Summary
Liposomer innehållande singel-kedjan amphiphiles, uppvisar särskilt fettsyror, distinkta egenskaper jämfört med de som innehåller diacylphospholipids på grund av enda kedja amphiphiles unika kemiska egenskaper. Här beskriver vi tekniker för förberedelse, rening och användning av liposomer består i del eller hela dessa amphiphiles.
Abstract
Liposomer innehållande singel-kedjan amphiphiles, uppvisar särskilt fettsyror, distinkta egenskaper jämfört med dem som innehåller diacylphospholipids på grund av dessa amphiphiles unika kemiska egenskaper. I synnerhet förbättra fettsyra liposomer dynamiska karaktär, på grund av den relativt höga lösligheten av singel-kedjan amphiphiles. Liposomer innehållande fria fettsyror är likaså känsligare för salt och tvåvärda katjoner, på grund av de starka samspelet mellan karboxylsyra huvud grupper och metalljoner. Här visar vi tekniker för förberedelse, rening och användning av liposomer består delvis eller hela enda kedja amphiphiles (e.g., oljesyra syror).
Introduction
Liposomer, eller blåsor – fack avgränsas av lipidens membran består av amfifila lipider - har funnit användning i många biomedicinska tillämpningar som leveransfordon för läkemedel, modeller av cellmembran, och för utvecklingen av syntetiska celler. Vi och andra har också anställt liposomer som modeller av primitiva cellmembran tidigt i livet. 1 , 2 , 3 , 4 vanligtvis i sådana system, vi anställer singel-kedjar amphiphiles som innehåller endast en lipid kolväte svans (t.ex., oljesyra), eftersom dessa molekyler är enklare att syntetisera utan förmånen av de kodade protein enzymer moderna celler anställa.
Liposomer består av singel-kedjan lipider är liknande de bildas från diacylphospholipids (t.ex.1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine eller POPC) däri gränsen består av lipidens membran. Liposomer bildas från antingen klass av lipider kan kan behålla en upplöst nyttolast, och skalas ned och renas genom olika tekniker. Flera viktiga skillnader resultera från de unika kemiska egenskaperna för singel-kedjan lipider. Blåsor bildas av fosfolipider är stabil över ett brett pH-område, medan fettsyra blåsor bara är stabil vid neutralt till milt grundläggande pH (ca. 7-9), vilket kräver vissa pH-buffert för vesikler beredning. De flesta av tiden, kan denna buffert också innehålla specifika lösliga molekyler för vesikler inkapsling, som kan vara antingen funktionella material (t.ex., RNA) för konkurrensbetingat biokemiska reaktioner eller enkel fluorescerande färgämnen (t.ex., det calcein ) för vesikler karakterisering.
Förekomsten av endast en enda kolväte kedja producerar ett membran som är mer genomsläppliga för lösta ämnen, såväl som mer dynamisk. Dessutom den karboxylsyra huvud gruppen närvarande i fettsyror resulterar i blåsor som är mer känsliga för förekomsten av salt och tvåvärda katjoner (t.ex., Mg2 +). Magnesium är en av de viktigaste divalenta katjonerna för katalysera biokemiska reaktioner i protocells för livets ursprung studier. Tidigt i livet, innan utvecklingen av sofistikerade protein enzymer, kan RNA ha varit den dominerande polymeren, på grund av dess dubbla kapaciteten att själv replikera och utföra katalys. Ett representativt exempel på en magnesium-kräver RNA om reaktion är icke-enzymatiska RNA kopiering, först visat i 1960-talet. 5 när kemiskt aktiverat RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binder till ett redan existerande primer-mall-komplex, 3'-hydroxylgruppen grundfärgens angriper det 5'-fosfatet av en intilliggande aktiverade monomer att tränga undan de lämnar gruppen (dvs. 2-metylimidazol), och bildar en ny phosphodiester bond. Detta RNA kopiering kemi kräver en hög koncentration av Mg2 +, som behöver vara kelaterat ska vara kompatibelt med fettsyra protocells. 6 en annan Mg2 +-beroende reaktion är som katalyseras av den hammerhead ribozyme, det är kanske bäst kännetecknas katalytiskt RNA. Detta ribozym, som kan beredas från två korta oligonukleotider, utför en self-klyvning reaktion som är bekvämt att övervaka genom en gel-SKIFT. Som sådan, är det ofta anställd som en modell ribozym i livets ursprung studier. 7 på grund av ett krav av denna ribozym för unliganded magnesium, liposomer är vanligtvis tillverkade av en blandning av fettsyror och glycerol fettsyreestrar, som är mer stabila till magnesium. 8 , 9 i detta protokoll, vi presenterar teknik vi har utvecklat för förberedelse, manipulation, karakterisering av dessa blåsor och demonstrera tillämpning av dessa blåsor som protocells till värd icke-enzymatiska RNA kopiering och hammerhead ribozyme katalys.
Protocol
1. vesikler förberedelse
-
Beredning av tunna filmer
- Använda gas snäva sprutor för att överföra viss mängd lipider som beskrivs i tabell 1.1 med kloroform i en injektionsflaska av glas.
- Indunsta lösningen under en ström av kväve eller argon i dragskåp.
- Omfattas den resulterande tunn filmen house vakuum för minst 2 h att ta bort kloroform rester. Lipid kan lämnas under vakuum över natten på denna punkt.
-
Rehydrering av blåsor
- Förbereda 10 mL av 5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8,0 återfuktning buffert genom upplösning 31 mg av calcein pulvret i 2,5 mL 1 M tris-HCl pH 8,0 buffert och lägga till ytterligare 7,5 mL avjoniserat vatten (DI).
- Pipettera 250 µL över återfuktning buffert i en tom röret och tillsätt 1.875 µL 10 M NaOH för en sista 75 mM bas (½ motsvarande totala fettsyror). Överför lösningen till tunt filmar av torr lipid till formuläret blåsor med en total lipid koncentration av 0,15 M.
- Använd höghastighetsinternet (> 3000 rpm) vortexer till vortex den resulterande blandningen för 4-5 s.
- Lämna lipid-buffert blandningen på en låg hastighet (ca. 30 rpm) roterande skakapparat att rehydrera, åtminstone över natten.
-
Dimensionering av blåsor (tillval)
- Med pincett, gäller ett filter stöd varje inre ytan av sprutan hamnarna i extrudern.
- Fukta varje filter stöd med 250 mM tris-HCl, pH 8.
- Med pincett, söka en spår-etsade 100 nm polykarbonat membran till extrudern O-ringar och filtrera stöder. Noga med att inte riva eller punktera membranet, försiktigt trycka membranet i o-ringen så att god kontakt mellan de två ytorna.
- Montera extruder, noga med att inte förskjuta membranet och filtret stöder.
- Fyll en extruder sprutan med ca. 0,5 mL 250 mM tris-HCl, pH 8. Sätt denna spruta i ena sidan av extruder.
- Infoga en tom spruta i andra sidan av extruder.
- För hand, tryck in kolven i sprutan innehållande buffert långsamt (≤ 50 µL/s) och kontrollera att motstånd känns, som visar spår-etsade membranet är på plats och intakt. Det är bra att öva detta steg utan ett membran på plats för att bedöma den förväntade nivån på motstånd.
- Ta bort och Töm de två sprutorna. Det är inte nödvändigt att rengöra de två sprutorna i detta skede eftersom de innehåller buffert av identisk sammansättning Liposom förberedelserna.
- Ladda den Liposom förberedelsen till ett av de två sprutorna.
- Återmontera extrudern med spruta innehållande vesikler prov på vänster sida och tomma sprutan på höger sida.
- Hand tryck kolven i sprutan innehållande vesikler provet mycket långsamt (10-25 µL/s).
- Noggrant följa sprutan på höger sida av extrudern; tydlig buffert kommer inledningsvis in till höger i extrudern (ca. 50 µL, detta beror på de inre dödvolym extrudern), följt av en liten plym av extruderad liposomer. Omedelbart sluta trycka på denna punkt, ta ut sprutan på höger sida av extruder och kassera denna lösning.
- Ersätta sprutan på höger sida av extruder och pressa tills vänster sprutan är tom.
- Vända orienteringen för extruder och upprepa steg 13. Fortsätta för önskat antal cykler (normalt 7, 9 eller 11); ett udda tal används alltid att säkerställa un-extruderad liposomer inte samlas in från den spruta som inledningsvis innehåller den före nedskärningar Liposom förberedelsen.
- Försiktigt dispensera innehållet i rätt sprutan i en Eppendorf-rör och placera röret på en låg hastighet (ca. 30 rpm) roterande skakapparat för ca 0.5 h.
- Fortsätt med vesikler rening, som beskrivs i avsnitt 2. Extruderad blåsor bör användas inom 24 h eller åter extruderade innan nästa gång användning.
2. vesikler rening
-
Beredning av mobila blåsstadiet rening
- Förbereda 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hydration buffert genom att lägga till 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 buffert, 3,75 mL DI vatten till en 15 mL falconrör. Lägg sedan till 37,5 µL 10 M NaOH (½ motsvarighet till base i förhållande till oförestrad fettsyra) till återfuktning bufferten. Pipettera 235 µL ren oljesyra direkt till Falcon röret vilket resulterar en vesikel lösning med 0,15 M total lipider.
- Använd höghastighetsinternet (> 3000 rpm) vortexer till vortex blandningen för 4-5 s, sedan falla på en låg hastighet roterande skakapparat för minst 2 h. Lipid preparatet kan lämnas över natten i den roterande skakapparaten på denna punkt. Filtrera den mobila fasen genom 0,22 μm spruta filterenheten före användning för att ta bort alla potentiella aggregat.
-
Rening av blåsor på Sepharose
- Ta bort ca. 5 mL enprocentig Sepharose 4B flytgödsel från flaskan med en pipett. Applicera detta till en disponibel 10 mL kromatografi kolumn.
- Gör att slammet sedimentera och etanol genomflöde tills etanol närmar sig toppen av harts sängen.
- Applicera 5 mL avjoniserat vatten till toppen av harts och låt genomflöde att tvätta bort etanol rester.
- Tillämpa 250 mM tris-HCl, pH 8 i 1-2 mL portioner till toppen av harts, tillämpa en ny portion varje gång vätskenivån närmar sig toppen av harts sängen. Upprepa för 3 - 5 gånger.
- Klämma kolumnen i retorten montern och sedan ansluta spets kolumn med Avstängningskranen kontakt och slangar till bråkdel insamlaren. Lägga till en annan del av buffert för att spola slangen, Stäng Avstängningskranen När vätskenivån i kolumnen närmar sig toppen av harts.
- Applicera de extruderade blåsor från avsnitt 1 till toppen av harts använder vi rekommenderar att en 200 µL, ta hand för att tillämpa vesikler preparatet så jämnt som möjligt på kådan utan att vidröra harts säng eller kolumn väggen.
- Öppna avstängningskranen för att påbörja flödet och börja samla fraktioner i en plattan med 96 brunnar. Tillämpa mobila blåsstadiet rening till toppen av harts sängen i 0,5-1 mL portioner som bufferten utarmar, noga med att inte tillåta harts sängen att torka ut. Samla fem-drop fraktioner, samla minst 36 wells (tre rader av en plattan med 96 brunnar).
-
Fluorescens karakterisering av rening fraktioner
- Ta plattan med 96 brunnar från föregående avsnitt och läsa den på en tallrik läsare (λex= 485 nm, λem= 515 nm).
- Rita den resulterande fluorescensen data som fluorescens vs bråkdel antal. Blåsor eluera först, följt av den oinkapslat fraktionen (figur 1).
-
Repurification av blåsor att övervaka vesikler läckage
- Upprepa steg för rening och karakterisering i avsnitten 2.2 och 2.3. Blåsor som har bevarat sin innehållet ställer ingen topp oinkapslat solute (eller en mycket liten en på ca. 5-10% av intensiteten i vesikler toppen).
3. användning av blåsor i närvaro av Magnesium
-
Användning av unliganded magnesium
- Förbereda och rena blåsor som beskrivs i avsnitt 1, 2.1 och 2.2.
- Laga 1 mL 50 mM MgCl2 lösning i 250 mM tris-HCl pH 8,0 buffert genom att lägga till 250 µL 1 M tris-HCl pH 8,0 buffert och 50 µL av 1 M MgCl2 700 µL av DI vatten. Vortex att blanda väl.
- För att ge önskad magnesium koncentrationen av 5 mM, blanda 0,9 mL renat blåsor och 100 µL av magnesium lösning och rör snabbt för att minimera vesikler störningar av blåsor övergående exponering för hög lokal koncentration av magnesium.
Obs: Snabb blandning av magnesium lösning är kritiska till vesikler stabilitet. Om magnesium och blåsor inte blandas snabbt av omedelbar vortexa, kommer några blåsor att utsättas för högre koncentrationer av magnesium, vilket resulterar i inkonsekventa resultat från prov till prov. - Lämna vesikler provet på ett dricksglas för minst 30 min innan repurification som beskrivs i 2.4 att kontrollera innehållet läckage. Lägga till samma koncentration av magnesium som i vesikler provet i den mobila fasen för repurification.
-
Användning av liganded magnesium
- Förbereda och rena blåsor som beskrivs i avsnitt 1, 2.1 och 2.2.
Obs: Använd ½ motsvarande KOH istället för NaOH att deprotonate fettsyror; Det har konstaterats att detta ger stabilare liposomer i kelaterade MgCl2 -system. - Förbered 2M kalium citratlösningen och justera pH till 8.0 med KOH.
- Premix MgCl2 och potassium citrate på angivna förhållandet (ca. 1:4 för stabil oljesyra blåsor) i 250 mM tris-HCl pH 8,0 buffert.
- Tillsätt färdigblandad magnesium citratlösning vesikler, kort vortex.
Obs: Premix alltid magnesium och ligand lösning. Utsätt aldrig blåsor till unchelated magnesium lösning ensam. - Lämna vesikler provet på ett dricksglas för minst 30 min innan repurification som beskrivs i 2.4. Lägga till samma koncentration av magnesium och citrat som i vesikler provet i den mobila fasen för repurification.
- Förbereda och rena blåsor som beskrivs i avsnitt 1, 2.1 och 2.2.
4. icke-enzymatiska RNA kopiering i blåsor
-
Beredning av monodisperse RNA inkapslade blåsor
- Förbereda en torr oljesyra film som beskrivs i avsnitt 1.1.
- Förbereda vesikler rehydrering buffert med 50 µM fluorescerande märkt RNA primer, 150 µM RNA mall och 250 mM tris-HCl pH 8,0 som innehåller ½ motsvarande KOH i förhållande till oljesyra.
- Tillsätt 250 µL rehydrering buffert i lipid filmen och följ steg 1.2.2 och 1.2.3 att göra blåsor med total 0,15 M lipid koncentration.
- För att göra små unilamellar monodisperse blåsor, följa avsnitt 1.3 för vesikler extrudering.
-
Magnesium-citrat tillägg och vesikler rening
- Premix magnesium och citrat bestånd, och blanda detta med vesikler provet till en slutlig lipid koncentration av 0,1 M.
- Rena blåsor på Sepharose 4B storlek utslagning kolumn, med 250 mM tris-HCl pH 8,0, 0.1 M lipider och med tanke på magnesium och citrat som Rörlig fas.
- Samla vesikler fraktioner av följande avsnitt 2.3.
-
Primer filändelsen reaktion
- Förbereda 200 mM 2-MeImpG (guanosin 5'-monofosfat 2-methylimidazolide) stamlösning med 250 mM tris-HCl pH 8,0. (Obs: Följ tidigare publicerade protokoll10 för 2-MeImpG syntes.)
- För att inleda primer filändelsen reaktion, överföra 150 µL av 2-MeImpG stamlösning till 450 µL vesikler prov att nå en slutlig koncentration på 75 mM lipid och 50 mM aktiveras monomer. Start timer och hålla reaktionen prova tumlande hela tiden.
- (Valfritt) För kontinuerlig färska monomer utfodring, överföra 300 µL reaktion lösning på en avdelning med en lab konstruerade små volymer Liposom dialysator11 och sätta 300 µL utfodring lösning i andra kammaren. Utfodring lösningen bör innehålla alla ingredienser i samma koncentration som i reaktion lösningen, förutom ersätter RNA som innehåller blåsor med Tom blåsor. Varje omgång av dialys tar 1-24 tim, beroende på vilken analyten och membran som används.
- För kinetiska studier, ta en 100 µL alikvotens vid varje tidpunkt, och repurify alikvoten genom en Sepharose 4B storlek utslagning kolumn med 250 mM tris-HCl pH 8,0 som den mobila fasen.
- Samla de vesikler fraktionerna i ett 1,5 mL eppendorf-rör.
- Pipettera Triton att vesikler fraktioner till en slutlig cirka 0,1% v/v.
- Tillsätt 0,5 mL kall etanol till röret och inkubera vid-20 ° C i minst 2 h.
- Centrifugera alla prover på 16,1 × 1000 rcf (16,1 × g) för 10 min och försiktigt pipett ut vätskorna. Tvätta RNA pellets med 70% kall etanol och centrifugera igen för 5 min. kasta vätskan och sätta röret med RNA pellets på en 80 ° C värme block för 2 min att avdunsta kvarstående etanol. Lös upp pellets i 50 µL 8 M Urea med 1xTBE lastning buffert.
-
Sidanalys
- Förbereda 20% sida gel genom att blanda UreaGel system 200 mL koncentrat, 25 mL av UreaGel system spädningsvätska, 25 mL 10xTBE buffert, 80 µL TEMED och 250 mg av ammonium persulfatoxidation. Snabbt Häll gel blandningen mellan Klamma gel plattor (35 cm × 45 cm) och infoga kammen. Vänta i minst 30 min tills fullständig polymerisation.
- Montera gelplattan på gel stativet och fylla rutorna gel med 1xTBE gel kör buffert. Ta bort kammen och spola brunnarna med spruta. Förväg Kör gelen med 60 W för 30 min.
- Värm proverna på 80 ° C värme block i 2 min och ladda 5 µL av varje prov per brunn.
- Aktivera power gelboxen och ställa gel kör med konstant watt på 60 W för 2,5 h.
- Ta isär gelplattan från gel stativet, torka rent glaset och satte hela plattan i gel scanner att starta gel skanningen.
- Kvantifiera gelen med ImageQuant TL 1D analys. Rita den naturliga logaritmen av förhållandet mellan mängden primer kvar vid en given tidpunkt till det ursprungliga beloppet av primer vs. tid, passar till en rad, och beräkna pseudo första ordning reaktionen klassar (figur 2).
5. hammerhead RNA Self klyvning i blåsor
- Förberedelse och rening av ribozym inkapslade i blåsor
- Förbereda en lipid tunn film (OA: GMO = 9:1) som i avsnitt 1.1 med komponenter som i tabell 1.2. Obs: varm GMO till minst 60 ° C för komplett smältning innan du använder.
- Förbereda vesikler rehydrering buffert med 5 µM varje hammerhead ribozyme strand och 250 mM tris-HCl pH 8,0.
- Tillsätt 250 µL rehydrering buffert i lipid filmen och följ steg 1.2.2 och 1.2.3 att göra blåsor med 0,15 M totalt lipid koncentration.
- För att göra små unilamellar monodisperse blåsor, följa avsnitt 1.3 för vesikler extrudering.
- Rena blåsor på en Sepharose 4B utslagning i kolumnen storlek, med 250 mM tris-HCl pH 8,0, 0,15 M blandade lipider som Rörlig fas.
-
Hammerhead ribozyme self-klyvning reaktion
- Förbereda magnesium lösning och blanda med renat blåsor som beskrivs i avsnitt 3.1 att inleda self-klyvning reaktionen.
- För kinetiska studier, ta 100 µL av blandningen vid varje tidpunkt och direkt repurify denna alikvot genom en Sepharose 4B storlek utslagning kolumn med 250 mM tris-HCl pH 8,0 som Rörlig fas. Samla den vesikler fraktionen.
-
Sidanalys
- Följ steg 4.3.6 till 4.3.8 för att förbereda RNA lastning provet.
- Kommersiellt gjuten 15% TBE-karbamid gel till gel låda och fyll gelboxen med 1xTBE gel kör buffert.
- Värm proverna på 80 ° C värme block för 1 min och ladda 5 µL av varje prov per brunn.
- Kör gelen med konstant 200 V för ca 1 h.
- Skanna gelen.
- Kvantifiera gelen med ett analysprogram, som ImageQuant TL 1D, för att mäta omfattningen av klyvning genom att jämföra intensiteten i återstående substrat RNA band och klyvs RNA fragment band (figur 3).
6. giant fettsyra blåsor för mikroskopi
-
Beredning av giant fettsyra blåsor
- Följ avsnitt 1.1 och tabell 1.3 förbereda en oljesyra tunn med 0,2 mol % av fluorescently märkt lipid för bättre membran observation.
- Rehydrera lipid film med 500 µL 250 mM tris-HCl pH 8,0 att göra de vesikler prov 10 mM lipider totalt. Bufferten kan innehålla fluorescerande färgämnen eller RNA-molekyler om så önskas. Lämna vesikler prov tumlande över natten.
- Förbereda 150 mL ren fettsyra dialys buffert med 10 mM total lipider genom att blanda 470 µL av oljesyra och 150 mL 250 mM tris-HCl pH 8,0 som innehåller ½ motsvarande NaOH.
- Extrudera vesikler provet genom en 10 µm polykarbonat membran att ta bort stora aggregat.
- Över vesikler provet till 1 µm stora-pore dialys kassett, som tidigare beskrivits. 12
- Placera dialys kassetten i en 100 mL-bägare som innehåller 30 mL dialys buffert. Agitera bägaren försiktigt på en bordsskiva shaker vid 80-100 rpm.
- Ändra dialys buffert varje 30 min för 5 gånger att ta bort gratis färgämnen eller RNA och små blåsor.
- Ta försiktigt bort vesikler provet från dialys kassett med en spruta och överföring till ett Eppendorf-rör.
-
Mikroskopi Observation
- Pipettera 10 µL av blåsor på en ren standard objektglas och placera ett glas täckglas över provet. Försegla täckglaset med genomskinligt nagellack.
- Respektera blåsor med en 60 X olja-dispersion eller liknande mål genom konfokalmikroskopi med hjälp av lämplig laser source för fluorescently-märkt membran, RNA eller inkapslade färgämne (figur 4).
Representative Results
Vi utför vanligtvis Liposom reningar på storlek-utslagning kolumner. Typiska Liposom förberedelserna innehåller en fluorophore av något slag. När liposomer genereras och extruderade, är arterna att vara inkapslade närvarande både i och utanför liposomer. Genom att rena liposomer på en storlek-utslagning harts (Sepharose 4B), behålls oinkapslat koncentrationsfördelningen inom porerna i kådan, medan större liposomer är inte och eluera första (figur 1A). Samlande fraktioner och plottning fluorescens vs bråkdel antal (figur 1B) vanligtvis ger en två-peak spårning, med tidig-eluering fraktioner motsvarar liposomer, som sedan samlas in och används i efterföljande program.
Vi undersöker ofta nonenzymatic primer filändelsen reaktioner, som var ett sannolikt sätt att RNA replikering före uppkomsten av ribozym och protein-baserade RNA-polymeraser. Dessa reaktioner använder vanligtvis en fluorescently märkt primer (figur 2A), som utökas av aktiverade monomerer. Dessa reaktioner kan övervakas med gelelektrofores (figur 2B) och den resulterande elektroferogrammen integrerade för att erhålla konstanter för en given reaktion villkor (figur 2 c).
För att demonstrera att RNA kan fungera inuti protocells, anställer vi hammerhead ribozyme self-klyvning (figur 3A) som en modell RNA katalytisk reaktion. Denna reaktion kräver gratis Mg2 + att underlätta katalys, och därför vi använde OA/GMO blåsor eftersom de är stabilt i närvaro av 5 mM Mg2 +. Liknar primer filändelsen reaktioner, hammerhead ribozyme self-klyvning reaktionen kan också övervakas med gelelektrofores (figur 3B) och senare analyseras för att förvärva konstanten särskilda villkor (figur 3 c).
Vi bild liposomer sysselsätter både fluorescens och genomlysning. Liposomer kan märkas med hjälp av fluorescerande lipider, som ger en membran etikett (figur 4A), eller en fluorescerande solute inom deras lumen (figur 4B). Genomlysning kan också användas för att följa blåsor (som också visas i figur 4B).
| Tabell 1.1 ren oljesyra i kloroform | |||
| Komponent | Beståndet | Belopp | |
| Oljesyra | > 99% | 11.7 ΜL | |
| Kloroform | 1 mL | ||
| Tabell 1.2 oljesyra och glycerol monooleat (9:1) i kloroform | |||
| Komponent | Beståndet | Belopp | |
| Oljesyra | > 99% | 10.5 ΜL | |
| Glycerol monooleate | > 99% | 1.4 ΜL | |
| Kloroform | 1 mL | ||
| Tabell 1.3 oljesyra med 0.2mol% rodamin-PE i kloroform | |||
| Komponent | Beståndet | Belopp | |
| Oljesyra | > 99% | 1.6 ΜL | |
| Rodamin-PE i kloroform | 10 mM | 20 ΜL | |
| Kloroform | 1 mL | ||
Tabell 1. Fettsyra kloroform lösningar.
Figur 1. Vesikler rening och fluorescens karakterisering av rening bråkdel. A. Separation av vesikler innehållande calcein från gratis calcein på en Sepharose 4B kolumn. B. vesikler och gratis calcein peak upptäckt genom att plotta fluorescensen i varje brunn vs. väl nummer efter bråkdel samling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Icke-enzymatisk RNA replikering inuti OA blåsor. A. systemet för icke-enzymatiska RNA primer filändelsen. B. sida bild av en primer filändelsen reaktion inuti ren oljesyra vesicles, med villkor som i avsnitt 4. C. linjär passar för den naturliga logaritmen av förhållandet mellan primer återstående vid given tidpunkt till det ursprungliga beloppet av primer vs. tid över 30 h. reaktionshastigheten, räknat från sluttningen av ln (P/P0) vs tid, är 0.058 h-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Hammerhead ribozyme klyvning i OA/GMO blåsor. A. systemet av hammerhead ribozyme klyvning av fluorescently märkt substrat strand (överst). B. sida bild av hammerhead ribozyme klyvning inuti OA/GMO blåsor med 5 mM Mg2 +. C. ribozym aktivitet inuti vesiklar. Linjär anfall av naturliga logaritmen av förhållandet mellan mängden substrat kvar vid given tidpunkt till den ursprungliga mängden substrat vs. tid i första 4 h. reaktion, räknat från sluttningen av ln (S/S0) vs tid, är 0,36 h-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Giant fettsyra blåsor för mikroskopi. A. konfokalmikroskopi bilden av ett rodamin PE märkt oljesyra vesikler, skala bar 10 μm. B. konfokalmikroskopi bild av oljesyra vesikler innehållande Alexa488 märkt RNA med membran visas i överförda detektor (TD) kanal, skala bar 5 μm.
Discussion
Liposomer bildas från fettsyror har föreslagits av många som potentiella modeller för primitiva celler på grund av sin höga permeabilitet och dynamiska egenskaper. Enda fettsyror karboxyl huvud gruppen bara självmontering in membran i en begränsad pH-område och de resulterande membran är ganska känsliga för förekomsten av salter. Som ett resultat, kräver fettsyra blåsor olika förberedelser och hantering metoder jämfört med fosfolipid blåsor.
I detta protokoll, även om vi använder oljesyra som ett exempel för Liposom bildandet, andra lång kedja, omättade fettsyror (C14) och deras derivat (ca. myristoleic syra, palmitoleic syra och de motsvarande alkoholerna och estrar av glycerol) också bilda blåsor efter metoden tunn film rehydrering så länge den totala lipid-koncentrationen är ovanför cmc och återfuktning buffert pH ligger nära pKa av fettsyran i membranet. Andra än tris-HCl buffert används i detta protokoll, rapporterades andra buffertsystem (ca. bicine, fosfat, Borat) att stödja fettsyra vesikler bildning, även blåsor bildas i fosfat eller Borat buffert är vanligtvis ganska läckande13. De resulterande fettsyra blåsor efter rehydrering är polydisperse och multilamellar, men kan lätt omvandlas till små monodisperse unilamellar blåsor av extrudering som beskrivs. Jämfört med ultraljudsbehandling som en alternativ metod för att generera små blåsor, ger extrudering fler alternativ för kontroll av vesikler storlek genom att tillämpa olika por storlek membran. Blåsor efter extrudering är vanligtvis något större än membran porstorlek, men genom att öka antalet extrudering cykler, blåsor med en smalare storlek distribution och en genomsnittlig storlek nära membran porstorlek kan erhållas.
För att syntetisera funktionella protocells, måste fettsyra blåsor värden specifika biokemiska reaktioner som följd av inkapsling av RNA eller andra byggstenar. Tunn film rehydrering metoden ger ett enkelt sätt att bilda blåsor som innehåller önskad inkapslade material. Dock inkapsling effektivitet är relativt låg och en stor del av dyrbara material såsom RNA förloras vanligtvis under reningsprocessen. I vissa fall kan inkapsling effektiviteten förbättras blygsamt genom upprepad frysning-tining cykler innan extrudering. Mikroflödessystem metoder för hög kapacitet beredning av fosfolipid liposomer tillåter nästan 100% inkapsling effektivitet, men liknande metoder inte har ännu utvecklats för fettsyra blåsor.
När hantering protocells med antingen kelaterade eller gratis Mg2 +, rening efter magnesium lösning tillägg och repurification innan varje tidpunkt garanterar avlägsnande av läckt inkapslade material som kan påverka precisionen av reaktionshastigheten mätningar inuti vesiklar. Eftersom varje rening tar minst 10 minuter att uppnå bra separation och samla vesikler fraktioner, analys av snabba reaktioner är svårt, och reaktionen måste stoppas innan kolumnen repurification.
Det protokoll som vi presenterar här är väl lämpad för byggandet av fettsyra liposomer som värd reaktioner härma dem som kan uppstå i primitiva celler. Våra protokoll kan också potentiella tillämpningar i utvecklingen av biomedicinska leveranssystem och bioreaktorer för andra biokemiska reaktioner.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
J.W.S. är en utredare för Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete stöds delvis av bidrag (290363) från stiftelsen Simons till J.W.S. Både A.E.E. och K.P.A. bekräftar stödet från University of Minnesota start fonderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
| calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
| tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
| citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
| sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
| potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
| oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
| glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
| Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
| magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
| sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
| 15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
| urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
| titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
| RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
| RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
| hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
| hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
| vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
| fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
| 96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
| plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
| confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
| gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |
References
- Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
- Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
- Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
- Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
- Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
- Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
- Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
- Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
- Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
- Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
- Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
