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Bioengineering

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

doi: 10.3791/57324 Published: February 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.

Abstract

포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 전시 포함 diacylphospholipids 이러한 amphiphiles의 독특한 화학적 특성 때문에 비해 뚜렷한 속성. 특히, 지방산 리 단일 체인 amphiphiles의 상대적으로 높은 가용성 때문에, 동적 특성을 향상 시킵니다. 마찬가지로, 리 무료 지방산을 포함 하는 소금, divalent 양이온, carboxylic 산 머리 그룹 및 금속 이온 사이 강한 상호 작용 때문에 더 민감합니다. 여기 우리는 기술을 대 한 준비, 정화, 단일 체인 amphiphiles (예를 들어, 올레 산)의 전체 또는 일부 구성 리의 사용을 보여 줍니다.

Introduction

리, 또는 소포-구획 이루어져 amphiphilic 지질 bilayer 막에 묶여-발견 사용 수많은 생명 의학 어플리케이션에 의약품, 세포 막의 모델 및 합성의 개발에 대 한 배달 차량으로 셀입니다. 우리와 다른 이른 생활에서 원시 세포 막의 모델로 리 채용도 했습니다. 1 , 2 , 3 , 4 일반적으로 이러한 시스템에서 우리는 고용 이러한 분자는 현대 셀 사용 하는 코딩 된 단백질 효소의 이점 없이 합성 하 간단 하 게 하나만 지질 탄화수소 꼬리 (예를 들면, 올레산)를 포함 하는 단일 체인 amphiphiles.

단일 체인 지질으로 구성 된 리는 diacylphospholipids에서 형성 된 것과 유사한 (예를 들어, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 또는 POPC) 그 경계 bilayer 막의 구성. 어느 클래스의 지질에서 형성 하는 리 녹아 페이로드를 유지할 수 있습니다 축소 고 다른 기술에 의해 순화 될 수 있습니다. 몇 가지 중요 한 차이점이 단일 체인 지질의 독특한 화학적 특성에서 유래한 다. 인지질에 의해 형성 된 소포는 넓은 pH 범위, 안정적인 지방산 소포는 약간 기본적인에 중립 pH (ca. 7-9), 기 준비를 위한 특정 pH 버퍼를 요구 하에서 안정만. 대부분의 시간,이 버퍼도 포함 될 수 있습니다 어느 기능 재료 (예를 들면, RNA)을 될 수 있는 소포 캡슐화에 대 한 특정 수용 성 분자 compartmentalized 생화학 반응 또는 간단한 형광 염료 (예를 들어, calcein에 대 한 ) 소포 특성에 대 한.

만 하나의 탄화수소 체인의 존재는 모두 더 침투성 용액에 더 동적 막을 생성 합니다. 또한, carboxylic 산 머리 그룹 (예를 들어, Mg2 +) 소금, divalent 양이온의 존재에 더 민감한 소포에 지방산 결과. 마그네슘 catalyzing protocells 생명의 기원 연구에 생 화 확 적인 반응에 대 한 가장 중요 한 divalent 양이온 중 하나입니다. 정교한 단백질 효소의 진화 이전 초기 생활에 RNA 지배적인 폴리머의 자기 복제 및 촉매 작용을 수행 하는 듀얼 기능으로 되었을 수도 있습니다. 마그네슘을 요구 하는 RNA에의 한 대표적인 예 관련 반응은 비 효소 RNA 복사, 1960 년대에 처음 시연 이다. 5 때 화학적으로 활성화 된 RNA 뉴클레오티드 ( 2 methylimidazolide 뉴클레오티드) 기존 뇌관 템플릿 단지 바인딩할 뇌관의 3'-수 산 기 그룹 공격에 5'-인산 염 치환 하는 인접 한 활성화 된 단위체의 떠나는 그룹 (예: 2-methylimidazole), 및 양식 새로운 phosphodiester 본드. 이 RNA 복사 화학의 Mg2 +, 지방산 protocells와 호환 되려면 chelated 필요가 필요 합니다. 6 다른 Mg2 +-귀상어 ribozyme에 의해 촉매는 아마도 가장 특징이 촉매 RNA는 종속 반응. 두 개의 짧은 oligonucleotides에서 재구성 될 수 있다,이 ribozyme 젤 교대에 의해 모니터링 하는 데 편리한 자기 분열 반응을 수행 합니다. 이와 같이, 그것은 자주 생명의 기원 연구에 모델 ribozyme로 채택 된다. 7 unliganded 마그네슘에 대 한이 ribozyme에 의해 요구 사항으로 인해 리는 일반적으로 구성 지방산 및 글리세롤 지방산 에스테 르, 마그네슘을 더 안정는의 혼합물에 의해. 8 , 9 이 프로토콜에 선물이 기술을 우리가 준비, 조작, 이러한 vesicles의 특성에 대 한 개발 하 고 응용 프로그램의 이러한 vesicles protocells 호스트 비 효소 RNA 복사 및 귀상어 ribozyme 보여 촉매입니다.

Protocol

1. 기 준비

  1. 박막의 준비
    1. 가스 꽉 주사기를 사용 하 여 유리 유리병에서 chloroform을 표 1.1 에 설명 된 대로 특정 양의 지질을 전송.
    2. 증발 질소 또는 증기 두건에서 아르곤의 스트림 아래 결과 솔루션.
    3. 클로 프롬 잔여물을 제거 하려면 적어도 2 시간에 대 한 집 진공 결과 박막을 적용. 지질 수 있습니다 남아 있을 진공에서 하룻밤이 시점에서.
  2. 소포의 재
    1. 2.5 ml 1 M tris HCl pH 8.0 버퍼의 calcein 분말의 31 밀리 그램을 녹이는 이온된 (DI) 수의 다른 7.5 mL를 추가 하 여 5 mM calcein 250 mM tris HCl pH 8.0 수 화 버퍼의 10 mL를 준비 합니다.
    2. 빈 관으로 250 µ L의 수 분 버퍼 위에 플라스틱을 1.875 µ L 최종 75mm 기본에 대 한 10 M NaOH의 (총 지방산의 ½에 해당)를 추가 합니다. 0.15 M의 총 지질 농도와 형태 소포를 건조 지질의 박막을 솔루션을 전송.
    3. 고속 사용 (> 3000 rpm) 소용돌이 4-5에 대 한 결과 혼합물을 vortexer.
    4. Rehydrate, 적어도 하룻밤을 낮은 속도 (ca. 30 rpm) 회전 통에 지질 버퍼 혼합물을 남겨 주세요.
  3. 소포 (옵션)의 크기 조정
    1. 족집게를 사용 하 여 압출 기의 주사기 포트의 각 내부 표면에 하나의 필터 지원을 적용 됩니다.
    2. 각 필터 지원 250 mM tris 젖은-HCl, pH 8.
    3. 족집게를 사용 하 여 압출 기 O-링 중 한 트랙 에칭 100 nm 폴 리카 보 네이트 막 적용 하 고 필터링 지원. 안 찢 어 또는 막 펑크, 부드럽게 두 표면 사이 좋은 접촉을 있도록 O-ring으로 막 밀어 돌보는.
    4. 압출 기, 멤브레인 및 필터 지원 치환 하지 않도록 주의 복용 조립.
    5. 압출 기 주사기를 채우십시오 ca. 250 mM tris의 0.5 mL-HCl, pH 8. 압출 기의 1 개의 측에이 주사기를 삽입 합니다.
    6. 압출 기의 다른 쪽에는 빈 주사기를 삽입 합니다.
    7. 손으로 (≤ 50 µ L/s), 천천히 버퍼를 포함 하는 주사기의 플런저를 밀어 하 고 트랙 에칭 막 이며 장소에 그대로 나타내는 저항 느꼈다는 것을 확인 합니다. 그것은 저항의 예상한 수준을 측정 하기 위해 자리에 막 없이이 단계를 연습 하는 데 도움이입니다.
    8. 제거 하 고 두 개의 주사기를 빈. 이 단계에서 두 개의 주사기 liposome 준비에 동일한 구성의 버퍼를 포함 하는 그들은 이후 청소 필요는 없습니다.
    9. 두 개의 주사기 중 하나로 liposome 준비를 로드 합니다.
    10. 주사기는 왼쪽 및 오른쪽에 빈 주사기에 소포 샘플을 포함 하는 압출 기를 재어셈블할 수 있습니다.
    11. 손으로 (10-25 µ L/s) 매우 느리게 소포 샘플을 포함 하는 주사기의 플런저를 밀어.
    12. 압출 기; 오른쪽에 주사기를 신중 하 게 관찰 버퍼는 압출 기의 오른쪽을 입력 처음 것 이다 명확한 (ca. 50 µ L, 이것은 압출 기의 내부 죽은 볼륨에), 뒤에 압출된 리의 작은 깃털. 이 시점에서 추진 즉시 중지, 압출 기의 오른쪽에 주사기를 제거 하 고이 솔루션을 취소.
    13. 압출 기의 오른쪽에 주사기를 장착 하 고 왼쪽된 주사기가 비어 때까지 돌출.
    14. 압출 기의 방향을 반전 하 고 13 단계를 반복 합니다. 원하는 주기 (일반적으로 7, 9, 또는 11) 수에 대 한 계속 홀수 항상 취소 압출 리 처음 사전 축소 liposome 준비를 포함 하는 주사기에서 수집 되지 않도록 하는 데 사용 됩니다.
    15. 부드럽게 오른쪽 주사기의 내용을 Eppendorf 관으로 분배 하 고 약 0.5 h에 대 한 낮은 속도 (ca. 30 rpm) 회전 통에 튜브를 놓습니다.
    16. 진행 기 정화 제 2에 설명 된 대로. 압출된 소포 또는 24 시간 내 사용 해야 다음 시간 사용 하기 전에 다시 내밀 었 다.

2. 기 정화

  1. 기 정화 모바일 위상의 준비
    1. 1 M tris HCl pH 8 버퍼, 디 15 mL 송 골 매 관에 물 3.75 mL의 1.25 mL을 추가 하 여 250 mM tris HCl pH 8 수 화 버퍼의 5 mL을 준비 합니다. 37.5 µ L 10 M NaOH의 추가 (½ 해당 unesterified 지방산 기준 자료) 수 화 버퍼를. 0.15 M 총 지질과 소포 솔루션 결과 팔 콘 튜브에 직접 순수 올레산의 235 µ L 플라스틱.
    2. 고속 사용 (> 3000 rpm) 소용돌이 대 한 4-5, 혼합물을 vortexer 다음 저속 회전 하는 적어도 2 시간에 대 한 셰이 커에 공중 제비. 지질 준비 남겨질 수 있습니다 하룻밤 회전 통에이 시점에서. 어떤 잠재적인 집계를 제거 하려면 사용 하기 전에 0.22 μ m 주사기 필터 장치를 통해 모바일 단계를 필터링 합니다.
  2. Sepharose에 소포의 정화
    1. 피 펫을 사용 하 여 병에서 ca. ethanolic Sepharose 4B 슬러리의 5 mL 제거 합니다. 일회용 10 mL 크로마토그래피 열이 적용 됩니다.
    2. 허용 정착 슬러리 에탄올 흐름 통해 에탄올 접근 수 지 침대 정상까지.
    3. 5 mL를 적용 수 지 및 에탄올 잔류물을 멀리 세척 하 게 자형의 상단에 이온을 제거 된 물.
    4. 250 mM tris 적용-HCl, pH 액체 수준 접근 수 지 침대의 상단 때마다 새로운 부분을 적용 하는 수 지의 상단에 1-2 mL 부분에 8. 반복 3-5 시간.
    5. 말 대 꾸에, 열을 클램프 다음 자 지 커넥터와 분수 수집기에 튜브 열 끝을 연결 합니다. 까는 자 지가 열에 액체 수준 수 지의 상단을 도달할 때, 튜브를 플러시 버퍼의 다른 부분을 추가 합니다.
    6. 섹션 1의 압출된 소포 200 µ L pipettor를 사용 하 여, 수 지 침대 또는 열 벽을 건드리지 않고 수 지에 소포 준비 가능한 균등 하 게 적용 하도록 수 지의 상단에 적용 됩니다.
    7. 흐름을 시작 하 고 96 잘 접시에 분수를 수집 하기 시작에 자 지를 엽니다. 0.5-1에서 수 지 침대의 상단에 소포 정화 모바일 단계 적용 mL 부분으로 버퍼 고갈, 건조 수 지 침대를 허용 하도록 하지. 5 드롭 분수, 적어도 36 우물 (96 잘 접시의 3 행) 수집에 수집 합니다.
  3. 정화 분수의 형광 특성
    1. 이전 섹션에서 96 잘 접시 하 고 플레이트 리더에 그것을 읽고 (exλ = 485 nm, λem= 515 nm).
    2. 분수 수 대 형광으로 결과 형광 데이터를 플롯 합니다. 소포 elute 먼저, 다음 unencapsulated 분수 (그림 1).
  4. 소포 기 누설 감시 하의 repurification
    1. 섹션 2.2 및 2.3의 정화 및 특성화 단계를 반복 합니다. 그들의 내용을 유지 소포 unencapsulated 용액 (또는 소포 피크의 강도의 ca. 5-10%의 매우 작은 하나)의 아무 피크를 전시할 것 이다.

3. 사용의 소포 마그네슘의 존재

  1. Unliganded 마그네슘의 사용
    1. 준비 하 고 1, 2.1, 2.2 섹션에 설명 된 대로 소포를 정화.
    2. 물 1 M tris HCl pH 8.0 버퍼의 250 µ L와 1m MgCl2 의 50 µ L 디의 700 µ L을 추가 하 여 50 mM MgCl2 솔루션 250 m m tris HCl pH 8.0 버퍼에서의 1 mL을 준비 합니다. 잘 섞어 소용돌이입니다.
    3. 5mm의 원하는 마그네슘 농도 주고, 순화 vesicles의 0.9 mL 및 마그네슘 솔루션의 100 µ L를 혼합 하 고 마그네슘의 높은 현지 농도에 소포의 과도 노출에 의해 기 장애를 최소화 하기 위해 빠르게 저 어.
      참고: 마그네슘 솔루션의 신속한 혼합은 소포 안정성에 중요 합니다. 마그네슘과 소포는 신속 하 게 혼합 되지 즉시 vortexing에 의해, 만약 일부 소포 마그네슘, 일관성 없는 결과 샘플에서 샘플 결과의 높은 농도에 노출 됩니다.
    4. 2.4 내용 누설에 대 한 확인에 설명 된 대로 repurification 전에 적어도 30 분 동안 텀블러에 소포 샘플을 둡니다. Repurification 모바일 단계에 기 샘플에서 마그네슘의 동일한 농도 추가 합니다.
  2. Liganded 마그네슘의 사용
    1. 준비 하 고 1, 2.1, 2.2 섹션에 설명 된 대로 소포를 정화.
      참고: 대신 사용 하 여 ½ 해당 코 NaOH deprotonate 지방산; 그것은이 chelated MgCl2 시스템에서 보다 안정적인 리 생산 발견 되었습니다.
    2. 2 M 칼륨 구 연산 염 해결책을 준비 하 고 코와 8.0 pH를 조정.
    3. MgCl2 , 칼륨 구 연산 염 250 mM tris HCl pH 8.0 버퍼에서 지정 된 비율 (ca. 1:4 안정 올레산 vesicles)에 공기로
    4. 기 샘플, 짧게 소용돌이에 premixed 마그네슘 시트르산 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 항상 마그네슘과 리간드 솔루션 공기로. 절대 혼자 unchelated 마그네슘 솔루션에 소포를 노출 합니다.
    5. 2.4에 설명 된 대로 repurification 전에 적어도 30 분 동안 텀블러에 소포 샘플을 둡니다. Repurification 모바일 단계에 마그네슘과 소포 샘플에서 시트르산의 동일한 농도 추가 합니다.

4. 비-효소 RNA 소포에 복사

  1. 단 분산 RNA의 준비 캡슐화 소포
    1. 1.1 섹션에 설명 된 대로 건조 올레산 영화를 준비 합니다.
    2. 50 µ M 형광 레이블이 RNA 뇌관 소포 재 버퍼, 150 µ M RNA 템플릿 및 250 mM tris HCl pH 8.0 올레산 기준으로 ½ 해당 코를 포함 준비.
    3. 지질 영화 재 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 1.2.2, 1.2.3 총 0.15 M 지질 농도와 소포 수 있도록 단계를 따라.
    4. 있도록 작은 unilamellar 단 분산 소포, 소포 압출에 대 한 섹션 1.3 따릅니다.
  2. 마그네슘 구 연산 염 추가 소포 정화
    1. 마그네슘과 시트르산 주식, 공기로 하 고 혼합이 0.1 m M의 마지막 지질 농도에 소포 샘플.
    2. Sepharose 4B 크기 제외 열, 250 mM tris HCl ph 8.0, 0.1 m M 지질과 마그네슘 및 모바일 단계로 시트르산에 소포를 정화.
    3. 다음 섹션 2.3 소포 분수를 수집 합니다.
  3. 뇌관 연장 반응
    1. 250 mM tris HCl ph 8.0 200 m m 2-MeImpG (guanosine 5'-monophosphate 2-methylimidazolide) 재고 솔루션을 준비 합니다. (참고: 이전에 따라 출판 2 MeImpG 합성에 대 한 프로토콜10 .)
    2. 뇌관 연장 반응 시작, 2-MeImpG 재고 솔루션의 150 µ L 75 m m 지질 및 50 mM의 최종 농도 도달 450 µ L 기 샘플을 전송 단위체를 활성화 합니다. 타이머와 계속 반응이 쏟아질 모든 시간 샘플을 시작 합니다.
    3. (선택 사항) 연속 신선한 단위체 먹이 대 한 전송 300 µ L 건설 연구소 작은 볼륨 liposome dialyzer11 의 한 챔버에 반응 해결책의 및 넣어 300 µ L 다른 챔버에 솔루션을 먹이. 수 유 솔루션 빈 소포와 소포를 포함 하는 RNA 교체 제외 반응 솔루션에서 동일한 농도에서 모든 재료를 포함 해야 합니다. 투 석의 각 라운드는 분석 및 사용 하는 막에 따라 1-24 h 걸립니다.
    4. 운동 연구에 대 한 100 µ L aliquot 각 시간 지점에서 고 250 mM tris HCl ph 8.0 모바일 상으로 Sepharose 4B 크기 제외 열 통해 약 수를 repurify.
    5. 1.5 mL eppendorf 관에 소포 분수를 수집 합니다.
    6. 마지막 약 0.1%에 소포 분수 트리톤 플라스틱 v/v.
    7. 튜브를 냉 에탄올의 0.5 mL을 추가 하 고 적어도 2 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
    8. 16.1 × 1000에서 모든 샘플을 원심 rcf (16.1 × g) 10 분을 부드럽게 피펫으로 액체 밖으로. 워시 RNA 70% 감기 에탄올과 원심 분리기로 펠 릿 다시 5 분 액체를 삭제 하 고 2 분 잔여 에탄올을 증발 하는 80 ° C 열 블록에 RNA 펠 릿으로 튜브를 넣어. 1xTBE 로드 버퍼 8 M 요소의 50 µ L에 펠 릿을 디졸브.
  4. 페이지 분석
    1. 20%를 준비 10xTBE 버퍼의 25 mL, TEMED의 80 µ L, 암모늄 persulfate의 250 mg 200 mL UreaGel 시스템의 집중, 희석제, UreaGel 시스템의 25 mL를 혼합 하 여 페이지 젤. 빨리 채워 젤 판 (35 × 45cm) 사이의 젤 혼합물을 부 어 하 고 빗을 삽입 합니다. 완전 한 중 합까지 적어도 30 분을 기다립니다.
    2. 젤 스탠드에 젤 접시를 조립 하 고 버퍼를 실행 하는 1xTBE 젤 젤 상자를 채우십시오. 빗을가지고 고 주사기 우물을 플러시. 미리 30 분 60 W 젤을 실행 합니다.
    3. 2 분 동안 80 ° C 열 블록에 샘플이 열 하 고 잘 당 각 샘플의 5 µ L을 로드 합니다.
    4. 젤 파워 상자를 켜고 젤 60 W 2.5 h에 대 한 지속적인 와트 실행 설정.
    5. 젤 스탠드에서 젤 접시를 분해, 청소 유리 닦 고 젤 젤 스캔 하려면 스캐너에서 전체 접시를 넣어.
    6. TL ImageQuant 1 D 분석 젤 계량. 뇌관 뇌관 시간 대의 초기 금액을 주어진된 시간에 나머지의 금액의 비율의 자연 로그를 플롯, 선 고 계산 가짜 첫번째 순서 반응 (그림 2) 있습니다.

5. 귀상어 RNA 자체 분열 소포에

  1. 준비 및 소포에 ribozyme의 정화
    1. 지질 얇은 필름 준비 (OA: GMO = 9:1)에서 같이 구성 요소와 섹션 1.1에서 테이블 1.2. 참고: 적어도 60 ° c를 사용 하기 전에 완전 한 용 해에 대 한 따뜻한 조합.
    2. 각 귀상어 ribozyme 물가 및 250 mM tris HCl pH 8.0의 5 µ M와 소포 재 버퍼를 준비 합니다.
    3. 지질 영화 재 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 1.2.2, 1.2.3 소포 0.15 m 총 수 있도록 단계 지질 농도 따라.
    4. 있도록 작은 unilamellar 단 분산 소포, 소포 압출에 대 한 섹션 1.3 따릅니다.
    5. 모바일 상으로 지질을 혼합 Sepharose 4B 크기 제외 열 250 mM tris HCl ph 8.0, 0.15 M에 소포를 정화.
  2. 귀상어 ribozyme 자기 분열 반응
    1. 마그네슘 솔루션을 준비 하 고 순화 된 소포 섹션 3.1 자체 분열 반응 시작에 설명 된 대로 혼합.
    2. 운동 연구에 대 한 각 시간 지점에서 혼합물의 100 µ L를가지고 고 직접 모바일 위상으로 250 mM tris HCl ph 8.0 Sepharose 4B 크기 제외 열을 통해이 약 수를 repurify. 소포 분수를 수집 합니다.
  3. 페이지 분석
    1. 단계 4.3.6 4.3.8 RNA 샘플 로드를 준비 합니다.
    2. 상업적으로 casted 15 %TBE 요소 젤 젤 상자에 배치 하 고 버퍼를 실행 하는 1xTBE 젤 젤 상자를 채우기.
    3. 1 분에 80 ° C 열 블록에 샘플이 열 하 고 잘 당 각 샘플의 5 µ L을 로드 합니다.
    4. 약 1 시간에 대 한 지속적인 200 V 젤을 실행 합니다.
    5. 젤을 검사 합니다.
    6. ImageQuant TL 1 D 같은 분석 소프트웨어와 함께 젤 계량, 나머지의 강도 비교 하 여 분열의 범위를 측정 하기 위해 기판 RNA 밴드 및 쪼개진된 RNA 조각 밴드 (그림 3).

6. 거 대 한 지방산 소포 현미경 검사 법에 대 한

  1. 거 대 한 지방산 vesicles의 준비
    1. 따라 섹션 1.1 테이블 1.3 올레산 박막 붙일 레이블된 지질 0.2 mol % 더 나은 막 관찰에 대 한 준비.
    2. 500 µ L 250 mM tris HCl ph 8.0 총에서 소포 샘플 10 m m 지질을 지질 영화 리하이드레이션 버퍼 원하는 경우 형광 염료 또는 RNA 분자를 포함할 수 있습니다. 기 샘플 쏟아질 하룻밤 둡니다.
    3. 올레산의 470 µ L 250 mM tris HCl pH 8.0 ½ 동등한 NaOH를 포함 150 mL를 혼합 하 여 150 mL 10 m m를 가진 순수한 지방산 투 버퍼의 총 지질을 준비 합니다.
    4. 10 µ m 폴 리 카보 네이트 막 큰 집계 제거를 통해 소포 샘플 압출 성형.
    5. 앞에서 설명한 1 µ m 큰 공 투 카세트로 소포 샘플을 전송 합니다. 12
    6. 30 mL 투 버퍼를 포함 하는 100 mL 비 커에 투 석 카세트를 놓습니다. 80-100 rpm 테이블 상단 통에 부드럽게 비 커를 교 반 하십시오.
    7. 투 석 버퍼 무료 염료 또는 RNA 및 작은 소포를 제거 하려면 5 시간 마다 30 분 변경.
    8. 조심 스럽게 제거 기 샘플 투 카세트에서 주사기와 전송 Eppendorf 관에.
  2. 현미경 관찰
    1. 깨끗 한 표준 현미경 슬라이드에 소포의 10 µ L 플라스틱 하 고 샘플 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 투명 매니큐어와 커버 글라스를 봉인.
    2. Confocal 현미경 검사 법 붙일 표시 막, RNA 또는 캡슐화 된 염료 (그림 4)에 대 한 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 오일 분산 또는 유사한 목표 X 60으로 소포를 관찰 합니다.

Representative Results

우리는 일반적으로 크기 제외 열에 liposome 담긴을 수행합니다. 전형적인 liposome 준비 포함 어떤 종류의 fluorophore. 리는 생성 하 고 압출, 캡슐화 될 종족은 내부와 외부는 리 존재 한다. 리 크기 제외 수 지 (Sepharose 4B)에, 정화 하 여 unencapsulated 용액 동안 큰 리 하지 않으며 elute 먼저 (그림 1A)는 수 지의 모 공 내에서 유지 됩니다. 분수를 수집 하 고 일반적으로 분수 번호 (그림 1B) 대 형광 플로팅 다음 수집 하 고 후속 응용 프로그램에서 사용 되는 리에 해당 하는 초기 방출 분수와 2 피크 추적을 생성 합니다.

우리는 자주 ribozyme 및 단백질 기반 RNA polymerases의 출현 이전 RNA 복제의 가능성이 의미 했다 nonenzymatic 뇌관 연장 반응 검사. 이 반응은 일반적으로 붙일 레이블된 뇌관 (그림 2A), 활성화 된 단위체에 의해 확장 된 사용 합니다. 젤 전기 이동 법 (그림 2B)에 의해 이러한 반응을 모니터링할 수 있습니다 및 결과 electropherograms 주어진된 반응 조건 (그림 2C)에 대 한 속도 상수를 통합.

RNA protocells 안에 작동할 수 입증, 우리는 모델 RNA 촉매 반응으로 귀상어 ribozyme 자기 분열 (그림 3A)를 사용 합니다. 이 반응 필요 무료 Mg2 + 촉매, 촉진 하 고 그들은 5 m m Mg2 +의 안정적인 OA/GMO 소포 사용 하는 따라서. 뇌관 연장 반응에 유사한, 귀상어 ribozyme 자기 분열 반응 수도 있습니다 젤 전기 이동 법 (그림 3B)에 의해 모니터링 하 고 특정 조건 (그림 3C)에서 속도 상수를 얻으려고 나중 분석.

우리 이미지 리 두 형광을 고용 하 고 빛을 전송 합니다. 리 주고 막 레이블 (그림 4A), 형광 지질을 사용 하 여 또는 그들의 루멘 (그림 4B) 내에서 형광 용액을 사용 하 여 표시 될 수 있습니다. 전송된 빛 소포 (또한 그림 4B참조)을 준수 사용할 수 있습니다.

표 1.1 순수 올레 산 클로 프롬에
구성 요소 주식 금액
올레산 > 99% 11.7 Μ L
클로 프롬 1 mL
표 1.2 올레산 및 글리세롤 monooleate 클로 프롬에 (9:1)
구성 요소 주식 금액
올레산 > 99% 10.5 Μ L
글리세롤 monooleate > 99% 1.4 Μ L
클로 프롬 1 mL
클로 프롬에 0.2mol% Rhodamine PE와 표 1.3 올레산
구성 요소 주식 금액
올레산 > 99% 1.6 Μ L
클로 프롬에 rhodamine PE 10 m m 20 Μ L
클로 프롬 1 mL

표 1입니다. 지방 산 성 클로 프롬 솔루션입니다.

Figure 1
그림 1입니다. 정화 분수의 소포 정화 및 형광 특성입니다. A. Sepharose 4B 열에 무료 calcein에서 calcein를 포함 하는 소포의 분리. B. 소포 그리고 분수 컬렉션 후에 각 잘 잘 수 대 형광 그려서 무료 calcein 피크 탐지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. OA 소포 안에 비 효소 RNA 복제입니다. A. 비 효소 RNA 뇌관 연장의 계획. B. 페이지 이미지 섹션 4에서 조건 순수 올레산 소포 안에 뇌관 연장 반응의. C. 선형 뇌관 뇌관 대 시간 이상 30 헤 반응 속도의 초기 금액을 시간 포인트 주어진에서 남은 금액의 비율의 자연 로그의 적합, ln (P/P0) vs 시간의 사면에서 계산, 0.058 h-1입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. OA/GMO 소포에 귀상어 ribozyme 분열입니다. A. 붙일 레이블된 기판 가닥 (맨 위)의 귀상어 ribozyme 분열의 체계. B. 페이지 이미지 5 m m Mg2 +OA/GMO 소포 안에 귀상어 ribozyme 분열의. C. 소포 안에 Ribozyme 활동입니다. 주어진 시간 포인트에서 남은 기판의 금액의 비율의 자연 로그의 선형 적합 처음 4 h. 반응에에서 시간 대 기판의 초기 금액, ln (s/S0) vs 시간, 사면에서 계산 속도가 0.36 h-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 현미경 검사 법에 대 한 거 대 한 지방산 소포입니다. A. Rhodamine PE의 Confocal 현미경 이미지 표시 올레산 소포, 눈금 10 μ m 막대. B. 올레산 소포를 포함 하는 Alexa488의 Confocal 현미경 이미지 전송된 검출기 (TD) 채널, 눈금 5 μ m 막대에 표시 된 막으로 RNA를 표시.

Discussion

리 지방산에서 형성 된 많은 원시 세포 그들의 높은 침투성 및 동적 속성에 대 한 잠재적인 모델 제안 있다. 단일 사슬 지방산의 carboxylic 머리 그룹만 자기 조립 막 제한 된 pH 범위에에 있으며 결과 막 소금의 존재에 매우 민감합니다. 그 결과, 지방산 소포 필요 다른 준비 및 인지질 소포와 비교 하는 메서드를 처리 합니다.

이 프로토콜에서 우리가 liposome 형성에 대 한 예를 들어 올레산을 사용 하지만 다른 긴 사슬 불포화 지방산 (C14) 및 그들의 유도체 (ca. myristoleic 산, palmitoleic 산과 해당 알콜 및 글리세롤 에스테 르) 소포 형성 총 지질 농도 cmc와 수 분 버퍼 pH는 박막 리하이드레이션 메서드를 다음 막 내에서 지방산의 pKa 가깝습니다. 이외의 tris HCl 버퍼가이 프로토콜에 사용, 붕 산 염 또는 인산 염 버퍼에서 형성 하는 소포는 일반적으로 매우 새13지방산 기 형성을 지원 하기 위해 다른 버퍼 시스템 (ca. bicine, 인산 염, 붕 산 염) 보도 했다. 재 후 결과 지방산 소포는 polydisperse 및 multilamellar, 하지만 쉽게 변환 됩니다 작은 단 분산 unilamellar 소포 밀어 남에 의해 설명 된 대로. 작은 소포를 생성 하기 위한 대체 방법으로 쥡니다와 비교, 압출 다른 기 공 크기 막 적용 하 여 소포 크기의 제어에 대 한 더 많은 옵션을 제공 합니다. 압출 후 소포는 보통 막 기 공 크기 보다 약간 더 큰 그러나 압출 사이클의 수를 늘림으로써, 소포 막 기 공 크기에 가까운 평균 크기와 좁은 크기 분포를 얻을 수 있다.

기능 protocells 합성, 지방산 소포 해야 호스트 특정 생화학 반응 RNA 또는 다른 빌딩 블록의 캡슐에 넣기에서 발생 합니다. 박막 리하이드레이션 메서드 원하는 캡슐화 된 물자를 포함 하는 양식 소포 하는 쉬운 방법을 제공 합니다. 그러나, 캡슐화 효율은 상대적으로 낮은 고 정화 과정에서 RNA 등 귀중 한 자료의 큰 부분 일반적으로 손실 됩니다. 경우에 따라 캡슐화 효율 겸손 압출 하기 전에 반복된 freeze-thaw 주기 하 여 개선할 수 있습니다. 그러나 유사한 방법 아직 지방산 소포에 대 한 개발 하지 않은 미세 메서드 인지질 리의 고수익 준비에 대 한 거의 100% 캡슐 효율성에 대 한 수 있습니다.

반응 속도의 정확도 영향을 미칠 수 있는 자료를 캡슐화 때 유출 protocells chelated 또는 무료 Mg2 +, 마그네슘 솔루션 추가 및 repurification 각 시간 포인트의 제거를 보장 하기 전에 후 정화 처리 소포 안에 측량입니다. 이후 각 정화 좋은 분리를 달성 기 분수를 수집 하 고 10 분 이상 걸립니다, 빠른 반응의 분석 어렵습니다, 그리고 반응 열 repurification 전에 중지 해야 합니다.

우리는 여기에 제시 하는 프로토콜은 원시 세포에서 발생할 수 있는 그를 흉내 낸 반응 호스트 지방산 리의 건설에 대 한 적합 합니다. 우리의 프로토콜 또한 생명 전달 시스템 및 다른 생 화 확 적인 반응에 대 한 생물 반응 기의 개발에 잠재적인 응용 프로그램 사용.

Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

J.W.S.은 하 워드 휴즈 의학 연구소의 조사. 이 작품은 J.W.S.에 시 몬스 재단에서 부여 (290363)에 의해 부분적으로 지원 A.E.E.와 K.P.A. 둘 다 미네소타의 대학 시작 자금 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

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References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454, (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559, (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59, (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342, (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328, (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10, (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4, (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용
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Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).More

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

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