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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Este protocolo permite al lector a analizar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos usando un enfoque multifacético para capturar la naturaleza dinámica de los biofilms bacterianos mediante la evaluación de adherencia, formación de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares, y de dispersión.

Abstract

Formación de biopelículas es un proceso dinámico y gradual que se produce en bacterias bajo condiciones ambientales difíciles o momentos de estrés. Para patógenos entéricos, se induce una respuesta de estrés importante durante el tránsito gastrointestinal y a la exposición de la bilis, un componente normal de la digestión humana. Para superar los efectos bactericidos de la bilis, muchos patógenos entéricos forman una biopelícula que se presumen para permitir sobrevivir al tránsito por el intestino. Aquí presentamos metodologías para definir la formación de biopelículas a través de ensayos de fase sólida adherencia así como detección de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y visualización. Además, se presenta evaluación de dispersión de biofilm para imitar el análisis de eventos desencadenar liberación de bacterias durante el proceso de infección. Tinción de cristal violeta se utiliza para detectar bacterias adherentes en un ensayo de adherencia de la placa de 96 pozos de alto rendimiento. Evaluación de producción de EPS está determinada por dos ensayos, a saber, microscopía de tinción de la matriz EPS y análisis semicuantitativo con una lectina de polisacárido conjugado fluorescente. Por último, dispersión de biofilm se mide a través de recuentos de colonias y chapado. Datos positivos de ensayos múltiples apoyan la caracterización de biopelículas y pueden ser utilizados para identificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en otras cepas bacterianas.

Introduction

Formación de biofilms es una estrategia importante de supervivencia bacteriana inducida durante duras condiciones ambientales. Exposición a compuestos bactericidas como antibióticos o cambios en los nutrientes o la disponibilidad de oxígeno induce un estado de estrés en las bacterias que pueden ser aliviadas a través de la formación de biopelículas. Una biopelícula se caracteriza por el accesorio de bacteria a una superficie o a otras bacterias y se acompaña de la secreción de la matriz de EPS conformada principalmente por polisacáridos1,2,3. Formación de biopelículas es un proceso dinámico en el que una cascada de eventos culmina en la formación de una comunidad bacteriana adherente madura1,2,3. Las bacterias producen adhesinas para facilitar el apego temprano mientras cambio de perfiles de expresión génica de adhesina para fortalecer el apego durante la maduración de la biopelícula. Al mismo tiempo, ocurre la producción de EPS para cubrir la comunidad bacteriana en una matriz para proteger las células contra el estresor inicial. Bacterias dentro del biofilm son de crecimiento lento; y como tal, la mayoría antibióticos ineficaces. Además, el lento crecimiento conserva energía hasta que las condiciones cambien para favorecer el crecimiento bacteriano1,2,3. Después de las duras condiciones, las bacterias dispersan el biofilm y reanudar un estilo de vida planctónica1,2,3. Tradicionalmente, los biofilms se observan en las superficies y representan un desafío clínico persistente debido a depósitos de infección en catéteres y en la vivienda aparatos1,2,3.

Formación de biofilms fue descrita recientemente por varios patógenos entéricos; bacterias que infectan el intestino delgado o colon4. Para las especies de Shigella , la infección ocurre en el colon humano después de un tránsito a través de la mayoría del tracto gastrointestinal. Durante el paso por el intestino, Shigella se expone a la bilis; un detergente de degradar lípidos secretado en el intestino para facilitar la digestión de lípidos mientras que simultáneamente mata la mayoría de las bacterias5. Patógenos entéricos tienen una capacidad única de resistir los efectos bactericidos de bilis6. Nuestro análisis recientes utilizaron en vivo-como combinaciones de glucosa y las sales biliares para demostrar formación de biofilm robusto en S. flexneri , así como otras especies de patógenos Shigella, Escherichia coliy Salmonella4. Previamente, Salmonella enterica serovar Typhi fue demostrado para formar un biofilm inducida por bilis debido a la colonización única de la vesícula biliar durante la infección crónica7,8,9, 10. Además, investigaciones previas con Vibrio11y Campylobacter12 demostraron la formación de biofilm en respuesta a la bilis. Por lo tanto, los análisis amplió las observaciones de la formación de biofilm inducida por bilis a otros patógenos y ayudan a establecer la demostración de una respuesta patógeno entérico conservado a bilis. A diferencia de la crónica biofilms que transcripción genética bacteriana limitada y senescencia celular puede ocurrir1,2,3, proponemos que el biofilm inducida por bilis entérico es más transitorio en naturaleza. Este transitorio, biofilm virulento se caracteriza por un desmontaje rápido (como se ve en el análisis de dispersión) y una mayor expresión de genes de virulencia en la biopelícula población4,6. 

Formación de biopelículas es un proceso multifacético, dinámico y el uso de las sales biliares como un factor de iniciación sólo ha sido recientemente descrito por patógenos entéricos más, las herramientas y técnicas utilizadas son únicas y creativas aplicaciones de los métodos tradicionales. Por lo tanto, aquí se presentan tres estrategias gratuitas para cuantificar varias características importantes de la formación de biofilm inducida por sales biliares, incluyendo la adherencia bacteriana, producción de la matriz EPS y la dispersión de bacterias viables del biofilm. Estas técnicas se han utilizado principalmente para la investigación con Shigella; y por lo tanto, la evaluación de otros patógenos entéricos puede requerir optimización. Sin embargo, datos positivos de los tres ensayos apoyan identificación de biofilms y establecen protocolos reproducibles para la formación del biofilm inducida por sales biliares.

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Protocol

1. preparación de reactivos

  1. Medio de las sales biliares: para preparar el caldo de soja tríptica (TSB) que contiene las sales biliares 0,4% (peso/volumen), resuspender 200 mg de las sales biliares en 50 mL esterilizado TSB. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco cada semana.
    Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente es una mezcla de 1:1 de colato sódico y desoxicolato de sodio aislado de las vesículas ovinas y bovinas. Como demostrado anteriormente4, la presencia de glucosa se requiere para la formación del biofilm inducida por sales biliares. TSB agrega glucosa en relación con caldo de Luria-Bertani (LB); y por lo tanto, era suficiente para inducir la formación de biofilm en Shigella y los otros patógenos entéricos analizados. Dependiendo de la bacteria a analizar, podrían necesitarse concentraciones diferentes de glucosa o azúcar diferentes requisitos.
  2. 0.5% w/v cristal violeta en agua: disolver 2,5 g de cristal violeta en 500 mL de agua destilada. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm.
  3. Concanavalina A (ConA) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir el stock en PBS 1 x. Diluir el caldo 10 mg concentrado con 400 μL de PBS 1 x a una concentración final de 25 μg/mL y proteger de la luz.
  4. PBS + glucosa: Disolver 0,2 g de glucosa en 10 mL 1 x PBS (glucosa 2% w/v final). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso.
  5. PBS + sales biliares: Disolver 40 mg en 10 mL 1 x PBS (0.4% w/v sales biliares finales). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso.
  6. PBS + glucosa y sales biliares: disolver las sales biliares 40 mg y glucosa 0,2 g en 10 mL 1 x PBS (0.4% w/v biliares sales y glucosa de 2% w/v final). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso.
  7. Preparar placas de agar LB.
  8. Solución de formaldehído/glutaraldehído: 810 añadir μl formaldehído (solución 37%, concentración final de 3%) y glutaraldehído de 125 μl (solución 25%, concentración final de 0.25%) a 14 mL 1 x PBS. Homogeneizar y almacenar a 4 ° C. La solución debe estar fría para el uso correcto.
    PRECAUCIÓN: La solución es tóxica y requiere de disposición de residuos peligrosos.
  9. Solución Antifade mountant: utilizar solución antifade mountant que contiene manchas de 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para inhibir el fotoblanqueo de muestras de microscopía inmunofluorescente y tinción fluorescente del ADN de las bacterias.

2. preparación de las bacterias

  1. Crecen durante la noche cultivos de cepas bacterianas a probarse al inocular 3 mL de TSB con una colonia sola, bien aislada en un tubo de cultivo estéril. Incubar a 37 ° C con agitación a 225 rpm para la incubación durante la noche (16-24 h).
    Nota: Las cepas deben ser restreaked de las existencias del congelador cada 2 a 4 semanas y placas de mantenimiento en no más de 2 semanas de edad.

3. fase sólida adherencia ensayo

Nota: Esta prueba cuantifica las bacterias adherentes utilizando un método de placa de 96 pocillos. Las bacterias se cultivan estáticamente en las placas de fondo plano. Lavado se realiza para eliminar las bacterias no adherente y bacterias adherentes se tiñen con cristal violeta. El colorante violeta cristal une peptidoglicano en la pared celular bacteriana y puede ser solubilizado con etanol. El número de bacterias adherentes se determina basado en retención de violeta cristal.

  1. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + sales biliares (BS).
  2. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos.
  3. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución).
  4. En una placa de 96 pocillos estéril, clara, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medios de comunicación (TSB TSB + y BS) para ser probado.
  5. Agregar 130 μL/pocillo de cultivo inoculados en tres pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado.
  6. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente.
  7. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como 'en blanco'. Confirmar que el medio de control es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos si existen diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas.
  8. Retire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío inclinando suavemente la placa y aspirando lentamente el medio en el borde inferior del pozo. Asegúrese de recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población bacteriana adherente en la superficie de plástico. Si la matriz EPS fue producido durante el tiempo de incubación, la matriz será visualizada como un precipitado blanco. No molestes a la matriz EPS.
  9. Lave suavemente los pozos una vez con 200 μL de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío.
  10. Invertir la placa para secar. Deje un mínimo de 20 minutos para secar.
    Nota: Puesto que el biofilm debe secarse completamente antes de la tinción, el protocolo puede ser pausado en este paso por unas horas o incluso durante la noche. El tiempo de secado adicional no modificará el procedimiento de tinción mientras que el secado incompleto afecta a la cuantificación de los resultados y la reproducibilidad.
  11. Añadir 150 μL de violeta de cristal de 0.5% a cada uno experimental y el control también.
  12. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (RT).
  13. Lavar los pozos una vez con 400 μL de agua destilada. El volumen agregado ayuda a eliminar residuos cloruro de metilrosanilina de los lados de los pocillos. Retire la colada con la línea de vacío.
  14. Lavar los pocillos 5 veces con 200 μL de agua destilada. Retire la colada con la línea de vacío.
    Nota: Lavado cuidadoso es importante para la cuantificación. Cuando los pocillos del blanco de agua destilada y no contienen ningún residual cloruro de metilrosanilina, proceder al siguiente paso.
  15. Invertir la placa para seco, protegido de la luz. Asegurar un secado completo de la placa como se señaló anteriormente.
  16. Desmanchar los pozos con 200 μL de etanol al 95%. Incube la placa en el agitador durante 30 minutos. Para evitar la evaporación, particularmente en temperaturas más altas, realizar este paso a 4 º C.
  17. Usando un lector de placas, grabar la OD540.
    Nota: La longitud de onda de máxima absorbancia de la violeta cristalina es cerca de 590 nm. La literatura reporta un rango de OD540 - OD5954,13,14,15,16 violeta cristal absorbencia; por lo tanto elegir una longitud de onda disponible en el lector de la placa base.

4. EPS matriz detección

Nota: Estos ensayos gratuitos cuantifican y visualizar la EPS. En tanto, EPS se detecta mediante una lectina de polisacáridos se unen. La proteína fluorescente conjugado permite cuantificación (paso 4.1) o visualización (paso 4.2).

  1. Detección semicuantitativa de EPS
    1. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS.
    2. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos.
    3. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (un 1:50 dilución).
    4. En una placa de 96 pocillos estéril, negro, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medio ser probado. Añadir 130 μL/pocillo de cultivo inoculados a los pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado.
    5. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente.
    6. Transfiera el medio de cultivo a una placa de 96 pocillos claro con una pipeta, idealmente una pipeta multicanal. Ser cauteloso para recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población adherente o la EPS se encuentra en la superficie de plástico. Ponga a un lado.
    7. Fije la placa negra durante 15 min a TA con 200 μL/pocillo de formaldehído/glutaraldehído en 1 x PBS.
    8. Mientras que la población adherente es fijación, evaluar la fracción sobrenadante del paso 4.1.6. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como 'en blanco'. Confirmar que el medio de control es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento.
      1. Por otra parte, el ensayo completo puede realizarse en una placa de fondo negro claro. En estas circunstancias, los valores de OD600 pueden grabarse y el medio de cultivo pueden ser posteriormente desechado antes de proceder al paso 4.1.7. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos en el caso hay diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas.
    9. Retire el parche y deshacerse de los residuos peligrosos.
    10. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío inclinando suavemente la placa y lentamente aspirando el lavado en el borde inferior del pozo.
    11. Añadir 150 μL/pocillo de ConA-FITC de 25 μg/mL e incubar por 15 min a TA.
    12. Suavemente Lave dos veces con 200 μL de PBS.
    13. Añadir 150 μL de PBS a cada pocillo. Registrar la fluorescencia a 488 nm.
  2. Visualización de la microscopia confocal de la producción de EPS y cálculo del espesor de la biopelícula
    1. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS.
    2. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos.
    3. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución).
    4. Configurar una placa de 24 pocillos estéril con 12 mm redondo vidrio cubreobjetos estériles. Añadir 400 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medio ser probado.
    5. Añadir 400 μL de cultivo inoculados a wells por duplicado y repita hasta que todas las condiciones experimentales son plateadas.
    6. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente.
    7. No confirmar visualmente el crecimiento en la condición TSB, crecimiento y precipitado EPS (blanco) en el TSB + condición de BS y crecimiento o precipitado blanco en los pozos control estéril. Eliminar el sobrenadante.
    8. Fijar durante 15 min a temperatura ambiente en 200 μL/pocillo de solución de glutaraldehído formaldehído / de 1 x PBS.
    9. Eliminar la solución y disponer de residuos peligrosos.
    10. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío.
    11. Añadir 150 μL/pocillo de ConA-FITC de 25 μg/mL e incubar por 15 min a TA.
    12. Suavemente Lave dos veces con 200 μL/pocillo de PBS.
    13. Monte con solución antifade mountant con DAPI.
      Nota: La solución es una solución de montaje prefabricado, basado en el glicerol que contiene DAPI para conservar la etiqueta fluorescente mientras que simultáneamente tinción el ADN en células bacterianas para la visualización como un contraste. Siga las instrucciones y recomendaciones del kit para tiempos de incubación antes de la proyección de imagen muestras. El DAPI procedimiento de tinción se puede realizar antes de aplicar la solución antifade mountant que contienen DAPI.
    14. Evaluar por microscopía confocal. En un microscopio confocal, ajustar el láser a 495 nm/519 nm excitación/emisión para visualización de FITC. Establecer un segundo láser a 360 nm, 460 nm excitación/emisión visualizar DAPI. Localice el biofilm, centrándose en el canal DAPI. Utilizar canales de la DAPI y FITC para determinar el espesor completo y la parte superior e inferior imagen fronteras. Grabar imágenes de todo el espesor Z-stack mediante la captura de imágenes cada 0.25 μm después de establecer perímetros en la parte superior e inferior de la pila de z. Para obtener más información sobre microscopía confocal, consulte publicaciones por Prado et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Reconstruir las imágenes 3D en ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar la formación de biofilm completo y calcular el espesor de la biopelícula. El espesor medio obtenido por S. flexneri sales biliares inducida por biofilms fue de 14 μm4.

5. ensayo de dispersión

Nota: En este ensayo, el desmontaje del biofilm a través dispersión bacteriana se detecta. Aquí, se establecen biofilms maduros y posteriormente (generalmente al día siguiente), los medios de comunicación se sustituyen con PBS o suplido PBS. El componente sobrenadante es luego evaluado para cuantificar el número de bacterias que han disociado de la biopelícula.

  1. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS.
  2. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos.
  3. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución).
  4. En una placa de 96 pocillos estéril, clara, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medios de comunicación ser probado.
  5. Añadir 130 μL/pocillo de cultivo inoculados a tres pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado.
  6. Incubar la placa por 4-24 h a 37 ° C estáticamente.
  7. Antes de continuar, caliente la PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa a 37 ° C. Preparar diariamente de estos reactivos.
  8. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como 'en blanco'. Confirman que el medio es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos si existen diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas.
  9. Retire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío. Asegúrese de recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población adherente en la superficie de plástico.
  10. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío.
  11. Sustituir el lavado con 130 μL/pocillo de los siguientes en tres pozos: PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa. Estos reactivos deben ser precalentados a 37 ° C.
  12. Incube la placa durante 30 min a 37 ° C.
  13. Retire con cuidado la placa de la incubadora de 37 ° C. Transferir el sobrenadante a una placa de 96 pocillos estéril, fresca.
  14. Usando un bloque de 96 pocillos la placa o dilución, preparar 10 veces (1:10) diluciones seriadas del sobrenadante en PBS estéril.
    Nota: La serie de diluciones debe estar comprendida de no diluido a 10-6 dependiendo de la cepa bacteriana para ser probado. Experiencias piloto se pueden realizar para determinar el rango de dilución óptima.
  15. Spot de la placa 5 μl de cada dilución en agar LB con una pipeta multicanal. Incubar a 37 ° C durante la noche. Contar las colonias en los próximos días y cuenta para el factor de dilución para determinar la Colonia recuperación formando unidades (UFC). Para calcular la dispersión por ciento en comparación con el 1 x PBS control de (100%), dividir la recuperación UFC de cada condición de tratamiento por la recuperación de UFC de la muestra de control de 1 x PBS.
    Nota: Las placas de los medios de comunicación de rutina para la cepa bacteriana de interés también pueden ser utilizadas. Por ejemplo, Shigella puede ser plateado en las placas de rojo Congo. Asegúrese de que las placas estén secas para técnicas apropiadas de la galjanoplastia del lugar.

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Representative Results

En la figura 1, formación de biopelículas se induce en la mayor parte del crecimiento siguiente prueba seis patógenos entéricos en medios que contienen sales biliares. Un aumento significativo de bacterias adherentes después de la exposición de las sales biliares se observa en casi todas las cepas probadas. La excepción es enteroaggregative e. coli (CEEA); sin embargo, tenga en cuenta la observación inducida de los mutantes de laaaf Δ4. Los resultados indican que los mecanismos de adherencia adicional son inducidos por la exposición de sales biliares en CEEA en ausencia de fimbrias de adherencia agregativa (AAF / I)21. Para sacar conclusiones de este conjunto de datos, trazar los valores de OD540 para cada tipo de cepa y medios de prueba. Comparar los valores de cada cepa en el control de los medios de comunicación (-BS) en relación con los medios de comunicación que contiene sales biliares determinará si sales biliares significativamente inducen la formación de biopelículas. Comparaciones a través de cepas bacterianas o mutantes pueden realizarse también para mayores análisis de caracterización.

La evaluación de la ConA-FITC de EPS se presenta en la figura 2. Figura 2A representa la evaluación semicuantitativa de la producción de EPS en la que ConA-FITC se utiliza para teñir los biofilms. El ConA se une a los polisacáridos en la matriz EPS y la cantidad retenida es detectada por un lector de placas de fluorescentes. Para presentar los datos, las unidades de fluorescencia promedio para cada condición de parcela y comparar las condiciones de inducción de biopelícula para el control negativo. Además, se pueden realizar comparaciones a través de cepas bacterianas o mutantes. Es fundamental analizar un control sólo de los medios de comunicación, negativo para determinar la cantidad de fluorescencia FITC ConA que se produce para la placa de fondo. La condición TSB no fue significativamente diferente desde el control de los medios de comunicación, mientras que la exposición de fluorescencia lecturas significativamente mayor siguiente sales biliares. Los datos confirman que la producción de EPS es indicativa de la formación de biopelículas y no ocurre en la ausencia de sales biliares por S. flexneri. Las imágenes de sales biliares inducida por biopelículas de S. flexneri es representado en la figura 2B. ConA-FITC se utiliza para la tinción de polisacáridos en la matriz EPS mientras una contratinción DAPI se utiliza para visualizar las bacterias por tinción el ADN. Bacterias no expuestas a sales biliares (control negativo), se detecta sólo DAPI. En particular, la densidad de bacterias es mucho menor que en la condición de las sales biliares. Se obtiene un fondo claro en el canal FITC para indicar la falta de producción de EPS. Como era de esperar, los datos demuestran que la producción de EPS está correlacionada con biofilm formación1,2,3 después de la exposición de las sales biliares. El ConA - coloración de control en las muestras tratadas con sales biliares se proporciona para demostrar la especificidad de la fluorescencia FITC. Estas imágenes, de 1 x PBS fue utilizado en lugar de ConA-FITC y se mantuvo la contratinción DAPI. La proyección de imagen puede realizarse con un microscopio confocal para evaluar el espesor de los biofilms con la EPS-positivos muestras4.

Dispersión bacteriana de biopelículas en la figura 3 se detecta por incubación biofilms establecidos en PBS o PBS suplementado. Fisiológico, bilis es reabsorbida en la circulación en el intestino y sólo el 5% de la bilis entra en el colon5. Shigella invade el epitelio colónico, presumimos que la reabsorción de la bilis es una señal importante para la dispersión de la biopelícula. En esta figura, la dispersión ocurre en biofilms expuestos a PBS o PBS + glucosa; sin embargo, la dispersión es inhibida en PBS + sales biliares independientemente de la presencia de glucosa. Los datos demuestran que la eliminación de las sales biliares es necesario y suficiente para inducir la dispersión de S. flexneri de biofilms inducida por sales biliares4. Para trazar los datos, se puede trazar la UFC recuperada de las bacterias o el porcentaje relativo al control (como se muestra aquí).

Figure 1
Figura 1: sales biliares inducen formación de biofilm en patógenos entéricos. 18 h biofilms fueron cultivados en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos tratado o TSB o TSB + 0.4% sales biliares medios y teñidos con violeta de cristal de 0,5%. Valores cuantitativos de solubilización de etanol de la tinción de cristal violeta se determinaron por espectrofotometría a540de la OD. Exposición de las sales biliares aumentó significativamente la formación de biopelículas en Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropatógeno Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi y S. enterica serovar Typhimurium. Significación estadística fue determinada por T-test el estudiante para cada cepa que compararon el tratamiento de las sales biliares para el control de los medios de comunicación. El error estándar de la media (SEM) está representado por las barras de error. Todos los p-los valores son < 0.0001. Datos mostrados son de uno (n = 3) experimento representativo, con un conjunto completo de datos en una publicación anterior4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: formación de biopelículas inducida por sales biliares es caracterizada por la producción de una matriz EPS que se ha detectado marcado con FITC concanavalina A. (A) estéril negro, placa de 96 pocillos fueron sembradas con S. flexneri en un 1:50 dilución en TSB o TSB + sales biliares y de 18 h. Biofilms se fijaron, cuidadosamente lavada y teñida con ConA-FITC. La cantidad de retenidos Concanavalin-A FITC se determinó por un lector de placas de fluorescentes. Los valores graficados demuestran cuantificación EPS tras el crecimiento de S. flexneri cultivada en TSB o TSB conteniendo las sales biliares. Significancia se determinó por ANOVA unidireccional y p-los valores son < 0.01. El SEM está representado por las barras de error. Datos mostrados son de uno (n = 3) experimento representativo, con un conjunto completo de datos en una publicación anterior4. Imágenes de microscopía (B) de una biopelícula de Shigella inducida por sales biliares. Cubreobjetos estériles fueron sembradas con S. flexneri en un 1:50 dilución en TSB o TSB + sales biliares y de 18 h. El cubreobjetos se fija posteriormente y teñidas con ConA-FITC o contratinción con DAPI. ConA-FITC se detectó sólo en la condición de las sales biliares debido a la presencia de la matriz EPS. Un cubreobjetos teñido con DAPI en el TSB + sales biliares tratamiento fue utilizado para demostrar la fluorescencia del Fondo mínimo para la creación de FITC en el microscopio confocal. Imágenes para cada canal de longitud de onda y un recubrimiento compuesto están previstas todas las condiciones de tratamiento. Barras de escala indican 10 μm. datos que se muestran son de una (n = 3) experimento representativo, con un conjunto completo de datos en una publicación anterior4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de dispersión bacteriana de biopelículas inducida por sales biliares de. 18 h inducida por sales biliares Shigella flexneri biopelículas fueron expuestos a PBS o PBS suplementado con glucosa, sales biliares o una combinación de glucosa y sales biliares. El sobrenadante fue posteriormente en serie diluido y revestido en placas de agar para enumerar las colonias formando unidades (UFC) que dispersa el biofilm. El número de bacterias que se recuperó fue trazado con respecto al control de PBS. Bacterias dispersaron de la biopelícula en la PBS o PBS + glucosa condiciones, pero la presencia de sales biliares fue suficiente para inhibir la dispersión de bacteria desde el biofilm. Datos mostrados son de uno (n = 3) experimento representativo, con un conjunto completo de datos en una publicación anterior4. Para referencia, bacterias más 100-fold fueron recuperadas rutinariamente desde el tratamiento de control de PBS (aproximadamente 7 x 107 UFC) en comparación con el PBS + sales biliares tratamiento (aproximadamente 7 x 105 UFC). Significancia se determinó por ANOVA unidireccional y p-los valores son < 0.0001. El SEM está representado por las barras de error.

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Discussion

Análisis de la formación de biofilm es un reto debido a la naturaleza dinámica de biofilms y la variabilidad entre cepas, materiales, laboratorios y ensayos. Aquí, se presentan varias estrategias para determinar la formación de biopelículas en patógenos entéricos después de la exposición de las sales biliares con conocimiento experimental para promover la reproducibilidad. Hay consideraciones adicionales para asegurar la reproducibilidad. Ante todo, recomendamos realizar independiente por lo menos tres experimentos con técnica triplicado para confirmar observaciones y significación estadística debido a la variación que puede ocurrir. En segundo lugar, el uso de controles positivos y negativos es vital para garantizar la reproducibilidad del ensayo. Se recomienda utilizar la cepa de tipo salvaje como control positivo al evaluar de mutantes para la formación del biofilm. Además, como se identifican los genes que son importantes para la formación de biopelículas (por ejemplo, ver22de Vibrio, Salmonella7y e. coli23,24,25), el uso de mutantes de biofilm como controles negativos validarán la reproducibilidad del ensayo. En tercer lugar, los métodos anteriores se basan en investigación con Shigella y S. flexneri, en particular. Ajustes de los protocolos pueden ser necesarios dependiendo de las necesidades de crecimiento de cada patógeno entérico evaluadas. En cuarto lugar, los ensayos de medir una respuesta bacteriana al estrés; y por lo tanto, es fundamental trabajar con bacterias apropiadamente mantenidas de acciones congeladas (-80 ° C) o placas de almacenamiento de información guardadas en refrigeración (máximo 4 ° C) durante no más de dos semanas. Es importante tener en cuenta que algunas bacterias como patógenos entéricos del género Yersinia son psychrotrophs que pueden crecer a temperaturas cercanas a 0 ° C26. Puesto que el almacenamiento a temperaturas de refrigeración puede alterar la fisiología bacteriana y posiblemente provocar genotípico o fenotípicos cambios27,28,29, se recomienda preparar alícuotas de la cultivo a-80 ° C para inoculación rutinaria en los cultivos. Además, trabajar con aislamientos clínicos requiere más frecuentes restreaks de la acción de-80 ° C como cambios genéticos se observan rápidamente cuando una cepa bacteriana clínico derivado de la transición en el laboratorio de ajuste de30,31 . Trabajando especialmente con Shigella aislamientos, cepas rápidamente adaptan y fenotipo cambios ocurren a menudo32,33. Se recomienda a las bacterias restreak de las existencias del congelador una vez un mes y restreak la acción de la placa cada dos semanas.

Otro factor importante para asegurar la reproducibilidad es fresco preparación de los medios de comunicación de las sales biliares para limitar la variabilidad de la prueba. Sales biliares medios mayores de 1 semana impactó negativamente el fenotipo robusto observado con la elaboración de medios frescos. Por otra parte, dependiendo del patógeno y el tipo de exposición a ser analizado (intestino delgado y colon), diferentes fuentes y mezclas de sales biliares pueden ser requeridos. Por ejemplo, individuales las sales biliares, conjugado conjugado de fuentes, o extractos de bilis cruda que incluyan componentes adicionales de la bilis como el colesterol y la bilirrubina puede ser utilizaron5,6. Análisis de Shigella se han centrado en la adaptación bacteriana al host durante el tránsito del intestino antes de la infección en el colon. Por lo tanto, el uso de una mezcla de cholate y desoxicolato imita las condiciones del intestino5,6,34. También en relación con el análisis de la dispersión (sección 5), se especifica que los reactivos suplementada con PBS son diario fresco y calentado previamente a 37 ° C antes del ensayo. Cuando se utilizaron reactivos más de unos pocos días, fue comprometida seriamente la reproducibilidad del ensayo. También fue crítico para precalentar los reactivos a 37 º C como dispersión no ocurre fácilmente con reactivos de temperatura. Finalmente, pueden utilizarse métodos de dispersión para la evaluación de enumeración completa título del biofilm, que incluyen sonicación35,36 o37de la digestión enzimática. El enfoque para el análisis de dispersión fue dirigido a evaluar el efecto de reabsorción de sales biliares como Shigella tránsitos del íleon terminal y el colon. El análisis se basó en las hipótesis de que la pérdida de sales biliares permitiría a dispersión de la biopelícula transitoria y que Shigella deben dispersar la biopelícula antes causando infección en el epitelio colónico4,5 . Condiciones como sonicación y digestión enzimática representan liberación total de la masa microbiana de la biopelícula, mientras que la estrategia presentada aquí emula el íleon a la transición de colon para capturar un fenotipo fisiológico para Shigella. Dependiendo de las condiciones experimentales deseadas, otros métodos para la enumeración de dispersión análisis o biofilm pueden ser necesarios.

Los ensayos están diseñados para ser moderadamente alto rendimiento con el uso de placas de 96 pocillos para comprobar múltiples cepas bacterianas o condiciones. Para asegurar reproducibilidad de la formación de biopelículas, se utilizaron placas de fondo plano, 96-well que fueron de cultivo de tejidos tratado. Por razones técnicas, lectores de placa no pueden medir con precisión la absorbencia o la fluorescencia en placas de fondo redondo. Además, las placas sin recubrimiento ofrecen perfiles de adherencia variable en Shigella, que es una avenida de investigación actual. Los ensayos se pueden escalar a grandes formatos bien proporcionalmente, pero requerirán las alteraciones del protocolo que pueden reducir la eficiencia experimental. Por ejemplo, los medios de cultivo tendrá que ser transferida a las cubetas para registrar los valores de OD600 con un espectrofotómetro. Además, se puede raspar la biopelícula teñido de cristal violeta después de una incubación de 30-60 min en el etanol al 95% desmanchar paso y puede transferir el contenido a una cubeta para la lectura del espectrofotómetro en OD540. Debe tenerse cuidado al desechar el contenido de la biopelícula en cada pozo para evitar salpicaduras, y hemos encontrado que desguace es más fácil después de una incubación de 60 minutos.

Análisis con Shigella, salmonela y patógeno e. coli4 demostró una observación repetida que la formación de biopelículas ocurre en una escala de tiempo acelerado (dentro de 24 h) para patógenos entéricos expuestos a sales biliares. Al contrario de otras bacterias que requieren de 48 a 72 h para observar la formación de biopelículas en condiciones normales, inducida por la sal biliar entérica biofilm comienza tan pronto como 4 horas con la fase de adherencia inicial. Posteriormente, la formación de matriz EPS es evidente por 6 h y maduración se produce por 24 h. Por lo tanto, el fenotipo de la adherencia a las 24 h puede ser demasiado robusto para descifrar el papel de los factores de adherencia diferentes en formación de biopelículas. Análisis temprano, por ejemplo tan pronto como 4 h, permite para la identificación de los factores importantes en la formación temprana de biofilm que si no te puedes perder en un momento posterior. Finalmente y como se ha mencionado anteriormente en los pasos del Protocolo, no se detectó formación de biopelículas inducida por sales biliares para Shigella en ausencia de glucosa4. Puesto que la matriz EPS se compone sobre todo de polisacáridos y es un paso crítico en la formación de biopelículas por bacterias más38, la presencia de glucosa u otro azúcar en los medios de comunicación es probablemente importante para observar la formación de biopelículas. Según el patógeno bacteriano analizado, formulaciones de diferentes medios de comunicación en la base pueden ser necesarias.

Formación de biopelículas es un proceso de varias capas que a menudo ocurre en un sistema abierto donde flujo de nutrientes y un movimiento fluido fácilmente ocurren1,2,3. Los métodos están limitados por la cultura cerrada y estática crecimiento requisitos; sin embargo, los métodos permiten la evaluación de la formación de biofilm en el entorno de laboratorio. Sobre la identificación del fenotipo de biofilm, más experimentos con las células del líquido o de estrategias de cultura continua39,40,41 puede proporcionar visión mecanicista adicional fisiológico o clínico importancia de la formación de biopelículas. Para la identificación de la matriz EPS, los protocolos utilizan el polisacárido lectina ConA. ConA une a residuos de α-D-glucosil o sterically-estrechamente relacionados con42. Diferentes lectinas pueden ser necesarias dependiendo del tipo de EPS producido para diferentes géneros o especies. Una estrategia alternativa para identificar producción EPS es espectrometría de masas, que proporcionará tanto verificación que EPS es producido y determinar la composición de la matriz EPS43,44. Además, la utilización de la contratinción DAPI puede resultar en brillo importante dado el número de bacterias en el biofilm o la aparición de ADN extracelular que está a menudo presente en la matriz EPS45,46.

Hay alternativas a los métodos anteriores descritos en la literatura. Por ejemplo, el ensayo de fase sólida encuadernación se ha divulgado para su uso en otros patógenos (por ejemplo, referencias4,25,47,48,49). Hay modificaciones en el protocolo entre publicaciones; y por lo tanto, las estrategias presentadas aquí son un formato fácil de replicar. Es importante tener en cuenta que los protocolos especifican biofilms secado al aire antes de la tinción (paso 3.10) mientras que algunos grupos prefieren fijar los biofilms. Los dos enfoques diferentes pueden representar diferentes estrategias específicas del patógeno. Además, mediante la preparación de la tinción de cristal violeta en el agua, se detectó un fenotipo de formación de biopelícula consistente. Otros grupos utilizan etanol para solubilizar cristal violeta; que para Shigella, conducido a la desestabilización de los biofilms y reproducibilidad en peligro. Actualmente estamos investigando los factores que pueden ser etanol soluble en la biopelícula de Shigella . Otro ejemplo es la cuantificación de la producción de EPS por ConA la coloración. Un método de detección fluorescente de placa de 96 pocillos (paso 4.1) se presenta para determinar valores semi cuantitativos que refleja la cantidad de conjugado FITC ConA vinculante a la biopelícula. A nuestro conocimiento, el método es la primera vez que esta estrategia se ha divulgado. Detección de EPS a través de la examinación microscópica es aceptada en la literatura y permite una estrategia diferente, pero complementario, visualizar EPS. La detección semicuantitativa de la fluorescencia combinada con la detección microscopio confocal de EPS sin duda fortaleció los datos, especialmente teniendo en cuenta las limitaciones del procedimiento de contratinción DAPI en el análisis de microscopía descrito anteriormente. En total, una fuerza importante en el conjunto de ensayos aquí descritos es que cada técnica complementa otro enfoque para dar lugar a una evaluación dinámica de la formación de biofilm inducida por sales biliares en patógenos entéricos.

Como las sales biliares y virulentos biofilms se incorporan el paradigma de la patogenia bacteriana entérica, se prevé que estos métodos se utilizarán para validar modelos, identificar funciones de genes específicos, identificar genes de función desconocida y proporcionar Caracterización general de las cepas clínicas. Este enfoque multifacético permite la identificación de genes importantes en uno de los aspectos de formación de biopelículas que se puede perder una vez el biofilm madurito se establece, que por lo tanto permite la identificación de funciones especializadas de cada componente bacteriano de la biofilm. Además, como es evidente por el hecho de que la adaptación del patógeno en el intestino humano es un fenómeno que ocurre rápidamente, el papel de la formación de biopelículas inducida por sales biliares es un ejemplo de un fenómeno recién apreciado, conservado y crítico que se presenta en Shigella infección, así como patógenos entéricos adicionales.

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Disclosures

Los autores no tienen ninguna revelación.

Acknowledgments

Agradecemos a Rachael B. Chanin y Alejandro Llanos-Chea para asistencia técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski y Bobby Cherayil para las cepas utilizadas en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y K22AI104755 de subvención de enfermedades infecciosas (C.S.F.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

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