Summary
単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids と比較して異なるプロパティを示します。ここで準備、精製、および一部で構成されるリポソームの使用またはこれらの両親媒性分子の全体のための手法について述べる。
Abstract
単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、これらの両親媒性分子のユニークな化学的性質による diacylphospholipids を含むと比較して異なるプロパティを示します。特に、脂肪酸リポソームは、単一鎖両親媒性の比較的高い容解性のための動的キャラクターを強化します。同様に、遊離脂肪酸を含むリポソームはカルボン酸頭部基と金属イオンとの間の強い相互作用のための塩と 2価陽イオンにより敏感です。ここでは、準備、浄化、および一部で構成されるリポソームの使用または単一のチェーン両親媒性物質 (例えばオレイン酸) の全体のためのテクニックを示しています。
Introduction
リポソーム、または小胞-両親媒性脂質の二重膜で囲まれた区画 - は、多数のバイオメディカル分野で、配送車両の合成開発、医薬品、細胞膜のモデルとして、使用を発見しました。セルです。私たちと他の人も初期の生活の中の原始的な細胞膜のモデルとしてリポソームを採用しています。1,2,3,4通常、このようなシステムを用いてこれらの分子は近代的な電池を採用コード化された蛋白質の酵素の利点なしで合成するより簡単な (例えばオレイン酸)、1 つだけ脂質炭化水素の尾を含む単一鎖両親媒性物質。
単一鎖脂質から成るリポソーム diacylphospholipids から形成されたものと類似している (例えば1-パルミトイル-2-オレオイル -sn- グリセロホスファチジン-3-phosphocholine、または POPC) 境界は二重膜で構成されるという点で。リポソームの脂質のいずれかのクラスから形成された溶存ペイロードを保持することができますと、縮小・異なった技術によって精製できます。単一鎖脂質のユニークな化学的特徴からいくつかの重要な違いの結果。リン脂質によって形成される小胞は、脂肪酸小胞、小胞の準備のためある特定の pH のバッファーを必要とする中性ないし弱塩基性 pH (ca. 7-9) で安定しているだけ広い pH 範囲で安定しています。ほとんどの時間、区分の生化学的な反作用または単純な蛍光染料 (例えばカルセインのため、このバッファーは小胞のカプセル化、どちらかの材料 (例えばRNA) をすることができます特定の水溶性分子を含めることができますも) 小胞のキャラクタリゼーションのため。
のみ 1 つの炭化水素の鎖の存在は、両方の溶質をより透過性だけでなくよりダイナミックな膜を生成します。また、カルボン酸頭のグループ (例えばMg2 +) 塩と 2価の陽イオンの存在に敏感な小胞の脂肪酸の結果に存在。マグネシウムは、まだ生命の起源研究の生化学反応を触媒するため最も重要な二価のカチオン類のひとつです。洗練された蛋白質の酵素の進化前の初期の人生の RNA 自己複製を触媒を実行するデュアル機能のための支配的な高分子であったかもしれません。マグネシウム必要とする RNA の 1 つの代表的な例は関連の反応は非酵素的 RNA コピー、1960 年代に初めて明らかにしました。5化学的に活性化された RNA ヌクレオチド (すなわち2 反応に対する生体のヌクレオチド) は複雑な既存プライマー テンプレートにバインド、プライマーの 3' ヒドロキシル グループ攻撃を転置するため隣接する活性モノマーの 5' リン酸残してグループ (すなわち2-methylimidazole)、およびフォーム新しいのリン酸ジエステルが付着します。この RNA のコピーの化学では、高濃度 Mg2 +、脂肪酸吹き込むと互換性があるためにキレート環を作る必要がある必要があります。6別の Mg2 +-依存性反応は、おそらく最も特徴付けられる触媒 RNA であるハンマー ヘッド型リボザイムによって触媒されます。2 つの短いオリゴヌクレオチドから再構成することができる、このリボザイムは、ゲルの転位によって監視に便利です自己開裂反応を実行します。など、それは頻繁にモデル リボザイムとして生命の起源の研究で採用です。7リガンド非結合状態のマグネシウムのこのリボザイムによって要件によるリポソームでマグネシウムに安定している脂肪酸グリセロール エステル脂肪酸の混合物で構成されています。8,9でこのプロトコルを提案手法を我々 は準備、操作、これらの小胞のキャラクタリゼーションを開発し、ホスト非酵素 RNA のコピーとハンマー ヘッド型リボザイムに吹き込むとしてこれらの小胞のアプリケーションを示す触媒。
Protocol
1. 小胞の準備
-
薄膜の作製
- ガス タイトな注射器を使用すると、ガラス瓶のクロロホルムに表 1.1で説明されているように脂質の一定量を転送します。
- 窒素またはアルゴン発煙のフードの流れの下で得られた溶液を蒸発させます。
- クロロホルムの任意の残基を削除する少なくとも 2 時間家真空の結果として得られる薄膜を対象します。脂質が一晩残される真空下でこの時点で。
-
小胞の水分補給
- カルセイン粉末 2.5 mL の 1 M トリス塩酸 pH 8.0 バッファーの 31 mg を溶解し、純水 (DI) の別の 7.5 mL の追加により 10 mL の 5 mM カルセイン 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 水和反応バッファーを準備します。
- 空チューブに水和バッファー上の 250 μ L をピペット、最終的な 75 mm の基本 10 M NaOH の 1.875 μ L (総脂肪酸の ½ 相当) を追加します。総脂質濃度 0.15 M のフォーム小胞に乾燥脂質薄膜にソリューションを転送します。
- 高速使用 (> 3000 rpm) 渦 4-5 秒の得られた混合物を vortexer。
- 水分補給、少なくとも一晩を低速 (約. 30 rpm) 回転シェーカーで脂質バッファー混合物を残します。
-
(省略可能) 小胞のサイズ変更
- ピンセットを使用して、押出機の注射器ポートの各内面 1 つサポートするフィルターが適用されます。
- 250 mM tris 各フィルター サポートを濡れている-塩酸で pH 8。
- ピンセットを使用して、押出機 O リングの 1 つに 1 つトラック エッチング 100 nm ポリカーボネート膜を適用し、サポートをフィルターします。世話ない涙や膜を穿刺、2 つのサーフェス間の良好な接触をするために o リングに膜をそっと押し込みます。
- 押出機、膜がずれないように世話を行い、フィルターをサポートしています。
- 250 mM tris の 0.5 mL と押出機の注射器を埋める-塩酸で pH 8。この注射器を押出機の 1 つの側面に挿入します。
- 押出機の反対側に空の注射器を挿入します。
- 手でゆっくりとバッファーを含む (≤ 50 μ L/s)、注射器のプランジャーを押して、トラック エッチング膜が場所、そのままを示す抵抗が感じられることを確認します。抵抗性の期待されるレベルを測定するために場所に膜なしこのステップを練習することをお勧めします。
- 削除し、空の注射器 2 本。リポソーム調製に同一組成のバッファーが含まれているので、この段階で注射器 2 本をきれいにする必要はありません。
- 注射器 2 のリポソーム調製に読み込みます。
- 左側にある、右側にある空の注射器に小胞サンプルの入った注射と押出機を組み立て直します。
- 手で非常にゆっくりと小胞サンプルの入った注射 (10-25 μ L/s) のプランジャーを押してください。
- 押出機の右側にある注射器を注意深く観察します。バッファーが押出機の右側にあるを入力して最初クリア (50 μ L、これは押出機の内部のデッド ボリュームのため)、押出リポソームの小さなプルームが続きます。この時点でを押してすぐに停止、押出機、右側にある注射器を取り外してこのソリューションを廃棄します。
- 押出機の右側にある注射器を交換し、左の注射器が空になるまでを押し出します。
- 押出機の向きを逆にし、手順 13 を繰り返します。必要な数のサイクル (通常 7、9、または 11) で続行します。奇数は非押し出しリポソームは最初中古小型化リポソーム調製を含む注射器から収集されないように常にされます。
- 優しく右注射器の内容をエッペン チューブに分注し、0.5 h 程度の低速 (約. 30 rpm) 回転シェーカーでチューブを配置します。
- セクション 2 で説明した小胞浄化を続行します。押し出された小胞を 24 h 内で使用するか、再度次の時間使用する前に押し出されます。
2. 小胞浄化
-
小胞浄化移動相の調製
- 1 M トリス塩酸 pH 8 バッファー、DI 水を 15 mL ファイティングファルコン管の 3.75 mL 1.25 mL を追加して 5 mL の 250 mM トリス塩酸 pH 8 水和バッファーを準備します。10 M NaOH の 37.5 μ L を追加 (unesterified 脂肪酸基準ベースの ½ 相当) 水和反応バッファーにします。0.15 M 総脂質小胞のソリューションの結果ファルコン チューブに直接純粋なオレイン酸の 235 μ L をピペットします。
- 高速使用 (> 3000 rpm) 渦 4 5 s の混合物 vortexer は、少なくとも 2 時間のシェーカーを回転低速で転落。脂質準備することができます一晩残される回転のシェーカーでこの時点で。潜在的な集計を削除する使用する前に 0.22 μ m シリンジ フィルター ユニットを介して移動相をフィルター処理します。
-
セファローズに小胞の精製
- Ca. エタノール セファローズ 4 b 液の 5 mL ボトルのピペットを使用してから削除します。10 mL の使い捨て可能なクロマトグラフィー コラムにこれを適用します。
- エタノール アプローチ樹脂床の上まで解決するスラリー、エタノールの通過を許可します。
- 5 ml の脱イオン水樹脂とエタノールの残渣を洗い流すため let フロースルーの上部に。
- 適用 250 mM トリス-HCl、pH 液面樹脂ベッドの上部に近づくたびに新しい部分を適用する樹脂の上に 1-2 mL の部分で 8。リピートの 3-5 回。
- レトルト スタンドに列をクランプし、活栓コネクタと分数コレクターに管列の先端に接続します。フラッシュ チューブは、列内の液体のレベルに近づくとガレージの上部、活栓を閉じてバッファーの別の部分を追加します。
- セクション 1 から 200 μ L pipettor を使用して、ベシクル調製を樹脂樹脂ベッドまたは列の壁に触れることがなく、できるだけ均等に適用する世話のガレージの上に押し出された小胞を適用します。
- 流れを開始、96 ウェル プレートに分画の収集を開始しバルブを開きます。0.5-1 の樹脂層の上に小胞浄化移動相を適用 mL 部分バッファーを使い果たす、樹脂ベッドを乾燥しないように世話として。5 ドロップ画、少なくとも 36 井戸 (96 ウェル プレートの 3 行) を収集を収集します。
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精製留分の蛍光特性
- 前のセクションから 96 ウェル プレート、プレート リーダーで読む (exλ = 485 nm、λem= 515 nm)。
- 分数の数対蛍光として得られた蛍光データをプロットします。小胞はまず、溶出カプセル化されていない部分 (図 1) が続きます。
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小胞の漏洩を監視する小胞の及び再精製
- セクション 2.2 と 2.3 の精製と諸性質の手順を繰り返します。その内容を保持している小胞はカプセル化されていない溶質 (または小胞ピークの強度の約 5-10% の非常に小さなもの) のピークを示さない。
3. マグネシウムの存在下での小胞の使用
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リガンド非結合状態のマグネシウムの使用
- 準備し、セクション 1、2.1 および 2.2 で説明したように小胞を浄化します。
- 水・ ディ ・ 700 μ L に 1 M トリス塩酸 pH 8.0 バッファーの 250 μ L と 1 M MgCl2の 50 μ L を追加することによって 50 mM 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 緩衝 MgCl2ソリューションの 1 つの mL を準備します。よく混合する渦。
- 5 mM の必要なマグネシウム濃度を与えるためには、浄化された小胞の 0.9 mL とマグネシウム溶液 100 μ L を混ぜるし、マグネシウム濃度の高いローカル小胞の短期曝露によって小胞の中断を最小限に抑えるために急速にかき混ぜます。
注: は、小胞の安定性に重要なマグネシウム溶液の急速混合です。マグネシウムおよび小胞はすぐに混合していない場合即時ボルテックスによって、いくつかの小胞はサンプルからサンプルに一貫性のない結果の結果マグネシウムの高濃度にさらされます。 - 及び再精製する前に、少なくとも 30 分間タンブラーに小胞サンプルそのままに内容漏れをチェックするための 2.4 で説明されています。及び再精製移動相に同じ小胞のサンプルのようにマグネシウム濃度を追加します。
-
リガンド結合状態のマグネシウムの使用
- 準備し、セクション 1、2.1 および 2.2 で説明したように小胞を浄化します。
注: 使用 ½ 相当島脱プロトン化脂肪酸に水酸化ナトリウムの代わりにこれはキレート MgCl2システムでより安定したリポソームを生成することが見つかりました。 - 2 M カリウムのクエン酸溶液を準備し、島の 8.0 pH を調整します。
- 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 バッファーで指定された比率 (約 1:4 安定したオレイン酸小胞の) で MgCl2カリウムのクエン酸をプレミックスします。
- 小胞のサンプルは、簡単に渦に予混合マグネシウム クエン酸溶液を追加します。
注: は、マグネシウムと配位子のソリューションを常にプレミックスします。Unchelated マグネシウム溶液だけに小胞を公開しないでください。 - 及び再精製する前に、少なくとも 30 分間タンブラーに小胞サンプルそのままに 2.4 で説明されています。及び再精製移動相に同じマグネシウムおよび小胞のサンプルのようにクエン酸濃度を追加します。
- 準備し、セクション 1、2.1 および 2.2 で説明したように小胞を浄化します。
4. 非酵素 RNA 小胞内のコピー
-
単分散 RNA の調製は、小胞をカプセル化
- 1.1 節で説明したように乾燥オレイン酸フィルムを準備します。
- 50 μ M 蛍光標識 RNA プライマーと小胞復元バッファー、150 μ M RNA テンプレートおよび 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 オレイン酸を基準にして ½ 相当島を含むを準備します。
- 脂質膜に水分補給バッファーの 250 μ L を追加し、1.2.2 と 0.15 M 脂質濃度と小胞に 1.2.3 のステップに従います。
- 小型単層単分散小胞を作る、ためにセクション 1.3 小胞押出に従います。
-
クエン酸マグネシウム添加および小胞の浄化
- マグネシウムやクエン酸株式をプレミックスし、最終的な脂質濃度 0.1 M の小胞のサンプルとこれをミックスします。
- セファローズ 4 b サイズ排除カラム、250 mM トリス塩酸 pH 8.0 0.1 M 脂質およびマグネシウムと移動相としてクエン酸の小胞を浄化します。
- 次のセクション 2.3 で小胞の分数を収集します。
-
プライマー拡張反応
- 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 で 200 mM 2 MeImpG (グアノシン 5'-一リン酸 2-反応に対する生体) 原液を準備します。(注: フォロー以前公開プロトコル10 2 MeImpG 合成します)。
- プライマー拡張反応を開始、脂質 75 mM と 50 mM の最終濃度に到達する 450 μ L 小胞サンプル 2 MeImpG 原液の 150 μ L を転送するには、モノマーを活性化。タイマーと維持反応サンプルのすべての時間をタンブリング スタート。
- (省略可能)連続的な新鮮なモノマーの餌、300 μ L 構築実習少量リポソーム ダイアライザー11の一室に反応液のと他の商工会議所でのソリューションを餌入れ 300 μ L を転送します。餌のソリューションは、空胞と小胞を含む RNA の交換を除いて、反応液のように同じ濃度ですべての成分を含める必要があります。透析の各ラウンドは、アンチモンや使われる膜によって、1 24 時間かかります。
- 速度論的研究の各時点で 100 μ L 分注を取るし、移動相として 250 mM トリス塩酸 ph 8.0 セファローズ 4 b サイズ排除列を介して因数を repurify します。
- 1.5 mL エッペン チューブに小胞分数を収集します。
- 最後の 0.1% 程度に小胞分数にトリトンをピペット v/v。
- チューブに冷たいエタノールの 0.5 mL を追加し、-20 ° C 少なくとも 2 時間インキュベートします。
- 16.1 × 1000 ですべてのサンプルを遠心分離機 10 分軽く、液体をピペットの rcf (16.1 × g)。RNA ペレット 70% 冷エタノールと遠心洗浄再び 5 分の液体を廃棄し、RNA ペレット管に置く残留エタノールを蒸発させるため 2 分の 80 ° C 熱ブロック。1xTBE 読み込みバッファーと 8 M 尿素を 50 μ l 添加のペレットを溶解します。
-
ページ解析
- 20% を準備 10xTBE バッファーの 25 mL、TEMED 80 μ、250 mg 過硫酸アンモニウムの濃縮物、25 mL の希釈、UreaGel システムの UreaGel システムの 200 mL を混合することによってページのゲル。すぐに固定ゲル平板 (35 cm × 45 cm) 間ゲル混合物を注ぎ、櫛を挿入します。完全な重合まで少なくとも 30 分待ちます。
- ゲルのスタンドの上にゲル板を組み立てるし、1xTBE ゲルの実行バッファーでゲル ボックスを埋めます。櫛離陸し、注射器で井戸をフラッシュします。60 W 30 分でゲルを実行済み。
- 2 分の 80 ° C の熱ブロックのサンプルを加熱し、5 μ L/ウェル各サンプルをロードします。
- ゲルのパワー ボックスをオンにし、ゲルの 2.5 h の 60 W で定ワットを実行を設定します。
- ゲル スタンドからゲル板を分解、ガラスをきれいに拭くし、ゲルのスキャンを開始するゲル スキャナーで全体の板を置きます。
- ImageQuant TL 1 次元解析とゲルを定量化します。プライマー プライマー対時間の初期量に与えられた時点で残りの量の比の自然対数をプロット、線に合わせるし、擬似最初順序反作用率 (図 2) を計算します。
5 小胞の RNA の自己胸の谷間ハンマー ヘッド
- 小胞にカプセル化されたリボザイムの合成と精製
- 脂質薄膜を準備 (OA: GMO = 9:1) のコンポーネントと同様に、1.1 節のように表 1.2.注: 使用する前に完全な溶解の少なくとも 60 の ° c の暖かい GMO。
- 各ハンマー ヘッド型リボザイム ストランドと 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 の 5 μ m の小胞水分補給バッファーを準備します。
- 脂質膜に水分補給バッファーの 250 μ L を追加し、手順 1.2.2 と 0.15 M と小胞を合計する 1.2.3 脂質濃度に従います。
- 小型単層単分散小胞を作る、ためにセクション 1.3 小胞押出に従います。
- 250 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.15 M を持つ、セファローズ 4 b サイズ排除列移動相として脂質の混合ベシクルを浄化します。
-
ハンマー ヘッド型リボザイム自己開裂反応
- マグネシウム溶液を準備し、自己開裂反応を開始するセクション 3.1 で説明されているように精製された小胞でミックスします。
- 速度論的研究の各時点で混合物の 100 μ L を取るし、移動相として 250 mM トリス塩酸 ph 8.0 セファローズ 4 b サイズ排除列を介してこの因数を直接 repurify。小胞の分数を収集します。
-
ページ解析
- RNA サンプルの読み込みを準備する 4.3.6 4.3.8 に手順に従います。
- ジェル ボックスに商業的キャスト 15 %tbe 尿素ゲルを置き、1xTBE ゲルの実行バッファーをゲルのボックスに入力します。
- 1 分の 80 ° C の熱ブロックのサンプルを加熱し、5 μ L/ウェル各サンプルをロードします。
- 約 1 h の定数 200 V でゲルを実行します。
- ゲルをスキャンします。
- ImageQuant TL 1 D のような解析ソフトウェアとゲルを定量化、残りの強さを比較することによって胸の谷間の程度を測定する基板 RNA バンドと切断 RNA フラグメント バンド (図 3)。
6. 巨大な脂肪酸小胞を顕微鏡
-
巨大な脂肪酸小胞の準備
- 1.1 節、表 1.3よい膜観察のための蛍光に分類された脂質 0.2 mol % オレイン酸薄膜を準備するに従ってください。
- 500 μ L 250 mM トリス塩酸 pH 8.0 小胞サンプル 10 mM 脂質は、合計すると脂質膜を水分補給します。必要な場合、バッファーは蛍光染料または RNA 分子を含むかもしれない。小胞サンプル タンブリング一晩おきます。
- オレイン酸の 470 μ、250 mM トリス塩酸 ph 8.0 ½ 相当 NaOH を含む 150 mL を混合することによって総脂質の 150 mL の 10 ミリメートルと純粋な脂肪酸透析バッファーを準備します。
- 大きな凝集体を削除する 10 μ m ポリカーボネート膜小胞サンプルを押し出します。
- 1 μ m 大孔径透析カセットには、前述のように小胞サンプルを転送します。12
- 30 mL 透析バッファーを含む 100 mL のビーカーに透析カセットを配置します。テーブル トップ シェーカー 80-100 rpm で静かにビーカーを揺り動かしなさい。
- 透析バッファー無料染料または RNA および小さい小胞を削除する 5 回の 30 分毎に変更します。
- エッペン チューブに注射器と転送、透析カセットからの小胞サンプルを削除慎重に。
-
顕微鏡観察
- きれいな標準的な顕微鏡スライド上に小胞の 10 μ L をピペット、サンプル上ガラス製カバー スリップを配置します。透明なマニキュアでカバーガラスをシールします。
- 油分散または同様の客観的 X 60 の小胞を膜の蛍光標識した RNA やカプセル化された色素 (図 4)、適切なレーザーを用いた共焦点顕微鏡による観察します。
Representative Results
我々 は通常、サイズ排除カラムにリポソーム浄化を実行します。典型的なリポソーム製剤には、いくつかの種類の蛍光体が含まれています。リポソームの生成および押し出しとき、カプセル化する種リポソームの内外の両方に存在しています。サイズ排除樹脂 (セファローズ 4 b) リポソームを浄化することによって大きいリポソームは、溶出させ (図 1 a)、カプセル化されていない溶質が樹脂の細孔内に保持されます。分数を収集し、通常蛍光対分数番号 (図 1 b) をプロットは、収集され、後続のアプリケーションで使用されているリポソームに対応する初期溶出画分と 2 つピーク トレースが得られます。
よくされたリボザイムと蛋白質による RNA ポリメラーゼの出現の前に RNA 複製の可能性が高いことを意味非酵素的プライマー拡張反応を調べた。これらの反応は通常活性モノマーによって拡張されている蛍光標識プライマー (図 2 a) を採用しています。これらの反作用はゲルの電気泳動 (図 2 b) によって監視でき、結果エレクトロフェロ統合した所定の反応条件 (図 2) の速度定数を取得します。
吹き込む内に RNA を機能することことを示すため、我々 はモデルの RNA の触媒反応としてハンマー ヘッド型リボザイムの自己切断 (図 3 a) を採用しています。この反応が必要無料 Mg2 +触媒化学、容易にするために、5 mM Mg2 +の存在下で安定しているので、したがって我々 は OA/遺伝子組み換え小胞を使用します。プライマー拡張反応と同様に、ハンマー ヘッド型リボザイム自己開裂反応することができますゲル電気泳動法 (図 3 b) によって監視され、特定の条件 (図 3) の下の速度定数を取得するを後で分析します。
我々 は、リポソーム両方の蛍光を採用し、透過光をイメージします。リポソームは、蛍光の脂質膜ラベル (図 4 a) を与える、または (図 4 b)、ルーメン内の蛍光溶質を使用ラベル付けできます。(また図 4 bに示すように) 小胞を観察する透過光を使用もできます。
| クロロホルムでは表 1.1 純粋なオレイン酸 | |||
| コンポーネント | 株式 | 量 | |
| オレイン酸 | > 99% | 11.7 Μ L | |
| クロロホルム | 1 mL | ||
| 表 1.2 オレイン酸とグリセリン モノオレート クロロホルム (9:1) | |||
| コンポーネント | 株式 | 量 | |
| オレイン酸 | > 99% | 10.5 Μ L | |
| グリセリン モノオレート | > 99% | 1.4 Μ L | |
| クロロホルム | 1 mL | ||
| 表 1.3 オレイン酸 0.2mol% ローダミン PE クロロホルム | |||
| コンポーネント | 株式 | 量 | |
| オレイン酸 | > 99% | 1.6 Μ L | |
| クロロホルムのローダミン PE | 10 mM | 20 Μ L | |
| クロロホルム | 1 mL | ||
表 1。脂肪酸クロロホルム ソリューション。
図 1。精製率の小胞浄化と蛍光特性評価。A.無料カルセイン セファローズ 4 b カラム上からカルセインを含む小胞の分離。B.小胞と分別後よく数対各ウェル内の蛍光をプロットすることによって無料のカルセイン ピーク検出。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。OA ベシクル内非酵素 RNA の複製。A.の非酵素的 RNA プライマー拡張方式。B.純粋なオレイン酸ベシクル内、セクション 4 の条件でプライマー拡張反応のページのイメージ。C.線形プライマー時点時間以上 30 h. 反応速度対のプライマーの初期量に与えられた残りの量の比の自然対数のフィット、ln (Π/P0) 対時間の斜面から計算、0.058 h-1です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。OA/遺伝子組み換え小胞でハンマー ヘッド型リボザイム切断。A.の蛍光に分類された基板ストランド (top) のハンマー ヘッド型リボザイム切断方式。B.ハンマー ヘッド型リボザイム切断 5 mm Mg2 +OA/遺伝子組み換えベシクル内のページのイメージ。ベシクル内C.リボザイム活動。基板の特定の時点で残りの量の比の自然対数の線形フィット最初 4 h 反応で時間対基板の初期量に ln (S/S0) 対時間の傾きから算出率は 0.36 h-1。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。顕微鏡検査のための巨大な脂肪酸小胞。A.ローダミン PE の共焦点顕微鏡画像ラベル オレイン酸小胞、スケール バー 10 μ m。B.オレイン酸 Alexa488 を含む分子膜ベシクルの共焦点顕微鏡画像の付いた RNA 膜透過検出 (TD) チャネル、スケール 5 μ m バーで示されています。
Discussion
脂肪酸から形成されるリポソームは、高透磁率、動的プロパティによる原始細胞の潜在的なモデルとして多くの人に提案されています。単鎖脂肪酸のカルボキシル ヘッドのみを自己制限 pH 範囲内膜に許可し、結果膜、塩の存在に非常に敏感。その結果、脂肪酸小胞異なる準備およびリン脂質ベシクルと比較してメソッドの処理が必要です。
このプロトコルでは、リポソームを形成する例としてオレイン酸を使用して他のロング チェーン不飽和脂肪酸 (C14) 及びその誘導体 (ca. ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、および対応するアルコールとグリセリンのエステル) も小胞を形成総脂質濃度は、cmc と水分補給バッファー pH の上がある限り薄膜水分補給方法を次は、膜内脂肪酸の pKa に近いです。トリス塩酸バッファーは、このプロトコルで使用する以外他のバッファー システム (ca. ビシン、リン酸、ホウ酸塩) はリン酸塩やホウ酸バッファーで形成される小胞は通常かなり漏れ13脂肪酸小胞形成をサポートする報告されました。水分補給後結果脂肪酸小胞は多と多重が、前述の押し出しによって小さな径ベシクルに簡単に変換されます。小さい小胞を生成するための代替方法として超音波処理と比較して、押出は、別孔サイズの膜を適用することによって小胞サイズのコントロールのより多くのオプションを提供します。押出後小胞は膜の孔径よりやや大きい通常が、押出成形サイクルの数を増加させると、狭いサイズ分布と膜孔径に近い平均サイズ小胞を得ることができます。
機能作成を合成するために脂肪酸小胞はホスト特定の生化学的な反作用は、RNA または他のビルディング ブロックのカプセル化に起因する必要があります。薄膜水分補給方法は、目的の内包物を含むフォーム小胞に簡単な方法を提供します。ただし、カプセル化効率は比較的低い、RNA など貴重な資料の大部分は浄化プロセスの間に通常失われます。いくつかのケースで、押出の前に繰り返し凍結融解によってカプセル化効率を控えめに改善できます。マイクロりん脂質リポソームの高収率作製法脂肪酸小胞類似方法がまだ開発されていませんがほぼ 100% カプセル化効率を可能にします。
反応速度の精度に影響を与える可能性があります素材をカプセル化処理キレート化無料 Mg2 +、その後マグネシウムのソリューション、及び再精製各時点の除去を保証する前に浄化と吹き込む流出しました。ベシクル内測定。各浄化は、良好な分離を達成するために、小胞の分数を収集するために、少なくとも 10 分を取る、ので高速反応の解析は困難であり、反応は列及び再精製する前に停止する必要があります。
ここでは提示プロトコルはよく模倣して原始的な細胞で発生する反応をホストする脂肪酸リポソームの構築に適しています。私達のプロトコルはまた、生体の配信システムとその他の生化学的な反作用のバイオリアクターの開発の潜在的なアプリケーションを有効にします。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
溶接学会概要は、ハワード ヒューズ医学研究所の研究員です。この仕事は一部に溶接学会概要にサイモンズ財団から助成金 (290363) によって支えられました。A.E.E. と K.P.A. の両方は、ミネソタ大学スタートアップ資金からサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
| calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
| tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
| citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
| sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
| potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
| oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
| glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
| Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
| magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
| sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
| 15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
| urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
| titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
| RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
| RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
| hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
| hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
| vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
| fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
| 96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
| plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
| confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
| gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |
References
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- Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
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- Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
