Summary
포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.
Abstract
포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 전시 포함 diacylphospholipids 이러한 amphiphiles의 독특한 화학적 특성 때문에 비해 뚜렷한 속성. 특히, 지방산 리 단일 체인 amphiphiles의 상대적으로 높은 가용성 때문에, 동적 특성을 향상 시킵니다. 마찬가지로, 리 무료 지방산을 포함 하는 소금, divalent 양이온, carboxylic 산 머리 그룹 및 금속 이온 사이 강한 상호 작용 때문에 더 민감합니다. 여기 우리는 기술을 대 한 준비, 정화, 단일 체인 amphiphiles (예를 들어, 올레 산)의 전체 또는 일부 구성 리의 사용을 보여 줍니다.
Introduction
리, 또는 소포-구획 이루어져 amphiphilic 지질 bilayer 막에 묶여-발견 사용 수많은 생명 의학 어플리케이션에 의약품, 세포 막의 모델 및 합성의 개발에 대 한 배달 차량으로 셀입니다. 우리와 다른 이른 생활에서 원시 세포 막의 모델로 리 채용도 했습니다. 1 , 2 , 3 , 4 일반적으로 이러한 시스템에서 우리는 고용 이러한 분자는 현대 셀 사용 하는 코딩 된 단백질 효소의 이점 없이 합성 하 간단 하 게 하나만 지질 탄화수소 꼬리 (예를 들면, 올레산)를 포함 하는 단일 체인 amphiphiles.
단일 체인 지질으로 구성 된 리는 diacylphospholipids에서 형성 된 것과 유사한 (예를 들어, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 또는 POPC) 그 경계 bilayer 막의 구성. 어느 클래스의 지질에서 형성 하는 리 녹아 페이로드를 유지할 수 있습니다 축소 고 다른 기술에 의해 순화 될 수 있습니다. 몇 가지 중요 한 차이점이 단일 체인 지질의 독특한 화학적 특성에서 유래한 다. 인지질에 의해 형성 된 소포는 넓은 pH 범위, 안정적인 지방산 소포는 약간 기본적인에 중립 pH (ca. 7-9), 기 준비를 위한 특정 pH 버퍼를 요구 하에서 안정만. 대부분의 시간,이 버퍼도 포함 될 수 있습니다 어느 기능 재료 (예를 들면, RNA)을 될 수 있는 소포 캡슐화에 대 한 특정 수용 성 분자 compartmentalized 생화학 반응 또는 간단한 형광 염료 (예를 들어, calcein에 대 한 ) 소포 특성에 대 한.
만 하나의 탄화수소 체인의 존재는 모두 더 침투성 용액에 더 동적 막을 생성 합니다. 또한, carboxylic 산 머리 그룹 (예를 들어, Mg2 +) 소금, divalent 양이온의 존재에 더 민감한 소포에 지방산 결과. 마그네슘 catalyzing protocells 생명의 기원 연구에 생 화 확 적인 반응에 대 한 가장 중요 한 divalent 양이온 중 하나입니다. 정교한 단백질 효소의 진화 이전 초기 생활에 RNA 지배적인 폴리머의 자기 복제 및 촉매 작용을 수행 하는 듀얼 기능으로 되었을 수도 있습니다. 마그네슘을 요구 하는 RNA에의 한 대표적인 예 관련 반응은 비 효소 RNA 복사, 1960 년대에 처음 시연 이다. 5 때 화학적으로 활성화 된 RNA 뉴클레오티드 (즉 2 methylimidazolide 뉴클레오티드) 기존 뇌관 템플릿 단지 바인딩할 뇌관의 3'-수 산 기 그룹 공격에 5'-인산 염 치환 하는 인접 한 활성화 된 단위체의 떠나는 그룹 (예: 2-methylimidazole), 및 양식 새로운 phosphodiester 본드. 이 RNA 복사 화학의 Mg2 +, 지방산 protocells와 호환 되려면 chelated 필요가 필요 합니다. 6 다른 Mg2 +-귀상어 ribozyme에 의해 촉매는 아마도 가장 특징이 촉매 RNA는 종속 반응. 두 개의 짧은 oligonucleotides에서 재구성 될 수 있다,이 ribozyme 젤 교대에 의해 모니터링 하는 데 편리한 자기 분열 반응을 수행 합니다. 이와 같이, 그것은 자주 생명의 기원 연구에 모델 ribozyme로 채택 된다. 7 unliganded 마그네슘에 대 한이 ribozyme에 의해 요구 사항으로 인해 리는 일반적으로 구성 지방산 및 글리세롤 지방산 에스테 르, 마그네슘을 더 안정는의 혼합물에 의해. 8 , 9 이 프로토콜에 선물이 기술을 우리가 준비, 조작, 이러한 vesicles의 특성에 대 한 개발 하 고 응용 프로그램의 이러한 vesicles protocells 호스트 비 효소 RNA 복사 및 귀상어 ribozyme 보여 촉매입니다.
Protocol
1. 기 준비
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박막의 준비
- 가스 꽉 주사기를 사용 하 여 유리 유리병에서 chloroform을 표 1.1 에 설명 된 대로 특정 양의 지질을 전송.
- 증발 질소 또는 증기 두건에서 아르곤의 스트림 아래 결과 솔루션.
- 클로 프롬 잔여물을 제거 하려면 적어도 2 시간에 대 한 집 진공 결과 박막을 적용. 지질 수 있습니다 남아 있을 진공에서 하룻밤이 시점에서.
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소포의 재
- 2.5 ml 1 M tris HCl pH 8.0 버퍼의 calcein 분말의 31 밀리 그램을 녹이는 이온된 (DI) 수의 다른 7.5 mL를 추가 하 여 5 mM calcein 250 mM tris HCl pH 8.0 수 화 버퍼의 10 mL를 준비 합니다.
- 빈 관으로 250 µ L의 수 분 버퍼 위에 플라스틱을 1.875 µ L 최종 75mm 기본에 대 한 10 M NaOH의 (총 지방산의 ½에 해당)를 추가 합니다. 0.15 M의 총 지질 농도와 형태 소포를 건조 지질의 박막을 솔루션을 전송.
- 고속 사용 (> 3000 rpm) 소용돌이 4-5에 대 한 결과 혼합물을 vortexer.
- Rehydrate, 적어도 하룻밤을 낮은 속도 (ca. 30 rpm) 회전 통에 지질 버퍼 혼합물을 남겨 주세요.
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소포 (옵션)의 크기 조정
- 족집게를 사용 하 여 압출 기의 주사기 포트의 각 내부 표면에 하나의 필터 지원을 적용 됩니다.
- 각 필터 지원 250 mM tris 젖은-HCl, pH 8.
- 족집게를 사용 하 여 압출 기 O-링 중 한 트랙 에칭 100 nm 폴 리카 보 네이트 막 적용 하 고 필터링 지원. 안 찢 어 또는 막 펑크, 부드럽게 두 표면 사이 좋은 접촉을 있도록 O-ring으로 막 밀어 돌보는.
- 압출 기, 멤브레인 및 필터 지원 치환 하지 않도록 주의 복용 조립.
- 압출 기 주사기를 채우십시오 ca. 250 mM tris의 0.5 mL-HCl, pH 8. 압출 기의 1 개의 측에이 주사기를 삽입 합니다.
- 압출 기의 다른 쪽에는 빈 주사기를 삽입 합니다.
- 손으로 (≤ 50 µ L/s), 천천히 버퍼를 포함 하는 주사기의 플런저를 밀어 하 고 트랙 에칭 막 이며 장소에 그대로 나타내는 저항 느꼈다는 것을 확인 합니다. 그것은 저항의 예상한 수준을 측정 하기 위해 자리에 막 없이이 단계를 연습 하는 데 도움이입니다.
- 제거 하 고 두 개의 주사기를 빈. 이 단계에서 두 개의 주사기 liposome 준비에 동일한 구성의 버퍼를 포함 하는 그들은 이후 청소 필요는 없습니다.
- 두 개의 주사기 중 하나로 liposome 준비를 로드 합니다.
- 주사기는 왼쪽 및 오른쪽에 빈 주사기에 소포 샘플을 포함 하는 압출 기를 재어셈블할 수 있습니다.
- 손으로 (10-25 µ L/s) 매우 느리게 소포 샘플을 포함 하는 주사기의 플런저를 밀어.
- 압출 기; 오른쪽에 주사기를 신중 하 게 관찰 버퍼는 압출 기의 오른쪽을 입력 처음 것 이다 명확한 (ca. 50 µ L, 이것은 압출 기의 내부 죽은 볼륨에), 뒤에 압출된 리의 작은 깃털. 이 시점에서 추진 즉시 중지, 압출 기의 오른쪽에 주사기를 제거 하 고이 솔루션을 취소.
- 압출 기의 오른쪽에 주사기를 장착 하 고 왼쪽된 주사기가 비어 때까지 돌출.
- 압출 기의 방향을 반전 하 고 13 단계를 반복 합니다. 원하는 주기 (일반적으로 7, 9, 또는 11) 수에 대 한 계속 홀수 항상 취소 압출 리 처음 사전 축소 liposome 준비를 포함 하는 주사기에서 수집 되지 않도록 하는 데 사용 됩니다.
- 부드럽게 오른쪽 주사기의 내용을 Eppendorf 관으로 분배 하 고 약 0.5 h에 대 한 낮은 속도 (ca. 30 rpm) 회전 통에 튜브를 놓습니다.
- 진행 기 정화 제 2에 설명 된 대로. 압출된 소포 또는 24 시간 내 사용 해야 다음 시간 사용 하기 전에 다시 내밀 었 다.
2. 기 정화
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기 정화 모바일 위상의 준비
- 1 M tris HCl pH 8 버퍼, 디 15 mL 송 골 매 관에 물 3.75 mL의 1.25 mL을 추가 하 여 250 mM tris HCl pH 8 수 화 버퍼의 5 mL을 준비 합니다. 37.5 µ L 10 M NaOH의 추가 (½ 해당 unesterified 지방산 기준 자료) 수 화 버퍼를. 0.15 M 총 지질과 소포 솔루션 결과 팔 콘 튜브에 직접 순수 올레산의 235 µ L 플라스틱.
- 고속 사용 (> 3000 rpm) 소용돌이 대 한 4-5, 혼합물을 vortexer 다음 저속 회전 하는 적어도 2 시간에 대 한 셰이 커에 공중 제비. 지질 준비 남겨질 수 있습니다 하룻밤 회전 통에이 시점에서. 어떤 잠재적인 집계를 제거 하려면 사용 하기 전에 0.22 μ m 주사기 필터 장치를 통해 모바일 단계를 필터링 합니다.
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Sepharose에 소포의 정화
- 피 펫을 사용 하 여 병에서 ca. ethanolic Sepharose 4B 슬러리의 5 mL 제거 합니다. 일회용 10 mL 크로마토그래피 열이 적용 됩니다.
- 허용 정착 슬러리 에탄올 흐름 통해 에탄올 접근 수 지 침대 정상까지.
- 5 mL를 적용 수 지 및 에탄올 잔류물을 멀리 세척 하 게 자형의 상단에 이온을 제거 된 물.
- 250 mM tris 적용-HCl, pH 액체 수준 접근 수 지 침대의 상단 때마다 새로운 부분을 적용 하는 수 지의 상단에 1-2 mL 부분에 8. 반복 3-5 시간.
- 말 대 꾸에, 열을 클램프 다음 자 지 커넥터와 분수 수집기에 튜브 열 끝을 연결 합니다. 까는 자 지가 열에 액체 수준 수 지의 상단을 도달할 때, 튜브를 플러시 버퍼의 다른 부분을 추가 합니다.
- 섹션 1의 압출된 소포 200 µ L pipettor를 사용 하 여, 수 지 침대 또는 열 벽을 건드리지 않고 수 지에 소포 준비 가능한 균등 하 게 적용 하도록 수 지의 상단에 적용 됩니다.
- 흐름을 시작 하 고 96 잘 접시에 분수를 수집 하기 시작에 자 지를 엽니다. 0.5-1에서 수 지 침대의 상단에 소포 정화 모바일 단계 적용 mL 부분으로 버퍼 고갈, 건조 수 지 침대를 허용 하도록 하지. 5 드롭 분수, 적어도 36 우물 (96 잘 접시의 3 행) 수집에 수집 합니다.
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정화 분수의 형광 특성
- 이전 섹션에서 96 잘 접시 하 고 플레이트 리더에 그것을 읽고 (exλ = 485 nm, λem= 515 nm).
- 분수 수 대 형광으로 결과 형광 데이터를 플롯 합니다. 소포 elute 먼저, 다음 unencapsulated 분수 (그림 1).
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소포 기 누설 감시 하의 repurification
- 섹션 2.2 및 2.3의 정화 및 특성화 단계를 반복 합니다. 그들의 내용을 유지 소포 unencapsulated 용액 (또는 소포 피크의 강도의 ca. 5-10%의 매우 작은 하나)의 아무 피크를 전시할 것 이다.
3. 사용의 소포 마그네슘의 존재
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Unliganded 마그네슘의 사용
- 준비 하 고 1, 2.1, 2.2 섹션에 설명 된 대로 소포를 정화.
- 물 1 M tris HCl pH 8.0 버퍼의 250 µ L와 1m MgCl2 의 50 µ L 디의 700 µ L을 추가 하 여 50 mM MgCl2 솔루션 250 m m tris HCl pH 8.0 버퍼에서의 1 mL을 준비 합니다. 잘 섞어 소용돌이입니다.
- 5mm의 원하는 마그네슘 농도 주고, 순화 vesicles의 0.9 mL 및 마그네슘 솔루션의 100 µ L를 혼합 하 고 마그네슘의 높은 현지 농도에 소포의 과도 노출에 의해 기 장애를 최소화 하기 위해 빠르게 저 어.
참고: 마그네슘 솔루션의 신속한 혼합은 소포 안정성에 중요 합니다. 마그네슘과 소포는 신속 하 게 혼합 되지 즉시 vortexing에 의해, 만약 일부 소포 마그네슘, 일관성 없는 결과 샘플에서 샘플 결과의 높은 농도에 노출 됩니다. - 2.4 내용 누설에 대 한 확인에 설명 된 대로 repurification 전에 적어도 30 분 동안 텀블러에 소포 샘플을 둡니다. Repurification 모바일 단계에 기 샘플에서 마그네슘의 동일한 농도 추가 합니다.
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Liganded 마그네슘의 사용
- 준비 하 고 1, 2.1, 2.2 섹션에 설명 된 대로 소포를 정화.
참고: 대신 사용 하 여 ½ 해당 코 NaOH deprotonate 지방산; 그것은이 chelated MgCl2 시스템에서 보다 안정적인 리 생산 발견 되었습니다. - 2 M 칼륨 구 연산 염 해결책을 준비 하 고 코와 8.0 pH를 조정.
- MgCl2 , 칼륨 구 연산 염 250 mM tris HCl pH 8.0 버퍼에서 지정 된 비율 (ca. 1:4 안정 올레산 vesicles)에 공기로
- 기 샘플, 짧게 소용돌이에 premixed 마그네슘 시트르산 솔루션을 추가 합니다.
참고: 항상 마그네슘과 리간드 솔루션 공기로. 절대 혼자 unchelated 마그네슘 솔루션에 소포를 노출 합니다. - 2.4에 설명 된 대로 repurification 전에 적어도 30 분 동안 텀블러에 소포 샘플을 둡니다. Repurification 모바일 단계에 마그네슘과 소포 샘플에서 시트르산의 동일한 농도 추가 합니다.
- 준비 하 고 1, 2.1, 2.2 섹션에 설명 된 대로 소포를 정화.
4. 비-효소 RNA 소포에 복사
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단 분산 RNA의 준비 캡슐화 소포
- 1.1 섹션에 설명 된 대로 건조 올레산 영화를 준비 합니다.
- 50 µ M 형광 레이블이 RNA 뇌관 소포 재 버퍼, 150 µ M RNA 템플릿 및 250 mM tris HCl pH 8.0 올레산 기준으로 ½ 해당 코를 포함 준비.
- 지질 영화 재 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 1.2.2, 1.2.3 총 0.15 M 지질 농도와 소포 수 있도록 단계를 따라.
- 있도록 작은 unilamellar 단 분산 소포, 소포 압출에 대 한 섹션 1.3 따릅니다.
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마그네슘 구 연산 염 추가 소포 정화
- 마그네슘과 시트르산 주식, 공기로 하 고 혼합이 0.1 m M의 마지막 지질 농도에 소포 샘플.
- Sepharose 4B 크기 제외 열, 250 mM tris HCl ph 8.0, 0.1 m M 지질과 마그네슘 및 모바일 단계로 시트르산에 소포를 정화.
- 다음 섹션 2.3 소포 분수를 수집 합니다.
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뇌관 연장 반응
- 250 mM tris HCl ph 8.0 200 m m 2-MeImpG (guanosine 5'-monophosphate 2-methylimidazolide) 재고 솔루션을 준비 합니다. (참고: 이전에 따라 출판 2 MeImpG 합성에 대 한 프로토콜10 .)
- 뇌관 연장 반응 시작, 2-MeImpG 재고 솔루션의 150 µ L 75 m m 지질 및 50 mM의 최종 농도 도달 450 µ L 기 샘플을 전송 단위체를 활성화 합니다. 타이머와 계속 반응이 쏟아질 모든 시간 샘플을 시작 합니다.
- (선택 사항) 연속 신선한 단위체 먹이 대 한 전송 300 µ L 건설 연구소 작은 볼륨 liposome dialyzer11 의 한 챔버에 반응 해결책의 및 넣어 300 µ L 다른 챔버에 솔루션을 먹이. 수 유 솔루션 빈 소포와 소포를 포함 하는 RNA 교체 제외 반응 솔루션에서 동일한 농도에서 모든 재료를 포함 해야 합니다. 투 석의 각 라운드는 분석 및 사용 하는 막에 따라 1-24 h 걸립니다.
- 운동 연구에 대 한 100 µ L aliquot 각 시간 지점에서 고 250 mM tris HCl ph 8.0 모바일 상으로 Sepharose 4B 크기 제외 열 통해 약 수를 repurify.
- 1.5 mL eppendorf 관에 소포 분수를 수집 합니다.
- 마지막 약 0.1%에 소포 분수 트리톤 플라스틱 v/v.
- 튜브를 냉 에탄올의 0.5 mL을 추가 하 고 적어도 2 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
- 16.1 × 1000에서 모든 샘플을 원심 rcf (16.1 × g) 10 분을 부드럽게 피펫으로 액체 밖으로. 워시 RNA 70% 감기 에탄올과 원심 분리기로 펠 릿 다시 5 분 액체를 삭제 하 고 2 분 잔여 에탄올을 증발 하는 80 ° C 열 블록에 RNA 펠 릿으로 튜브를 넣어. 1xTBE 로드 버퍼 8 M 요소의 50 µ L에 펠 릿을 디졸브.
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페이지 분석
- 20%를 준비 10xTBE 버퍼의 25 mL, TEMED의 80 µ L, 암모늄 persulfate의 250 mg 200 mL UreaGel 시스템의 집중, 희석제, UreaGel 시스템의 25 mL를 혼합 하 여 페이지 젤. 빨리 채워 젤 판 (35 × 45cm) 사이의 젤 혼합물을 부 어 하 고 빗을 삽입 합니다. 완전 한 중 합까지 적어도 30 분을 기다립니다.
- 젤 스탠드에 젤 접시를 조립 하 고 버퍼를 실행 하는 1xTBE 젤 젤 상자를 채우십시오. 빗을가지고 고 주사기 우물을 플러시. 미리 30 분 60 W 젤을 실행 합니다.
- 2 분 동안 80 ° C 열 블록에 샘플이 열 하 고 잘 당 각 샘플의 5 µ L을 로드 합니다.
- 젤 파워 상자를 켜고 젤 60 W 2.5 h에 대 한 지속적인 와트 실행 설정.
- 젤 스탠드에서 젤 접시를 분해, 청소 유리 닦 고 젤 젤 스캔 하려면 스캐너에서 전체 접시를 넣어.
- TL ImageQuant 1 D 분석 젤 계량. 뇌관 뇌관 시간 대의 초기 금액을 주어진된 시간에 나머지의 금액의 비율의 자연 로그를 플롯, 선 고 계산 가짜 첫번째 순서 반응 (그림 2) 있습니다.
5. 귀상어 RNA 자체 분열 소포에
- 준비 및 소포에 ribozyme의 정화
- 지질 얇은 필름 준비 (OA: GMO = 9:1)에서 같이 구성 요소와 섹션 1.1에서 테이블 1.2. 참고: 적어도 60 ° c를 사용 하기 전에 완전 한 용 해에 대 한 따뜻한 조합.
- 각 귀상어 ribozyme 물가 및 250 mM tris HCl pH 8.0의 5 µ M와 소포 재 버퍼를 준비 합니다.
- 지질 영화 재 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 1.2.2, 1.2.3 소포 0.15 m 총 수 있도록 단계 지질 농도 따라.
- 있도록 작은 unilamellar 단 분산 소포, 소포 압출에 대 한 섹션 1.3 따릅니다.
- 모바일 상으로 지질을 혼합 Sepharose 4B 크기 제외 열 250 mM tris HCl ph 8.0, 0.15 M에 소포를 정화.
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귀상어 ribozyme 자기 분열 반응
- 마그네슘 솔루션을 준비 하 고 순화 된 소포 섹션 3.1 자체 분열 반응 시작에 설명 된 대로 혼합.
- 운동 연구에 대 한 각 시간 지점에서 혼합물의 100 µ L를가지고 고 직접 모바일 위상으로 250 mM tris HCl ph 8.0 Sepharose 4B 크기 제외 열을 통해이 약 수를 repurify. 소포 분수를 수집 합니다.
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페이지 분석
- 단계 4.3.6 4.3.8 RNA 샘플 로드를 준비 합니다.
- 상업적으로 casted 15 %TBE 요소 젤 젤 상자에 배치 하 고 버퍼를 실행 하는 1xTBE 젤 젤 상자를 채우기.
- 1 분에 80 ° C 열 블록에 샘플이 열 하 고 잘 당 각 샘플의 5 µ L을 로드 합니다.
- 약 1 시간에 대 한 지속적인 200 V 젤을 실행 합니다.
- 젤을 검사 합니다.
- ImageQuant TL 1 D 같은 분석 소프트웨어와 함께 젤 계량, 나머지의 강도 비교 하 여 분열의 범위를 측정 하기 위해 기판 RNA 밴드 및 쪼개진된 RNA 조각 밴드 (그림 3).
6. 거 대 한 지방산 소포 현미경 검사 법에 대 한
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거 대 한 지방산 vesicles의 준비
- 따라 섹션 1.1 테이블 1.3 올레산 박막 붙일 레이블된 지질 0.2 mol % 더 나은 막 관찰에 대 한 준비.
- 500 µ L 250 mM tris HCl ph 8.0 총에서 소포 샘플 10 m m 지질을 지질 영화 리하이드레이션 버퍼 원하는 경우 형광 염료 또는 RNA 분자를 포함할 수 있습니다. 기 샘플 쏟아질 하룻밤 둡니다.
- 올레산의 470 µ L 250 mM tris HCl pH 8.0 ½ 동등한 NaOH를 포함 150 mL를 혼합 하 여 150 mL 10 m m를 가진 순수한 지방산 투 버퍼의 총 지질을 준비 합니다.
- 10 µ m 폴 리 카보 네이트 막 큰 집계 제거를 통해 소포 샘플 압출 성형.
- 앞에서 설명한 1 µ m 큰 공 투 카세트로 소포 샘플을 전송 합니다. 12
- 30 mL 투 버퍼를 포함 하는 100 mL 비 커에 투 석 카세트를 놓습니다. 80-100 rpm 테이블 상단 통에 부드럽게 비 커를 교 반 하십시오.
- 투 석 버퍼 무료 염료 또는 RNA 및 작은 소포를 제거 하려면 5 시간 마다 30 분 변경.
- 조심 스럽게 제거 기 샘플 투 카세트에서 주사기와 전송 Eppendorf 관에.
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현미경 관찰
- 깨끗 한 표준 현미경 슬라이드에 소포의 10 µ L 플라스틱 하 고 샘플 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 투명 매니큐어와 커버 글라스를 봉인.
- Confocal 현미경 검사 법 붙일 표시 막, RNA 또는 캡슐화 된 염료 (그림 4)에 대 한 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 오일 분산 또는 유사한 목표 X 60으로 소포를 관찰 합니다.
Representative Results
우리는 일반적으로 크기 제외 열에 liposome 담긴을 수행합니다. 전형적인 liposome 준비 포함 어떤 종류의 fluorophore. 리는 생성 하 고 압출, 캡슐화 될 종족은 내부와 외부는 리 존재 한다. 리 크기 제외 수 지 (Sepharose 4B)에, 정화 하 여 unencapsulated 용액 동안 큰 리 하지 않으며 elute 먼저 (그림 1A)는 수 지의 모 공 내에서 유지 됩니다. 분수를 수집 하 고 일반적으로 분수 번호 (그림 1B) 대 형광 플로팅 다음 수집 하 고 후속 응용 프로그램에서 사용 되는 리에 해당 하는 초기 방출 분수와 2 피크 추적을 생성 합니다.
우리는 자주 ribozyme 및 단백질 기반 RNA polymerases의 출현 이전 RNA 복제의 가능성이 의미 했다 nonenzymatic 뇌관 연장 반응 검사. 이 반응은 일반적으로 붙일 레이블된 뇌관 (그림 2A), 활성화 된 단위체에 의해 확장 된 사용 합니다. 젤 전기 이동 법 (그림 2B)에 의해 이러한 반응을 모니터링할 수 있습니다 및 결과 electropherograms 주어진된 반응 조건 (그림 2C)에 대 한 속도 상수를 통합.
RNA protocells 안에 작동할 수 입증, 우리는 모델 RNA 촉매 반응으로 귀상어 ribozyme 자기 분열 (그림 3A)를 사용 합니다. 이 반응 필요 무료 Mg2 + 촉매, 촉진 하 고 그들은 5 m m Mg2 +의 안정적인 OA/GMO 소포 사용 하는 따라서. 뇌관 연장 반응에 유사한, 귀상어 ribozyme 자기 분열 반응 수도 있습니다 젤 전기 이동 법 (그림 3B)에 의해 모니터링 하 고 특정 조건 (그림 3C)에서 속도 상수를 얻으려고 나중 분석.
우리 이미지 리 두 형광을 고용 하 고 빛을 전송 합니다. 리 주고 막 레이블 (그림 4A), 형광 지질을 사용 하 여 또는 그들의 루멘 (그림 4B) 내에서 형광 용액을 사용 하 여 표시 될 수 있습니다. 전송된 빛 소포 (또한 그림 4B참조)을 준수 사용할 수 있습니다.
| 표 1.1 순수 올레 산 클로 프롬에 | |||
| 구성 요소 | 주식 | 금액 | |
| 올레산 | > 99% | 11.7 Μ L | |
| 클로 프롬 | 1 mL | ||
| 표 1.2 올레산 및 글리세롤 monooleate 클로 프롬에 (9:1) | |||
| 구성 요소 | 주식 | 금액 | |
| 올레산 | > 99% | 10.5 Μ L | |
| 글리세롤 monooleate | > 99% | 1.4 Μ L | |
| 클로 프롬 | 1 mL | ||
| 클로 프롬에 0.2mol% Rhodamine PE와 표 1.3 올레산 | |||
| 구성 요소 | 주식 | 금액 | |
| 올레산 | > 99% | 1.6 Μ L | |
| 클로 프롬에 rhodamine PE | 10 m m | 20 Μ L | |
| 클로 프롬 | 1 mL | ||
표 1입니다. 지방 산 성 클로 프롬 솔루션입니다.
그림 1입니다. 정화 분수의 소포 정화 및 형광 특성입니다. A. Sepharose 4B 열에 무료 calcein에서 calcein를 포함 하는 소포의 분리. B. 소포 그리고 분수 컬렉션 후에 각 잘 잘 수 대 형광 그려서 무료 calcein 피크 탐지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. OA 소포 안에 비 효소 RNA 복제입니다. A. 비 효소 RNA 뇌관 연장의 계획. B. 페이지 이미지 섹션 4에서 조건 순수 올레산 소포 안에 뇌관 연장 반응의. C. 선형 뇌관 뇌관 대 시간 이상 30 헤 반응 속도의 초기 금액을 시간 포인트 주어진에서 남은 금액의 비율의 자연 로그의 적합, ln (P/P0) vs 시간의 사면에서 계산, 0.058 h-1입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. OA/GMO 소포에 귀상어 ribozyme 분열입니다. A. 붙일 레이블된 기판 가닥 (맨 위)의 귀상어 ribozyme 분열의 체계. B. 페이지 이미지 5 m m Mg2 +OA/GMO 소포 안에 귀상어 ribozyme 분열의. C. 소포 안에 Ribozyme 활동입니다. 주어진 시간 포인트에서 남은 기판의 금액의 비율의 자연 로그의 선형 적합 처음 4 h. 반응에에서 시간 대 기판의 초기 금액, ln (s/S0) vs 시간, 사면에서 계산 속도가 0.36 h-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 현미경 검사 법에 대 한 거 대 한 지방산 소포입니다. A. Rhodamine PE의 Confocal 현미경 이미지 표시 올레산 소포, 눈금 10 μ m 막대. B. 올레산 소포를 포함 하는 Alexa488의 Confocal 현미경 이미지 전송된 검출기 (TD) 채널, 눈금 5 μ m 막대에 표시 된 막으로 RNA를 표시.
Discussion
리 지방산에서 형성 된 많은 원시 세포 그들의 높은 침투성 및 동적 속성에 대 한 잠재적인 모델 제안 있다. 단일 사슬 지방산의 carboxylic 머리 그룹만 자기 조립 막 제한 된 pH 범위에에 있으며 결과 막 소금의 존재에 매우 민감합니다. 그 결과, 지방산 소포 필요 다른 준비 및 인지질 소포와 비교 하는 메서드를 처리 합니다.
이 프로토콜에서 우리가 liposome 형성에 대 한 예를 들어 올레산을 사용 하지만 다른 긴 사슬 불포화 지방산 (C14) 및 그들의 유도체 (ca. myristoleic 산, palmitoleic 산과 해당 알콜 및 글리세롤 에스테 르) 소포 형성 총 지질 농도 cmc와 수 분 버퍼 pH는 박막 리하이드레이션 메서드를 다음 막 내에서 지방산의 pKa 가깝습니다. 이외의 tris HCl 버퍼가이 프로토콜에 사용, 붕 산 염 또는 인산 염 버퍼에서 형성 하는 소포는 일반적으로 매우 새13지방산 기 형성을 지원 하기 위해 다른 버퍼 시스템 (ca. bicine, 인산 염, 붕 산 염) 보도 했다. 재 후 결과 지방산 소포는 polydisperse 및 multilamellar, 하지만 쉽게 변환 됩니다 작은 단 분산 unilamellar 소포 밀어 남에 의해 설명 된 대로. 작은 소포를 생성 하기 위한 대체 방법으로 쥡니다와 비교, 압출 다른 기 공 크기 막 적용 하 여 소포 크기의 제어에 대 한 더 많은 옵션을 제공 합니다. 압출 후 소포는 보통 막 기 공 크기 보다 약간 더 큰 그러나 압출 사이클의 수를 늘림으로써, 소포 막 기 공 크기에 가까운 평균 크기와 좁은 크기 분포를 얻을 수 있다.
기능 protocells 합성, 지방산 소포 해야 호스트 특정 생화학 반응 RNA 또는 다른 빌딩 블록의 캡슐에 넣기에서 발생 합니다. 박막 리하이드레이션 메서드 원하는 캡슐화 된 물자를 포함 하는 양식 소포 하는 쉬운 방법을 제공 합니다. 그러나, 캡슐화 효율은 상대적으로 낮은 고 정화 과정에서 RNA 등 귀중 한 자료의 큰 부분 일반적으로 손실 됩니다. 경우에 따라 캡슐화 효율 겸손 압출 하기 전에 반복된 freeze-thaw 주기 하 여 개선할 수 있습니다. 그러나 유사한 방법 아직 지방산 소포에 대 한 개발 하지 않은 미세 메서드 인지질 리의 고수익 준비에 대 한 거의 100% 캡슐 효율성에 대 한 수 있습니다.
반응 속도의 정확도 영향을 미칠 수 있는 자료를 캡슐화 때 유출 protocells chelated 또는 무료 Mg2 +, 마그네슘 솔루션 추가 및 repurification 각 시간 포인트의 제거를 보장 하기 전에 후 정화 처리 소포 안에 측량입니다. 이후 각 정화 좋은 분리를 달성 기 분수를 수집 하 고 10 분 이상 걸립니다, 빠른 반응의 분석 어렵습니다, 그리고 반응 열 repurification 전에 중지 해야 합니다.
우리는 여기에 제시 하는 프로토콜은 원시 세포에서 발생할 수 있는 그를 흉내 낸 반응 호스트 지방산 리의 건설에 대 한 적합 합니다. 우리의 프로토콜 또한 생명 전달 시스템 및 다른 생 화 확 적인 반응에 대 한 생물 반응 기의 개발에 잠재적인 응용 프로그램 사용.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
J.W.S.은 하 워드 휴즈 의학 연구소의 조사. 이 작품은 J.W.S.에 시 몬스 재단에서 부여 (290363)에 의해 부분적으로 지원 A.E.E.와 K.P.A. 둘 다 미네소타의 대학 시작 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
| calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
| tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
| citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
| sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
| potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
| oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
| glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
| Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
| magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
| sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
| 15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
| urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
| titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
| RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
| RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
| hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
| hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
| vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
| fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
| 96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
| plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
| confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
| gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |
References
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