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Bioengineering

तैयारी, शुद्धि, और फैटी एसिड युक्त Liposomes का उपयोग

Published: February 9, 2018 doi: 10.3791/57324
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,3, 1
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, एक श्रृंखला amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में विशिष्ट गुणों का प्रदर्शन । यहां हम तैयारी, शुद्धि, और भाग या इन amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes के उपयोग के लिए तकनीक का वर्णन ।

Abstract

Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, इन amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में अलग गुण दर्शाते हैं । विशेष रूप से, फैटी एसिड liposomes गतिशील चरित्र में वृद्धि, एकल श्रृंखला amphiphiles के अपेक्षाकृत उच्च घुलनशीलता के कारण । इसी प्रकार, liposomes युक्त मुक्त फैटी एसिड अधिक नमक और divalent cations के प्रति संवेदनशील हैं, carboxylic एसिड सिर समूहों और धातु आयनों के बीच मजबूत बातचीत के कारण । यहां हम तैयारी, शुद्धि के लिए तकनीक का वर्णन, और भाग या एकल श्रृंखला amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes का उपयोग करें (उदा., ओलिक एसिड) ।

Introduction

Liposomes, या बुलबुले-bilayer amphiphilic लिपिड के शामिल झिल्ली से घिरा डिब्बों फार्मास्यूटिकल्स, सेल झिल्ली के मॉडल के लिए प्रसव के वाहनों के रूप में कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग मिला है, और सिंथेटिक के विकास के लिए कोशिकाओं. हम और दूसरों को भी प्रारंभिक जीवन में आदिम कोशिका झिल्ली के मॉडल के रूप में liposomes कार्यरत है । 1 , 2 , 3 , 4 आमतौर पर, ऐसी प्रणालियों में, हम केवल एक लिपिड हाइड्रोकार्बन पूंछ (जैसे, ओलिक एसिड) युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles को रोजगार, के रूप में इन अणुओं कोडित प्रोटीन एंजाइमों आधुनिक कोशिकाओं के लाभ के बिना संश्लेषित करने के लिए सरल कर रहे है रोजगार ।

Liposomes एकल श्रृंखला लिपिड के शामिल diacylphospholipids से गठित उन लोगों के लिए समान हैं (जैसे, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, या POPC) कि सीमा bilayer झिल्ली से बना है. Liposomes लिपिड के या तो वर्ग से गठित एक भंग पेलोड बनाए रखने कर सकते हैं, और आकार छोटा और विभिंन तकनीकों से शुद्ध किया जा सकता है । कई महत्वपूर्ण मतभेद एकल श्रृंखला लिपिड के अद्वितीय रासायनिक विशेषताओं से परिणाम । फॉस्फोलिपिड द्वारा गठित बुलबुले एक व्यापक पीएच रेंज पर स्थिर हैं, जबकि फैटी एसिड बुलबुले तटस्थ में हल्के बुनियादी पीएच (ca. 7-9) के लिए ही स्थिर हैं, जो पुटिका तैयारी के लिए कुछ पीएच बफर की आवश्यकता है । समय के अधिकांश, इस बफर भी पुटिका encapsulation के लिए विशिष्ट घुलनशील अणुओं को शामिल कर सकते हैं, जो या तो कार्यात्मक सामग्री (जैसे, आरएनए) compartmentalized जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं या सरल फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, calcein के लिए हो सकता है ) पुटिका लक्षण वर्णन के लिए ।

केवल एक एकल हाइड्रोकार्बन श्रृंखला की उपस्थिति एक झिल्ली है कि दोनों solutes को और अधिक पारगंय है, साथ ही अधिक गतिशील पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, carboxylic एसिड सिर के बुलबुले में फैटी एसिड परिणाम में मौजूद समूह है कि और अधिक नमक और divalent cations की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है (जैसे,2 मिलीग्राम +) । मैग्नीशियम की उत्पत्ति के लिए protocells में catalyzing जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए सबसे महत्वपूर्ण divalent cations में से एक है जीवन अध्ययन । प्रारंभिक जीवन में, परिष्कृत प्रोटीन एंजाइमों के विकास से पहले, आरएनए प्रमुख बहुलक हो सकता है, अपनी दोहरी क्षमता के कारण स्वयं को दोहराने और प्रदर्शन catalysis. एक मैग्नीशियम की आवश्यकता होती है आरएनए संबंधित प्रतिक्रिया के एक प्रतिनिधि उदाहरण गैर एंजाइमी आरएनए नकल है, पहले 1960 के दशक में प्रदर्शन किया । 5 जब रासायनिक आरएनए न्यूक्लियोटाइड (यानी 2-methylimidazolide न्यूक्लियोटाइड) एक मौजूदा प्राइमर टेम्पलेट जटिल करने के लिए बाइंड, 3 '-हाइड्रॉक्सिल समूह प्राइमर हमलों के 5 '-फॉस्फेट एक आसंन सक्रिय मोनोमर के विस्थापन के लिए छोड़ने के समूह (यानी 2-methylimidazole), और एक नया phosphodiester बांड रूपों । इस आरएनए नकल रसायन मिलीग्राम की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता है2 +, जो chelated करने की जरूरत है ताकि फैटी एसिड protocells के साथ संगत हो । 6 एक और मिलीग्राम2 +-निर्भर प्रतिक्रिया है कि हथौड़ा ribozyme, जो शायद सबसे अच्छी विशेषता उत्प्रेरक आरएनए है द्वारा catalyzed है । इस ribozyme, जो दो लघु oligonucleotides से पुनर्गठन किया जा सकता है, एक आत्म-दरार प्रतिक्रिया है कि एक जेल बदलाव से निगरानी करने के लिए सुविधाजनक है करता है । जैसे, यह अक्सर मूल जीवन के अध्ययन में एक मॉडल ribozyme के रूप में कार्यरत है । 7 unliganded मैग्नीशियम के लिए इस ribozyme द्वारा एक आवश्यकता के कारण, liposomes आम तौर पर फैटी एसिड और फैटी एसिड ग्लिसरॉल एस्टर, जो मैग्नीशियम के लिए और अधिक स्थिर है का एक मिश्रण द्वारा निर्माण कर रहे हैं । 8 , 9 इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, हेरफेर, इन बुलबुले के लक्षण वर्णन और गैर एंजाइमी आरएनए नकल और हथौड़ा ribozyme की मेजबानी करने के लिए protocells के रूप में इन बुलबुले के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए विकसित किया है हम वर्तमान तकनीक catalysis.

Protocol

१. पुटिका तयारी

  1. तनु की फिल्मों की तैयारी
    1. एक गिलास शीशी में क्लोरोफॉर्म करने के लिए तालिका १.१ में वर्णित के रूप में लिपिड की कुछ राशि हस्तांतरण करने के लिए गैस तंग सीरिंज का उपयोग करें ।
    2. धुएं के हुड में नाइट्रोजन या आर्गन की एक धारा के तहत आने वाले समाधान लुप्त हो जाना ।
    3. किसी भी क्लोरोफॉर्म अवशेषों को दूर करने के लिए कम से 2 ज के लिए घर निर्वात के परिणामस्वरूप पतली फिल्म विषय । लिपिड इस बिंदु पर रात भर वैक्यूम के तहत छोड़ा जा सकता है ।
  2. बुलबुले के निर्जलीकरण
    1. 5 मिमी calcein २५० मिमी tris की 10 मिलीलीटर तैयार-एचसीएल पीएच ८.० जलयोजन बफर 1 एम tris-एचसीएल पीएच ८.० बफर के २.५ मिलीलीटर में calcein पाउडर के 31 मिलीग्राम भंग करके और एक और ७.५ मिलीलीटर (DI) पानी के जोड़ने ।
    2. पिपेट २५० एक खाली ट्यूब में ऊपर जलयोजन बफर के µ एल और एक अंतिम ७५ mM आधार के लिए 10 एम NaOH के १.८७५ µ एल जोड़ने (कुल फैटी एसिड की ½ समकक्ष) । ०.१५ मीटर की कुल लिपिड एकाग्रता के साथ बुलबुले के रूप में सूखी लिपिड की पतली फिल्म के लिए समाधान स्थानांतरण ।
    3. 4-5 एस के लिए परिणामी मिश्रण भंवर करने के लिए उच्च गति (> 3000 rpm) भंवर का प्रयोग करें
    4. एक कम गति पर लिपिड बफर मिश्रण छोड़ दो (ca. 30 rpm) reहाइड्रेट करने के लिए अस्थिर करने के लिए, कम से रात ।
  3. बुलबुले का आकार घटाने (वैकल्पिक)
    1. चिमटी का उपयोग करना, बाहर निकालना के सिरिंज बंदरगाहों के प्रत्येक भीतरी सतह के लिए एक फिल्टर समर्थन लागू होते हैं ।
    2. २५० मिमी tris-एचसीएल, पीएच 8 के साथ प्रत्येक फिल्टर समर्थन गीला ।
    3. चिमटी का उपयोग करना, एक ट्रैक लागू-बाहर निकालना ओ-अंगूठियां और फिल्टर का समर्थन करता है में से एक के लिए १०० एनएम कार्बोनेट झिल्ली खोदना । आंसू या झिल्ली पंचर नहीं करने के लिए देखभाल, धीरे दो सतहों के बीच अच्छा संपर्क बनाने के लिए इतनी के रूप में ओ-अंगूठी में झिल्ली धक्का ।
    4. बाहर निकालना, ध्यान झिल्ली और फिल्टर का समर्थन करता है विस्थापित करने के लिए नहीं ले इकट्ठा ।
    5. सीए के साथ एक बाहर निकालना सिरिंज भरें । २५० एमएम tris की ०.५ एमएल-एचसीएल, पीएच 8 । बाहर निकालना के एक पक्ष में इस सिरिंज डालें.
    6. बाहर निकालना के दूसरे पक्ष में एक खाली सिरिंज डालें.
    7. हाथ से, धीरे बफर युक्त सिरिंज के गोताख़ोर पुश (≤ ५० µ एल/एस), और सत्यापित करें कि प्रतिरोध महसूस किया जाता है, ट्रैक धंसा झिल्ली का संकेत जगह में है और बरकरार है । यह जगह में एक झिल्ली के बिना इस कदम का अभ्यास करने के लिए प्रतिरोध की उंमीद स्तर गेज करने के लिए उपयोगी है ।
    8. निकालें और दो सीरिंज को खाली । इस स्तर पर दो सीरिंज को साफ करने के लिए आवश्यक नहीं है क्योंकि वे liposome तैयारी करने के लिए समान संरचना के बफर होते हैं ।
    9. दो सीरिंज में से एक में liposome तैयारी लोड ।
    10. पुटिका नमूना युक्त सिरिंज बाईं ओर और सही पक्ष पर खाली सिरिंज के साथ फिर से इकट्ठा करना.
    11. हाथ से, पुटिका नमूना युक्त सिरिंज के गोताख़ोर पुश बहुत धीरे (10-25 µ एल/
    12. ध्यान से बाहर निकालना के सही पक्ष पर सिरिंज का निरीक्षण; स्पष्ट बफर शुरू में बाहर निकालना (ca. ५० µ एल के दाईं ओर प्रवेश करेंगे, यह बाहर निकालना के भीतरी मृत मात्रा के कारण है), बाहर निकाला liposomes के एक छोटे से बेर के बाद । तुरंत इस बिंदु पर धक्का बंद करो, बाहर निकालना मशीन के दाईं ओर सिरिंज, और इस समाधान को छोड़ दें ।
    13. बाहर निकालना के दाईं ओर सिरिंज की जगह और जब तक छोड़ दिया सिरिंज खाली है बाहर निकालना.
    14. बाहर निकालना के उंमुखीकरण रिवर्स और 13 कदम दोहराएं । चक्रों की इच्छित संख्या के लिए जारी रखें (आमतौर पर 7, 9, या 11); एक विषम संख्या हमेशा संयुक्त राष्ट्र के बाहर निकाला liposomes सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है शुरू में पूर्व घटाने liposome तैयारी युक्त सिरिंज से एकत्र नहीं कर रहे हैं ।
    15. धीरे एक Eppendorf ट्यूब में सही सिरिंज की सामग्री को बांटना और एक कम गति पर ट्यूब जगह (ca. 30 rpm) लगभग ०.५ ज के लिए घूर्णन शेखर ।
    16. पुटिका शुद्धि के साथ आगे बढ़ें, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है । बाहर निकाला बुलबुले 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए या फिर से अगली बार उपयोग करने से पहले बाहर निकाला ।

2. पुटिका शुद्धिकरण

  1. पुटिका शुद्धिकरण सचल चरण की तैयारी
    1. २५० mM tris के 5 मिलीलीटर तैयार-एचसीएल पीएच 8 जलयोजन बफर 1 एम tris की १.२५ मिलीलीटर-एचसीएल पीएच 8 बफर, DI पानी की ३.७५ मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब को जोड़कर । फिर 10 मीटर NaOH (unesterified फैटी एसिड के सापेक्ष आधार के ½ समकक्ष) जलयोजन बफर के लिए ३७.५ µ एल जोड़ें । पिपेट २३५ शुद्ध ओलिक एसिड के µ एल सीधे बाज़ ट्यूब में ०.१५ मीटर कुल लिपिड के साथ एक पुटिका समाधान जिसके परिणामस्वरूप ।
    2. 4-5 s के लिए मिश्रण भंवर करने के लिए उच्च गति (> 3000 rpm) भंवर का प्रयोग करें, तो कम से 2 ज के लिए एक कम गति घूर्णन शेखर पर हुई । लिपिड तैयारी इस बिंदु पर घूर्णन शेखर पर रातोंरात छोड़ दिया जा सकता है । किसी भी संभावित समुच्चय को निकालने के लिए उपयोग करने से पहले मोबाइल चरण को ०.२२ माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर इकाई के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
  2. Sepharose पर बुलबुले का शुद्धिकरण
    1. एक पिपेट का उपयोग कर बोतल से इथेनॉल Sepharose 4B घोल के ca .5 मिलीलीटर निकालें । यह एक डिस्पोजेबल 10 मिलीलीटर क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के लिए लागू होते हैं ।
    2. घोल को व्यवस्थित और इथेनॉल प्रवाह के माध्यम से अनुमति देने के माध्यम से जब तक इथेनॉल राल बिस्तर के ऊपर दृष्टिकोण ।
    3. राल के शीर्ष करने के लिए जल के 5 मिलीलीटर लागू करें और चलो प्रवाह के माध्यम से दूर इथेनॉल के अवशेषों को धोने के लिए ।
    4. लागू करें २५० mM tris-HCl, पीएच 8 में 1-2 मिलीलीटर भागों राल के शीर्ष करने के लिए, एक नया भाग हर बार तरल स्तर राल बिस्तर के ऊपर दृष्टिकोण लागू । 3-5 बार के लिए दोहराएं ।
    5. अपकार स्टैंड पर स्तंभ दबाना, फिर टोंटी कनेक्टर और टयूबिंग के साथ भिन्न संग्राहक के लिए स्तंभ की नोक कनेक्ट करें । टयूबिंग फ्लश करने के लिए बफर का एक और भाग जोड़ें, टोंटी बंद जब कॉलम में तरल स्तर राल के शीर्ष दृष्टिकोण ।
    6. एक २०० µ एल pipettor का उपयोग कर राल के शीर्ष करने के लिए धारा 1 से बाहर निकाला बुलबुले लागू करें, देखभाल करने के लिए राल बिस्तर या स्तंभ दीवार को छूने के बिना राल के लिए समान रूप से संभव के रूप में पुटिका तैयारी लागू.
    7. टोंटी को खोलने के लिए प्रवाह शुरू और एक ९६-अच्छी तरह से थाली में भागों का संग्रह शुरू करते हैं । 0.5 में राल बिस्तर के शीर्ष करने के लिए पुटिका शुद्धिकरण मोबाइल चरण लागू करें-1 मिलीलीटर भाग बफ़र के रूप में गिरेगा, देखभाल करने के लिए राल बिस्तर बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं ले । पांच बूंद भागों में इकट्ठा, कम से ३६ कुओं का संग्रह (एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट की तीन पंक्तियों) ।
  3. शुद्धि अंशों का प्रतिदीप्ति लक्षण वर्णन
    1. पिछले अनुभाग से ९६ अच्छी तरह से थाली ले लो और यह एक प्लेट रीडर पर पढ़ें (λex= ४८५ एनएम, λem= ५१५ एनएम) ।
    2. परिणामी प्रतिदीप्ति डेटा को प्रतिदीप्ति बनाम भिंन संख्या के रूप में प्लॉट करे । बुलबुले elute पहले, encapsulated भिन्न (चित्रा 1) द्वारा पीछा किया.
  4. पुटिका रिसाव पर नजर रखने के लिए बुलबुले की शुद्धि
    1. २.२ और २.३ वर्गों में शुद्धि और लक्षण वर्णन चरणों को दोहराएँ । बुलबुले कि उनकी सामग्री को बनाए रखा है unencapsulated घुला हुआ (या सीए के एक बहुत छोटे से एक का कोई शिखर प्रदर्शित करेगा. पुटिका चोटी की तीव्रता का 5-10%) ।

3. मैग्नीशियम की उपस्थिति में बुलबुले का उपयोग

  1. unliganded मैग्नीशियम का उपयोग
    1. तैयार है और 1, २.१ और २.२ वर्गों में वर्णित के रूप में बुलबुले शुद्ध ।
    2. ५० mm MgCl2 में 1 मिलीलीटर घोल तैयार करें २५० mm tris-hcl ph ८.० बफ़र में २५० µ एल जोड़कर 1 m tris-एचसीएल नं० ८.० बफर और ५० µ एल के 1 एम MgCl2 से ७०० µ एल के डीआई पानी । भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
    3. के लिए वांछित मैग्नीशियम एकाग्रता देने के लिए 5 मिमी, शुद्ध बुलबुले और मैग्नीशियम समाधान के १०० µ एल के ०.९ मिलीलीटर मिश्रण और तेजी से हलचल मैग्नीशियम के उच्च स्थानीय एकाग्रता के लिए बुलबुले के क्षणिक जोखिम से पुटिका व्यवधान को कम करने के लिए ।
      नोट: तेजी से मैग्नीशियम समाधान के मिश्रण पुटिका स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है । यदि मैग्नीशियम और बुलबुले जल्दी से तत्काल भंवर से मिश्रित नहीं कर रहे हैं, कुछ बुलबुले मैग्नीशियम की उच्च सांद्रता के लिए उजागर किया जाएगा, नमूना से असंगत परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप के लिए नमूना ।
    4. सामग्री रिसाव के लिए जांच करने के लिए २.४ में वर्णित के रूप में पुनर्शोधन से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए एक गिलास पर पुटिका नमूना छोड़ दें । reशुद्धि मोबाइल चरण के लिए पुटिका नमूना में के रूप में मैग्नीशियम की एक ही एकाग्रता जोड़ें ।
  2. liganded मैग्नीशियम का उपयोग
    1. तैयार है और 1, २.१ और २.२ वर्गों में वर्णित के रूप में बुलबुले शुद्ध ।
      नोट: deprotonate फैटी एसिड के लिए NaOH के बजाय ½ समकक्ष KOH का प्रयोग करें; यह पाया गया है कि यह chelated MgCl2 प्रणालियों में अधिक स्थिर liposomes पैदा करता है ।
    2. 2 एम पोटेशियम साइट्रेट समाधान तैयार है और KOH के साथ ८.० के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. Premix MgCl2 और पोटेशियम साइट्रेट निर्दिष्ट अनुपात (स्थिर ओलिक एसिड बुलबुले के लिए ca. 1:4) में २५० mM tris-HCl pH ८.० बफ़र में ।
    4. पुटिका नमूना, संक्षेप भंवर के लिए मिश्रित मैग्नीशियम साइट्रेट समाधान जोड़ें ।
      नोट: हमेशा premix मैग्नीशियम और ligand समाधान । कभी नहीं बुलबुले unchelated मैग्नीशियम समाधान के लिए अकेले बेनकाब ।
    5. २.४ में वर्णित के रूप में पुनर्शोधन से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए एक गिलास पर पुटिका नमूना छोड़ दें । reशुद्धि मोबाइल चरण के लिए पुटिका नमूना में के रूप में मैग्नीशियम और साइट्रेट की ही एकाग्रता जोड़ें ।

4. बुलबुले में गैर एंजाइमी आरएनए नकल

  1. monodisperse आरएनए encapsulated बुलबुले की तैयारी
    1. धारा १.१ में वर्णित के रूप में एक सूखी ओलिक एसिड फिल्म तैयार करें ।
    2. ५० µ एम फ्लोरोसेंट लेबल आरएनए प्राइमर, १५० µ m आरएनए टेम्पलेट और २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.० ½ एसिड के सापेक्ष के समकक्ष KOH युक्त के साथ पुटिका निर्जलीकरण बफर तैयार करें ।
    3. लिपिड फिल्म के लिए निर्जलीकरण बफर के २५० µ एल जोड़ें और कदम 1.2.2 और 1.2.3 कुल ०.१५ एम लिपिड एकाग्रता के साथ बुलबुले बनाने के लिए का पालन करें ।
    4. आदेश में छोटे unilamellar monodisperse बुलबुले बनाने के लिए, पुटिका बाहर निकालना के लिए धारा १.३ का पालन करें ।
  2. मैग्नीशियम-साइट्रेट इसके अलावा और पुटिका शुद्धि
    1. Premix मैग्नीशियम और साइट्रेट स्टॉक, और फिर ०.१ एम के एक अंतिम लिपिड एकाग्रता के लिए पुटिका नमूना के साथ इस मिश्रण
    2. Sepharose 4B आकार अपवर्जन कॉलम पर बुलबुले शुद्ध, २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.१ M लिपिड और दिया मैग्नीशियम और मोबाइल चरण के रूप में साइट्रेट के साथ ।
    3. धारा २.३ का पालन करते हुए पुटिका अंशों को एकत्र करें ।
  3. प्राइमरी एक्सटेंशन रिएक्शन
    1. २०० mm 2-MeImpG (guanosine 5 '-मोनोफोस्फेट 2-methylimidazolide) स्टॉक सॉल्यूशन २५० mm tris-HCl pH ८.० के साथ तैयार करें । (नोट: 2-MeImpG संश्लेषण के लिए पिछले प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करें10 .)
    2. प्राइमरी एक्सटेंशन रिएक्शन आरंभ करने के लिए, स्थानांतरण १५० µ l के 2-MeImpG स्टॉक सॉल्यूशन के लिए ४५० µ l पुटिका नमूना ७५ mm लिपिड और ५० mm सक्रिय मोनोमर की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए । टाइमर शुरू और प्रतिक्रिया हर समय tumbling नमूना रखना ।
    3. वैकल्पिक) निरंतर ताजा मोनोमर खिलाने के लिए, स्थानांतरण ३०० µ एल प्रतिक्रिया समाधान के एक कक्ष के लिए एक प्रयोगशाला का निर्माण छोटे मात्रा liposome अपोहक11 और अंय कक्ष में ३०० µ l खिला समाधान डाल दिया । खिला समाधान प्रतिक्रिया समाधान के रूप में एक ही एकाग्रता में सभी सामग्री को शामिल करना चाहिए, खाली बुलबुले के साथ बुलबुले युक्त आरएनए की जगह के अलावा. डायलिसिस के प्रत्येक दौर analyte और इस्तेमाल किया झिल्ली पर निर्भर करता है, 1-24 ज लेता है ।
    4. काइनेटिक अध्ययन के लिए, एक १०० µ एल aliquot हर समय बिंदु पर ले लो, और मोबाइल चरण के रूप में २५० mM 4B-एचसीएल पीएच ८.० के साथ एक Sepharose tris आकार अपवर्जन कॉलम के माध्यम से aliquot पुनर्शुद्ध ।
    5. एक १.५ मिलीलीटर eppendorf ट्यूब में पुटिका भागों लीजिए ।
    6. पिपेट ट्राइटन के पुटिका अंशों को अंतिम लगभग ०.१% v/
    7. ट्यूब के लिए ठंडा इथेनॉल के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और-20 डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज के लिए ।
    8. 16.1 × 1000 आरसीएफ (१६.१ × g) 10 मिनट के लिए और धीरे से तरल पदार्थ बाहर पिपेट में सभी नमूनों केंद्रापसारक । ७०% ठंडा इथेनॉल के साथ आरएनए छर्रों धोने और 5 मिनट के लिए फिर से केंद्रापसारक । तरल त्यागें और एक ८० ° c हीट ब्लॉक पर आरएनए छर्रों के साथ ट्यूब डाल करने के लिए 2 मिनट अवशिष्ट इथेनॉल लुप्त हो जाना. 1xTBE लोड हो रहा है बफर के साथ 8 मीटर यूरिया की ५० µ एल में छर्रों भंग ।
  4. पृष्ठ विश्लेषण
    1. २०० मिलीलीटर UreaGel प्रणाली ध्यान केंद्रित, UreaGel प्रणाली मंदक के 25 मिलीलीटर, 10xTBE बफर के 25 मिलीलीटर, ८० µ एल के TEMED और २५० मिलीग्राम का मिश्रण द्वारा 20% पेज जेल तैयार करें अमोनियम persulfate । जल्दी से clamped जेल प्लेटों के बीच जेल मिश्रण डालना (३५ cm × ४५ cm) और कंघी डालें । पूरी तरह से बहुलकीकरण तक ंयूनतम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
    2. जेल की थाली पर इकट्ठा करने के लिए खड़े हो जाओ और जेल बक्से 1xTBE जेल चल बफर के साथ भरें । कंघी से दूर ले और सिरिंज के साथ कुओं फ्लश । पूर्व ६० डब्ल्यू के साथ 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
    3. 2 मिनट के लिए ८० ° c हीट ब्लॉक पर नमूनों गर्मी और प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 5 µ एल लोड ।
    4. जेल पावर बॉक्स को चालू करें और २.५ h के लिए ६० W पर निरंतर वाट के साथ चल रहे जेल सेट करें ।
    5. जेल से जेल थाली जुदा खड़े हो जाओ, साफ गिलास पोंछ और जेल स्कैनिंग शुरू करने के लिए जेल स्कैनर में पूरी थाली डाल दिया ।
    6. ImageQuant TL 1 डी विश्लेषण के साथ जेल मात्रा बढ़ाता है । एक निश्चित समय पर शेष प्राइमर की राशि के अनुपात का प्राकृतिक लघुगणक बनाम प्राइमर की प्रारंभिक राशि के लिए समय, एक लाइन के लिए फिट, और छद्म पहले आदेश प्रतिक्रिया दर (चित्रा 2) की गणना ।

5. हथौड़ा आरएनए आत्म दरार में बुलबुले

  1. तैयारी और ribozyme की शुद्धि के बुलबुले में encapsulated
    1. एक लिपिड पतली फिल्म तैयार (OA: GMO = 9:1) के रूप में तालिका १.२ में घटकों के साथ धारा १.१ के रूप में. नोट: का उपयोग करने से पहले पूरा पिघलने के लिए गर्म GMO कम से ६० डिग्री सेल्सियस ।
    2. प्रत्येक हथौड़ा ribozyme कतरा और २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.० के 5 µ मीटर के साथ पुटिका निर्जलीकरण बफर तैयार करें ।
    3. लिपिड फिल्म के लिए निर्जलीकरण बफर के २५० µ एल जोड़ें और चरणों का पालन करें 1.2.2 और 1.2.3 ०.१५ एम कुल लिपिड एकाग्रता के साथ बुलबुले बनाने के लिए ।
    4. आदेश में छोटे unilamellar monodisperse बुलबुले बनाने के लिए, पुटिका बाहर निकालना के लिए धारा १.३ का पालन करें ।
    5. एक Sepharose 4B आकार अपवर्जन कॉलम पर बुलबुले शुद्ध, २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.१५ एम मिश्रित लिपिड मोबाइल चरण के रूप में के साथ ।
  2. हथौड़ा ribozyme सेल्फी-क्लीवेज रिएक्शन
    1. स्वयं-क्लीवेज प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए धारा ३.१ में वर्णित के रूप में मैग्नीशियम समाधान और शुद्ध बुलबुले के साथ मिश्रण तैयार करें ।
    2. काइनेटिक अध्ययन के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर मिश्रण के १०० µ एल ले और सीधे मोबाइल चरण के रूप में २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.० के साथ एक Sepharose 4B आकार अपवर्जन कॉलम के माध्यम से इस aliquot पुनर्शुद्ध । पुटिका अंश एकत्र करा.
  3. पृष्ठ विश्लेषण
    1. आरएनए लदान नमूना तैयार करने के लिए 4.3.8 करने के लिए 4.3.6 चरणों का पालन करें.
    2. जगह व्यावसायिक रूप से डाली 15% TBE-जेल बॉक्स में यूरिया जेल और जेल बॉक्स 1xTBE जेल चल बफर के साथ भरें ।
    3. 1 मिनट के लिए ८० ° c हीट ब्लॉक पर नमूनों गर्मी और प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 5 µ एल लोड ।
    4. लगातार २०० वी के आसपास के लिए 1 एच के साथ जेल भागो ।
    5. जेल स्कैन ।
    6. ImageQuant TL 1 डी की तरह एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ जेल को बढ़ाता है, शेष सब्सट्रेट आरएनए बैंड और सट आरएनए टुकड़ा बैंड की तीव्रता की तुलना करके दरार की हद को मापने के लिए (चित्रा 3).

6. माइक्रोस्कोपी के लिए विशाल फैटी एसिड बुलबुले

  1. विशाल फैटी एसिड बुलबुले की तैयारी
    1. धारा १.१ और तालिका १.३ का पालन करें बेहतर झिल्ली अवलोकन के लिए फ्लोरोसेंट लेबल लिपिड के ०.२ मॉल% के साथ एक ओलिक एसिड पतली फिल्म तैयार करने के लिए ।
    2. ५०० µ एल २५० mM tris-एचसीएल पीएच ८.० के साथ reहाइड्रेट लिपिड फिल्म कुल में पुटिका नमूना 10 मिमी लिपिड बनाने के लिए । बफर फ्लोरोसेंट रंजक या आरएनए अणु शामिल अगर वांछित हो सकता है । छोड़ पुटिका नमूना रात भर tumbling ।
    3. १५० मिलीलीटर शुद्ध फैटी एसिड डायलिसिस बफर के साथ 10 मिमी कुल लिपिड के ४७० µ एल मिश्रण द्वारा तैयार ओलिक एसिड और १५० एमएल के २५० मिमी tris-एचसीएल पीएच ८.० युक्त ½ समकक्ष NaOH.
    4. बड़े समुच्चय निकालने के लिए एक 10 µm पाली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से पुटिका नमूना बाहर निकालना ।
    5. 1 µm बड़े में पुटिका नमूना हस्तांतरण-, डायलिसिस कैसेट ताकना के रूप में पहले वर्णित है । 12
    6. डायलिसिस कैसेट को १०० एमएल वाले यूरिन में लगाएं जिसमें 30 मिलीलीटर डायलिसिस बफर हो । एक मेज-80-100 rpm पर शीर्ष शेखर पर धीरे चोंच आंदोलन ।
    7. डायलिसिस बफर हर 30 मिनट के लिए 5 बार मुक्त रंजक या आरएनए और छोटे बुलबुले को हटाने के लिए बदलें ।
    8. ध्यान से डायलिसिस कैसेट से पुटिका नमूना एक सिरिंज के साथ निकालें और एक Eppendorf ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
  2. सूक्ष्म अवलोकन
    1. एक साफ मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बुलबुले के 10 µ एल पिपेट और नमूना पर एक गिलास कवर पर्ची जगह है । सील कवर ग्लास पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ ।
    2. एक 60X तेल के साथ बुलबुले-फैलाव या इसी तरह के उद्देश्य से फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त लेजर स्रोत का उपयोग कर फ्लोरोसेंट लेबल झिल्ली, आरएनए या encapsulated डाई (चित्रा 4) के लिए निरीक्षण ।

Representative Results

हम सामान्यतया आकार-बहिष्करण स्तंभों पर liposome शुद्धिकरण करते हैं. ठेठ liposome तैयारी किसी तरह का एक fluorophore होते हैं । जब liposomes उत्पन्न कर रहे हैं और बाहर निकाला, encapsulated किया जा करने के लिए प्रजातियों liposomes के अंदर और बाहर दोनों मौजूद हैं. एक आकार-अपवर्जन राल (Sepharose 4B) पर liposomes शुद्ध करके, unencapsulated solutes राल के pores के भीतर बनाए रखा, जबकि बड़ा liposomes नहीं कर रहे है और elute पहले (आंकड़ा 1a) । भागों का संग्रह और प्रतिदीप्ति बनाम अंश संख्या (चित्र 1b) आम तौर पर पैदावार एक दो चोटी का पता लगाने, जल्दी-eluting liposomes है, जो तब एकत्र कर रहे है और बाद में अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया भागों के साथ ।

हम अक्सर ribozyme और प्रोटीन आधारित आरएनए polymerases के उद्भव से पहले आरएनए प्रतिकृति का एक संभावित साधन थे जो nonenzymatic प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं, की जाँच. इन प्रतिक्रियाओं को आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमर (चित्र 2a), जो सक्रिय मोनोमर द्वारा विस्तारित है रोजगार । इन प्रतिक्रियाओं जेल ट्रो (चित्रा 2 बी) और परिणामस्वरूप electropherograms एक दी प्रतिक्रिया हालत (चित्रा 2c) के लिए दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए एकीकृत द्वारा निगरानी की जा सकती है ।

आरएनए protocells अंदर समारोह सकता है कि प्रदर्शन करने के लिए, हम एक मॉडल आरएनए उत्प्रेरक प्रतिक्रिया के रूप में ribozyme आत्म दरार (चित्रा 3) हथौड़ा रोजगार. यह प्रतिक्रिया मुक्त मिलीग्राम की आवश्यकता है2 + catalysis की सुविधा के लिए, और इसलिए हम OA प्रयोग/GMO बुलबुले के बाद से वे 5 मिमी मिलीग्राम2 +की उपस्थिति में स्थिर हैं । प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं के समान, हथौड़ा ribozyme स्व-क्लीवेज प्रतिक्रिया भी जेल ट्रो (चित्र3) द्वारा निगरानी की जा सकती है और बाद में विशिष्ट शर्तों के तहत दर लगातार प्राप्त करने के लिए विश्लेषण

हम छवि liposomes दोनों प्रतिदीप्ति और संचारित प्रकाश रोजगार । Liposomes फ्लोरोसेंट लिपिड का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है, जो एक झिल्ली लेबल (चित्रा 4a), या उनके लुमेन के भीतर एक फ्लोरोसेंट घुला हुआ का उपयोग (चित्रा 4B) दे । संचारित प्रकाश भी बुलबुले का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्रा 4Bमें दिखाया गया है) ।

तालिका १.१ क्लोरोफॉर्म में शुद्ध ओलिक अम्ल
घटक शेयर राशि
ओलिक अम्ल > 99% ११.७ µ l
क्लोरोफॉर्म 1 मिलीलीटर
तालिका १.२ ओलिक अम्ल और ग्लिसरॉल monooleate (9:1) में क्लोरोफॉर्म
घटक शेयर राशि
ओलिक अम्ल > 99% १०.५ µ l
ग्लिसरॉल monooleate > 99% १.४ µ l
क्लोरोफॉर्म 1 मिलीलीटर
टेबल १.३ ओलिक एसिड विथ 0.2 मॉल% Rhodamine-PE in क्लोरोफॉर्म
घटक शेयर राशि
ओलिक अम्ल > 99% १.६ µ l
Rhodamine-पे मे क्लोरोफॉर्म 10 एमएम 20 µ l
क्लोरोफॉर्म 1 मिलीलीटर

तालिका 1. फैटी एसिड क्लोरोफॉर्म समाधान ।

Figure 1
चित्र 1. शुद्धि अंश के पुटिका शुद्धिकरण और प्रतिदीप्ति लक्षण वर्णन. एक Sepharose 4B कॉलम पर मुक्त calcein से calcein युक्त बुलबुले के ए जुदाई । B. पुटिका और भिंन संग्रह के बाद एक अच्छी तरह से बनाम अच्छी संख्या में प्रतिदीप्ति की साजिश रचने के द्वारा मुक्त calcein चोटी का पता लगाने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. OA बुलबुले के अंदर गैर एंजाइमी आरएनए प्रतिकृति । गैर एंजाइमी आरएनए प्राइमर एक्सटेंशन की ए. योजना. शुद्ध ओलिक एसिड बुलबुले के अंदर एक प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के बी पृष्ठ छवि, धारा 4 के रूप में शर्तों के साथ । C. प्राइमर की राशि के अनुपात के प्राकृतिक लघुगणक के रेखीय फिट दिया समय बिंदु पर किताब के प्रारंभिक राशि के लिए शेष बनाम । समय 30 से अधिक h. reaction की दर, ln की ढलान से गणना (p/p0) बनाम समय, ०.०५८ एच-1है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. हथौड़ा ribozyme दरार में OA/GMO बुलबुले । फ्लोरोसेंट लेबल सब्सट्रेट कतरा (ऊपर) के हथौड़ा ribozyme दरार की ए योजना. बी पृष्ठ छवि हथौड़ा ribozyme दरार के अंदर OA/5 मिमी मिलीग्राम2 +के साथ GMO बुलबुले । C. Ribozyme गतिविधि अंदर बुलबुले । समय पर शेष सब्सट्रेट की राशि के अनुपात के प्राकृतिक लघुगणक फिट सब्सट्रेट की प्रारंभिक राशि के लिए समय बिंदु पर पहले 4 ज. reaction दर में, ln की ढलान से गणना की (s/s0बनाम समय, ०.३६ एच-1है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. माइक्रोस्कोपी के लिए विशाल फैटी एसिड बुलबुले । ए Rhodamine पीई की एक फोकल माइक्रोस्कोपी छवि लेबल ओलिक एसिड पुटिका, स्केल बार 10 माइक्रोन । ख. ओलिक एसिड पुटिका की फोकल माइक्रोस्कोपी छवि युक्त Alexa488 लेबल आरएनए में दिखाया झिल्ली के साथ संचारित डिटेक्टर (टीडी) चैनल, स्केल बार 5 माइक्रोन.

Discussion

फैटी एसिड से गठित Liposomes उनके उच्च पारगम्यता और गतिशील गुणों के कारण आदिम कोशिकाओं के लिए संभावित मॉडल के रूप में कई द्वारा सुझाव दिया गया है. एकल चेन फैटी एसिड की carboxylic सिर समूह केवल एक सीमित पीएच रेंज में झिल्ली में आत्म विधानसभा की अनुमति देता है, और जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली लवण की उपस्थिति के लिए काफी संवेदनशील हैं । नतीजतन, फैटी एसिड बुलबुले फॉस्फोलिपिड बुलबुले के साथ तुलना में अलग तैयारी और हैंडलिंग तरीकों की आवश्यकता होती है ।

इस प्रोटोकॉल में, यद्यपि हम liposome गठन के लिए एक उदाहरण के रूप में ओलिक एसिड का उपयोग, अंय लंबी श्रृंखला unसंतृप्त फैटी एसिड (सी14) और उनके डेरिवेटिव (सीए. myristoleic एसिड, palmitoleic एसिड, और इसी शराब और ग्लिसरॉल एस्टर) भी बुलबुले के रूप में पतली फिल्म निर्जलीकरण के रूप में लंबे समय के रूप में कुल लिपिड एकाग्रता सीएमसी के ऊपर है और जलयोजन बफर पीएच झिल्ली के भीतर फैटी एसिड की pKa के करीब है के बाद । tris-HCl बफर के अलावा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, अंय बफर सिस्टम (ca. bicine, फॉस्फेट, बोराटे) फैटी एसिड पुटिका गठन का समर्थन करने के लिए सूचित किया गया था, हालांकि फॉस्फेट या बोराटे बफर में गठित बुलबुले आमतौर पर काफी टपका हुआ13हैं । निर्जलीकरण के बाद परिणामस्वरूप फैटी एसिड बुलबुले polydisperse और multilamellar हैं, लेकिन आसानी से बाहर निकालना द्वारा वर्णित के रूप में छोटे monodisperse unilamellar बुलबुले में परिवर्तित कर रहे हैं । छोटे बुलबुले पैदा करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में sonication के साथ तुलना में, बाहर निकालना अलग ताकना आकार झिल्ली लागू करने से पुटिका आकार के नियंत्रण के लिए और अधिक विकल्प प्रदान करता है । बाहर निकालना के बाद बुलबुले आम तौर पर झिल्ली ताकना आकार से थोड़ा बड़ा कर रहे हैं, लेकिन बाहर निकालना चक्र की संख्या में वृद्धि से, एक संकरा आकार वितरण के साथ बुलबुले और एक औसत आकार झिल्ली ताकना आकार के करीब प्राप्त किया जा सकता है ।

कार्यात्मक protocells को संश्लेषित करने के लिए, फैटी एसिड बुलबुले के लिए विशिष्ट जैव-रासायनिक आरएनए या अन्य इमारत ब्लॉकों के encapsulation के परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाओं की मेजबानी की जरूरत है । पतली फिल्म निर्जलीकरण विधि एक आसान तरीका है वांछित encapsulated सामग्री युक्त बुलबुले के रूप प्रदान करता है । हालांकि, encapsulation दक्षता अपेक्षाकृत कम है और शाही सेना के रूप में कीमती सामग्री का एक बड़ा अंश आम तौर पर शुद्धि प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं । कुछ मामलों में encapsulation दक्षता बाहर निकालना से पहले दोहराया फ्रीज-गल चक्र द्वारा मामूली सुधार किया जा सकता है । उच्च फॉस्फोलिपिड liposomes की उपज की तैयारी के लिए Microfluidic तरीके लगभग १००% encapsulation दक्षता के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन अनुरूप तरीके अभी तक फैटी एसिड बुलबुले के लिए विकसित नहीं किया गया है ।

जब या तो chelated या नि: शुल्क मिलीग्राम2 +के साथ protocells हैंडलिंग +, मैग्नीशियम समाधान इसके अलावा और प्रत्येक समय बिंदु से पहले शोधन के बाद शुद्धिकरण की लीक encapsulated सामग्री है कि प्रतिक्रिया की दर की सटीकता को प्रभावित कर सकता है को हटाने सुनिश्चित करता है बुलबुले के अंदर माप । के बाद से प्रत्येक शुद्धि के लिए अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए और पुटिका भागों को इकट्ठा करने के लिए ंयूनतम 10 मिनट लगते हैं, तेजी से प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण मुश्किल है, और प्रतिक्रिया स्तंभ शोधन से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए ।

प्रोटोकॉल हम यहां मौजूद फैटी एसिड liposomes के निर्माण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि मेजबान उन है कि आदिम कोशिकाओं में हो सकता नकल उतारना प्रतिक्रियाओं । हमारे प्रोटोकॉल भी जैव चिकित्सा वितरण प्रणालियों और अंय जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया के विकास में संभावित अनुप्रयोगों को सक्षम करें ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

J.W.S. हावर्ड ह्यूजेस आयुर्विज्ञान संस्थान के जांचकर्ता हैं । यह काम एक अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था (२९०३६३) शमौन फाउंडेशन से J.W.S. के लिए दोनों A.E.E. और K.P.A. मिनेसोटा प्रारंभमें कोष के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

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References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

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इंजीनियरिंग अंक १३२ liposomes बुलबुले protocells सिंथेटिक कोशिकाओं synells जीवन की उत्पत्ति
तैयारी, शुद्धि, और फैटी एसिड युक्त Liposomes का उपयोग
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Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

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