Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse, rensing og bruk av fettsyrer inneholder liposomer

Published: February 9, 2018 doi: 10.3791/57324
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,3, 1
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

Liposomer inneholder én-kjeden amphiphiles, viser spesielt fettsyrer, forskjellige egenskaper sammenlignet med de som inneholder diacylphospholipids på grunn av de unike kjemiske egenskapene til enkelt kjede amphiphiles. Her beskriver vi teknikker, rensing, og bruk av liposomer består delvis eller helt av disse amphiphiles.

Abstract

Liposomer inneholder én-kjeden amphiphiles, viser spesielt fettsyrer, forskjellige egenskaper sammenlignet med de som inneholder diacylphospholipids på grunn av de unike kjemiske egenskapene til disse amphiphiles. Spesielt forsterke fettsyrer liposomer dynamiske karakter, på grunn av den relativt høye Løseligheten av enkelt-kjeden amphiphiles. Tilsvarende er liposomer inneholder frie fettsyrer mer følsomme for salt og divalent kasjoner, på grunn av sterk samspillet mellom karboksylsyre leder gruppene og metall ioner. Her beskriver vi metoder for forberedelse, rensing og bruk av liposomer består delvis eller hele enkelt kjede amphiphiles (f.eks, oleic syrer).

Introduction

Liposomer eller blemmer-avdelinger avgrenset bilayer membraner består av amphiphilic lipider - har funnet bruk i mange biomedisinsk applikasjoner som levering biler for legemidler, modeller av celle membraner, og utviklingen av syntetisk celler. Vi og andre har også ansatt liposomer som modeller av primitive cellemembranene i tidlige liv. 1 , 2 , 3 , 4 vanligvis i slike systemer, vi bruker enkelt-kjeden amphiphiles som inneholder bare én lipid hydrokarbon hale (f.eks, oljesyre) som disse molekylene er enklere å syntetisere uten fordelen av kodet protein enzymer moderne celler ansette.

Liposomer består av enkelt-kjeden lipider er lik de dannet fra diacylphospholipids (f.eks1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine eller POPC) i den grensen er sammensatt av bilayer membraner. Liposomer dannet fra enten klasse av lipider kan kan beholde en oppløst nyttelast, og forminsket og renset ved ulike teknikker. Flere viktige forskjeller resultat unike kjemiske egenskaper enkelt-kjeden lipider. Blemmer dannet av fosfolipider er stabile over et bredt pH-område, mens fettsyrer blemmer bare stabilt på nøytral til mildt grunnleggende pH (ca. 7-9), som krever visse pH i bufferen for vesicle forberedelse. Mesteparten av tiden, kan denne bufferen også inneholde bestemte løselige molekyler for vesicle innkapsling, som kan være enten funksjonelle materialer (f.eksRNA) for compartmentalized desinfisering eller enkel fluorescerende fargestoffer (f.eks, calcein ) for vesicle karakterisering.

Tilstedeværelse av bare en enkelt hydrokarbon kjede produserer en membran som er både mer gjennomtrengelig til solutes, samt mer dynamisk. I tillegg karboksylsyre leder gruppen i fettsyrer resultater i blemmer som er mer følsomme for tilstedeværelsen av salt og divalent kasjoner (f.eks, Mg2 +). Magnesium er en av de viktigste divalent kasjoner for å utløse biokjemiske reaksjoner i protocells for opprinnelse-of-life studier. I tidlige liv, før utviklingen av sofistikert protein enzym, kan RNA ha vært den dominerende polymer, på grunn av sin doble evnen til å selv replikere og utføre katalyse. Et representativt eksempel av en magnesium-krever relatert reaksjon er ikke-enzymatisk RNA kopiering, først vist i 1960. 5 når kjemisk aktivert RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binde til en eksisterende primer-mal, 3-hydroksyl gruppen av primer angrep den 5'-fosfat av en tilstøtende aktivert monomer å forskyve forlate grupper (dvs. 2-methylimidazole) og skjemaer bånd en ny phosphodiester. Denne RNA kopiering kjemi krever en høy konsentrasjon av Mg2 +, som må være chelated for å være kompatibel med fettsyrer protocells. 6 en annen Mg2 +-avhengige reaksjon er det katalysert av hammerhead ribozyme, som er kanskje den mest preget katalytisk RNA. Denne ribozyme, som kan rekonstitueres fra to korte oligonucleotides, utfører en selv-cleavage reaksjon som er praktisk å overvåke ved en gel SKIFT. Som sådan, er det ofte ansatt som en modell ribozyme i opprinnelse-of-life studier. 7 på grunn av et krav av denne ribozyme for unliganded magnesium, liposomer er vanligvis konstruert av en blanding av fettsyrer og fettsyrer glyserol estere, som er mer stabile til magnesium. 8 , 9 i denne protokollen presenterer vi teknikker vi har utviklet for forberedelse, manipulasjon, karakteristikk av disse vesikler og demonstrere bruk av disse vesikler som protocells til verten ikke-enzymatisk RNA kopiering og hammerhead ribozyme katalyse.

Protocol

1. vesicle forberedelse

  1. Utarbeidelse av tynne filmer
    1. Bruke gass stramt sprøyter til å overføre viss lipider som beskrevet i tabellen 1.1 til kloroform i et hetteglass.
    2. Fordampe resulterende løsningen under en strøm av nitrogen eller argon i avtrekksvifte.
    3. Underlagt den resulterende tynnfilm huset vakuum minst 2 h å fjerne noen kloroform rester. Lipid kan stå under vakuum natten på dette punktet.
  2. Utvanning av blemmer
    1. Forberede 10 mL av 5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8.0 hydration buffer ved oppløsning 31 mg av calcein pulver i 2,5 mL 1 M tris-HCl pH 8.0 bufferen og legge til en annen 7,5 mL deionisert (DI) vann.
    2. Pipetter 250 µL av over hydration buffer i en tom rør og legge 1.875 µL av 10 M NaOH for en siste 75 mM base (½ tilsvarer totalt fettsyrer). Overføre løsningen til tynn film av tørr lipid til skjemaet blemmer med en total lipid konsentrasjon av 0,15 M.
    3. Bruk høyhastighets (> 3000 rpm) vortexer til vortex resulterende blandingen for 4-5 s.
    4. La blandingen lipid-buffer på en lav hastighet (ca. 30 rpm) roterende shaker rehydrate, minst over natten.
  3. Størrelse på blemmer (valgfritt)
    1. Ved hjelp av pinsett, gjelde en filter-støtte for hver overflatebehandling av sprøyte portene i extruder.
    2. Våt hvert filter støtte med 250 mM tris-HCl, pH 8.
    3. Ved hjelp av pinsett, gjelder en i extruder o-ringer ett spor-risset inn 100 nm polykarbonat membran og filtrere støtter. Pass på at du ikke rive eller punktere membranen, skyv membranen i O-ring slik at god kontakt mellom de to flatene.
    4. Montere extruder, ta vare ikke for å fortrenge membranen og filteret støtter.
    5. Fylle en extruder sprøyte med ca. 250 mM tris 0,5 mL-HCl, pH 8. Denne sprøyte inn en side i extruder.
    6. Sett inn en tom sprøyte i den andre siden av extruder.
    7. For hånd, skyv stempelet til sprøyten som inneholder bufferen sakte (≤ 50 µL/s), og kontroller at motstand føles, spor-etset membranen er på plass og intakt. Det er nyttig å praktisere dette trinnet uten en membran i stedet for å måle den forventede nivået av motstand.
    8. Fjerne og tømme to sprøyter. Det er ikke nødvendig å rense to sprøyter på dette stadiet siden de inneholde buffer med identiske sammensetning liposome utarbeidelse.
    9. Legg liposome forberedelse i en av to sprøyter.
    10. Montere extruder med sprøyte som inneholder vesicle eksempel på venstre side og tom sprøyte på høyre side.
    11. For hånd, skyv stempelet til sprøyten som inneholder vesicle eksempel veldig sakte (10-25 µL/s).
    12. Nøye observere sprøyten til høyre i extruder; klart buffer først inn til høyre i extruder (ca. 50 µL, dette skyldes indre døde volumet i extruder), etterfulgt av en liten sky av ekstruderte liposomer. Umiddelbart stoppe skyve på dette punktet, fjerne sprøyten til høyre i extruder og forkaste denne løsningen.
    13. Erstatt sprøyten til høyre i extruder og extrude til venstre sprøyten er tom.
    14. Reversere retningen på extruder Gjenta trinn 13. Fortsett til ønsket antall sykluser (vanligvis 7, 9 eller 11); et oddetall brukes alltid å sikre FN ekstrudert liposomer ikke er samlet inn fra sprøyten først som inneholder pre nedbemanning liposome utarbeidelse.
    15. Forsiktig dispensere innholdet av rett inn i et Eppendorf rør og sett røret på en lav hastighet (ca. 30 rpm) roterende shaker rundt 0,5 h.
    16. Fortsett med vesicle rensing, som beskrevet i del 2. Ekstrudert blemmer bør brukes innen 24 timer eller nytt ekstrudert før neste gangs bruk.

2. vesicle rensing

  1. Utarbeidelse av vesicle rensing mobile fase
    1. Forberede 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hydration bufferen ved å legge 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 buffer, 3.75 mL DI vann til en 15 mL Falcon rør. Deretter legger 37,5 µL av 10 M NaOH (½ tilsvarer base i forhold til unesterified fettsyrer) til den hydration bufferen. Pipetter 235 µL av ren oljesyre direkte inn i Falcon røret gir en vesicle løsning med 0,15 M totalt lipider.
    2. Bruk høyhastighets (> 3000 rpm) vortexer å virvle blandingen for 4-5 s, deretter riste på en lav hastighet roterende shaker minst 2 h. Lipid utarbeidelse kan stå over natten på roterende shaker på dette punktet. Filtrere den mobile fasen gjennom 0.22 μm sprøyte filter enhet før bruk for å fjerne alle potensielle aggregat.
  2. Rensing av blemmer på Sepharose
    1. Fjern ca. 5 mL av ethanolic Sepharose 4B slurry fra flasken bruker en pipette. Gjelde dette for en engangs 10 mL kromatografi kolonne.
    2. La slurry å bosette seg og etanol gjennomflytsenhet til etanol nærmer seg toppen av massen.
    3. Bruke 5 mL deionisert vann til toppen av harpiks og la gjennomflytsenhet å vaske bort etanol rester.
    4. Bruke 250 mM tris-HCl, pH 8 i 1-2 mL deler til toppen av harpiks, søker en ny del hver gang væskenivået nærmer seg toppen av massen. Gjenta for 3 - 5 ganger.
    5. Klemme kolonnen på retorten stand, og koble spissen av kolonnen med stopcock kontakt og rør til brøkdel samleren. Legge til en annen del av buffer for å spyle slangen, nær stopcock når væskenivået i kolonnen nærmer seg toppen av harpiks.
    6. Bruk ekstrudert blemmer fra del 1 på toppen av harpiks bruker en 200 µL hindre, ta vare for å bruke vesicle utarbeidelse så jevnt som mulig på harpiks uten å berøre harpiks seng eller kolonnen veggen.
    7. Åpne stopcock for å starte strømmen og begynne å samle brøker i en 96-brønns plate. Bruke vesicle rensing mobile fase på toppen av massen 0,5-1 mL deler som bufferen reduserer, ta vare ikke for å tillate harpiks sengen tørke. Samle i fem-slipp fraksjoner, samle minst 36 brønner (tre rader med en 96-brønns plate).
  3. Fluorescens karakterisering av rensing fraksjoner
    1. Ta 96-brønns tallerkenen fra forrige inndeling og lese den på en plate leser (λex= 485 nm, λem= 515 nm).
    2. Tegne fluorescens resultatdataene som fluorescens vs brøkdel tall. Blemmer elute først, etterfulgt av unencapsulated brøken (figur 1).
  4. Repurification av blemmer overvåke vesicle lekkasje
    1. Gjenta rensing og karakterisering trinnene i avsnittene 2.2 og 2.3. Blemmer som har beholdt innholdet har ingen topp unencapsulated stoff (eller en liten en av ca. 5-10% intensitet av vesicle toppen).

3. Bruk av blemmer i nærvær av Magnesium

  1. Bruk unliganded magnesium
    1. Klargjøre og rense blemmer som beskrevet i delene 1, 2.1 og 2.2.
    2. Klargjør 1 mL av 50 mM MgCl2 løsning i 250 mM tris-HCl pH 8.0 buffer ved å legge til 250 µL 1 M tris-HCl pH 8.0 bufferen og 50 µL av 1 M MgCl2 700 µL av DI vann. Vortex å bland godt.
    3. For å gi ønsket magnesium konsentrasjonen av 5 mM, bland 0.9 mL renset blemmer og 100 µL av magnesium løsning og raskt rør for å minimere vesicle avbrudd av forbigående eksponering for blemmer høy lokal konsentrasjon av magnesium.
      Merk: Rask blanding av magnesium løsning er kritisk til vesicle stabilitet. Hvis magnesium og blemmer ikke er raskt blandet med umiddelbar vortexing, vil noen blemmer bli utsatt for høyere konsentrasjoner av magnesium, resulterer i inkonsekvente resultater fra prøve å prøve.
    4. La vesicle prøven på et vannglass for minst 30 min før repurification som beskrevet i 2.4 etter innholdet lekkasje. Legge til samme konsentrasjonen av magnesium som vesicle prøven til repurification mobile fase.
  2. Bruk liganded magnesium
    1. Klargjøre og rense blemmer som beskrevet i delene 1, 2.1 og 2.2.
      Merk: Bruk ½ tilsvarende KOH stedet for NaOH å deprotonate fatty syren; Det har blitt funnet at dette gir mer stabil liposomer i sin natur chelated MgCl2 systemer.
    2. Forberede 2M kalium citrate løsning og justere pH til 8.0 med KOH.
    3. Premix MgCl2 og kalium citrate på angitte forholdet (ca. 1:4 for stabil oljesyre blemmer) 250 mM tris-HCl pH 8.0 buffer.
    4. Legge til ferdigblandet magnesium citrate løsning vesicle prøven, kort vortex.
      Merk: Alltid premix magnesium og ligand løsning. Utsett aldri blemmer unchelated magnesium løsningen alene.
    5. La vesicle prøven på et vannglass for minst 30 min før repurification som beskrevet i 2.4. Legge til samme konsentrasjonen av magnesium og citrate som vesicle prøven til repurification mobile fase.

4. ikke-enzymatisk RNA kopiering blemmer

  1. Utarbeidelse av monodisperse RNA innkapslet blemmer
    1. Forberede en tørr oljesyre film som beskrevet i avsnitt 1.1.
    2. Forberede vesicle rehydrering buffer med 50 µM fluorescerende merket RNA primer, 150 µM RNA mal og 250 mM tris-HCl pH 8.0 med ½ tilsvarende KOH i forhold til oljesyre.
    3. Legge til 250 µL rehydrering bufferen lipid filmen og Følg trinn 1.2.2 og 1.2.3 gjøre blemmer med totalt 0,15 M lipid konsentrasjon.
    4. For å gjøre små unilamellar monodisperse blemmer, følg delen 1.3 for vesicle ekstrudering.
  2. Magnesium sitrat tillegg og vesicle rensing
    1. Premix magnesium og citrate aksjer, og bland dette med vesicle prøven til en siste lipid konsentrasjon av 0.1 M.
    2. Rense blemmer på Sepharose 4B størrelse utelukkelse kolonnen med 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.1 M lipider og magnesium og citrate som mobile fase.
    3. Samle vesicle fraksjoner av avsnittet 2.3.
  3. Primer forlengelsen reaksjon
    1. Forberede 200 mM 2-MeImpG (guanosine 5'-monofosfat 2-methylimidazolide) lager løsning med 250 mM tris-HCl pH 8.0. (Merk: Følg tidligere publisert protokollen10 for 2-MeImpG syntese.)
    2. Å starte primer forlengelsen reaksjon, overføre 150 µL av 2-MeImpG lager løsning til 450 µL vesicle prøve å nå en siste konsentrasjon av 75 mM lipid og 50 mM aktivert monomer. Start tidtaker og holde reaksjonen sample tumbling hele tiden.
    3. (Valgfritt) For kontinuerlig frisk monomer fôring, overføre 300 µL av reaksjon-løsning til et kammer av en lab konstruert små volumer liposome dialyzer11 og sette 300 µL fôring løsning i andre kammeret. Fôring løsningen skal inneholde alle ingrediensene på samme konsentrasjonen som reaksjon løsningen, unntatt erstatte RNA inneholder blemmer med Tom blemmer. Hver runde dialyse tar 1-24 h, avhengig av analytt og membranen brukes.
    4. Kinetisk studier, ta en 100 µL aliquot på hvert punkt og repurify aliquot gjennom en Sepharose 4B størrelse utelukkelse kolonne med 250 mM tris-HCl pH 8.0 som den mobile fasen.
    5. Samle vesicle fraksjoner i en 1,5 mL eppendorf tube.
    6. Pipetter Triton vesicle fraksjoner til en endelig rundt 0,1% v/v.
    7. Legg til 0,5 mL kaldt etanol til røret og ruge på-20 ° C i minst 2 timer.
    8. Sentrifuge alle prøvene for 16.1 × 1000 rcf (16,1 × g) for 10 min og forsiktig pipette ut væske. Vask RNA pellets med 70% kaldt etanol og sentrifuger igjen for 5 min. forkaste væsken og sette tuben med RNA pellets på en 80 ° C varme blokk i 2 minutter å fordampe gjenværende etanol. Oppløse pellets i 50 µL av 8 M Urea med 1xTBE lasting buffer.
  4. SIDE analyse
    1. Forberede 20% siden gel ved å blande 200 mL UreaGel systemet konsentrat, 25 mL av UreaGel system fortynningsmiddel, 25 mL av 10xTBE buffer, 80 µL av TEMED og 250 mg ammonium persulfate. Raskt hell gel blandingen mellom festet gel plater (35 cm x 45 cm) og sett kam. Vent minst 30 min før fullstendig polymerisasjon.
    2. Montere gel platen på stativet gel og fyll boksene gel med 1xTBE gel kjører buffer. Ta av kammen og tømme brønnene med sprøyte. Pre kjøre gel med 60 W i 30 min.
    3. Varme prøvene på 80 ° C varme blokk i 2 minutter og laste 5 µL av hvert utvalg per brønn.
    4. Slå på gel nettdel og sett gel kjører med konstant watt på 60 W for 2,5 t.
    5. Demontere gel platen fra gel stativet, tørke ren glasset og sette hele platen i gel skanner for å starte gel skanning.
    6. Kvantifisere gel med ImageQuant TL 1D analyse. Tegne den naturlige logaritmen til forholdet mellom mengden av primer resterende på et gitt tidspunkt i første arbeidsmengden primer vs tid, passer til en linje, og beregne pseudo første ordre reaksjon hastigheten (figur 2).

5. hammerhead RNA selv Cleavage i blemmer

  1. Forberedelse og rensing av ribozyme innkapslet i blemmer
    1. Forberede en lipid tynn film (OA: GMO = 9:1) i del 1.1 med komponenter som tabellen 1.2. Merk: varm GMO minst 60 ° c for komplett smelting før du bruker.
    2. Forberede vesicle rehydrering buffer med 5 µM hver hammerhead ribozyme strand og 250 mM tris-HCl pH 8.0.
    3. Legge til 250 µL rehydrering bufferen lipid filmen og Følg trinn 1.2.2 og 1.2.3 gjøre blemmer med 0,15 M totalt lipid konsentrasjon.
    4. For å gjøre små unilamellar monodisperse blemmer, følg delen 1.3 for vesicle ekstrudering.
    5. Rense blemmer på en Sepharose 4B størrelse utelukkelse kolonne, med 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0,15 M blandet lipider som mobile fase.
  2. Hammerhead ribozyme selv-cleavage reaksjon
    1. Forberede magnesium løsning og bland med renset blemmer som beskrevet i avsnitt 3.1 å starte selv-cleavage reaksjonen.
    2. Kinetisk studier, ta 100 µL av blandingen på hvert punkt og direkte repurify denne aliquot gjennom en Sepharose 4B størrelse utelukkelse kolonne med 250 mM tris-HCl pH 8.0 som mobile fase. Samle vesicle brøken.
  3. SIDE analyse
    1. Følg trinnene 4.3.6 å 4.3.8 å forberede RNA lasting prøven.
    2. Plasser kommersielt støpt 15% TBE-Urea gel i gel-boksen, og fyll boksen gel med 1xTBE gel kjører buffer.
    3. Varme prøvene på 80 ° C varme blokk for 1 min og laste 5 µL av hvert utvalg per brønn.
    4. Kjør gel med konstant 200 V for rundt 1 time.
    5. Skanne gel.
    6. Kvantifisere gel med en analyseprogramvare, som ImageQuant TL 1D, for å måle spalting ved å sammenligne intensiteten av gjenværende substrat RNA band og kløyvde RNA fragmentere band (Figur 3).

6. kjempe fettsyrer blemmer for mikroskopi

  1. Utarbeidelse av gigantiske fettsyrer blemmer
    1. Følg Seksjon 1.1 og tabellen 1.3 å forberede en oljesyre tynnfilm 0,2 mol % av fluorescently merket lipid bedre membran observasjon.
    2. Rehydrate lipid film med 500 µL 250 mM tris-HCl pH 8.0 gjøre vesicle eksempel 10 mM lipider totalt. Bufferen kan inneholde fluorescerende fargestoffer eller RNA molekyler hvis ønskelig. La vesicle eksempel tumbling over natten.
    3. Forberede 150 mL av ren fettsyrer dialyse buffer med 10 mM totale lipider ved å blande 470 µL av oljesyre og 150 mL av 250 mM tris-HCl pH 8.0 med ½ tilsvarende NaOH.
    4. Extrude vesicle utvalget gjennom en 10 µm polykarbonat membran fjerne store mengder.
    5. Overføre vesicle prøven til 1 µm store-pore dialyse kassett, som beskrevet tidligere. 12
    6. Plass dialyse kassetten i en 100-mL kanne inneholder 30 mL dialyse buffer. Agitere begeret forsiktig på et bord shaker på 80-100 rpm.
    7. Endre dialyse bufferen enhver 30 min for 5 ganger fjerne gratis fargestoffer eller RNA og små blemmer.
    8. Nøye fjerne vesicle prøven fra dialyse kassetten med en sprøyte og overføre til en Eppendorf tube.
  2. Mikroskopi observasjon
    1. Pipetter 10 µL av blemmer på en feilfri målestokk microscope skyve og Legg en glass cover slip over utvalget. Seal dekker glass med transparent neglelakk.
    2. Observere blemmer med en 60 X olje-spredning eller lignende mål av AC confocal mikroskopi bruke riktige laser kilden for fluorescently-merket membran, RNA eller innkapslet fargestoff (Figur 4).

Representative Results

Vi utfører vanligvis liposome renselser på størrelse-utestenging kolonner. Typisk liposome preparater inneholder en fluorophore av noe slag. Når liposomer genereres og ekstruderte, finnes arten innkapsles både i og utenfor i liposomer. Ved å rense liposomer på en størrelse-utestenging harpiks (Sepharose 4B), beholdes unencapsulated solutes i porene av harpiks, mens de større liposomer ikke og elute første (figur 1A). Samle deler og plotte fluorescens vs brøkdel nummer (figur 1B) vanligvis gir to-peak spor, med tidlig eluting fraksjoner tilsvarer liposomer, som samles og brukes i senere utligninger.

Vi undersøker ofte nonenzymatic primer forlengelsen reaksjoner, som var en sannsynlig betyr RNA replikasjon før fremveksten av ribozyme og protein-basert RNA-polymerases. Disse reaksjonene vanligvis benytter en fluorescently merket primer (figur 2A), som er utvidet av aktivert monomerer. Disse reaksjonene kan overvåkes av gel geleelektroforese (figur 2B) og den resulterende electropherograms integrert for å få rate konstanter for en gitt reaksjon tilstand (figur 2C).

For å demonstrere at RNA kan fungere i protocells, bruker vi hammerhead ribozyme selv-cleavage (figur 3A) som en modell RNA katalytisk reaksjon. Dette krever gratis Mg2 + å lette katalyse, og derfor vi brukte OA/GMO blemmer siden de er stabile i nærvær av 5 mM Mg2 +. Ligner primer forlengelsen reaksjoner, hammerhead ribozyme selv-cleavage reaksjonen kan også være overvåket av gel geleelektroforese (figur 3B) og senere analysert for å erverve rate konstant ved bestemte betingelser (Figur 3 c).

Vi bildet liposomer ansette både fluorescens og overført lys. Liposomer kan merkes med fluorescerende lipider, som gir en membran etikett (figur 4A), eller med et fluorescerende stoff i deres lumen (figur 4B). Lyset kan også brukes til å observere blemmer (også vist i figur 4B).

Tabellen 1.1 ren oljesyre i kloroform
Komponent Lager Beløp
Oljesyre > 99% 11,7 ΜL
Kloroform 1 mL
1.2 oljesyre og glyserol monooleate (9:1) i kloroform
Komponent Lager Beløp
Oljesyre > 99% 10,5 ΜL
Glyserol monooleate > 99% 1.4 ΜL
Kloroform 1 mL
Tabellen 1.3 oljesyre med 0.2mol% Rhodamine-PE i kloroform
Komponent Lager Beløp
Oljesyre > 99% 1.6 ΜL
Rhodamine-PE i kloroform 10 mM 20 ΜL
Kloroform 1 mL

Tabell 1. Fettsyrer kloroform løsninger.

Figure 1
Figur 1. Vesicle rensing og fluorescens karakterisering av rensing brøkdel. A. separasjon av blemmer som inneholder calcein fra gratis calcein på en Sepharose 4B kolonne. B. Vesicle og gratis calcein peak oppdagelsen ved å plotte fluorescens i hver brønn vs brønn nummer etter brøkdel samling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Ikke-enzymatisk RNA replikering inne Rentabilitet blemmer. A. av ikke-enzymatisk RNA primer forlengelsen. B. sidebilde av en primer forlengelsen reaksjon i ren oljesyre blemmer, med vilkår som seksjon 4. C. lineær passer for den naturlige logaritmen av forholdet mellom primer gjenværende på gitt tidspunkt til innledende beløpet av primer vs tid over 30 h. reaksjon hastighet, beregnet fra skråningen ln (P/P0) vs tid, er 0.058 h-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Hammerhead ribozyme cleavage i OA/GMO blemmer. A. av hammerhead ribozyme cleavage fluorescently merket substrat strand (øverst). B. sidebilde hammerhead ribozyme cleavage inne Rentabilitet/GMO blemmer med 5 mM Mg2 +. C. Ribozyme aktivitet inne blemmer. Lineær anfall av naturlige logaritmen av forholdet mellom mengde substrat resterende på gitt tidspunkt den innledende beløpet av underlaget vs tid i første 4 h. reaksjon hastighet, beregnet fra skråningen ln (s/s0) vs tid, er 0.36 h-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Gigantiske fettsyrer blemmer for mikroskopi. A. AC Confocal mikroskopi bildet av en Rhodamine PE merket oljesyre vesicle, skala bar 10 μm. B. AC Confocal mikroskopi bilde av oljesyre vesicle inneholder Alexa488 merket RNA med membran i overført detektor (TD) kanal, skala bar 5 μm.

Discussion

Liposomer dannet av fettsyrer har blitt foreslått av mange som potensielle modeller for primitive celler på grunn av deres høy permeabilitet og dynamiske egenskaper. Karbonoxylsyre leder gruppen enkelt kjede fettsyrer bare innrømmer selvtillit forsamlingen i membraner i et begrenset pH-område, og de resulterende membranene er ganske følsomme for tilstedeværelsen av salter. Resultatet krever fettsyrer blemmer ulike forberedelse og behandling sammenlignet med phospholipid blemmer.

I denne protokollen, selv om vi bruker oljesyre som et eksempel for liposome formasjon, andre lang kjede umettede fettsyrer (C14) og deres derivater (ca. myristoleic syre, palmitoleic syre og tilsvarende alkoholer og glyserol estere) også danne blemmer etter metoden tynnfilm rehydrering totale lipid konsentrasjonen er over cmc og hydrering buffer pH er nær pKa av fettsyrer i membranen. Annet enn tris-HCl bufferen brukes i denne protokollen, ble andre buffer systemer (ca. bicine, fosfat, borate) rapportert å støtte fettsyrer vesicle formasjon, om blemmer i fosfat eller borate bufferen er vanligvis ganske lekk13. De resulterende fettsyrer blemmer etter utvanning er polydisperse og multilamellar, men er enkelt konverteres til små monodisperse unilamellar blemmer ved ekstrudering som beskrevet. Sammenlignet med sonication som en alternativ metode for å generere små blemmer, inneholder ekstrudering flere alternativer for kontroll av vesicle størrelse ved å bruke ulike pore størrelse membraner. Blemmer etter ekstrudering er vanligvis litt større enn membran porestørrelse, men ved å øke antall ekstrudering sykluser, blemmer med en smalere størrelsesDistribusjon og en gjennomsnittlig størrelse nær porestørrelse membranen kan oppnås.

For å syntetisere funksjonelle protocells, må fettsyrer blemmer verten desinfisering skyldes innkapsling av RNA eller andre byggeblokker. Metoden tynnfilm rehydrering gir en enkel måte å skjemaet blemmer som inneholder ønsket innkapslede materialer. Men innkapsling effektiviteten er relativt lav og et stort utvalg av verdifulle materialer som RNA er vanligvis tapt under en renselsesprosess. I noen tilfeller kan innkapsling effektiviteten beskjedent forbedres ved gjentatte fryse-Tin sykluser før ekstrudering. Microfluidic metoder for høy avkastning utarbeidelse av phospholipid liposomer tillate nesten 100% innkapsling effektivitet, men tilsvarende metoder ikke har ennå blitt utviklet for fettsyrer blemmer.

Når håndtere protocells med sin natur chelated eller gratis Mg2 +, rensing etter magnesium løsning tillegg og repurification før hvert punkt sikrer fjerning av lekkasje innkapslet materiale som kan påvirke nøyaktigheten av reaksjon målinger i blemmer. Siden hver rensing tar minst 10 min å oppnå god separasjon og samle vesicle fraksjoner, analyse av raske reaksjoner er vanskelig, og reaksjonen må stoppes før kolonnen repurification.

Protokollen vi presenterer her er godt egnet for bygging av fettsyrer liposomer som vert reaksjoner etterligne de som måtte oppstå i primitive celler. Våre protokoller kan også potensielle anvendelser i utviklingen av biomedisinsk leveringssystemer og bioreaktorer for andre biokjemiske reaksjoner.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

J.W.S. er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute. Dette arbeidet var støttes delvis av en bevilgning (290363) fra Simons Foundation til J.W.S. Både A.E.E. og K.P.A. anerkjenner støtte fra University of Minnesota oppstart midler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

Tags

Bioteknologi problemet 132 liposomer blemmer protocells syntetisk celler synells opprinnelsen til liv
Forberedelse, rensing og bruk av fettsyrer inneholder liposomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala,… More

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter