tre brønner som Tom kontrollen. Definere tre kontroll brønner for hver medietype skal testes.
  5. Legg 130 µL/vel inokulerte kultur tre brønner, og gjenta til alle eksperimentelle forhold er belagt i tre eksemplarer.
  6. Inkuber platen i 4-24 h på 37 ° C statisk.
  7. Før du fortsetter, varme på PBS, PBS + glukose, PBS + galle salter, og PBS + galle salter + glukose til 37 ° C. Forberede disse reagensene fresh daglig.
  8. Bruke en plate leser, post OD600. Angi kontroll brønnene som "tomt." Bekreft mediet klart med bevis for turbiditet. Hvis noen turbiditet oppdages, forkaste eksperimentet. OD600 verdiene kan brukes til å normalisere dataene hvis det er betydelige forskjeller i vekst mellom bakteriell stammer.
  9. Fjerne kultur mediet bruker en vakuum linje. Husk å samle alle kultur medium uten å forstyrre tilhenger befolkningen på plast overflaten.
  10. Forsiktig vaske brønnene to ganger med 200 µL/godt av sterile PBS. Fjerne PBS vask ved hjelp av vakuum linjen.
  11. Erstatte vask med 130 µL/godt av følgende i tre brønner: PBS, PBS + glukose, PBS galle salter, og PBS + galle salter ++ glukose. Skal disse reagensene må forvarmes til 37 ° C.
  12. Inkuber platen i 30 min på 37 ° C.
  13. Nøye fjerne platen fra 37 ° C inkubator. Overføring av supernatants til en frisk og sterile 96-brønns plate.
  14. Bruke en 96-brønns tallerken eller fortynning blokk, forberede 10-fold (1:10) føljetong fortynninger av nedbryting i sterilt PBS.
    Merk: Fortynning serien skulle variere fra ufortynnet til 10-6 avhengig av bakterielle belastningen skal testes. Piloten eksperimenter kan utføres for å bestemme optimale fortynning området.
  15. Flekk tallerken 5 µL av hver fortynning på LB agar bruker en flerkanals pipette. Ruge på 37 ° C over natten. Telle kolonier på neste dag og konto for fortynningsfaktoren når utvinning kolonien danner enheter (CFU). For å beregne prosent spredning i forhold til 1 x PBS kontroll (sette på 100%), kan du dele utvinning CFU fra betingelsene behandling av utvinning CFU fra 1 x PBS kontroll prøven.
    Merk: Rutinen media plater for bakterielle belastningen av interesse kan også brukes. For eksempel kan Shigella være belagt på Kongo red plater. Sikre platene er tørt for spot-plating teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 1, er biofilm formasjon indusert i de fleste av seks enteric patogener testet følgende vekst i media som inneholder galle salter. En betydelig økning i tilhenger bakterier etter galle salter eksponering er observert i nesten alle stammer testet. Unntaket er enteroaggregative E. coli (EAEC); men oppmerksom indusert observasjon av Δaaf mutant4. Resultatene indikerer at ytterligere tilslutning mekanismer er indusert av galle salter eksponering i EAEC i fravær av overholdelse av aggregative fimbriae jeg (AAF / jeg)21. Trekke konklusjoner fra datasettet, plot OD540 verdiene for hver belastning og media testet. Sammenligne verdiene fra hver stamme i kontrollen media (-BS) i forhold til inneholder galle salter som vil avgjøre hvis galle salter betydelig skape biofilm. Sammenligninger mellom bakteriell stammer og/eller mutanter kan også utføres for videre karakterisering analyser.

ConA-FITC vurdering av EPS vises i figur 2. Figur 2A representerer semi kvantitativ vurdering av EPS produksjon der ConA-FITC brukes stain på biofilm. ConA binder til polysakkarider i EPS matrix og hvor beholdt oppdages av en fluorescerende plate leser. Presentere dataene, plot gjennomsnittlig fluorescens enhetene for hver tilstand og sammenligne biofilm-inducing forholdene til kontrollen negative. I tillegg kan sammenligninger mellom bakteriell stammer eller mutanter utføres. Det er viktig å analysere en medier bare, negative kontroll for å bestemme mengden av bakgrunnen ConA-FITC fluorescens som oppstår for plate. Betingelsen TSB var ikke signifikant forskjellig fra mediekontroll, mens fluorescens opplesninger betydelig økt følgende galle salter eksponering. Data bekrefte at EPS produksjon antyder biofilm dannelse og oppstår ikke i fravær av galle salter for S. flexneri. Bilder av galle salt-indusert biofilm i S. flexneri er representert i figur 2B. ConA-FITC brukes stain polysakkarider i EPS-matrise mens en DAPI counterstain brukes til å visualisere bakterier ved farging DNA. For bakterier ikke utsatt for galle salter (negativ kontroll), registreres bare DAPI. Spesielt er tettheten av bakterier mye lavere enn galle salter tilstanden. En klar bakgrunn på FITC kanalen oppnås for å angi manglende EPS produksjon. Som forventet, viser data at EPS produksjon er korrelert med biofilm formasjon1,2,3 etter galle salter eksponering. -ConA flekker kontroll i galle salt-behandlet prøvene er forutsatt for å demonstrere spesifisiteten av FITC fluorescens. For disse bildene, 1 x PBS ble brukt i stedet for ConA-FITC og DAPI counterstain ble opprettholdt. Bildebehandling kan utføres med et AC confocal mikroskop å vurdere tykkelsen på biofilm med EPS-positive eksempler4.

Bakteriell spredning fra biofilm i Figur 3 oppdages av rugende etablerte biofilm i PBS eller supplert PBS. Fysiologisk galle er reabsorbed inn sirkulasjon i tynntarmen og bare 5% av galle angir kolon5. Som Shigella invaderer colonic epitel, vi hypothesize at reabsorpsjon av galle er en viktig signal for biofilm spredning. I denne illustrasjonen oppstår spredning i biofilm utsatt for PBS eller PBS + glukose; Imidlertid er dispersjon hemmet i PBS + galle salter uavhengig av tilstedeværelse av glukose. Dataene viser at fjerning av galle salter er nødvendig og tilstrekkelig til å indusere spredning av S. flexneri galle salt-indusert biofilm4. Hvis du vil tegne inn dataene, kan enten de gjenopprettede CFU av bakterier eller relativ prosent til kontroll (som vist her) tegnes.

Figure 1
Figur 1: galle salter skape biofilm i enteric patogener. 18 h biofilm dyrket på vev-kultur behandlet 96-brønns plater i enten TSB eller TSB + 0,4% galle salter media og farget med 0,5% crystal fiolett. Kvantitative verdiene fra etanol solubilization krystall violet flekken ble fastsatt av spectrophotometry på OD540. Galle salter eksponering betydelig økt biofilm formasjon i Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi og S. enterica serovar Typhimurium. Statistisk betydning ble bestemt av student T-test for hver stamme sammenligne galle salter behandling til media kontrollen. Standard feil av gjsnitt (SEM) representeres av feilfeltene. Alle p-verdier er < 0,0001. Dataene er fra en (n = 3) representant eksperiment, med et komplett sett med data i en tidligere publikasjon4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: galle salt-indusert biofilm formasjon er preget av produksjon av en EPS matrise som oppdages med FITC-merket Concanavalin A. (A) Sterile svart, 96-brønns plate var sådd med S. flexneri på en 1:50 fortynning i TSB eller TSB + galle salter og vokst for 18 h. biofilm er løst, forsiktig vasket og farget med ConA-FITC. Mengden beholdt Concanavalin-A FITC ble bestemt av en fluorescerende plate leser. Verdiene som tegnes inn vise EPS kvantifisering følge veksten av S. flexneri vokst TSB eller TSB inneholder galle salter. Betydning var bestemt av enveis ANOVA og p -verdier er < 0,01. SEM er representert ved feilfeltene. Dataene er fra en (n = 3) representant eksperiment, med et komplett sett med data i en tidligere publikasjon4. (B) mikroskopi bilder fra en galle salt-indusert Shigella biofilm. Sterilt coverslips var sådd med S. flexneri på en 1:50 fortynning i TSB eller TSB + galle salter og vokst for 18 t. Coverslips ble deretter fast og farget med ConA-FITC og/eller counterstained med DAPI. ConA-FITC fant bare galle salter tilstanden på grunn av tilstedeværelsen av EPS matrix. En dekkglassvæske bare med DAPI i TSB + galle salter behandling ble brukt til å demonstrere minimal bakgrunn fluorescens for innstillingen FITC på AC confocal mikroskopet. Bilder for hver bølgelengde kanal og en sammensatt overlegg tilbys for alle behandling forhold. Skala stolper angir 10 µm. dataene er fra en (n = 3) representant eksperiment, med et komplett sett med data i en tidligere publikasjon4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: analyse av bakteriell spredning fra galle salt-indusert biofilm. 18 h galle salt-indusert Shigella flexneri biofilm ble utsatt for PBS eller PBS med glukose, galle salter eller en kombinasjon av glukose og galle salter. Nedbryting ble senere serielt utvannet og belagt på agar plater nummerere kolonien danner enheter (CFUs) som spres av biofilm. Hvor mange bakterier utvinnes ble tegnet inn i forhold til kontrollen PBS. Bakterier spres fra biofilm i PBS eller PBS + glukose forhold og tilstedeværelse av galle salter var tilstrekkelig til å hindre bakteriell spredning fra biofilm. Dataene er fra en (n = 3) representant eksperiment, med et komplett sett med data i en tidligere publikasjon4. For referanse gjenvunnet rutinemessig 100-fold mer bakterier fra PBS kontroll behandling (ca 7 x 107 CFU) forhold til PBS + galle salter behandling (ca 7 x 105 CFU). Betydning var bestemt av enveis ANOVA og p -verdier er < 0,0001. SEM er representert ved feilfeltene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse av biofilm formasjon er utfordrende på grunn av dynamikken i biofilm og variasjonen mellom stammer, materialer, laboratorier og analyser. Her presenteres flere strategier for å fastslå biofilm formasjonen i enteric patogener etter galle salter eksponering med eksperimentelle innsikt forsynt for å fremme reproduserbarhet. Det er flere hensyn å sikre reproduserbarhet. Først og fremst, anbefales det at du utfører minst tre uavhengige eksperimenter med teknisk triplicates å bekrefte observasjoner og statistiske betydning på grunn av variasjoner som kan oppstå. Andre er bruken av positive og negative kontroller avgjørende for å sikre reproduserbarhet til analysen. Det anbefales å bruke wild type belastningen som en positiv når du vurderer mutanter for biofilm-formasjonen. Videre, som gener som er viktige for biofilm formasjon er identifisert (for eksempel se Vibrio22, Salmonella7og E. coli23,24,25), bruk av biofilm mutanter som negative kontroller validerer reproduserbarhet til analysen. Tredje er metodene ovenfor basert på fokusert forskning med Shigella og S. flexneri, spesielt. Justeringer protokollene kan være nødvendig utløst vekst hver enteric patogen evalueres. Fjerde, analyser måle en bakteriell stressrespons; og derfor er det viktig å arbeide med riktig vedlikeholdt bakterier fra frosne aksjer (-80 ° C) eller lagring plater holdt under nedkjøling (maksimalt 4 ° C) i mer enn to uker. Det er viktig å merke seg at noen bakterier inkludert enteric patogener i Yersinia slekten er psychrotrophs som kan vokse med temperatur nær 0 ° C26. Siden lagring ved nedkjølt temperaturer kan endre bakteriell fysiologi og muligens resultere i genotypic eller fenotypiske endringer27,28,29, er det sterkt anbefalt å forberede dele det lager kultur ved-80 ° C i rutinemessig vaksinering til startkulturer. Videre krever arbeider med kliniske isolater hyppigere restreaks fra-80 ° C aksjer som genetiske endringer er raskt observert når overgang en klinisk-avledet bakterielle belastningen i laboratoriet sette30,31 . Spesielt arbeider med Shigella isolerer, stammer tilpasse raskt og fenotypen Skift oppstår ofte32,33. Det anbefales å restreak bakterier fra fryseren aksjer når en måned og restreak lager plate annenhver uke.

En annen viktig faktor å sikre reproduserbarhet er frisk forberedelse av galle salter media å begrense variasjon av analysen. Galle salter media eldre enn 1 uke påvirket negativt robust fenotypen observert med fersk media forberedelse. Videre, avhengig av patogen og hvilken eksponering å være analysert (tynntarmen versus kolon), ulike kilder og blandinger av galle salter som kan være nødvendig. For eksempel personlige galle salter, bøyd og de konjugert kilder, eller grov galle ekstrakter som inneholder ekstra galle komponenter som kolesterol og bilirubin kan være utnyttet5,6. Shigella analyser har fokusert på bakteriell tilpasning til verten under overføringen av tynntarmen før infeksjon i tykktarmen. Derfor etterligner bruk av en cholate og deoxycholate blanding forholdene i tynntarmen5,6,34. Også når det gjelder spredning analysen (del 5), er det angitt at PBS-supplert reagensene skal gjøres fresh daglig og pre varme til 37 ° C før analysen. Når reagenser eldre enn noen få dager ble brukt, ble reproduserbarhet til analysen kraftig svekket. Det var også avgjørende å forvarme disse reagensene 37 ° c som spredning ikke oppstår lett med romtemperatur reagenser. Til slutt, spredning metoder for vurdering av komplett titer opplisting av biofilm kan brukes som inkluderer sonication35,36 eller enzymatisk fordøyelsen37. Tilnærming til spredning analysen var rettet mot å vurdere effekten av galle salt reabsorpsjon som Shigella transporter fra terminal ileum og inn i tykktarmen. Analysen var basert på hypoteser at tapet av galle salter ville aktivere spredning av forbigående biofilm og at Shigella må spre biofilm før forårsaker infeksjon i colonic epitel4,5 . Sonication og enzymatiske fordøyelsen representerer totalt utgivelsen av mikrobielle masse fra biofilm mens strategien presenteres her emulerer ileum kolon overgang å fange en fysiologisk fenotypen for Shigella. Avhengig av ønsket eksperimentelle forhold, kan ekstra metoder for spredning analyse eller biofilm opplisting være nødvendig.

Analyser er designet for å være moderat høy gjennomstrømming med bruk av 96-brønns plater å aktivere testing av flere bakteriell stammer og/eller betingelser. For ytterligere å sikre reproduserbarhet biofilm formasjonen, ble flat bunn, 96-brønns plater som var vev kultur behandlet brukt. Tekniske årsaker måle plate lesere ikke nøyaktig absorbansen eller fluorescens i runde bunnplater. I tillegg tilbys ubestrøket plater varierende etterlevelse profiler i Shigella, som en avenue for gjeldende etterforskning. Analyser kan skaleres til større godt formater proporsjonalt, men vil kreve endringer i protokollen som kan redusere eksperimentelle effektivitet. For eksempel må kultur media overføres til cuvettes å registrere OD600 verdier med et spektrofotometer. I tillegg til crystal violet-farget biofilm kan være scraping etter en 30-60 min inkubasjon i 95% etanol destain trinn og innholdet kan overføres til søppel for spektrofotometer avlesninger på OD540. Hensyn må tas når utrangering innholdet i biofilm i hver brønn for å unngå sprut, og vi har funnet at utrangering er lettere etter en 60 min inkubasjon.

Analyse med Shigella, Salmonella, og patogene E. coli4 vist en gjentatt observasjon at biofilm formasjon oppstår i en akselerert tidsskalaen (innen 24 timer) for enteric patogener utsatt for galle salter. I motsetning til andre bakterier som krever 48 til 72 h å observere biofilm formasjon under normale forhold, begynner galle salt-indusert enteric biofilm så tidlig som 4 h med overholdelse av første fase. Deretter EPS matrix formasjon er tydelig ved 6 h og modning oppstår av 24 timer. Slik kanskje etterlevelse fenotypen på 24 h også robust å dechiffrere rollen overholdelse av ulike faktorer i biofilm formasjonen. Utføre tidlig analyser, for eksempel kan så tidlig som 4 h, identifisere faktorer viktig i tidlig biofilm formasjon som ellers ville gå glipp på et senere tidspunkt. Til slutt, og som nevnt ovenfor i protokollen trinnene, ble galle salt-indusert biofilm formasjonen for Shigella ikke funnet i fravær av glukose4. Siden EPS matrix består hovedsakelig av polysakkarider, og er et viktig skritt i biofilm formasjonen for de fleste bakterier38, er glukose eller andre sukker i media sannsynligvis viktig å observere biofilm formasjon. Avhengig av bakteriell patogen analysert, kan ulike base media formuleringer være nødvendig.

Biofilm formasjon er en flerlags prosess som ofte oppstår i et åpent system hvor næringsstoffer fluks og flytende bevegelse lett oppstå1,2,3. Metodene er begrenset av lukkede kulturen og statisk vekst krav; imidlertid aktivere metodene vurdering av biofilm formasjonen i innstillingen laboratorium. Etter identifikasjon av biofilm fenotypen, kan ytterligere eksperimenter ved hjelp av flytende celler eller kontinuerlig kultur strategier39,40,41 gi ekstra mekanistisk innsikt i fysiologiske eller klinisk betydningen av biofilm formasjon. Identifikasjon av EPS matrix bruker protokollene polysakkarid-bindende Lektiner ConA. ConA binder α-D-glucosyl eller sterically-nært beslektet rester42. Forskjellige lectins kan være nødvendig avhengig av type EPS produsert for ulike arter eller arter. En alternativ strategi å identifisere EPS produksjon er massespektrometri, som vil gi både bekreftelse at EPS produseres og bestemme sammensetningen av EPS matrix43,44. I tillegg, kan bruk av DAPI counterstain medføre betydelig lysstyrke gitt antall bakterier i biofilm eller forekomsten av ekstracellulære DNA som er ofte tilstede i EPS matrix45,46.

Det finnes alternativer til metodene ovenfor beskrevet i litteraturen. For eksempel er solid-fase bindende analysen rapportert for bruk i andre patogener (for eksempel referanser4,25,47,48,49). Det er endringer i protokollen mellom publikasjoner; Derfor strategier presenteres her er en lett-å-kopiere format. Det er viktig å merke seg at protokollene angir luft-tørking biofilm før flekker (trinn 3.10) mens noen grupper foretrekker å fikse biofilm. De to ulike tilnærmingene kan representere varierende patogen-spesifikke strategier. I tillegg ved å forberede crystal violet flekken i vann, ble en konsekvent biofilm formasjon fenotypen oppdaget. Andre grupper bruker etanol til solubilize krystall violet; som for Shigella, førte til destabilization av biofilm og kompromittert reproduserbarhet. Vi er nå undersøke hvilke faktorer som kan være etanol løselig i Shigella biofilm. Et annet eksempel er kvantifisering av EPS produksjonen av ConA flekker. En 96-brønns plate fluorescerende oppdagelsen metoden (trinn 4.1) presenteres for å fastslå semi kvantitative verdier som gjenspeiler hvor mye FITC-konjugerte ConA binding til biofilm. Vi vet er metoden første gang denne strategien har blitt rapportert. EPS oppdagelsen via mikroskopisk undersøkelse er akseptert i litteratur og tillater en annen, men gratis, strategi å visualisere EPS. Semi kvantitative fluorescens deteksjon kombinert med AC confocal mikroskopiske påvisning av EPS styrket sikkert dataene, spesielt på grunn av begrensningene for DAPI counterstain prosedyren i mikroskopi analysen beskrevet ovenfor. I alt er en betydelig styrke i settet med analyser beskrevet her at hver teknikk utfyller en annen tilnærming for å gi opphav til en dynamisk vurdering av galle salt-indusert biofilm formasjonen i enteric patogener.

Galle salter og virulente biofilm er inkorporert i paradigme enteric bakteriell patogenesen, er det ventet at disse metodene skal brukes til å validere modeller, identifisere roller av bestemte gener, identifisere tilblivelse av ukjent funksjon og gi generell karakteristikk av klinisk stammer. Denne mangefasetterte tilnærming gjør identifikasjon av gener viktig i ett aspekt av biofilm formasjon som kan gå tapt når den eldre biofilm opprettes, som gir derfor identifikasjon av spesialiserte funksjoner av hver bakteriell komponenten av den biofilm. Som tydelig ved at patogen tilpasning i menneskelige tarmen er et raskere forekommende fenomen, er rollen av galle salt-indusert biofilm formasjon et eksempel på et nylig verdsatt, bevart og kritisk fenomen som oppstår i Shigella infeksjon samt flere enteric patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk assistanse. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for stammene som er brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 135 Biofilm formasjon enteric patogener Shigella galle galle salter EPS matrise spredning
Galle Salt-indusert Biofilm formasjonen i Enteric patogener: teknikker for identifikasjon og måling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, K. P., Faherty, C. S.… More

Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter